JP3700035B2

JP3700035B2 - 稀少出現ほ乳類細胞を検出しカウントするための装置及び方法

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Publication number: JP3700035B2
Application number: JP32374595A
Authority: JP
Inventors: デュロクルジャン−ルイ; ギイェジャン−ジェラル; グローナーワレン
Original assignee: シェミュネクス
Priority date: 1994-11-17
Filing date: 1995-11-17
Publication date: 2005-09-28
Anticipated expiration: 2015-11-17
Also published as: DE69417899T2; JPH08304288A; EP0713086A1; US5751839A; EP0713086B1; DE69417899D1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光色素によって標識を付けた血液及びその他の組織内で稀少出現するほ乳類細胞の高速検出及びカウントを行うことのできる装置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光色素で標識を付けた少量の分子又は細胞を自動的に検出することは、良く知られた技術であり、且つしばしば実施される診断方法の一つである。伝統的な検出及び定量化法は以下の一般的な３つの態様の一つに従う：
＊第１の態様（“溶解化学（solution chemistry）”）に於いては、分子がそれを担持していた細胞から解放された後検出される。結果として得られる蛍光強度は分子濃度に関係している。
【０００３】
＊第２の態様（フローサイトメトリー）に於いては、無傷の細胞を蛍光色素で標識化した後、蛍光を検知する検出ステーションを通す。この時標識化された細胞は、総細胞の一部としてカウントされる。
【０００４】
第３の態様（画像分析法）に於いては、標識化された組織を固体性基盤に載置した状態で自動顕微鏡に掛け、該顕微鏡によって形成された画像の分析を通じて細胞を検出しカウントする。典型的に該画像は、蛍光分子を励起させるために小サイズのスポットで走査される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これらの形態の各々に於いては感度の点に著しい限界があり、このことは稀少イベント（event）の検出に応用する場合に影響を与えている。この限界の存在により、分子診断学の現代技術に対して応用することは実際上特に厳しいものとなるであろう。
【０００６】
生物学或いは解剖病理学（anatomopathological）の研究に於いて、また日常的な診断分析に於いて多数の通常細胞の中から少数の異常細胞を検出することの必要性がますます高まっている。このような異常細胞の試料は、腫瘍細胞かウイルスに感染した細胞のいずれかである。こういった異常細胞は、蛍光標識により識別することができるが、標識は特定の蛋白質などの細胞の一要素をアドレス化し、或いはインサイチューハイブリダイゼーション又はインサイチューＰＣＲ等の技術を通じて遺伝子をアドレス化するものである。
【０００７】
多くの医療分野に於いて、多数の試料について極少数の異常細胞を正確に且つ迅速に検出できれば非常に有益である。例えばバイオプシーに於いて２・３の腫瘍細胞を早期に検出できれば腫瘍細胞の転移を阻止できるし、癌腫瘍の拡大を防止することができるのである。
【０００８】
他の例としては、（ＨＩＶ等の）侵攻ウイルスに侵入された細胞数の早期検出・監視に関する。早期検出ができれば他の人が感染することを防止できるし、また緻密な監視を行うことは疾病の治療にとり非常に有益である。
【０００９】
この種の適用を行なうには、検出の感度を非常に高いものとしなければならない。というのも１０⁵を越える他の細胞の中から一個の異常細胞のみを検出できることが重要なことだからである。
【００１０】
ある観点から、満足することができる程度に有効な情報を得るためには、約１００個の異常細胞をカウントすることが望ましい。このことは１０⁷個の他の総ての細胞を検査したことを意味する。
【００１１】
固体支持体上に広げられた試料を顕微鏡を使用して視認検査することは、単調な作業であり、非常に時間がかかる。そして他にも蛍光物質が存在する場合には作業は複雑なものとなる。顕微鏡で異常細胞を検索する場合、広い領域を観察する必要があり、たった一つの異常細胞を見逃してしまう危険が高い。
【００１２】
共焦点顕微鏡又は画像分析装置を使用することにより、異常細胞（稀少イベント）を検出することが可能となる。しかし実用上走査は非常にのろく、分析できる面積も小さい。
【００１３】
尤も上記例で発生する稀少細胞をフローサイトメトリー若しくは画像分析法により検出する場合の主な技術的課題は、ノイズに対する検出信号の比、より具体的には偽信号が検出される可能性を考察することにより理解される。良く知られるところだが、偽信号の発生可能性は、検出器が稀少イベントを探知するのに必要とされる時間の量と共に直線的に増加する。従って、偽信号と真信号とを区別することのできる能力を維持するためには、必要とされるノイズに対する信号の比（Ｓ／Ｎ比）は、真信号の発生可能性が減少するに伴い増加しなければならない。或いは、ノイズに対する信号比の中には発生頻度の点で限界があるものがあり、これ以下の頻度ではイベントを信頼して検出することはできない。
【００１４】
上記限界を克服する一つの方法があるが、これは第３の分析（画像分析）に対してのみ適用可能なものである。この態様に於いて、細胞は、固体支持体に固定されているので、２回目の分析工程に於いて標本を再度分析し偽信号と区別できる。こうして、自動顕微鏡の稀少イベント検出能力を改善するための公知の方法の一つに、まず標本を粗分析し、次いで第２の段階として疑われるポジティブ信号をより詳しく調べることとするものがある。しかしこの技術は、分析速度の点でやはり限界がある。この限界は検出可能性が最初の粗走査で特定されなければならないことに基づく。このように蛍光検出法に於いては、照射スポットのサイズは十分な強度を達成できるよう小サイズのものである必要があり、第１段階で稀少イベントをポジティブと認識（検出対象であると認識）できる程度に走査は遅いものでなければならない。
【００１５】
この問題をよりよく理解するためには、電子画像形成システムに於いて得られる画像が個々の画素（ピクセル）により構成されていることを認識することが有用である。電子画像形成技術の現況に於いては、最も優秀なビデオカメラでさえ１００，０００個若しくは百万個のピクセルからなる画像を形成できるに過ぎない。しかし一細胞当たりの直径は１０μｍのオーダーであることが典型的であるが、観察すべき固体支持体の表面は５ｃｍ²のオーダーとなっている。従って１ピクセルを１細胞の大きさとするならば、支持体の全てをカバーするには約３，０００万個のピクセルが必要となる。
【００１６】
その結果、１個の画素（ピクセル）は１個の細胞の寸法よりもかなり大きいものとならざるを得ず、また分析は多くの連続画像を使用することが必要となる。しかしこれらのアプローチのいずれもが満足のいくものではない。最初のケースの場合には検出感度が低く、また後者の場合には分析に要する時間と分析の複雑さが制限要因となる。
【００１７】
その結果実用の場面に於いては、この技術によっては固体支持体に広げられた試料の一部しか分析されず、研究目的に対しては受け入れられるが、厳格性の要求される医療分野に於いては偽ネガティブの結果（検出対象が存在しないとの誤った検出結果）をもたらす可能性があり、日常のインビトロ診断実験に於いて許容することはできない。
【００１８】
この技術に対する他の制限要素としては、データ処理の点にある。スキャンを２回行なう場合に於いては、２回目の分析を完了して初めてポジティブイベントが確認されるので、データ処理装置は１回目の分析記録を完全な状態で保持していなければならない。稀少イベントの検出に於いては、ポジティブ因子の発生頻度は高いので、１００万の以上のネガティブ因子のデータを各ポジティブイベント毎に記憶する必要がある。
【００１９】
さらに検索された細胞の標識は脆弱なものであるので、時間と共に素早く低減していくものであるから、結果的に２回目の走査が誤った偽否定結果へと導かれることとなろう。
【００２０】
最後にこれらの技術は、検索された蛍光細胞と、試料上に存在し自己蛍光性を有するか又は色素を吸収することによって蛍光化した種々の微粒子とを、自動的に区別するための適切な手段の開発には簡単につながるものではない。確かに検出するべき異常細胞の大きさ及び形状は、実質的に多義に亘っているので、標準に対する比較はきわめて問題のあるものとなっている。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、支持体をレーザ走査することにより該支持体上の蛍光化された稀少ほ乳類細胞を迅速且つ正確に検出し、カウントすることができる装置及び方法に関する。上述した限界点は、検出されるべき細胞より大きい走査スポット、好ましくは細長い走査スポットを少なくとも１つ用い、重複走査パターンで走査することにより解消される。
【００２２】
さらに、このユニークな装置を使用することにより、比較的大きい固体支持体（典型的には２、３平方センチメートル）の高速走査が行うことができるので、検出するべき稀少ほ乳類細胞は実質上漏れなく検出され、偽信号を実時間で拒絶することができる。識別工程（識別装置）により、検索された細胞が発生する蛍光信号と、自発蛍光微粒子又は蛍光化されてしまった他の材料との分離を確実に自動且つ迅速に行うことができる。
【００２３】
本発明を理解するためには、目標に対するＮ回の独立した走査当たりに検出される可能性は１回の走査当たりに検出される可能性のＮ倍の平方根に比例することを認識しておくことが有用である。そして１回の走査で検出される可能性は、走査の速度に反比例する。このように、大略的に言って、倍速で同じ領域を２回走査することは、検出の可能性の点に於いて一度だけ走査して検出される可能性にほぼ等しく、走査時間の純利得は実現されない。しかし、もし同期させた状態で２本の走査を行えば、もはやそれは独立した走査ではなく、（該２本の走査の間に於いて相関関係のある）一つの信号イベントが（相関関係のない）ノイズイベント対して優位に取り扱われる。こうして検出の可能性を増加させ走査時間を短縮することが可能となるのである。
【００２４】
本発明に於いては、例えば面積の大きいレーザスポット（図１参照）により走査を行い、また走査を重複させて、領域の各部分が少なくとも２回走査されることなるようにすることで走査速度の増加を図っている。そして走査対のＸ方向への走査の結果が、検出可能性を維持するために非相関信号を除去することにより同期して比較される。このように各ポジティブイベントは、（蛍光対称の大きさに依拠して）２以上の走査ライン間により相関づけられる。
【００２５】
定義
レーザスポットが（スライドグラス等の）固体支持体上の走査ラインに沿って移動する時に、発生する蛍光（存在する場合）を１以上の検出器が（種々の波長で）連続的に測定する。検出器からのアナログ信号は、一定の周波数間隔で採取されることによりデジタル化される。
【００２６】
「読みとり」
読みとりは測定時の信号値である。
【００２７】
「サンプル」
サンプルは、ある特定の動的閾値を越える検出器からの信号の読みとりとして定義或いはされる。
【００２８】
「フィーチャー」
１走査ライン上の隣接する一連の試料は、フィーチャーと呼ばれる。
【００２９】
ライン間相関づけ：
２つの試料は、隣接する２つの走査ライン上で同期して現れる場合に相関しているとされる。
【００３０】
「単一フィーチャー」
一つの走査ライン上にのみ現れるフィーチャー、即ち相関づけられないフィーチャーを、単一フィーチャーと呼ぶ。
【００３１】
「蛍光スポット」
レーザビームによって励起された蛍光微粒子が発生する蛍光発光。該微粒子は細胞であることもあるし、埃等の他の物質であることもある。
【００３２】
これらの微粒子は、自発的な蛍光性を有するものであることもあるし、検出のために蛍光化されたもの（例えば細胞など）である場合もある。
【００３３】
「イベント」
イベントとは隣接する走査ライン上で同期して相関づけられた少なくとも２つの一組のフィーチャーをいう。１つのイベントは、測定工程に於ける蛍光スポットの翻訳されたものである。
【００３４】
その後イベントは識別器によってポジティブイベント（即ち細胞等のイベントが検索された場合）又はノイズイベント（即ち、自発蛍光性微粒子等により発生した蛍光であり拒絶されるべきイベント）として分類される。ノイズイベントは、最終のカウントに含まれる場合には、偽ポジティブの結果を出してしまう。
【００３５】
「レーザスポット」
レーザビームによって支持体上で形成された光スポットのことをいう。
【００３６】
「ライン間又はライン間隔Ｙ」
２つの走査ライン間の距離を指す。
【００３７】
上記定義は、図２に於いて示されており、ここではサンプルは○によって表されている。またイベント（一連の相関フィーチャー）の長さは、走査ライン上で走査方向の最も初期に現れるフィーチャーの出発時から走査ラインで最も遅く表れるフィーチャーの終部までの蓄積されたサンプル数に対応している。前記カウントは、異なる走査ラインに跨って相関を示す全てのサンプルを１サンプルとして扱い、１つのイベントの幅は同じイベントが出現する隣接ラインの数によって定義される。
【００３８】
本発明の１つの特徴に於いては、スライドグラス等の固体支持体上の蛍光標識化細胞をカウントするための方法が提供され、該方法は：
−検出されるべき細胞より実質的に大きく１５μｍ及び３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザースポットを固体支持体上に形成するようにして、レーザ装置からの入射レーザビームを用いて蛍光細胞を含む可能性を有する試料を載置した固体支持体を走査し、二つの走査ラインは、前記固体支持体の各部分が、隣接する走査路を部分的に重複させることにより少なくとも２回走査されるように間隔を設定され、望ましくはレーザスポットの寸法の半分より短い間隔とされ、；同時に
−ある閾値を越える検出信号であるサンプルだけを選択するようにして、少なくなくとも１種の波長で、結果として得られる蛍光を検出し、一つの走査ライン上の隣接する一連の試料はフィーチャーであり；
−隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上のフィーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーの組が出現する走査ラインの数をカウントし、各組の相関フィーチャーはイベントを形成し、あらゆる非相関フィーチャーである単一フィーチャーを除去することによって、個々のフィーチャーのライン間相関づけにより相関フィーチャーの組を認識し；
相関は、対比される前記２つのフィーチャー内の１以上のサンプルが前記ライン対上の同じ位置で検出されるときに存在するとされ、前記相関フィーチャーの組が出現するラインの数がカウントされ、その後サイズ識別に使用され、
−隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上の前記相関フィーチャーを少なくとも２つの異なる波長λ₁及びλ₂で同期して比較し、該２つの波長に於ける所定数未満の発光強度比を有する相関フィーチャーを選択し、相関する前記サンプルにより前記波長で発生した前記発光比が所定の値より大きいものである場合、前記イベント全体が排除されるようにし；
−維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択し；
−サイズ認識後に維持されるイベントに対して、該イベント内における前記サンプルの強度分布である３次元のイベントエネルギープロファイルが所定のガウス形状基準内にあるか否かを判断し、該ガウス形状基準にないイベントを排除し；
このような分析は例えば、ソフトウェアの曲線照合アルゴリズムによって行われ、前記基準内の全てのイベントは、最終カウント用の蛍光細胞として受け入れられ、前記基準外のものはノイズ、即ち、前記支持体上の埃又はその他の微粒子として分類されることとなり、
−前記固体支持体上に存在する蛍光細胞を決定しそれらのみをカウントするために前記残存する前記イベントをカウントすることを含む。
【００３９】
より正確には本発明の前記特徴の好適な実施例に従えば、前記サイズの識別は：
−前記イベントの内の最初に現れる如何なるフィーチャーについても走査方向上で最初に現れるサンプルから出発し、如何なるフィーチャーが最後に終るかに拘わらず走査方向に最後に現れるサンプルを含むようにサンプル数を続けてカウントし、カウントでは異なる走査ライン上の総ての相関サンプルを１サンプルとみなし、
−同じイベントがカバーする隣接走査ラインの数をカウントすることによりそのイベントの幅を決定し、
−前記カウントされたサンプルの数が所定数Ａより大きく、且つ／又は前記カバーする隣接走査ラインの数が所定数Ｂより大きいイベントを除去することにより実行される。
【００４０】
本発明の他の特徴に於いては本方法は：
−検出されるべき稀少出現ほ乳類細胞を含む分析されるべき試料を固体支持体上に広げて薄膜状態にし；
−前記固体支持体に適当な試薬を塗布して、モノクローナル抗体法、インサイチューハイブリダイゼーション法、インサイチューＰＣＲ法、酵素結合プローブ法等の、選択された波長で蛍光を発光するよう励起された場合に可能な技術を使用して検索された細胞を蛍光標識化し、これらの技術は、一以上の波長で蛍光を発生させて識別手段又は特定のタイプの稀有細胞だけを識別するか又は選択するための手段とするために、個別的に又は同時に一つの試料に使用されており；
−検出されるべき細胞より実質的に大きく１５μｍ及び３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザースポットを固体支持体上に形成するようにして、レーザ装置からの入射レーザビームを用いて蛍光細胞を含む可能性を有する試料を載置した固体支持体を走査し、二つの走査ラインは、前記固体支持体の各部分が、隣接する走査路を部分的に重複させることにより少なくとも２回走査されるように間隔を設定され、望ましくはレーザスポットの寸法の半分より短い間隔とされ、；同時に
−ある閾値を越える検出信号であるサンプルだけを選択するようにして、少なくなくとも１種の波長で、結果として得られる蛍光を検出し、一つの走査ライン上の隣接する一連の試料はフィーチャーであり；
−隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上のフィーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーの組が出現する走査ラインの数をカウントし、各組の相関フィーチャーはイベントを形成し、あらゆる非相関フィーチャーである単一フィーチャーを除去することによって、個々のフィーチャーのライン間相関づけにより相関フィーチャーの組を認識し；
相関は、対比される前記２つのフィーチャー内の１以上のサンプルが前記ライン対上の同じ位置で検出されるときに存在するとされ、前記相関フィーチャーの組が出現するラインの数がカウントされ、その後サイズ識別に使用され、
−隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上の前記相関フィーチャーを少なくとも２つの異なる波長λ₁及びλ₂で同期して比較し、該２つの波長に於ける所定数未満の発光強度比を有する相関フィーチャーを選択し、相関する前記サンプルにより前記波長で発生した前記発光比が所定の値より大きいものである場合、前記イベント全体が排除されるようにし；
−維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択し；
− サイズ認識後に維持されるイベントに対して、該イベント内における前記サンプルの強度分布である３次元のイベントエネルギープロファイルが所定のガウス形状基準内にあるか否かを判断し、該ガウス形状基準にないイベントを排除し；
このような分析は例えば、ソフトウェアの曲線照合アルゴリズムによって行われ、前記基準内の全てのイベントは、最終カウント用の蛍光細胞として受け入れられ、前記基準外のものはノイズ、即ち、前記支持体上の埃又はその他の微粒子として分類されることとなり、
−前記固体支持体上に存在する蛍光細胞を決定しそれらのみをカウントするために残存する前記イベントをカウントすることを含む。
【００４１】
上記したように、２つの走査ライン（ライン間又はライン間隔ｙ）間の距離は、レーザスポットサイズの寸法の半分未満であり、このことにより走査面の重複が行われる。
【００４２】
より正確には本発明の前記特徴に関する好適な実施例に従えば、前記サイズの識別は：
−前記イベントの内の最初に現れる如何なるフィーチャーについても走査方向上で最初に現れるサンプルから出発し、如何なるフィーチャーが最後に終るかに拘わらず走査方向に最後に現れるサンプルを含むようにサンプル数を続けてカウントし、カウントでは異なる走査ライン上の総ての相関サンプルを１サンプルとみなし、
−同じイベントがカバーする隣接走査ラインの数をカウントすることによりそのイベントの幅を決定し、
−前記カウントされたサンプルの数が所定数Ａより大きく、且つ／又は前記カバーする隣接走査ラインの数が所定数Ｂより大きいイベントを除去することにより実行される。
【００４３】
好ましくは結果として得られる蛍光発光を検出する工程は、デジタル信号処理装置（ＤＳＰ）によって動的閾値を越える信号（＝サンプル）を測定することによって行われる。
【００４４】
前記ＤＳＰによれば（細胞に対応する）所望の信号と（電子ノイズ等の）不要な信号とを区別することが可能となる。
【００４５】
このような方法を用いることにより、偽ネガティブ及び偽ポジティブ結果の双方を予想以上に避けることが可能となる。
【００４６】
以下の表１は、偽ネガティブ又は偽ポジティブ結果となった考え得る原因と、これらの誤りを除去する本方法の関連工程とを概略的に示すものである。
【００４７】
【表１】

【００４８】
以下のことを明記しなければならない。即ち本発明の望ましい形態である本方法は、蛍光スポットのみを使用して実施され、走査レーザ装置に対する標識の蛍光反応を分析することにより蛍光標識化されたバクテリアを識別するものである。該分析方法は：
−１つの走査ライン（＝フィーチャー）上の試料数を評価し；
−ライン間相関を行い；
−上述したように“サイズ識別”を行い、細胞の正確な検出を行うために相関フィーチャーのナンバーを得ることからなる。
【００４９】
従って本分析技術は、検出すべき対称のサイズを以下の方法により利用する。即ち：
−あらゆる信号走査ライン上の蛍光反応が所定のノイズ閾値を越える程度に大きいものでなければならず；
−フィーチャーは、少なくとも２つの連続するライン走査上で所定の重なり度で検出されなければならないこと；
によってサイズを利用する。
【００５０】
これらの要件は、フィーチャーの形状及びサイズについて著しく多くの情報を必要とする画像形成システムと本発明方法とが顕著に異なることを意味する。
【００５１】
これらの要件に相当するものを画像形成システムで得るには、レーザスポットを検出される対象より小さいものとする必要があり、このことは小さなレーザスポットサイズを有するものとして設計させることとなる。本発明に於けるスポットサイズは、フィーチャーに対して大きいものとすることができ、現在のところフィーチャーサイズの１０倍のオーダーにある。このことはサンプリング速度、光学的正確性の要件及び処理能力（データ取り扱い速度及びメモリ仕様）の点で大きく貢献する。
【００５２】
意外にも本方法は：
−単一レベルの動的閾値化：データ処理システムが、連続的に背景ノイズレベルを監視し、フィーチャーが取り込まれるように重要とみなされる信号値を捉えるべく閾値を調節する。このことによりシステムは、スライドグラス（固体支持体）からスライドグラスへの取り替え時に発生する変動、また単一のスライドグラスの面積上の変動を許容することができる；
−信号のライン間相関付け：細胞として特定されるためには、フィーチャーは少なくとも２つの走査ライン上に存在しなければならない；
−フィーチャー識別用緑色蛍光スペクトル形の使用（赤／緑信号レベル）：該緑色帯域で検出されたフィーチャーは、緑色蛍光マーカー発光スペクトルの形状から予測されるように、対応する赤色帯域信号を少ししか、又は全く有していてはならない。赤色帯域反応がより高いレベルにあるとフィーチャーが否定される。
【００５３】
信号識別：信号は、受け入れることができるためには所定数分だけ走査ポイントに存在していなければならない。短い信号はノイズとして拒絶される。
【００５４】
−所定数以上のサンプル又は所定数以上のラインを含む（即ち、特定の走査ラインに沿う又は幾つかの走査ラインをまたぐ）相関フィーチャーが否定される。
【００５５】
本発明の他の特徴に於いて固体支持体上の細胞を蛍光によって検出及びカウントする装置が提供される。
【００５６】
前記装置は：
−寸法の検出及びカウントをされるべき種類のほ乳類細胞より固体支持体上で実質的に大きく１５μｍ及び３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザスポットとなるようにレーザービームを照準する手段と協働する、入射ビームを出射するためのレーザ光源と；
− 前記光源からの光を前記固体支持体上に導いて、スポット状に前記ほ乳類細胞を照射し蛍光スポットを形成し、２つの走査ライン間の距離は、前記支持体の各部分が隣接する走査路を部分的に重複させることにより少なくとも２回走査され、好ましくは前記レーザスポットの寸法より小さい走査手段と；
−少なくとも２つの異なる波長λ₁及びλ₂で前記発光する蛍光を検出して光電子的に変換するための手段と；
−デジタル信号処理装置及び少なくとも２つの発光蛍光波長を選択する複数の光学路を備える、非ほ乳類蛍光を識別・除去するための手段と；
− 隣接するラインからなる各ライン対上のフィーチャーを同期して比較し、該相関フィーチャーの組が出現するラインの数をカウントし、各組の相関フィーチャーはイベントを形成しており、一つのライン上だけに発生するあらゆる非相関フィーチャーを排除することにより個々のフィーチャーのライン間相関付けをおこない一連の相関づけられたフィーチャーを判別し；所定数未満の２つの波長λ₁及びλ₂に於ける発光強度比を有する相関フィーチャーを選択するために、少なくとも２つの異なる前記波長に於いて隣接するラインからなる各ライン対上の相関フィーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーによる前記波長での前記発光比があらかじめ定義された値より大きい場合、そのイベント全体が排除し；維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択し；サイズ認識後に維持されるイベントに対して、該イベント内におけるサンプルの強度分布である３次元のイベントエネルギープロファイルが所定のガウス形状基準内にあるか否かを判断し該ガウス形状基準にないイベントを排除し；前記残存イベントをカウントして前記固定支持体上に存在する蛍光ほ乳類細胞を決定しそれらのみをカウントする信号処理手段を備える。
【００５７】
前記装置によれば固体支持体前面が走査されることとなる。
【００５８】
前記装置の一つの特徴に従えば、前記走査手段が第１振動ミラーと第２ミラーとを備えたことを特徴とし、第１振動ミラーの振動軸はビームによりラインを走査するために光ビーム軸に対して直角となっており、第２ミラーの軸は、前記第１振動ミラーの振動軸に対して直角となっており、該第２ミラーは前記第１振動ミラーの走査動作に同期して走査動作を行う。
【００５９】
前記装置の他の特徴に従えば、前記検出装置は、少なくとも２つの光電子増倍管を光電子変換用手段として備える。
【００６０】
前記装置の他の特徴に従えば、前記レーザスポットは延きのばされた形状を有している。
【００６１】
前記装置の他の特徴に従えば、前記固体支持体はスライドグラスである。
【００６２】
前記装置の他の特徴に従えば、前記試料保持器は、ペルティエ効果を導く等の冷却手段と協働する。
【００６３】
さらにシリコン等の材料からなる薄膜を前記試料保持器とスライドグラスとの間に挟んでもよい。
【００６４】
前記薄膜は例えば、次のような利点を有する：自発蛍光発光が起こらず、励起波長に於いて反射が低く、洗浄が容易である。
【００６５】
以下の図は、本発明を実施する手段を説明するために使用することのできるものである。
【００６６】
【発明の実施の形態】
図３を参照するに、走査手段１０と、二色性フィルター２０を有し発光する蛍光を検出するための手段と、光学フィルター２１と、光電子増倍管（ＰＭＴ）３０と、信号処理システム４０〜４２と、デジタル信号処理装置４３と、計測器のコンピュータ５０と、ユーザーコンピュータ６０と、自動顕微鏡７０とを備えた本発明に係る装置が示されてる。
【００６７】
走査装置１０は、スライドグラス保持器８に取り付けられたスライドガラスに代表される固体支持体１１を走査するためにコヒーレント光を使用する。
【００６８】
好ましい実施形態に於いて走査装置１０の構成要素としては、４８８ナノメートルアルゴン−イオン水冷式レーザ１２と、走査ミラー１６と、走査レンズ１７と、安全装置としてのビームダンパ１８とが含まれ、前記走査装置は、レーザビームをレーザスポットに照準しビームエキスパンダを備える手段と協働し、該ビームエキスパンダ１３は、照射レーザスポットのサイズを１５〜３０μｍ、好ましくは２０μｍにまで制御し、照射スポットを前記走査ミラー１６に導く。
【００６９】
ビームエキスパンダ１３はレンズを２つ備えており、これらのレンズは、固体支持体上でレーザスポットが１５から３０μｍとなるよう、例えばレーザスポットが２０μｍ、第１レンズの焦点距離が９０ｍｍ、第２レンズの焦点距離が５０ｍｍ、そして２つのレンズ間の間隔が３６．５ｍｍとなるよう（焦点距離及び２つのレンズ間の距離が）調整されている。
【００７０】
前記２つの走査ミラーは、検出されるべき細胞を含む試料が載せられた固体支持体１１に照射レーザスポットを走査するために使用される。このレーザスポットは、例えば毎秒１メートルの速度でｘ方向に移動する。
【００７１】
前記走査ミラー１６（スキャナ１６）は、例えば、７μｍのライン間（ｙ）間隙（２つの走査ライン間の距離）の形成を可能にする。
【００７２】
前記走査手段がレーザスポット（走査レンズ１７）を確実に正確に位置決めするためには高い光学的精度が要求される。
【００７３】
１ｍ／ｓの速度で２０μｍのレーザスポットサイズを用いることで、２５ｍｍのフィルターを２分以内で走査することができる。
【００７４】
分析されるべき試料が載せられた（スライドグラス等の）固体支持体１１（又は試料支持器）は、取り外し可能な試料保持器に載置されており、該試料保持器は、試料支持体を研究所、或いは試料が収集されている場所から運び出すために、又は本装置にかける場合に使用されるものである。
【００７５】
この試料保持器は、スライドグラス等の矩形状試料保持器を好ましく取り扱うことができるよう設計されている。
【００７６】
装填引出し装置（図示せず）は、ユーザが容易に操作を及ぼしうるものとなっている。前記取り外し可能な試料保持器は、矩形状固体支持体を扱うことができるよう設計されており、装填引出し装置に載置されている。次に装填引出し装置は、計測装置内に押し込まれ、細胞が載せられた試料保持器はスキャナ１６の直下となる。試料保持器は、標識化された細胞の安定性を保護するために（ペルティエ効果等によって）冷却される。
【００７７】
前記試料装填引き出し装置は、装置内で試料保持器を誘導し自動的に該保持器を走査レンズから正しい距離に精度を保って運搬するための機構と協働する。該試料装填装置は、図面では表されていない。
【００７８】
スキャナ１６は、焦点を定められたレーザビームをターゲット１１に照射することにより、細胞又はあらゆる蛍光物質から蛍光を誘発する。
【００７９】
ＰＭＴ３０は、（５３０ナノメートルと６１５ナノメートルとに中心波長を有し、以下緑色及び赤色の帯域と称される）２つの波長で蛍光を検出する。
【００８０】
該蛍光は、信号処理システム４０によって更に分析に掛けられる。
【００８１】
ＰＭＴ信号は、スキャナ１６からの時間同期情報と共に、信号処理システム４０に送られる。
【００８２】
このシステム４０は、予備増幅器４１と、信号サンプリング装置４２と、デジタル信号処理装置４３とを備えている。
【００８３】
より正確にはＰＭＴ信号の各々は、専用の予備増幅器４１によって増幅される。増幅されたアナログ信号は、８ビット（２５６信号レベル）の分解度を使用して２ＭＨｚでデジタル値としてサンプリングされる。各ＰＭＴ周波数帯は、専用のサンプリング装置を有している。
【００８４】
サンプリングされたＰＭＴ信号は、デジタル信号処理装置（ＤＳＰ）４３に送られる。
【００８５】
そこでこれらの信号は分析され、結果として得られる出力情報は計測器コンピュータ５０を通過する。該コンピュータは走査装置を制御し、ＤＳＰシステム４３用のホストとして機能し、固体支持体を走査している間に於いてデータを蓄積し、走査結果をユーザのコンピュータ６０に送る。
【００８６】
前記ユーザのコンピュータ６０は、現在のところ分析ツールとしてソフトウェア「Ｍａｔｌｂ」（商標名）を用いて、走査の結果を処理し画像表示するために使用される。
【００８７】
本発明装置は、必要ならユーザのコンピュータ６０から自動顕微鏡を駆動することにより、固体支持体上のあらゆる対象物の直接観察を可能とする能力を備えたものとすることができる。
【００８８】
図４〜８は：
− 背景ノイズ（動的閾値、図５）
− 色彩の識別（図７）
− 非相関フィーチャー（図６）
− サイズ識別（図８）
に関し必要な否定をするための本発明方法の種々の工程を要約して示すものである。
【００８９】
設計パラメータの変化に伴う影響
以下の走査に関する物理的パラメータ：
図９に示されるように、レーザスポットサイズ（ｄ）、走査ラインサンプリング（ｘ）及びライン間隔（ｙ）は、本発明方法の検出能力に影響を与えるものである。これらのパラメータは：
ｄ：走査レーザスポットの寸法。スポットの強度分布はガウス分布であり、スポット寸法は、通常、レーザー強度が、ピーク値の１／ｅ²（約１３％）に落ちるところの大きさとして定義される。
【００９０】
ｘ：一つの走査ライン上の連続したデータサンプル間の距離。これは、サンプリング速度及び走査ミラーの速度によって制御される。
【００９１】
ｙ：連続する走査ライン間の距離。これは、走査ミラーを移動する際のステップサイズによって制御される。
【００９２】
これらのパラメータを変化させることによって生じる効果は、表２に於いて概略的に示されている。各パラメータ毎に最適の作動範囲が存在することが明らかである。この範囲の大きさは：
・偽ポジティブ又は偽ネガティブの結果を得る可能性を最小限にすること；
・実際上の工学的制限（構成要素の誤差、走査ミラーの位置精度等）；
・処理及びデータ分析装置のコスト（処理速度、データ蓄積メモリ）
からなる３つの実際上の制限要素によって決定される。
【００９３】
【表２】

【００９４】
これらのパラメータの役割は、図１及び１０においても示されている。
【００９５】
ターゲット１１は、図１に示されるようにして走査される。図１を参照するに、レーザスポット寸法及びＳＮＲの観点から走査時間を以下のように評価することができる：
− 走査される全面積は、Ｘ・Ｙである。
− 走査速度はｖである。
− 引き返し時間は無視することができる。
− スポットの直径は、ａ_x及びａ_yである。
【００９６】
− スキャンのＹ方向への進行度（スキャンライン間隔）はΔｙである。
全面積を走査するための時間は、１本のラインを走査する時間と走査ラインの数との積に等しい。
【００９７】
走査ライン１本当たりの時間＝Ｘ／ｖ
走査ラインの数＝Ｙ／Δｙ
ｙ＝ａ_y／ｎである。ここでｎは、各スポットが走査される回数である。
【００９８】
こうして走査時間は下記の式で与えられる：
走査時間＝（Ｘ・Ｙｎ）／（ｖ・ａ_y）
もし全てが等しければ、走査を完了する時間は走査された面積及び各要素が走査される回数に比例している。そして走査時間は、走査速度及びスポットのｙ方向の寸法に反比例している。
【００９９】
しかしこれらの全てが等しいわけではなく、またスポットのサイズ又は速度の何れかを単に増加させるということによって走査時間が短縮される場合、信号対ノイズ比の点は妥協せざるを得ない。
【０１００】
信号の程度は照射強度（ワット／平方センチメートル）及び各スポットが照射される時間に比例する。ノイズは照射された面積の平方根に比例し、走査速度に反比例する。こうして以下を考察する：
−目標の細胞は、照射スポットよりも小さい；
−総レーザー出力は一定（Ｉo ）であり、照射スポットに照射される；
−上述のように走査は重複して行われる。ここでｎは、各スポットが走査される回数を意味する。
【０１０１】
信号対ノイズは、以下のように良く知られた量で表現することができる：
Ｓ／Ｎ＝〔Ｉo／（ａ_x・ａ_y）〕・〔ｎ／（ａ_y・ｖ）〕^1/2。
【０１０２】
これにより、走査速度又はレーザースポットの寸法のいずれかが増加する時に、検出信号対ノイズがどのようにして減少するかが明瞭に分かる。しかしこの方程式は、隣接する走査ライン（図１参照）の相関付けによって得られる信号対ノイズの再生については考慮していない。
【０１０３】
図１０は、２種類の条件下に於いての上記で展開された２つの式の結果の比較を示している。各場合において初期条件は、レーザスポットが直径ａの円形であるとされた。この条件に於いてはＳＮＲが１００％であって、走査時間も１００％であった。
【０１０４】
条件１：スポットの円形状態を維持しつつ走査が重複しないようにして一定の割合でレーザースポットの寸法を増加する。
ｎ＝１、及びａ_x＝ａ_y
条件２：スポット面積を一定となるようスポットのｙ方向の寸法を増加させスポットのｘ方向の寸法を減少させてスポットを引き延ばし、各スポットが２度走査されるように重複させる：
ｎ＝２、及びａ_x＝１／ａ_y
実験例１：ワクシニアウイルスに感染したヒトの細胞（ヒーラー細胞）の検出
細胞（１０⁵ｍｌ）をスライド上で増殖させ、２・１０^-1ｐｆｕ／ｍｌの天然型ワクシニアウイルスで処置した。感染させて６時間を経た後、細胞をＦＩＴＣで標識化されたワクシニアモノクローナル抗体で２０分間インキュベーションし、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。処理懸濁液を２０μｌ（２・１０³個の細胞）をスライドとカバースリップとの間に載せ、本発明を使用してカウントした。装置設定パラメータ、基本的検出結果及び識別工程後の最終結果を表３に示した。検出された細胞は顕微鏡を使用してポジティブと確認された。
【０１０５】
実験例２：マウス形質転換細胞の検出
Ｐ−８１５細胞から構築され、βガラクトシド蛋白質を構成的に発現する数個のＰ１３−１細胞を非トランスフェクトされた細胞の懸濁液に添加し、結果として得られた懸濁液をフルオレセインジガラクトシドを使用して３７゜Ｃで５分間標識化した。標識化の後、３０μｌをスライドとスライドとカバースリップとの間に載せ、本発明を使用してカウントした。装置設定パラメータ、基本的検出結果及び識別工程最終結果を図３に示す。
【０１０６】
【表３】

【０１０７】
上記表３において“ 比率”は、緑色帯域における蛍光強度から分離された（即ち、緑色帯域に於ける蛍光強度として検出されない）赤色帯域の蛍光強度を意味し、“●●”で示されたコラムは、本明細書内で定義されたイベントの総数と非相関フィーチャー（シングルフィーチャーとも呼ばれる）の数を実際上含んでいることが指摘されねばならない。
【０１０８】
フィーチャーとイベントが、赤色帯域でのみ発見される場合及びその逆の場合、及び個の表には示されていない他の基準の適用後にガウス分布による識別インパクトを行って発見される場合もある。
【図面の簡単な説明】
【図１】走査パターンを重ね合わせた状態を示し、ビーム形状、走査パターン、方向及び相対寸法が示されている説明図である。
【図２】イベントの定義及び寸法を示す説明図である。
【図３】レーザ装置、光学系、走査ミラー、試料保持具、検出装置、及び検出後の処理用電子機器のためのブラックボックスを示す装置のブロック図である。
【図４】トップレベルの制御アルゴリズムを示すフローチャートである。
【図５】フィーチャー検出を示すフローチャートである。
【図６】ライン相関づけを示すフローチャートである。
【図７】色彩比の識別を示すフローチャートである。
【図８】イベントのサイズ識別を示すフローチャートである。
【図９】主走査パラメーターであるｄ，ｘ，ｙ，を示す説明図である。
【図１０】レーザスポットが円形（ケース１）又は細長型（ケース２）である場合の信号対ノイズの低減についての比較を示すグラフである。
【符号の説明】
１０走査手段
１１固体支持体
１２レーザ装置
１３ビームエクスパンダ
１６走査ミラー
１７走査レンズ
１８ビームダンパ
２０二色性フィルター
２１光学フィルター
３０光電子増倍管（PMT）
４２デジタル信号処理装置（DSP）
５０計測器のコンピュータ
６０ユーザーのコンピュータ

Claims

稀少出現ほ乳類細胞を検出しカウントするための方法であって：
―検出されるべき細胞より実質的に大きく１５μｍ及び３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザースポットを固体支持体上に形成するようにして、レーザー装置からの入射レーザービームを用いて蛍光細胞を含む可能性を有する試料を載置した固体支持体を走査し、二つの走査ラインは、前記固体支持体の各部分が、隣接する走査路を部分的に重複させることにより少なくとも２回走査されるように間隔を設定されており；同時に
―ある閾値を越える検出信号であるサンプルだけを選択するようにして、少なくとも１種の波長で、結果として得られる蛍光を検出し、一つの走査ライン上の隣接する一連の試料はフィーチャーであり；
−隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上のフィーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーの組が出現する走査ラインの数をカウントし、各組の相関フィーチャーはイベントを形成し、あらゆる非相関フィーチャーである単一フィーチャーを除去することによって、個々のフィーチャーのライン間相関づけにより相関フィーチャーの組を認識し；
−隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上の前記相関フィーチャーを少なくとも２つの異なる波長λ１及びλ２で同期して比較し、該２つの波長に於ける所定数未満の発光強度比を有する相関フィーチャーを選択し、相関する前記サンプルにより前記波長で発生した前記発光比が所定の値より大きいものである場合、前記イベント全体が排除されるようにし；
−維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択し；
−サイズ認識後に維持されるイベントに対して、該イベント内における前記サンプルの強度分布である３次元のイベントエネルギープロファイルが所定のガウス形状基準内にあるか否かを判断し、該ガウス形状基準内にないイベントを排除し；
―前記固体支持体上に存在する蛍光細胞を決定しそれらのみをカウントするために残存する前記イベントをカウントすることを含む方法。
前記サイズの識別は：
−前記イベントの内の最初に現れる如何なるフィーチャーについても走査方向上で最初に現れるサンプルから出発し、如何なるフィーチャーが最後に終るかに拘わらず走査方向に最後に現れるサンプルを含むようにサンプル数を続けてカウントし、カウントでは異なる走査ライン上の総ての相関サンプルを１サンプルとみなし、
−同じイベントがカバーする隣接走査ラインの数をカウントすることによりそのイベントの幅を決定し、
−前記カウントされたサンプルの数が所定数Ａより大きく、且つ／又は前記カバーする隣接走査ラインの数が所定数Ｂより大きいイベントを除去することにより実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
稀少出現ほ乳類細胞の検出しカウントするための方法であって：
−検出されるべき稀少出現ほ乳類細胞を含む分析されるべき試料を固体支持体上に広げて薄膜状態にし；
−前記固体支持体に適当な試薬を塗布して、モノクローナル抗体法、インサイチューハイブリダイゼーション法、インサイチューＰＣＲ法、酸素結合ブローブ法等の、選択された波長で蛍光を発光するように励起された場合に可能な技術を使用して検索された細胞を蛍光標識化し、これらの技術は、一以上の波長で蛍光を発生させて識別手段又は特定のタイプの稀少出現ほ乳類細胞だけを識別するか又は選択するための手段とするために、個別的に又は同時に一つの試料に使用されており；
−検出されるべき細胞より実質的に大きく１５μｍ及び３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザースポットを固体支持体上に形成するようにして、レーザー装置からの入射レーザービームを用いて蛍光細胞を含む可能性を有する試料を載置した固体支持体を走査し、二つの走査ラインは、前記固体支持体の各部分が、隣接する走査路を部分的に重複させることにより少なくとも２回走査されるように間隔を設定されており；同時に
−ある閾値を越える検出信号であるサンプルだけを選択するようにして、少なくとも１種の波長で、結果として得られる蛍光を検出し、一つの走査ライン上の隣接する一連の試料はフィーチャーであり；
−隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上のフィーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーの組が出現する走査ラインの数をカウントし、各組の相関フィーチャーはイベントを形成し、あらゆる非相関フィーチャーである単一フィーチャーを除去することによって、個々のフィーチャーのライン間相関づけにより相関フィーチャーの組を認識し；
−隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上の前記相関フィーチャーを少なくとも２つの異なる波長λ１及びλ２で同期して比較し、該２つの波長に於ける所定数未満の発光強度比を有する相関フィーチャーを選択し、相関する前記サンプルにより前記波長で発生した前記発光比が所定の値より大きいものである場合、前記イベント全体が排除されるようにし；
−維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択し；
−サイズ認識後に維持されるイベントに対して、該イベント内における前記サンプルの強度分布である３次元のイベントエネルギープロファイルが所定のガウス形状基準内にあるか否かを判断し、該ガウス形状基準にないイベントを排除し；
―前記固体支持体上に存在する蛍光細胞を決定しそれらのみをカウントするために残存する前記イベントをカウントすることを含む方法。
前記サイズの識別は：
―前記イベントの内の最初に現れる如何なるフィーチャーについても走査方向上で最初に現れるサンプルから出発し、如何なるフィーチャーが最後に終るかに拘わらず走査方向に最後に現れるサンプルを含むようにサンプル数を続けてカウントし、カウントでは異なる走査ライン上の総ての相関サンプルを１サンプルとみなし、
―同じイベントがカバーする隣接走査ラインの数をカウントすることによりそのイベントの幅を決定し、
―前記カウントされたサンプルの数が所定数Ａより大きく、且つ／又は前記カバーする隣接走査ラインの数が所定数Ｂより大きいイベントを除去することにより実行されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
蛍光によって細胞を検出及びカウントするための装置であって：
―寸法の検出及びカウントをされるべき種類のほ乳類細胞より固体支持体上で実質的に大きく１５μｍ及び３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザースポットとなるようにレーザービームを照準する手段と協働する、入射ビームを出射するためのレーザー光源と；
―前記光源からの光を前記固体支持体上に導いて、スポット状に前記ほ乳類細胞を照射し蛍光スポットを形成し、２つの走査ライン間の距離が、前記支持体の各部分が隣接する走査路を部分的に重複させることにより少なくとも２回走査され、好ましくは前記レーザースポットの寸法より小さい走査手段と；
―少なくとも２つの異なる波長λ１及びλ２で前記発光する蛍光を検出して光電子的に変換するための手段と；
―デジタル信号処理装置及び少なくとも２つの発光蛍光波長を選択する複数の光学路を備える、非ほ乳類蛍光を識別・除去するための手段と；
―隣接するラインからなる各ライン対上のフィーチャーを同期して比較し、該相関フィーチャーの組が出現するラインの数をカウントし、各組の相関フィーチャーはイベントを形成しており、一つのライン上だけに発生するあらゆる非相関フィーチャーを排除することにより個々のフィーチャーのライン間相関付けをおこない一連の相関づけられたフィーチャーを判別し；所定数未満の２つの波長λ１及びλ２に於ける発光強度比を有する相関フィーチャーを選択するために、少なくとも２つの異なる前記波長に於いて隣接するラインからなる各ライン対上の相関フィーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーによる前記波長での前記発光比があらかじめ定義された値より大きい場合、そのイベント全体が排除し；維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択し；サイズ認識後に維持されるイベントに対して、該イベント内における前記サンプルの強度分布である３次元のイベントエネルギープロファイルが所定のガウス形状基準内にあるか否かを判断し該ガウス形状基準にないイベントを排除し；前記残存イベントをカウントして前記固定支持体上に存在する蛍光ほ乳細胞を決定しそれらのみをカウントする信号処理手段とを；備えたことを特徴とする装置。
前記走査手段が第１振動ミラーと第２ミラーとを備えたことを特徴とし、第１振動ミラーの振動軸はビームによりラインを走査するために光ビーム軸に対して直角となっており、第２ミラーの軸は、前記第１振動ミラーの振動軸に対して直角となっており、該第２ミラーは前記第１振動ミラーの走査動作に同期して走査動作を行う請求項５に記載の装置。
前記検出手段は、少なくとも２つの光電子増倍管を光電子交換手段として備えていることを特徴とする請求項５に記載の装置。
前記レーザースポットは引き延ばされた形状を有することを特徴とする請求項５に記載の装置。
前記固体支持体はスライドグラスであることを特徴とする請求項５に記載の装置。
前記固体支持体は試料保持器に載せられ、該試料保持器は、冷却手段と、選択的に該試料保持器と前記固体支持体との間に挟まれたシリコン材料性の薄膜と協働することを特徴とする請求項５に記載の装置。