JPH08304288A - 稀少出現ほ乳類細胞を検出しカウントするための装置及び方法 - Google Patents

稀少出現ほ乳類細胞を検出しカウントするための装置及び方法

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JPH08304288A
JPH08304288A JP7323745A JP32374595A JPH08304288A JP H08304288 A JPH08304288 A JP H08304288A JP 7323745 A JP7323745 A JP 7323745A JP 32374595 A JP32374595 A JP 32374595A JP H08304288 A JPH08304288 A JP H08304288A
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle

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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 蛍光色素で標識化された血液及び他の組織内
の稀少出現ほ乳類細胞を迅速に検出しカウントできる装
置及び方法の提供。 【解決手段】 検出細胞より実質的に大きく１５〜３０
μｍのサイズを有するレーザースポットを固体支持体上
に形成するようにして、レーザ装置からの入射レーザビ
ームを用いて蛍光細胞を含む可能性を有する試料を載置
した固体支持体を走査し；同時に少なくなくともある波
長で蛍光を検出し；個々のフィーチャーのライン間相関
づけにより相関フィーチャーの組を認識し；各隣接走査
ライン対上の前記相関フィーチャーを少なくとも異なる
波長λ1，λ2で同期、比較し；維持されるイベントのサ
イズ認識を行い、検索された細胞の種類に対応するサイ
ズを有するイベントを選択し；サイズ認識後に維持され
るイベントに対して、３次元のイベントエネルギープロ
ファイルが所定のガウス形状基準内にあるかを判断す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光色素によって
標識を付けた血液及びその他の組織内で稀少出現するほ
乳類細胞の高速検出及びカウントを行うことのできる装
置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛍光色素で標識を付けた少量の分子又は
細胞を自動的に検出することは、良く知られた技術であ
り、且つしばしば実施される診断方法の一つである。伝
統的な検出及び定量化法は以下の一般的な３つの態様の
一つに従う： ＊第１の態様（“溶解化学（solution chemistry）”）
に於いては、分子がそれを担持していた細胞から解放さ
れた後検出される。結果として得られる蛍光強度は分子
濃度に関係している。
【０００３】＊第２の態様（フローサイトメトリー）に
於いては、無傷の細胞を蛍光色素で標識化した後、蛍光
を検知する検出ステーションを通す。この時標識化され
た細胞は、総細胞の一部としてカウントされる。
【０００４】第３の態様（画像分析法）に於いては、標
識化された組織を固体性基盤に載置した状態で自動顕微
鏡に掛け、該顕微鏡によって形成された画像の分析を通
じて細胞を検出しカウントする。典型的に該画像は、蛍
光分子を励起させるために小サイズのスポットで走査さ
れる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】これらの形態の各々に
於いては感度の点に著しい限界があり、このことは稀少
イベント（event）の検出に応用する場合に影響を与え
ている。この限界の存在により、分子診断学の現代技術
に対して応用することは実際上特に厳しいものとなるで
あろう。
【０００６】生物学或いは解剖病理学（anatomopatholo
gical）の研究に於いて、また日常的な診断分析に於い
て多数の通常細胞の中から少数の異常細胞を検出するこ
との必要性がますます高まっている。このような異常細
胞の試料は、腫瘍細胞かウイルスに感染した細胞のいず
れかである。こういった異常細胞は、蛍光標識により識
別することができるが、標識は特定の蛋白質などの細胞
の一要素をアドレス化し、或いはインサイチューハイブ
リダイゼーション又はインサイチューＰＣＲ等の技術を
通じて遺伝子をアドレス化するものである。
【０００７】多くの医療分野に於いて、多数の試料につ
いて極少数の異常細胞を正確に且つ迅速に検出できれば
非常に有益である。例えばバイオプシーに於いて２・３
の腫瘍細胞を早期に検出できれば腫瘍細胞の転移を阻止
できるし、癌腫瘍の拡大を防止することができるのであ
る。
【０００８】他の例としては、（ＨＩＶ等の）侵攻ウイ
ルスに侵入された細胞数の早期検出・監視に関する。早
期検出ができれば他の人が感染することを防止できる
し、また緻密な監視を行うことは疾病の治療にとり非常
に有益である。
【０００９】この種の適用を行なうには、検出の感度を
非常に高いものとしなければならない。というのも１０
5を越える他の細胞の中から一個の異常細胞のみを検出
できることが重要なことだからである。
【００１０】ある観点から、満足することができる程度
に有効な情報を得るためには、約１００個の異常細胞を
カウントすることが望ましい。このことは１０7個の他
の総ての細胞を検査したことを意味する。
【００１１】固体支持体上に広げられた試料を顕微鏡を
使用して視認検査することは、単調な作業であり、非常
に時間がかかる。そして他にも蛍光物質が存在する場合
には作業は複雑なものとなる。顕微鏡で異常細胞を検索
する場合、広い領域を観察する必要があり、たった一つ
の異常細胞を見逃してしまう危険が高い。
【００１２】共焦点顕微鏡又は画像分析装置を使用する
ことにより、異常細胞（稀少イベント）を検出すること
が可能となる。しかし実用上走査は非常にのろく、分析
できる面積も小さい。
【００１３】尤も上記例で発生する稀少細胞をフローサ
イトメトリー若しくは画像分析法により検出する場合の
主な技術的課題は、ノイズに対する検出信号の比、より
具体的には偽信号が検出される可能性を考察することに
より理解される。良く知られるところだが、偽信号の発
生可能性は、検出器が稀少イベントを探知するのに必要
とされる時間の量と共に直線的に増加する。従って、偽
信号と真信号とを区別することのできる能力を維持する
ためには、必要とされるノイズに対する信号の比（Ｓ／
Ｎ比）は、真信号の発生可能性が減少するに伴い増加し
なければならない。或いは、ノイズに対する信号比の中
には発生頻度の点で限界があるものがあり、これ以下の
頻度ではイベントを信頼して検出することはできない。
【００１４】上記限界を克服する一つの方法があるが、
これは第３の分析（画像分析）に対してのみ適用可能な
ものである。この態様に於いて、細胞は、固体支持体に
固定されているので、２回目の分析工程に於いて標本を
再度分析し偽信号と区別できる。こうして、自動顕微鏡
の稀少イベント検出能力を改善するための公知の方法の
一つに、まず標本を粗分析し、次いで第２の段階として
疑われるポジティブ信号をより詳しく調べることとする
ものがある。しかしこの技術は、分析速度の点でやはり
限界がある。この限界は検出可能性が最初の粗走査で特
定されなければならないことに基づく。このように蛍光
検出法に於いては、照射スポットのサイズは十分な強度
を達成できるよう小サイズのものである必要があり、第
１段階で稀少イベントをポジティブと認識（検出対象で
あると認識）できる程度に走査は遅いものでなければな
らない。
【００１５】この問題をよりよく理解するためには、電
子画像形成システムに於いて得られる画像が個々の画素
（ピクセル）により構成されていることを認識すること
が有用である。電子画像形成技術の現況に於いては、最
も優秀なビデオカメラでさえ１００，０００個若しくは
百万個のピクセルからなる画像を形成できるに過ぎな
い。しかし一細胞当たりの直径は１０μｍのオーダーで
あることが典型的であるが、観察すべき固体支持体の表
面は５ｃｍ2のオーダーとなっている。従って１ピクセ
ルを１細胞の大きさとするならば、支持体の全てをカバ
ーするには約３，０００万個のピクセルが必要となる。
【００１６】その結果、１個の画素（ピクセル）は１個
の細胞の寸法よりもかなり大きいものとならざるを得
ず、また分析は多くの連続画像を使用することが必要と
なる。しかしこれらのアプローチのいずれもが満足のい
くものではない。最初のケースの場合には検出感度が低
く、また後者の場合には分析に要する時間と分析の複雑
さが制限要因となる。
【００１７】その結果実用の場面に於いては、この技術
によっては固体支持体に広げられた試料の一部しか分析
されず、研究目的に対しては受け入れられるが、厳格性
の要求される医療分野に於いては偽ネガティブの結果
（検出対象が存在しないとの誤った検出結果）をもたら
す可能性があり、日常のインビトロ診断実験に於いて許
容することはできない。
【００１８】この技術に対する他の制限要素としては、
データ処理の点にある。スキャンを２回行なう場合に於
いては、２回目の分析を完了して初めてポジティブイベ
ントが確認されるので、データ処理装置は１回目の分析
記録を完全な状態で保持していなければならない。稀少
イベントの検出に於いては、ポジティブ因子の発生頻度
は高いので、１００万の以上のネガティブ因子のデータ
を各ポジティブイベント毎に記憶する必要がある。
【００１９】さらに検索された細胞の標識は脆弱なもの
であるので、時間と共に素早く低減していくものである
から、結果的に２回目の走査が誤った偽否定結果へと導
かれることとなろう。
【００２０】最後にこれらの技術は、検索された蛍光細
胞と、試料上に存在し自己蛍光性を有するか又は色素を
吸収することによって蛍光化した種々の微粒子とを、自
動的に区別するための適切な手段の開発には簡単につな
がるものではない。確かに検出するべき異常細胞の大き
さ及び形状は、実質的に多義に亘っているので、標準に
対する比較はきわめて問題のあるものとなっている。
【００２１】
【課題を解決するための手段】本発明は、支持体をレー
ザ走査することにより該支持体上の蛍光化された稀少ほ
乳類細胞を迅速且つ正確に検出し、カウントすることが
できる装置及び方法に関する。上述した限界点は、検出
されるべき細胞より大きい走査スポット、好ましくは細
長い走査スポットを少なくとも１つ用い、重複走査パタ
ーンで走査することにより解消される。
【００２２】さらに、このユニークな装置を使用するこ
とにより、比較的大きい固体支持体（典型的には２、３
平方センチメートル）の高速走査が行うことができるの
で、検出するべき稀少ほ乳類細胞は実質上漏れなく検出
され、偽信号を実時間で拒絶することができる。識別工
程（識別装置）により、検索された細胞が発生する蛍光
信号と、自発蛍光微粒子又は蛍光化されてしまった他の
材料との分離を確実に自動且つ迅速に行うことができ
る。
【００２３】本発明を理解するためには、目標に対する
Ｎ回の独立した走査当たりに検出される可能性は１回の
走査当たりに検出される可能性のＮ倍の平方根に比例す
ることを認識しておくことが有用である。そして１回の
走査で検出される可能性は、走査の速度に反比例する。
このように、大略的に言って、倍速で同じ領域を２回走
査することは、検出の可能性の点に於いて一度だけ走査
して検出される可能性にほぼ等しく、走査時間の純利得
は実現されない。しかし、もし同期させた状態で２本の
走査を行えば、もはやそれは独立した走査ではなく、
（該２本の走査の間に於いて相関関係のある）一つの信
号イベントが（相関関係のない）ノイズイベント対して
優位に取り扱われる。こうして検出の可能性を増加させ
走査時間を短縮することが可能となるのである。
【００２４】本発明に於いては、例えば面積の大きいレ
ーザスポット（図１参照）により走査を行い、また走査
を重複させて、領域の各部分が少なくとも２回走査され
ることなるようにすることで走査速度の増加を図ってい
る。そして走査対のＸ方向への走査の結果が、検出可能
性を維持するために非相関信号を除去することにより同
期して比較される。このように各ポジティブイベント
は、（蛍光対称の大きさに依拠して）２以上の走査ライ
ン間により相関づけられる。
【００２５】定 義 レーザスポットが（スライドグラス等の）固体支持体上
の走査ラインに沿って移動する時に、発生する蛍光（存
在する場合）を１以上の検出器が（種々の波長で）連続
的に測定する。検出器からのアナログ信号は、一定の周
波数間隔で採取されることによりデジタル化される。
【００２６】「読みとり」 読みとりは測定時の信号値である。
【００２７】「サンプル」 サンプルは、ある特定の動的閾値を越える検出器からの
信号の読みとりとして定義或いはされる。
【００２８】「フィーチャー」 １走査ライン上の隣接する一連の試料は、フィーチャー
と呼ばれる。
【００２９】ライン間相関づけ：２つの試料は、隣接す
る２つの走査ライン上で同期して現れる場合に相関して
いるとされる。
【００３０】「単一フィーチャー」 一つの走査ライン上にのみ現れるフィーチャー、即ち相
関づけられないフィーチャーを、単一フィーチャーと呼
ぶ。
【００３１】「蛍光スポット」 レーザビームによって励起された蛍光微粒子が発生する
蛍光発光。該微粒子は細胞であることもあるし、埃等の
他の物質であることもある。
【００３２】これらの微粒子は、自発的な蛍光性を有す
るものであることもあるし、検出のために蛍光化された
もの（例えば細胞など）である場合もある。
【００３３】「イベント」 イベントとは隣接する走査ライン上で同期して相関づけ
られた少なくとも２つの一組のフィーチャー をいう。
１つのイベントは、測定工程に於ける蛍光スポットの翻
訳されたものである。
【００３４】その後イベントは識別器によってポジティ
ブイベント（即ち細胞等のイベントが検索された場合）
又はノイズイベント（即ち、自発蛍光性微粒子等により
発生した蛍光であり拒絶されるべきイベント）として分
類される。ノイズイベントは、最終のカウントに含まれ
る場合には、偽ポジティブの結果を出してしまう。
【００３５】「レーザスポット」 レーザビームによって支持体上で形成された光スポット
のことをいう。
【００３６】「ライン間又はライン間隔Ｙ」 ２つの走査ライン間の距離を指す。
【００３７】上記定義は、図２に於いて示されており、
ここではサンプルは○によって表されている。またイベ
ント（一連の相関フィーチャー）の長さは、走査ライン
上で走査方向の最も初期に現れるフィーチャーの出発時
から走査ラインで最も遅く表れるフィーチャーの終部ま
での蓄積されたサンプル数に対応している。前記カウン
トは、異なる走査ラインに跨って相関を示す全てのサン
プルを１サンプルとして扱い、１つのイベントの幅は同
じイベントが出現する隣接ラインの数によって定義され
る。
【００３８】本発明の１つの特徴に於いては、スライド
グラス等の固体支持体上の蛍光標識化細胞をカウントす
るための方法が提供され、該方法は： −検出されるべき細胞より実質的に大きく１５μｍ及び
３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザースポッ
トを固体支持体上に形成するようにして、レーザ装置か
らの入射レーザビームを用いて蛍光細胞を含む可能性を
有する試料を載置した固体支持体を走査し（ここで二つ
の走査ラインは、前記固体支持体の各部分（element）
が、隣接する走査路を部分的に重複させることにより少
なくとも２回走査されるように間隔を設定され、望まし
くはレーザスポットの寸法（径）の半分より短い間隔と
される）；同時に −ある閾値（例えば動的（dynamic）閾値）を越える検
出信号（＝サンプル）だけを選択するようにして、少な
くなくとも１種の波長で、結果として得られる蛍光を検
出し（ここで一つの走査ライン上の隣接する一連の試料
はフィーチャーである）； −隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上のフィ
ーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーの組が出
現する走査ラインの数をカウントし（各組の相関フィー
チャーはイベント（event）を形成する）、あらゆる非
相関フィーチャー（＝単一フィーチャー）を除去するこ
とによって、個々のフィーチャーのライン間相関づけに
より相関フィーチャーの組を認識し；（相関は、対比さ
れる前記２つのフィーチャー内の１以上のサンプルが前
記ライン対上の同じ位置で検出されるときに存在すると
される。前記相関フィーチャーの組が出現するラインの
数がカウントされ、その後サイズ識別に使用される） −隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上の前記
相関フィーチャーを少なくとも２つの異なる波長λ1及
びλ2で同期して比較し、該２つの波長に於ける所定数
未満の発光強度比を有する相関フィーチャーを選択し、
前記相関サンプルにより前記波長で発生した前記発光比
が所定の値より大きいものである場合、前記イベント全
体が排除されるようにし； −維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された
細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択
し； −サイズ認識後に維持されるイベントに対して、３次元
のイベントエネルギープロファイル（the events energ
y profile）が所定のガウス形状基準内にあるか否かを
判断し、該ガウス形状基準にないイベントを排除し；
（このような分析は例えば、ソフトウェアの曲線照合ア
ルゴリズムによって行われる。前記基準内の全てのイベ
ントは、最終カウント用の蛍光細胞として受け入れら
れ、前記基準外のものはノイズ（即ち、前記支持体上の
埃又はその他の微粒子）として分類されることとなる） −前記固体支持体上に存在する蛍光細胞を決定しそれら
のみをカウントするために前記残存イベントをカウント
することを含む。
【００３９】より正確には本発明の前記特徴の好適な実
施例に従えば、前記サイズの識別は： −前記イベントの内の最初に現れる如何なるフィーチャ
ーについても走査方向上で最初に現れるサンプルから出
発し、如何なるフィーチャーが最後に終るかに拘わらず
走査方向に最後に現れるサンプルを含むようにサンプル
数を続けてカウントし（このカウントでは異なる走査ラ
イン上の総ての相関サンプルを１サンプルとみなす）、 −同じイベントがカバーする隣接ラインの数をカウント
することによりそのイベントの幅を決定し、 −前記カウントされたサンプルの数が所定数Ａより大き
く、且つ／又は前記カバーする隣接走査ラインの数が所
定数Ｂより大きいイベントを除去することにより実行さ
れる。
【００４０】本発明の他の特徴に於いては本方法は： −検出されるべき稀有ほ乳類細胞を含む分析されるべき
試料を固体支持体上に広げて薄膜状態にし； −前記固体支持体に適当な試薬を塗布して、モノクロー
ナル抗体法、インサイチューハイブリダイゼーション
法、インサイチューＰＣＲ法、酵素結合プローブ法等
の、選択された波長で蛍光を発光するよう励起された場
合に可能な技術を使用して検索された細胞を蛍光標識化
し（これらの技術は、一以上の波長で蛍光を発生させて
識別手段又は特定のタイプの稀有細胞だけを識別するか
又は選択するための手段とするために、個別的に又は同
時に一つの試料に使用される）； −検出されるべき細胞より実質的に大きく１５μｍ及び
３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザースポッ
トを固体支持体上に形成するようにして、レーザ装置か
らの入射レーザビームを用いて蛍光細胞を含む可能性を
有する試料を載置した固体支持体を走査し（ここで二つ
の走査ラインは、前記固体支持体の各部分（element）
が、隣接する走査路を部分的に重複させることにより少
なくとも２回走査されるように間隔を設定され、望まし
くはレーザスポットの寸法（径）の半分より短い間隔と
される）；同時に −ある閾値（例えば動的（dynamic）閾値）を越える検
出信号（＝サンプル）だけを選択するようにして、少な
くなくとも１種の波長で、結果として得られる蛍光を検
出し（ここで一つの走査ライン上の隣接する一連の試料
はフィーチャーである）； −隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上のフィ
ーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーの組が出
現する走査ラインの数をカウントし（各組の相関フィー
チャーはイベント（event）を形成する）、あらゆる非
相関フィーチャー（＝単一フィーチャー）を除去するこ
とによって、個々のフィーチャーのライン間相関づけに
より相関フィーチャーの組を認識し；（相関は、対比さ
れる前記２つのフィーチャー内の１以上のサンプルが前
記ライン対上の同じ位置で検出されるときに存在すると
される。前記相関フィーチャーの組が出現するラインの
数がカウントされ、その後サイズ識別に使用される） −隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上の前記
相関フィーチャーを少なくとも２つの異なる波長λ1及
びλ2で同期して比較し、該２つの波長に於ける所定数
未満の発光強度比を有する相関フィーチャーを選択し、
前記相関サンプルにより前記波長で発生した前記発光比
が所定の値より大きいものである場合、前記イベント全
体が排除されるようにし； −維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された
細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択
し； −サイズ認識後に維持されるイベントに対して、３次元
のイベントエネルギープロファイル（the events energ
y profile）が所定のガウス形状基準内にあるか否かを
判断し、該ガウス形状基準にないイベントを排除し；
（このような分析は例えば、ソフトウェアの曲線照合ア
ルゴリズムによって行われる。前記基準内の全てのイベ
ントは、最終カウント用の蛍光細胞として受け入れら
れ、前記基準外のものはノイズ（即ち、前記支持体上の
埃又はその他の微粒子）として分類されることとなる） −前記固体支持体上に存在する蛍光細胞を決定しそれら
のみをカウントするために前記残存イベントをカウント
することを含む。
【００４１】上記したように、２つの走査ライン（ライ
ン間又はライン間隔ｙ）間の距離は、レーザスポットサ
イズの寸法の半分未満であり、このことにより走査面の
重複が行われる。
【００４２】より正確には本発明の前記特徴に関する好
適な実施例に従えば、前記サイズ識別は： −前記イベントの内の最初に現れる如何なるフィーチャ
ーについても走査方向上で最初に現れるサンプルから出
発し、如何なるフィーチャーが最後に終るかに拘わらず
走査方向に最後に現れるサンプルを含むようにサンプル
数を続けてカウントし（このカウントでは異なる走査ラ
イン上の総ての相関サンプルを１サンプルとみなす）、 −同じイベントがカバーする隣接ラインの数をカウント
することによりそのイベントの幅を決定し、 −前記カウントされたサンプルの数が所定数Ａより大き
く、且つ／又は前記カバーする隣接走査ラインの数が所
定数Ｂより大きいイベントを除去することにより実行さ
れる。
【００４３】好ましくは結果として得られる蛍光発光を
検出する工程は、デジタル信号処理装置（ＤＳＰ）によ
って動的閾値を越える信号（＝サンプル）を測定するこ
とによって行われる。
【００４４】前記ＤＳＰによれば（細胞に対応する）所
望の信号と（電子ノイズ等の）不要な信号とを区別する
ことが可能となる。
【００４５】このような方法を用いることにより、偽ネ
ガティブ及び偽ポジティブ結果の双方を予想以上に避け
ることが可能となる。
【００４６】以下の表１は、偽ネガティブ又は偽ポジテ
ィブ結果となった考え得る原因と、これらの誤りを除去
する本方法の関連工程とを概略的に示すものである。
【００４７】
【表１】
【００４８】以下のことを明記しなければならない。即
ち本発明の望ましい形態である本方法は、蛍光スポット
のみを使用して実施され、走査レーザ装置に対する標識
の蛍光反応を分析することにより蛍光標識化されたバク
テリアを識別するものである。該分析方法は： −１つの走査ライン（＝フィーチャー）上の試料数を評
価し； −ライン間相関を行い； −上述したように“サイズ識別”を行い、細胞の正確な
検出を行うために相関フィーチャーのナンバーを得るこ
とからなる。
【００４９】従って本分析技術は、検出すべき対称のサ
イズを以下の方法により利用する。即ち： −あらゆる信号走査ライン上の蛍光反応が所定のノイズ
閾値を越える程度に大きいものでなければならず； −フィーチャーは、少なくとも２つの連続するライン走
査上で所定の重なり度で検出されなければならないこ
と；によってサイズを利用する。
【００５０】これらの要件は、フィーチャーの形状及び
サイズについて著しく多くの情報を必要とする画像形成
システムと本発明方法とが顕著に異なることを意味す
る。
【００５１】これらの要件に相当するものを画像形成シ
ステムで得るには、レーザスポットを検出される対象よ
り小さいものとする必要があり、このことは小さなレー
ザスポットサイズを有するものとして設計させることと
なる。本発明に於けるスポットサイズは、フィーチャー
に対して大きいものとすることができ、現在のところフ
ィーチャーサイズの１０倍のオーダーにある。このこと
はサンプリング速度、光学的正確性の要件及び処理能力
（データ取り扱い速度及びメモリ仕様）の点で大きく貢
献する。
【００５２】意外にも本方法は： −単一レベルの動的閾値化：データ処理システムが、連
続的に背景ノイズレベルを監視し、フィーチャーが取り
込まれるように重要とみなされる信号値を捉えるべく閾
値を調節する。このことによりシステムは、スライドグ
ラス（固体支持体）からスライドグラスへの取り替え時
に発生する変動、また単一のスライドグラスの面積上の
変動を許容することができる； −信号のライン間相関付け：細胞として特定されるため
には、フィーチャーは少なくとも２つの走査ライン上に
存在しなければならない； −フィーチャー識別用緑色蛍光スペクトル形の使用（赤
／緑信号レベル）：該緑色帯域で検出されたフィーチャ
ーは、緑色蛍光マーカー発光スペクトルの形状から予測
されるように、対応する赤色帯域信号を少ししか、又は
全く有していてはならない。赤色帯域反応がより高いレ
ベルにあるとフィーチャーが否定される。
【００５３】信号識別：信号は、受け入れることができ
るためには所定数分だけ走査ポイントに存在していなけ
ればならない。短い信号はノイズとして拒絶される。
【００５４】−所定数以上のサンプル又は所定数以上の
ラインを含む（即ち、特定の走査ラインに沿う又は幾つ
かの走査ラインをまたぐ）相関フィーチャーが否定され
る。
【００５５】本発明の他の特徴に於いて固体支持体上の
細胞を蛍光によって検出及びカウントする装置が提供さ
れる。
【００５６】前記装置は： −寸法の検出及びカウントをされるべき種類のほ乳類細
胞より固体支持体上で実質的に大きく１５μｍ及び３０
μｍの間に含まれるサイズを有するレーザスポットとな
るようにレーザービームを照準する手段と協働する、入
射ビームを出射するためのレーザ光源と； −前記光源からの光を前記固体支持体上に導いて、スポ
ット状に前記ほ乳類細胞を照射し蛍光スポットを形成す
る走査手段と（ここで、２つの走査ライン間の距離は、
前記支持体の各部分が隣接する走査路を部分的に重複さ
せることにより少なくとも２回走査され、好ましくは前
記レーザスポットの寸法より小さい）； −少なくとも２つの異なる波長λ1及びλ2で前記発光す
る蛍光を検出して光電子的に変換するための手段と； −デジタル信号処理装置及び少なくとも２つの発光蛍光
波長を選択する複数の光学路を備える、非ほ乳類蛍光を
識別・除去するための手段と； −隣接するラインからなる各ライン対上のフィーチャー
を同期して比較し、該相関フィーチャーの組が出現する
ラインの数をカウントし（ここで、各組の相関フィーチ
ャーはイベントを形成している）、一つのライン上だけ
に発生するあらゆる非相関フィーチャーを排除すること
により個々のフィーチャーのライン間相関付けをおこな
い一連の相関づけられたフィーチャーを判別し；所定数
未満の２つの波長λ1及びλ2に於ける発光強度比を有す
る相関フィーチャーを選択するために、少なくとも２つ
の異なる前記波長に於いて隣接するラインからなる各ラ
イン対上の相関フィーチャーを同期して比較し、相関フ
ィーチャーによる前記波長での前記発光比があらかじめ
定義された値より大きい場合、そのイベント全体が排除
し；維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索され
た細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択
し；サイズ認識後に維持されるイベントに対して、３次
元のイベントエネルギープロファイル（the events ene
rgy profile）が所定のガウス形状基準内にあるか否か
を判断し害ガウス形状基準にないイベントを排除し；前
記残存イベントをカウントして前記固定支持体上に存在
する蛍光ほ乳類細胞を決定しそれらのみをカウントする
信号処理手段を備える。
【００５７】前記装置によれば固体支持体前面が走査さ
れることとなる。
【００５８】前記装置の一つの特徴に従えば、前記走査
手段が第１振動ミラーと第２ミラーとを備えたことを特
徴とし、第１振動ミラーの振動軸はビームによりライン
を走査するために光ビーム軸に対して直角となってお
り、第２ミラーの軸は、前記第１ミラーの振動軸に対し
て直角となっており、該第２ミラーは前記第１ミラーの
走査動作に同期して走査動作を行う。
【００５９】前記装置の他の特徴に従えば、前記検出装
置は、少なくとも２つの光電子増倍管を光電子変換用手
段として備える。
【００６０】前記装置の他の特徴に従えば、前記レーザ
スポットは延きのばされた形状を有している。
【００６１】前記装置の他の特徴に従えば、前記固体支
持体はスライドグラスである。
【００６２】前記装置の他の特徴に従えば、前記試料保
持器は、ペルティエ効果を導く等の冷却手段と協働す
る。
【００６３】さらにシリコン等の材料からなる薄膜を前
記試料保持器とスライドグラスとの間に挟んでもよい。
【００６４】前記薄膜は例えば、次のような利点を有す
る：自発蛍光発光が起こらず、励起波長に於いて反射が
低く、洗浄が容易である。
【００６５】以下の図は、本発明を実施する手段を説明
するために使用することのできるものである。
【００６６】
【発明の実施の形態】図３を参照するに、走査手段１０
と、二色性フィルター２０を有し発光する蛍光を検出す
るための手段と、光学フィルター２１と、光電子増倍管
（ＰＭＴ）３０と、信号処理システム４０〜４２と、デ
ジタル信号処理装置４３と、計測器のコンピュータ５０
と、ユーザーコンピュータ６０と、自動顕微鏡７０とを
備えた本発明に係る装置が示されてる。
【００６７】走査装置１０は、スライドグラス保持器８
に取り付けられたスライドガラスに代表される固体支持
体１１を走査するためにコヒーレント光を使用する。
【００６８】好ましい実施形態に於いて走査装置１０の
構成要素としては、４８８ナノメートルアルゴン−イオ
ン水冷式レーザ１２と、走査ミラー１６と、走査レンズ
１７と、安全装置としてのビームダンパ１８とが含ま
れ、前記走査装置は、レーザビームをレーザスポットに
照準しビームエキスパンダを備える手段と協働し、該ビ
ームエキスパンダ１３は、照射レーザスポットのサイズ
を１５〜３０μｍ、好ましくは２０μｍにまで制御し、
照射スポットを前記走査ミラー１６に導く。
【００６９】ビームエキスパンダ１３はレンズを２つ備
えており、これらのレンズは、固体支持体上でレーザス
ポットが１５から３０μｍとなるよう、例えばレーザス
ポットが２０μｍ、第１レンズの焦点距離が９０ｍｍ、
第２レンズの焦点距離が５０ｍｍ、そして２つのレンズ
間の間隔が３６．５ｍｍとなるよう（焦点距離及び２つ
のレンズ間の距離が）調整されている。
【００７０】前記２つの走査ミラーは、検出されるべき
細胞を含む試料が載せられた固体支持体１１に照射レー
ザスポットを走査するために使用される。このレーザス
ポットは、例えば毎秒１メートルの速度でｘ方向に移動
する。
【００７１】前記走査ミラー１６（スキャナ１６）は、
例えば、７μｍのライン間（ｙ）間隙（２つの走査ライ
ン間の距離）の形成を可能にする。
【００７２】前記走査手段がレーザスポット（走査レン
ズ１７）を確実に正確に位置決めするためには高い光学
的精度が要求される。
【００７３】１ｍ／ｓの速度で２０μｍのレーザスポッ
トサイズを用いることで、２５ｍｍのフィルターを２分
以内で走査することができる。
【００７４】分析されるべき試料が載せられた（スライ
ドグラス等の）固体支持体１１（又は試料支持器）は、
取り外し可能な試料保持器に載置されており、該試料保
持器は、試料支持体を研究所、或いは試料が収集されて
いる場所から運び出すために、又は本装置にかける場合
に使用されるものである。
【００７５】この試料保持器は、スライドグラス等の矩
形状試料保持器を好ましく取り扱うことができるよう設
計されている。
【００７６】装填引出し装置（図示せず）は、ユーザが
容易に操作を及ぼしうるものとなっている。前記取り外
し可能な試料保持器は、矩形状固体支持体を扱うことが
できるよう設計されており、装填引出し装置に載置され
ている。次に装填引出し装置は、計測装置内に押し込ま
れ、細胞が載せられた試料保持器はスキャナ１６の直下
となる。試料保持器は、標識化された細胞の安定性を保
護するために（ペルティエ効果等によって）冷却され
る。
【００７７】前記試料装填引き出し装置は、装置内で試
料保持器を誘導し自動的に該保持器を走査レンズから正
しい距離に精度を保って運搬するための機構と協働す
る。該試料装填装置は、図面では表されていない。
【００７８】スキャナ１６は、焦点を定められたレーザ
ビームをターゲット１１に照射することにより、細胞又
はあらゆる蛍光物質から蛍光を誘発する。
【００７９】ＰＭＴ３０は、（５３０ナノメートルと６
１５ナノメートルとに中心波長を有し、以下緑色及び赤
色の帯域と称される）２つの波長で蛍光を検出する。
【００８０】該蛍光は、信号処理システム４０によって
更に分析に掛けられる。
【００８１】ＰＭＴ信号は、スキャナ１６からの時間同
期情報と共に、信号処理システム４０に送られる。
【００８２】このシステム４０は、予備増幅器４１と、
信号サンプリング装置４２と、デジタル信号処理装置４
３とを備えている。
【００８３】より正確にはＰＭＴ信号の各々は、専用の
予備増幅器４１によって増幅される。増幅されたアナロ
グ信号は、８ビット（２５６信号レベル）の分解度を使
用して２ＭＨｚでデジタル値としてサンプリングされ
る。各ＰＭＴ周波数帯は、専用のサンプリング装置を有
している。
【００８４】サンプリングされたＰＭＴ信号は、デジタ
ル信号処理装置（ＤＳＰ）４３に送られる。
【００８５】そこでこれらの信号は分析され、結果とし
て得られる出力情報は計測器コンピュータ５０を通過す
る。該コンピュータは走査装置を制御し、ＤＳＰシステ
ム４３用のホストとして機能し、固体支持体を走査して
いる間に於いてデータを蓄積し、走査結果をユーザのコ
ンピュータ６０に送る。
【００８６】前記ユーザのコンピュータ６０は、現在の
ところ分析ツールとしてソフトウェア「Ｍａｔｌｂ」
（商標名）を用いて、走査の結果を処理し画像表示する
ために使用される。
【００８７】本発明装置は、必要ならユーザのコンピュ
ータ６０から自動顕微鏡を駆動することにより、固体支
持体上のあらゆる対象物の直接観察を可能とする能力を
備えたものとすることができる。
【００８８】図４〜８は： − 背景ノイズ（動的閾値、図５） − 色彩の識別（図７） − 非相関フィーチャー（図６） − サイズ識別（図８） に関し必要な否定をするための本発明方法の種々の工程
を要約して示すものである。
【００８９】設計パラメータの変化に伴う影響 以下の走査に関する物理的パラメータ：図９に示される
ように、レーザスポットサイズ（ｄ）、走査ラインサン
プリング（ｘ）及びライン間隔（ｙ）は、本発明方法の
検出能力に影響を与えるものである。これらのパラメー
タは： ｄ：走査レーザスポットの寸法。スポットの強度分布は
ガウス分布であり、スポット寸法は、通常、レーザー強
度が、ピーク値の１／ｅ2（約１３％）に落ちるところ
の大きさとして定義される。
【００９０】ｘ：一つの走査ライン上の連続したデータ
サンプル間の距離。これは、サンプリング速度及び走査
ミラーの速度によって制御される。
【００９１】ｙ：連続する走査ライン間の距離。これ
は、走査ミラーを移動する際のステップサイズによって
制御される。
【００９２】これらのパラメータを変化させることによ
って生じる効果は、表２に於いて概略的に示されてい
る。各パラメータ毎に最適の作動範囲が存在することが
明らかである。この範囲の大きさは： ・偽ポジティブ又は偽ネガティブの結果を得る可能性を
最小限にすること； ・実際上の工学的制限（構成要素の誤差、走査ミラーの
位置精度等）； ・処理及びデータ分析装置のコスト（処理速度、データ
蓄積メモリ） からなる３つの実際上の制限要素によって決定される。
【００９３】
【表２】
【００９４】これらのパラメータの役割は、図１及び１
０においても示されている。
【００９５】ターゲット１１は、図１に示されるように
して走査される。図１を参照するに、レーザスポット寸
法及びＳＮＲの観点から走査時間を以下のように評価す
ることができる： − 走査される全面積は、Ｘ・Ｙである。 − 走査速度はｖである。 − 引き返し時間は無視することができる。 − スポットの直径は、ａx及びａyである。
【００９６】− スキャンのＹ方向への進行度（スキャ
ンライン間隔）はΔｙである。 全面積を走査するための時間は、１本のラインを走査す
る時間と走査ラインの数との積に等しい。
【００９７】走査ライン１本当たりの時間＝Ｘ／ｖ 走査ラインの数＝Ｙ／Δｙ ｙ＝ａy／ｎである。ここでｎは、各スポットが走査さ
れる回数である。
【００９８】こうして走査時間は下記の式で与えられ
る： 走査時間＝（Ｘ・Ｙｎ）／（ｖ・ａy） もし全てが等しければ、走査を完了する時間は走査され
た面積及び各要素が走査される回数に比例している。そ
して走査時間は、走査速度及びスポットのｙ方向の寸法
に反比例している。
【００９９】しかしこれらの全てが等しいわけではな
く、またスポットのサイズ又は速度の何れかを単に増加
させるということによって走査時間が短縮される場合、
信号対ノイズ比の点は妥協せざるを得ない。
【０１００】信号の程度は照射強度（ワット／平方セン
チメートル ）及び各スポットが照射される時間に比例
する。ノイズは照射された面積の平方根に比例し、走査
速度に反比例する。こうして以下を考察する： −目標の細胞は、照射スポットよりも小さい； −総レーザー出力は一定（Ｉo ）であり、照射スポット
に照射される； −上述のように走査は重複して行われる。ここでｎは、
各スポットが走査される回数を意味する。
【０１０１】信号対ノイズは、以下のように良く知られ
た量で表現することができる： Ｓ／Ｎ ＝ 〔Ｉo／（ａx・ａy）〕・〔ｎ／（ａy・
ｖ）〕1/2。
【０１０２】これにより、走査速度又はレーザースポッ
トの寸法のいずれかが増加する時に、検出信号対ノイズ
がどのようにして減少するかが明瞭に分かる。しかしこ
の方程式は、隣接する走査ライン（図１参照）の相関付
けによって得られる信号対ノイズの再生については考慮
していない。
【０１０３】図１０は、２種類の条件下に於いての上記
で展開された２つの式の結果の比較を示している。各場
合において初期条件は、レーザスポットが直径ａの円形
であるとされた。この条件に於いてはＳＮＲが１００％
であって、走査時間も１００％であった。
【０１０４】条件１： スポットの円形状態を維持しつ
つ走査が重複しないようにして一定の割合でレーザース
ポットの寸法を増加する。 ｎ＝１、及びａx＝ａy 条件２： スポット面積を一定となるようスポットのｙ
方向の寸法を増加させスポットのｘ方向の寸法を減少さ
せてスポットを引き延ばし、各スポットが２度走査され
るように重複させる： ｎ＝２、及びａx＝１／ａy 実験例１ ： ワクシニアウイルスに感染したヒトの細胞
（ヒーラー細胞）の検出細胞（１０5ｍｌ）をスライド
上で増殖させ、２・１０-1ｐｆｕ／ｍｌの天然型ワクシ
ニアウイルスで処置した。感染させて６時間を経た後、
細胞をＦＩＴＣで標識化されたワクシニアモノクローナ
ル抗体で２０分間インキュベーションし、ＰＢＳ緩衝液
で洗浄した。処理懸濁液を２０μｌ（２・１０3個の細
胞）をスライドとカバースリップとの間に載せ、本発明
を使用してカウントした。装置設定パラメータ、基本的
検出結果及び識別工程後の最終結果を表３に示した。検
出された細胞は顕微鏡を使用してポジティブと確認され
た。
【０１０５】実験例２： マウス形質転換細胞の検出 Ｐ−８１５細胞から構築され、βガラクトシド蛋白質を
構成的に発現する数個のＰ１３−１細胞を非トランスフ
ェクトされた細胞の懸濁液に添加し、結果として得られ
た懸濁液をフルオレセインジガラクトシドを使用して３
７゜Ｃで５分間標識化した。標識化の後、３０μｌをス
ライドとスライドとカバースリップとの間に載せ、本発
明を使用してカウントした。装置設定パラメータ、基本
的検出結果及び識別工程最終結果を図３に示す。
【０１０６】
【表３】
【０１０７】上記表３において“ 比率”は、緑色帯域
における蛍光強度から分離された（即ち、緑色帯域に於
ける蛍光強度として検出されない）赤色帯域の蛍光強度
を意味し、“●●”で示されたコラムは、本明細書内で
定義されたイベントの総数と非相関フィーチャー（シン
グルフィーチャーとも呼ばれる）の数を実際上含んでい
ることが指摘されねばならない。
【０１０８】フィーチャーとイベントが、赤色帯域での
み発見される場合及びその逆の場合、及び個の表には示
されていない他の基準の適用後にガウス分布による識別
インパクトを行って発見される場合もある。
【図面の簡単な説明】
【図１】走査パターンを重ね合わせた状態を示し、ビー
ム形状、走査パターン、方向及び相対寸法が示されてい
る説明図である。
【図２】イベントの定義及び寸法を示す説明図である。
【図３】レーザ装置、光学系、走査ミラー、試料保持
具、検出装置、及び検出後の処理用電子機器のためのブ
ラックボックスを示す装置のブロック図である。
【図４】トップレベルの制御アルゴリズムを示すフロー
チャートである。
【図５】フィーチャー検出を示すフローチャートであ
る。
【図６】ライン相関づけを示すフローチャートである。
【図７】色彩比の識別を示すフローチャートである。
【図８】イベントのサイズ識別を示すフローチャートで
ある。
【図９】主走査パラメーターであるｄ，ｘ，ｙ，を示す
説明図である。
【図１０】レーザスポットが円形（ケース１）又は細長
型（ケース２）である場合の信号対ノイズの低減につい
ての比較を示すグラフである。
【符号の説明】
１０ 走査手段 １１ 固体支持体 １２ レーザ装置 １３ ビームエクスパンダ １６ 走査ミラー １７ 走査レンズ １８ ビームダンパ ２０ 二色性フィルター ２１ 光学フィルター ３０ 光電子増倍管（PMT） ４２ デジタル信号処理装置（DSP） ５０ 計測器のコンピュータ ６０ ユーザーのコンピュータ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｍ 33/52 33/52 Ｚ (72)発明者 ワレン グローナー アメリカ合衆国 ニューヨーク 11020 グレート−ネック メリヴァール ロード 50 センター フォー ラボラトリー テクノロジー

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 稀少出現ほ乳類細胞を検出しカウントす
    るための方法であって： −検出されるべき細胞より実質的に大きく１５μｍ及び
    ３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザースポッ
    トを固体支持体上に形成するようにして、レーザ装置か
    らの入射レーザビームを用いて蛍光細胞を含む可能性を
    有する試料を載置した固体支持体を走査し（ここで二つ
    の走査ラインは、前記固体支持体の各部分（element）
    が、隣接する走査路を部分的に重複させることにより少
    なくとも２回走査されるように間隔を設定される）；同
    時に −ある閾値（例えば動的（dynamic）閾値）を越える検
    出信号（＝サンプル）だけを選択するようにして、少な
    くなくとも１種の波長で、結果として得られる蛍光を検
    出し（ここで一つの走査ライン上の隣接する一連の試料
    はフィーチャーである）； −隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上のフィ
    ーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーの組が出
    現する走査ラインの数をカウントし（各組の相関フィー
    チャーはイベント（event）を形成する）、あらゆる非
    相関フィーチャー（＝単一フィーチャー）を除去するこ
    とによって、個々のフィーチャーのライン間相関づけに
    より相関フィーチャーの組を認識し； −隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上の前記
    相関フィーチャーを少なくとも２つの異なる波長λ1及
    びλ2で同期して比較し、該２つの波長に於ける所定数
    未満の発光強度比を有する相関フィーチャーを選択し、
    前記相関サンプルにより前記波長で発生した前記発光比
    が所定の値より大きいものである場合、前記イベント全
    体が排除されるようにし； −維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された
    細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択
    し； −サイズ認識後に維持されるイベントに対して、３次元
    のイベントエネルギープロファイル（the events energ
    y profile）が所定のガウス形状基準内にあるか否かを
    判断し、該ガウス形状基準にないイベントを排除し； −前記固体支持体上に存在する蛍光細胞を決定しそれら
    のみをカウントするために前記残存イベントをカウント
    することを含む方法。
  2. 【請求項２】 前記サイズ識別工程は： −前記イベントの内の最初に現れる如何なるフィーチャ
    ーについても走査方向上で最初に現れるサンプルから出
    発し、如何なるフィーチャーが最後に終るかに拘わらず
    走査方向に最後に現れるサンプルを含むようにサンプル
    数を続けてカウントし（このカウントでは異なる走査ラ
    イン上の総ての相関サンプルを１サンプルとみなす）、 −同じイベントがカバーする隣接ラインの数をカウント
    することによりそのイベントの幅を決定し、 −前記カウントされたサンプルの数が所定数Ａより大き
    く、且つ／又は前記カバーする隣接走査ラインの数が所
    定数Ｂより大きいイベントを除去することにより実行さ
    れることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 稀少出現ほ乳類細胞の検出しカウントす
    るための方法であって： −検出されるべき稀有ほ乳類細胞を含む分析されるべき
    試料を固体支持体上に広げて薄膜状態にし； −前記固体支持体に適当な試薬を塗布して、モノクロー
    ナル抗体法、インサイチューハイブリダイゼーション
    法、インサイチューＰＣＲ法、酵素結合プローブ法等
    の、選択された波長で蛍光を発光するよう励起された場
    合に可能な技術を使用して検索された細胞を蛍光標識化
    し（これらの技術は、一以上の波長で蛍光を発生させて
    識別手段又は特定のタイプの稀有細胞だけを識別するか
    又は選択するための手段とするために、個別的に又は同
    時に一つの試料に使用される）； −検出されるべき細胞より実質的に大きく１５μｍ及び
    ３０μｍの間に含まれるサイズを有するレーザースポッ
    トを固体支持体上に形成するようにして、レーザ装置か
    らの入射レーザビームを用いて蛍光細胞を含む可能性を
    有する試料を載置した固体支持体を走査し（ここで二つ
    の走査ラインは、前記固体支持体の各部分（element）
    が、隣接する走査路を部分的に重複させることにより少
    なくとも２回走査されるように間隔を設定される）；同
    時に −ある閾値（例えば動的（dynamic）閾値）を越える検
    出信号（＝サンプル）だけを選択するようにして、少な
    くなくとも１種の波長で、結果として得られる蛍光を検
    出し（ここで一つの走査ライン上の隣接する一連の試料
    はフィーチャーである）； −隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上のフィ
    ーチャーを同期して比較し、相関フィーチャーの組が出
    現する走査ラインの数をカウントし（各組の相関フィー
    チャーはイベント（event）を形成する）、あらゆる非
    相関フィーチャー（＝単一フィーチャー）を除去するこ
    とによって、個々のフィーチャーのライン間相関づけに
    より相関フィーチャーの組を認識し； −隣接する走査ラインからなる各走査ライン対上の前記
    相関フィーチャーを少なくとも２つの異なる波長λ1及
    びλ2で同期して比較し、該２つの波長に於ける所定数
    未満の発光強度比を有する相関フィーチャーを選択し、
    前記相関サンプルにより前記波長で発生した前記発光比
    が所定の値より大きいものである場合、前記イベント全
    体が排除されるようにし； −維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索された
    細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択
    し； −サイズ認識後に維持されるイベントに対して、３次元
    のイベントエネルギープロファイル（the events energ
    y profile）が所定のガウス形状基準内にあるか否かを
    判断し、該ガウス形状基準にないイベントを排除し； −前記固体支持体上に存在する蛍光細胞を決定しそれら
    のみをカウントするために前記残存イベントをカウント
    することを含む方法。
  4. 【請求項４】 前記サイズ識別は： −前記イベントの内の最初に現れる如何なるフィーチャ
    ーについても走査方向上で最初に現れるサンプルから出
    発し、如何なるフィーチャーが最後に終るかに拘わらず
    走査方向に最後に現れるサンプルを含むようにサンプル
    数を続けてカウントし（このカウントでは異なる走査ラ
    イン上の総ての相関サンプルを１サンプルとみなす）、 −同じイベントがカバーする隣接ラインの数をカウント
    することによりそのイベントの幅を決定し、 −前記カウントされたサンプルの数が所定数Ａより大き
    く、且つ／又は前記カバーする隣接走査ラインの数が所
    定数Ｂより大きいイベントを除去することにより実行さ
    れることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 蛍光によって細胞を検出及びカウントす
    るための装置であって： −寸法の検出及びカウントをされるべき種類のほ乳類細
    胞より固体支持体上で実質的に大きく１５μｍ及び３０
    μｍの間に含まれるサイズを有するレーザスポットとな
    るようにレーザービームを照準する手段と協働する、入
    射ビームを出射するためのレーザ光源と； −前記光源からの光を前記固体支持体上に導いて、スポ
    ット状に前記ほ乳類細胞を照射し蛍光スポットを形成す
    る走査手段と（ここで、２つの走査ライン間の距離は、
    前記支持体の各部分が隣接する走査路を部分的に重複さ
    せることにより少なくとも２回走査され、好ましくは前
    記レーザスポットの寸法より小さい）； −少なくとも２つの異なる波長λ1及びλ2で前記発光す
    る蛍光を検出して光電子的に変換するための手段と； −デジタル信号処理装置及び少なくとも２つの発光蛍光
    波長を選択する複数の光学路を備える、非ほ乳類蛍光を
    識別・除去するための手段と； −隣接するラインからなる各ライン対上のフィーチャー
    を同期して比較し、該相関フィーチャーの組が出現する
    ラインの数をカウントし（ここで、各組の相関フィーチ
    ャーはイベントを形成している）、一つのライン上だけ
    に発生するあらゆる非相関フィーチャーを排除すること
    により個々のフィーチャーのライン間相関付けをおこな
    い一連の相関づけられたフィーチャーを判別し；所定数
    未満の２つの波長λ1及びλ2に於ける発光強度比を有す
    る相関フィーチャーを選択するために、少なくとも２つ
    の異なる前記波長に於いて隣接するラインからなる各ラ
    イン対上の相関フィーチャーを同期して比較し、相関フ
    ィーチャーによる前記波長での前記発光比があらかじめ
    定義された値より大きい場合、そのイベント全体が排除
    し；維持されるイベントのサイズ認識を行い、検索され
    た細胞の種類に対応するサイズを有するイベントを選択
    し；サイズ認識後に維持されるイベントに対して、３次
    元のイベントエネルギープロファイル（the events ene
    rgy profile）が所定のガウス形状基準内にあるか否か
    を判断し害ガウス形状基準にないイベントを排除し；前
    記残存イベントをカウントして前記固定支持体上に存在
    する蛍光ほ乳類細胞を決定しそれらのみをカウントする
    信号処理手段とを；備えたことを特徴とする装置。
  6. 【請求項６】 前記走査手段が第１振動ミラーと第２ミ
    ラーとを備えたことを特徴とし、第１振動ミラーの振動
    軸はビームによりラインを走査するために光ビーム軸に
    対して直角となっており、第２ミラーの軸は、前記第１
    ミラーの振動軸に対して直角となっており、該第２ミラ
    ーは前記第１ミラーの走査動作に同期して走査動作を行
    う請求項５に記載の装置。
  7. 【請求項７】 前記検出手段は、少なくとも２つの光電
    子増倍管を光電子変換手段として備えていることを特徴
    とする請求項５に記載の装置。
  8. 【請求項８】 前記レーザスポットは引き延ばされた形
    状を有することを特徴とする請求項５に記載の装置。
  9. 【請求項９】 前記固体支持体はスライドグラスである
    ことを特徴とする請求項５ニキ債の装置。
  10. 【請求項１０】 前記固体支持体は試料保持器に載せら
    れ、該試料保持器は、冷却手段と、選択的に該試料保持
    器と前記固体支持体との間に挟まれたシリコン材料性の
    薄膜と協働することを特徴とする請求項５に記載の装
    置。
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