JP2002537563A

JP2002537563A - 化学的及び生物化学的アッセイ方法及び装置

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Publication number: JP2002537563A
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Abstract

(57)【要約】１つの成分が他の成分に結合する量を判定する非分離アッセイを実施する方法。この方法は、溶液に第一成分を提供するステップを有する。複数の部位からなるアレイは、濃縮された第二成分が内部又はその上に置かれる。複数の部位からなるアレイは溶液に浸され、複数の部位を照射している間に溶液を透過するような照射光線によって前記複数の部位からなるアレイが走査される。複数の部位の各々及び溶液からの光の強度は、照射中に少なくとも一つの波長で判定される。上記溶液のみを示す参照値と第二成分に対する第一成分の結合量を示す値とを判定するために受光された光の強度を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、化学的及び生物化学的アッセイを実施するための方法及び装置に関
する。

【０００２】

【背景技術】

細胞及び準細胞レベルでプロセスを特徴付ける能力は、新薬発見及び臨床診断
の両方で重要である。頻繁に研究されている相互作用の１つとして、生物学的分
子が他の分子、細胞、又は細胞の一部と結合することがある。このことには、例
えば抗原に対する抗体の結合、受容体に対するホルモンの結合、細胞表面受容体
に対するリガンドの結合、基質に対する酵素の結合、他の核酸に対する核酸の結
合、核酸とタンパク質との結合、及びウィルスと細胞表面との結合が挙げられる
。

【０００３】細胞生物学にとって重要な別の種類の相互作用は、膜を介した分子又は細胞の
拡散又は輸送である。このことは、例えば特定の輸送タンパク質を経由して、又
はファゴサイトシスを介した浸透現象によって生ずる。

【０００４】多くの疾患が結合又は輸送プロセスによって特徴付けられる。新薬発見では、
そのプロセスを促進させるか、又は阻害する手段を割り出すことを目的とする。
臨床診断では、それらのプロセスにおける異常機能、異常核酸物質の存在を検出
し、又は外来物質（ウィルス又は細菌等）を割り出して、適当な治療が行えるよ
うに病気の診断を行うことを目的とする。本発明は、新薬発見及び臨床診断にとって重要な結合及び輸送プロセスを検出
及び定量化するための迅速かつ簡単なアッセイを提供しようとするものである。

【０００５】以下に記述する詳細な説明において、「受容体（レセプタ）」は他の分子、細
胞、又は構造に結合する任意の生物学的分子、細胞又は構造を意味する。同様に
、「リガンド」は「受容体」に結合する任意の有機分子又は無機分子を意味する
。説明及び例は、受容体に結合する標識リガンドのアッセイに焦点を当てる。記
述した従来技術及び本発明は、新薬発見において一般に使用されているような競
合アッセイにおける非標識アゴニスト又はアンタゴニストの相互作用も含まれる
ものである。可逆的結合反応の基本原理は、以下の式によって表すことができる。

【０００６】解離定数（Ｋ_d）＝［Ｌ］×［Ｒ］／［Ｌ・Ｒ］

【０００７】式中、［Ｌ］＝平衡状態における非結合リガンドの濃度、［Ｒ］＝平衡状態に
おける非結合受容体の濃度、及び［Ｌ・Ｒ］＝平衡状態における結合リガンド／
受容体複合体の濃度である。

【０００８】濃度は、一般にモルで測定され、リガンドのＫ_d、すなわちタンパク質相互作
用は一般に１０^-4乃至１０^-5Ｍ^-1の範囲である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】

新薬発見及び診断で使用された古典的なアッセイは分離アッセイである。この
アッセイでは、１つの成分（例えばリガンド）が溶液中に溶解又は懸濁される。
他の成分（例えば受容体）はマイクロタイタ・プレートのウェル等の表面に不動
化され、又は細胞表面に存在していてもよい。一方又は両方の成分に対して蛍光
又は放射性標識を結合させることで機器による測定をアシストするものであって
もよい。アッセイは、可溶成分を不動化した成分が含まれるウェルに添加し、平
衡に達するまで成分間の結合を可能とさせる。遊離した標識リガンドの存在下に
おける結合標識リガンドの量を直接決定することは、従来の検出器、例えば比色
計、蛍光又は放射性活性プレート・リーダでは不可能である。この問題は、遊離
リガンドを含む溶液をデカントすることで結合リガントと遊離リガントとを分離
することにより克服される。新鮮な溶媒で１回以上洗浄することで過剰な遊離リ
ガンドを除去する。残留標識の測定は、元の溶液に含まれる結合複合体の濃度を
表すものと仮定される。細胞に受容体があればこのプロセスを行うことができる
。もし細胞がウェルに結合していなければ、洗浄プロセスは細胞を保持するが洗
浄溶媒は通過する特定のフィルタ・プレートを用いて行われる。

【００１０】この方法は、結合複合体の解離速度が遅い場合に十分良好に働き、実に多くの
アッセイで首尾良く使用されている。しかし、より幅広く適用する場合にこのア
ッセイ方法では著しく不利益が伴う。

【００１１】もし解離速度が速ければ、いくつかの結合標識が放出されて洗浄溶液の中に戻
り、読み取りの際に誤差が生ずる。洗浄そのものの効率は、１つの試料から次の
試料まで変化し、アッセイの再現性を減少させる。スループットを高め、複雑さ
を減少させ、さらに試料間での相互汚染のリスクを取り除くために、自動化され
たシステムでの洗浄工程を少なくするか、省いてしまう必要がある。

【００１２】近年、それらの問題を解決するためにいくつかの非分離アッセイ技術が開発さ
れている。そのような技術として、例えばシンチレーション近接アッセイ（ＳＰ
Ａ）、蛍光ポーラリゼーション（ＦＰ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、及び時間
分解蛍光法（ＴＲＦ）が挙げられる。しかし、これらの技術の各々は、その適用
性が制限されているという欠点を有する。

【００１３】ＳＰＡは、受容体が結合したシンチラント・ビーズに対して放射性標識リガン
トからエネルギーを移すことに基づいている。このアッセイは、十分な信号を生
成させるために相対的に高濃度で実施されなければならない。放射活性物質の破
棄に対する法的規制及び作業従事者の被爆の危険性があることから、企業はそれ
に代わるものを求めている。ＳＰＡは全細胞を用いるいくつかのアッセイには適
しておらず、また細胞内の受容体又はタンパク質のアッセイへの使用には適して
いない。このことは、アッセイ実施のために機能性受容体を細胞外に単離させな
ければならないことを意味しており、このことは不経済で、困難であり、さらに
いくつかの場合では達成することができない。

【００１４】ＦＰは、その回転速度又は拡散による転流から蛍光対象物の質量を推定する技
術である。試料は、偏光のバーストによって照射され、放射された蛍光は同一又
は他の偏光面で測定される。もし標識が大きな対象物に結合しているならば、回
転又は転流の速度が遅くなり、照射後、しばらくの間励起するので発光は同一偏
光面にある。もし遊離標識（free label）が結合複合体よりもかなり小さければ
、分子はよりいっそう素早く入射偏光の面から移動して他の面に入射される。も
し蛍光体が十分に長い減衰時間を有するものとするならば、検出器に達する光は
、溶液中の蛍光体標識リガンドの実質的な数がより大きな分子に結合している場
合に励起後の励起がよりいっそう長くかかる。

【００１５】この方法は、遊離標識に対する結合を直接測定というよりはむしろ相関関係であ
る。遊離標識のいくつかは、励起として同一面上に放される。また、標識された
リガンドが受容体よりもかなり小さいことが求められ、また蛍光体の減衰時間が
標的分子の回転速度よりも大きいことが求められる。この技術には多くの欠点が
ある。すなわち、非特異的結合及び汚染によるバックグラウンドの蛍光を特異的
に結合した標識リガンドから分けることが難しい。また、細胞内での相互作用を
研究する際に使用することができない。さらに、蛍光のピークよりも信号の減衰
に依存していることで、その方法の感度が減少する。

【００１６】ＦＣＳは、該ＦＣＳが信号分子との相関関係を結ぶこと以外はＦＰと類似して
いる。その方法によれば、蛍光粒子又は分子の大きさがブラウン運動によって固
定レーザ光線を介して転流速度から予測される。この方法を実施するために、蛍
光体の信号分子のみが一時、レーザ光線中に存在することが求められる。どれぐ
らいレーザ光線を狭めることができるかが実際的な限界として存在する（一般に
直径が数ミクロンのオーダで）。また、流体中にかなり短い経路長を有すること
も非実用的である。このような理由から、ＦＣＳは一般に非常に低い濃度の標識
によって実施される。この技術は、実際のアッセイで特有な汚染によるバックグ
ラウンド蛍光にかなり影響されやすい。また、それは比較的にゆっくりで、より
大きな分子に対する結合を検出するために３０分間に及ぶ連続測定を要する。

【００１７】ＦＣＳの技術は、２０年以上も知られている。それを用いることの困難性が、
実際のアッセイにおける使用を比較的最近まで妨げてきた。この技術の欠点のい
くつかは、固定ビームＦＣＳは試料全体を表しているとは思えない一度に１回の
相互作用のみを調べるものであること、さらに特異的結合と非特異的結合とを直
接分けることができないことである。さらに該技術ではかなり低い濃度でアッセ
イが実行されることを必要とすることから、標識や受容体の容器の壁に対する非
特異的結合を通して信号が消えることや、低信号強度の結果として信号対ノイズ
比が低いということ等、さらに別の問題が生ずる。また、この技術は熱的に誘導
された渦電流に対しても影響受けやすい。これらの過酷な制限は液体の流れの研
究で使用されている確立された技術を用いることで減少させることができる。レ
ーザ光線を操作することで、いくつかの蛍光粒子の位置についてスナップショッ
トを取ることが可能であろう。連続的なスナップショットによってそのような粒
子の転流速度及び方向を決定することができ、さらにそれによってその質量が求
まる。しかし、既に挙げたその技術の多くの根本的な限界がまだあてはまる。

【００１８】ＴＲＦは、１つの分子から他の分子への極めて接近したエネルギーの移動に依
拠している点でＳＰＡに類似する。この場合、蛍光体からのエネルギーは、極め
て接近した別の蛍光体に移される。この技術では、可溶な受容体及びリガンドの
両方を必要とし、さらに蛍光体がリガンドと受容体との両方に存在することが必
要とされる。このことは、可溶性の受容体が得られないアッセイでは不適当であ
り、また標識の添加による受容体の化学的修飾が困難であり、活性の減少又は不
活化につながる。

【００１９】この数年にわたって、いくつかの機器及び技術が顕微鏡対物レンズ及び／又はＣ
ＣＤカメラを用いたイメージング技術に基づいた細胞の低スループット・スクリ
ーニングに対して導入されてきた。それらの典型的なものは、蛍光顕微鏡及び走
査ＣＣＤシステムである。これらのシステムは、底が透明なプレートを下から照
射する光源を用いる。細胞がウェルの底部で増殖又は沈着され、蛍光標識又は試
薬を細胞の上にある溶液へ添加する。検出器の焦点をウェルの底部（細胞シート
内）のみ合わせ、遊離標識を含む溶液の大部分からの信号が検出されるのを避け
る。試料はＣＣＤアレイ上に画像化され、得られたフレームをソフトウェアによ
って輝度分析される。このようなアプローチは、細胞又はビーズ内又はそれらに
結合した蛍光を画像化することに使用可能であるが、定量的なアッセイでの使用
に制限が加わるいくつかの欠点を有する。

【００２０】ＣＣＤの解像度には限界がある。今日入手可能な最も大きいＣＣＤは、約百万
ピクセルを有するが、化学機器で使用される経済的な装置はかなり少ない。した
がって、視野と解像度との妥協が存在する。このことは、一般に解像度が最良の
４μｍであって視野がたったの１ｍｍ²でことを意味する。これでは、一度に約
１００個の細胞が貧弱な解像度の画像として得るのが精一杯であり、いくつかの
アッセイの種類では統計的に有意な結果を得るには不十分である。そのような解
像度は、細胞又はビーズの寸法及び形状の正確な測定を可能とするには不十分で
ある。ＣＣＤの感度は、実質的にＰＭＴよりも低く、低光源レベルでの定量的測
定を実施する上で感度が不十分である（例えば、発現が低い細胞上の細胞表面受
容体、例えば細胞あたり５，０００個の受容体に結合した標識リガンド）。その
ことは、飽和未満のウェルに結合した蛍光の測定が可能となる定量的競合アッセ
イにとって必要であり、ＣＣＤ画像形成システムはこの性能に欠けている。ＣＣ
Ｄアレイの各ピクセルは、異なる感度を有するので、走査全体にわたる測定結果
に一貫性がない。各ピクセルは、一度に１つの色のみを検出することができる。
多色画像はＣＣＤアレイの前面にフィルタ・ホイールを用いて得ることが可能で
あり、異なるフィルタによって多数のフレームが得られる。このことは、読み取
り時間を落とし、もし試料が測定のあいだ動いているならば（遊離した細胞やビ
ーズの液体中での挙動のように）、スペクトル情報が消失する。マルチＣＣＤア
レイは、マルチカラーの画像を回収するために使用することができるが、検出器
間で完全なピクセル・アライメントを達成することや、真の同時多波長検出を行
うことは不可能である。ＣＣＤアレイは、可視範囲全体にわたって感度が均一と
はならない。そのことは、真の同時スペクトル測定がなされる低信号レベルでの
バックグラウンド拒絶にとってとても重要である。

【００２１】ＣＣＤアレイは、過渡的測定又は時間分解蛍光技術（ナノ秒乃至マイクロ秒の
サンプリング速度）を実行するのに十分な速度で１つの領域を繰り返し走査する
ことはできない。

【００２２】いくつかのシステム、例えばモレキュラー・デバイス（Molecular Devices）
の”ＦＬＩＰＲ”及びパーキン・エルマー（Perkin Elmer）のＦＭＡＴは、レー
ザによって試料を走査する。これらのシステムは、慎重に検出器の視野の深さを
制限する共焦点オプティックスを用いるので、遊離標識からのバックグラウンド
信号が最小限となる。この信号は、結合標識濃度：遊離標識濃度を測定するため
には使用されない。さらに、それらのシステムの解像度は小さなビーズ又は細胞
の形状及び寸法を正確に測定することを可能とするにはあまりにも貧弱である。

【００２３】これら画像化システムの全ては、遊離標識の濃度測定を意図していない。受容
体／リガンド結合アッセイ等の動的平衡となるアッセイに関して、平衡定数又は
ＩＣ５０等の関連した実測値を計算するための遊離及び結合リガンドの測定を行
うことが必要である。このことは、特に蒸発効果及び液体処理装置のバラツキが
アッセイの際のリガンドの濃度が所定の濃度と一致しないことを意味することが
できる。

【００２４】各技術に対して説明した限界に加えて、最も幅広い範囲のアッセイ全体に対し
て適用する上でそれらの技術の全てが一般的な欠点を有する。高スループット・
スクリーニングの開発にあたって、単一のシステムでいくつかの種類のアッセイ
が実行可能であることが重要である。上記した技術の各々がそれ自身の検出器を
必要とする。このことは、しばしば、スクリーニングを担当するチームが一種類
のアッセイから別の種類のアッセイに変更する場合に、ロボット・システムに異
なる検出器をボルトで留める必要が生ずる。このことは、段取りのために動作が
不能となる時間（ダウンタイム）が含まれ、一般にロボットの再プログラミング
も含まれる。

【００２５】蛍光検出は、新薬発見のための選択方法となり始めている。なぜなら、健康上
のリスクや廃棄上の問題なしに放射性標識アッセイのそれへアプローチする感度
を提供するためである。本実施形態は、上記した問題の現実的解決策を提供する
。

【００２６】

【課題を解決するための手段】

本発明によれば、ある成分が他の成分に結合する量を判定する非分離アッセイ
を実施する方法であって、溶液に第一成分を提供するステップと、濃縮された第
二成分が内部又はその上に置かれる複数の部位からなるアレイを提供するステッ
プと、複数の部位からなるアレイを上記溶液に浸すステップと、前記複数の部位
を照射する間に溶液を透過するような照射光線によって複数の部位からなるアレ
イを走査するステップと、照射中に少なくとも一つの波長で複数の部位の各々及
び溶液からの受光強度を判定するステップと、前記受光強度を用いて溶液のみを
示す参照値と第二成分に対する第一成分の結合量を示す値とを判定するステップ
とを有する。

【００２７】前記検出器によって受け取った信号に対して数学的計算を適用することで所定
のパラメータを決定することを可能とする。前記照射光は、レーザ光線によって生ずるものであってもよい。受光された光
は蛍光から生じた光であってもよく、さらに複数の波長の光を受光してもよい。

【００２８】前記受光強度は、各部位の大きさ及び／又は容積、及び前記部位に結合した分
子の数を判定するために用いてもよい。前記部位は任意の面又は粒子、例えば細
胞、ビーズ、パターン形成面、又は単にウェルによって形成されるもので、前記
面又は粒子の内側又はその上で成分が濃縮されるものであてもよい。

【００２９】照射光は、放射された光によって試料の上又は下から照射するように配置され
たものであってもよく、放射された光は、照射光が前記部位と前記部位上又は前
記部位に隣接した溶液の有意な容積との両方に照射されるようにして任意の組み
合わせで試料の上又は下から検出されてもよい。

【００３０】本発明は、また上記方法を実施するための装置も提供する。本発明の利点は、複数の部位が置かれた溶液に対して参照値を提供するために
用いることができるという点である。それによって、溶液内の任意の蛍光成分（
遊離成分）が測定され、かつ部位に結合した任意の蛍光成分（結合成分）の分子
が測定され、結合成分からの信号と一致する遊離成分からの任意の信号に対して
補正が行われる。それによって部位に結合した分子の数についての正確な値が測
定可能となり、さらに結合：遊離比が成分分離させる必要なく推定可能となる。
さらに、よりいっそう正確な結果を得るために、本発明の方法及び装置によって
、結合量のみならず、各部位の面積／容積を判定することが可能である。

【００３１】光源は、１回の走査が次の回の走査と重複部分を生ずるようにして直線上に溶
液及び複数の部位を走査してもよく、それによって受光した光強度の連続測定が
可能となる。受光した光強度に関連したデータは、処理を要するデータ量を減少
させるために固定閾値又は可変閾値を用いてフィルタにかけてもよい。

【００３２】本発明のさらなる利点は、複数の部位及び溶液を連続的に走査することで、部
位の位置を正確に判定し、また汚染等によって生じた偽りの結果が信頼を持って
示されることである。本発明のさらに別の利点は、結合：遊離の測定と同時に試料のメニスカスを判
定することができ、数学的解析において補正することができるという点である。

【００３３】

【発明の実施の形態】

ここで、本発明の一例を図面を参照しながら説明する。米国特許第5663057号は、水中の微生物を素早く検出する方法を記載している
。この方法の最終プロセスは、蛍光標識された細菌が保持された膜フィルタに対
してレーザを走査することが含まれる。システムは、分別及び閾値アルゴリズム
を組み合わせて使用することで、遊離標識の連続的バックグラウンド及びバック
グラウンド蛍光の中に埋もれた個々の細胞を検出する。各細胞に対して得られる
ライン振幅は、細胞の蛍光強度の正確な測定値であり、校正することで結合蛍光
体量の基準が得られる。ある程度の遊離標識が常に細菌の標識の際に存在してい
るが、そのような遊離標識は細菌の検出にとって不必要である。そこで、米国特
許第5663057号の方法では細胞内に標識を保持させることが可能となる限度で調
製することによって遊離標識が最小となるように、さらにまた多孔性の膜を使用
することで試料上の液体が最小となるように工夫している。これらのことから、
溶液中の標識濃度の測定にとって適当な液体が存在する一定かつ均質な層が存在
していない。システムは、平均バックグラウンド蛍光を測定する。このデータは
、参照目的のために集められるもので、微生物の検出には使用されない。図１は
、米国特許第5663057号で使用した装置の模式図であるが、この装置は本発明の
方法を実施するために改造されている。以下、この装置を詳しく説明する。

【００３４】図１を参照すると、レーザ１は一連のミラー及びビーム拡大器３によって送ら
れる照射光線２を発光する。次に、照射光線２は走査ミラー４及びレンズ５を介
して配向される。走査ミラー４は、図２を参照して後述するようにして、フィル
タ６及びアッセイ用試料７の表面に対する光線２の走査を制御することができる
。

【００３５】テレスコープをビーム拡張器３の位置に導入してもよい。それによって走査レ
ンズ５に対して異なる距離でスポットの焦点を結ぶことができ、或いは標的上で
のレーザ・スポットの大きさを制御することが可能となる。

【００３６】アッセイ用試料７からの光は、フィルタ６、レンズ７、及びミラー７を経て１
つ以上の受光ユニット８に戻る。この例では、受光ユニット８は、光電子増倍管
である。光電子増倍管８によって生じた信号は解析部９に送られる。解析部９は
、増幅及びサンプリング用電子機器１０が含まれる。増幅かつサンプリングされ
た信号は、さらにデータ処理手段１１へ送られる。該手段の動作については後述
する。処理手段１１の出力は、表示装置１２に送られる。表示手段１１は単純な
モニタ又はパーソナル・コンピュータであってもよい。

【００３７】図２を参照すると、どのようにして試料の表面積全体をカバーするようにして
光線２が連続的に試料用サンプル７を走査するかが分かる。各々の隣接した走査
線が先行する走査線と部分的に重なり合うようにして走査することが好ましく、
それによって特徴が見逃されてしまうような事態を確実に避けることができる。
部分的重なりについて補正可能なかたちで処理手段１１を構成することができる
。

【００３８】以下、本発明のシステムの動作原理を図３及び図４を参照しながら説明する。
図３は、試料を走査した時にどのようにしてライン増幅が得られるかを説明する
。図４は、アッセイの原理を説明する。

【００３９】実施例１本発明の単純な例を簡単に説明するために、以下のようないくつかの仮定を設
ける。

【００４０】１．レーザ光線は、πｒ²ｈの量を照射すると考える。ここで、ｒ＝光線の半
径（この実施例では３μｍ）、ｈ＝液体の深さである。これを照射光量（ＩＶ）
と呼ぶ。２．蛍光体溶液は希釈され、最小量のクエンチングが存在する。また、ボリュ
ーム・エレメント内の蛍光体の各分子は同一強度で発光する。

【００４１】３．細胞又はビーズは球形容積を有し、また細胞又は容積に結合した蛍光体分
子の全ては溶液にある場合と等しい蛍光を表す。これをビーズ容積（ＢＶ）と呼
ぶ。４．各ビーズ又は細胞が受容体の局所濃度を示すものと考えることができ、受
容体の数はビーズの体積によって分けられている。

【００４２】５．ボリューム・エレメントにビーズ又は細胞が存在しない場合（「非集団ボ
リューム／エレメント信号」）、検出器は遊離標識のみにもとづいて蛍光強度を
読み取る。このことは、強度容積「非集団ボリューム・エレメント」又はＵＶＳ
と呼ぶ。細胞又はビーズがレーザ・ボリューム・エレメント（「集団ボリューム
・エレメント）に存在する場合、強度信号は細胞又はビーズ上に濃縮された標識
の加算的な強度からなるだろう。この信号を「集団ボリューム・エレメント信号
」又はＰＶＳと呼ぶ。

【００４３】当業者は、これらの仮定を不正確なものと考えるかもしれないが、我々は実施
例３及び図１５乃至図２１で、これらの仮定が観察値と予測値との間に高い相関
性によって実施することが少なくなる方法を可能とさせるのに十分である。

【００４４】システムが以下の式で表される差を検出するために、細胞容積における蛍光分
子の濃度が等価容積の溶液よりも著しく高いか、もしくは低いことが必要である
。

【００４５】信号比ＰＶＳ／ＵＶＳ＝＜１＞

【００４６】細胞又はビーズに対する蛍光体の結合を示すため、多くの場合、我々はＰＶＳ
／ＵＶＳ＞１を目指す。細胞容積の輝度は、主に３つの因子に依存する。すなわ
ち、該因子とは、細胞又はビーズ上の結合部位（又は受容体）の数；結合定数Ｋ _d ；及び平衡状態での溶液中の標識リガンドの濃度である。

【００４７】また、表面に対する蛍光体の結合又は近接の範囲を測定することにも本発明が
使用可能であることを理解することができる。該表面は、蛍光体から出た光が局
所的に減少又は取り除かれるように、蛍光体を修飾するか、発光をマスク又はク
エンチングするものであってよい。例として、限定されるものではないが、酵素
による蛍光体化合物から非蛍光体化合物への変換；表面、ビーズ、又は細胞上の
クエンチング剤の存在による蛍光の減少；又は標識を細胞内に移動させ、蛍光体
のスペクトル特性を変化させることが挙げられる。

【００４８】もし遊離蛍光体の濃度が高すぎ、さらに／又は液体が深すぎるならば、標識細
胞を検出することは困難である。したがって、実際のアッセイではそれらのパラ
メータは検出可能な限度内に保たれていなければならない。図５は、Ｋ_dに対し
てプロットされたＰＶＳ／ＵＶＳ信号比についての予測値を与えるもので、この
場合の条件は、図示したように結合部位数が異なる直径が６μｍのビーズ、６μ
ｍ直径レーザ光線、液体の深さ１００μｍ、さらに平衡状態での標識リガンド濃
度が１ｎＭである。

【００４９】上記した仮定によって、各ビーズ又は細胞に結合したリガンドの分子数又は表
面濃度、及び遊離リガンドの濃度を推定することが可能となる。この場合、次式
である。

【００５０】［遊離］ ∝ ＵＶＳ［結合］ ∝ ＰＶＳ −（ＵＶＳ．（ＩＶ−ＢＶ／ＩＶ）

【００５１】ここで次式である。

【００５２】遊離標識の濃度＝［遊離］結合標識の濃度＝［結合］

【００５３】これは、例示した目的に対してかなり単純化された場合についてである。実際
には、いくつかの因子、例えばフィールドの深さ、液体の深さ、液体のメニスカ
ス、レーザ減衰量、クエンチングを補正する必要がある。測定精度を改善するた
めにこのモデルを補正する方法は、後の例で説明する。

【００５４】以下では本発明のより具体的な例について説明する。実施例２本発明の一実施形態の単純な例を図６に示す。４８ｎＭフルオレセインイソチ
オシアネート標識ビオチン（FITC−ビオチン）からなる溶液の５μｌ試料をスト
レプトアビジン（Dynalより入手）でコートした単一の直径２．８μｍビーズを
５μｌ溶液に添加する。試料を顕微鏡用スライドガラスの表面に１０μｌ液滴と
して走査機器に呈示した。照明及び集光は試料の上からされるよう配置した。装
置は、ｙ方向に２．２μｍのライン間ステップによりＸ方向に試料を横切る１μ
ｍ間隔で蛍光強度測定が行われるように設定した。レーザのスポット・サイズは
６μｍとした。これによって各走査線が部分的に重なりあう。表は、位置（試料
番号）に対する相対強度（アナログ対デジタル・コンバータ又はＡＤＣカウント
）をいくつかの隣接走査線についてプロットしてある。最初に、FITC−ビオチン
は、ビーズ上に濃縮されたストレプトアビジン部位に拡散するには不十分な時間
を有した。試料の走査は実験中、間隔を置いて行った。照射から得た信号が各ポ
イントでレーザの経路中にある標識（FITC−ビオチン）の分子数に比例する。も
し、この場合、標識が上記液滴全体で均質ならば各ポイントにおける信号は試料
を通るレーザの経路長に比例する。上位の線図はあきらかに各走査線が液滴を通
る横断面を示しており、この場合の液滴のメニスカスは予測通り半円球である。

【００５５】もし標識の濃度が知られているならば、試料の容積及び形状（この場合、液滴
）は計算によって推定することができる。また、続いて、もし溶液の容積及び高
さが分かっているならば、既知の溶液を有する装置をキャリブレーション後、得
られた強度信号から遊離標識の濃度を計算することが可能である。

【００５６】経時的に、FITC−ビオチンがビーズに拡散し、徐々にビーズの表面に集中する
（下方のプロット）。この実験では、３０分後に平衡状態に達する。ビーズ上の
信号は等量の溶液のものよりも高いことがわかる。また、このビーズからの信号
が溶液からの信号に加えられることが分かる（平衡状態でＰＶＳ／ＵＳＶ＝約６
．１）。

【００５７】実施例２では、測定が実施され、データが試料の各々のポイントに対して保存
された。この用途のために修飾されたケムスキャンＲＤＩ（Chemscan RDI）は、
３つの検出器チャンネルを有しており、４００ｍｍ²の一回の走査で６億回以上
の読み取りを行うことができる。分析をスピードアップし、保管のために保存を
要するデータ量を少なくするために、コンピュータに送られる最終分析のための
データ量を少なくすることが求められる。このことは、未加工データに対して閾
値アルゴリズムを適用することによって達成できる。本発明は、２通りの閾値ア
ルゴリズムを利用する。「頻度表」閾値化では、各測定を強度の値のテーブルに
置く。もし信号測定が事前に設定された割合（例えば２０％）でその点に対して
行われるならば、その測定はコンピュータに送られる。この閾値を超えない測定
の全てが破棄される。「動的閾値化」では、システムは信号の移動平均を計算し
、事前設定が移動平均よりも高いそれらの測定を保持する。また、信号応答の勾
配を連続的に測定し、該勾配又は該勾配の変化率が事前に設定された値又は該平
均の設定割合よりも大きいか、小さい場合にイベントの開始又は終了をトリガー
することで、動的閾値化することが可能である。

【００５８】頻度表閾値化は、試料中に明るい対象物が僅かしかなく、かつバックグラウン
ドが低い場合に良好に作用する。動的閾値化は、遊離標識が著しい濃度で存在す
る場合に個々の部位に基づいて信号を単離及び記録することができるという利点
を有する。

【００５９】１本以上の走査線に関する未加工データは、走査中にシステムによって短時間
保持される。このことは、ビーズ又は細胞等の対象物が閾値化によって検出され
た場合、バックグラウンド・データの残りを拒否する前に対象物に対して該対象
物のすぐ前後の測定試料が測定試料の残りによって保持されることを意味する。

【００６０】図７は、動的閾値を実行している間、米国特許第5663059号に示すようなケム
スキャンＲＤＩ装置によって液体試料中で検出された蛍光粒子の典型的な走査マ
ップを示す。左側走査マップは、見出された全ての蛍光粒子を表示し、右側走査
マップは本発明の実施形態の方法で実行されたアッセイの蛍光により標識された
ビーズに対して決定された特徴に一致する粒子を表示する。

【００６１】ビーズ又は細胞の寸法及び容積の推定図８は、典型的な標識ビーズに対するライン増幅を与えるものである。多くの
場合球形であるビーズ及び細胞は、Ｘ及びＹ方向において「半正弦波」である複
数のライン増幅プロット（Ｚ）を与える。これらのプロットはビーズ又は細胞の
正確な複製ではない。これはあくまでも近似である。例えば、プロトタイプは正
規分布であるビーム・エネルギーを有する。ビーズは球形である。したがって、
ビーズの真の幅に対する補正は正規分布と正弦波関数の組み合わせである。サン
プリング速度は走査速度よりも高い。例えば、試料が１μｍ間隔毎（２ｍｓ^-1で
走査、２ＭＨｚでサンプリング）に取られるが、レーザのスポット・サイズはよ
りいっそう大きい（直径６μｍ）。このことは、ビーズ又は細胞の真の直径が概
ねプロットの幅からレーザ・スポット径の２倍をひいたものであろうことを意味
している。既知の大きさのビーズは、装置のキャリブレーションに使用される。

【００６２】結合及び遊離蛍光測定ビーズ又は細胞がレーザ・スポット径よりも小さいか等しいならば、ライン増
幅プロット上のピーク強度は、ビーズ又は細胞に結合した蛍光体の量及びその上
の蛍光体溶液の容積に直接的に比例しなければならない。このことは、ＰＶＳと
して取られる。レーザのスポット・サイズよりも大きいビーズ又は細胞について
、ピーク強度値は、補正することができる細胞又はビーズの直径に比例した量に
よってアンダー・リードされる。３Ｄ−プロット下の領域もまた別のキャリブレ
ーションを有するＰＶＳを表すために使用することができる。ＵＶＳは、閾値アルゴリズムよって検出されたビーズ又は細胞の前後に取られ
た前（プレ）及び後（ポスト）試料から得ることができる。

【００６３】このようにして、収集された全ての未各データを記録することなく結合及び遊
離標識の両方で読み取りを得ることが可能である。最大で１００％までＵＶＳの
対応部分を差し引くことで結合標識に加えられた遊離ラベルからの信号に対して
補正を行うことができる。あるいは、動的閾値は、遊離標識寄与率の基準線をＰ
ＶＳに自動的に与え、結合標識はこの閾値以上のピークの高さ又は面積として取
られる。そのことは、集団ボリューム・エレメントに対するピーク強度値がこの
プロット上の最大値から得ることができ、また非集団ボリューム・エレメントの
強度がプロットの縁で前及び後試料から得られることを意味している。

【００６４】非集団ボリューム・エレメント信号もまたシステムによって記録された平均バ
ックグラウンド閾値から得ることができ、或いは走査のどこでも得られる最も低
い信号として得ることができる。

【００６５】統計的サンプリング及び分析個々のビーズ又は細胞は、結合部位の寸法、数、又は受容体発現等のキー・パ
ラメータにおいて大きく変動し得る。これらの理由から、定量的データを集める
際に、僅かのビーズ又は細胞からの信号の測定に依存することは賢明ではない。
本発明の方法では、著しい数のビーズ又は細胞が使用可能である（一般に一試料
中に１００〜１０００）。ビーズ又は細胞全体のピーク又は平均強度等のキー・
パラメータは、個々に記録され、このデータは次に効果的に集団として処理され
る。各ビーズ又は細胞は、効果的に分離アッセイであり、その集団に対して得ら
れたデータは一般に正規分布（図９を参照）である。

【００６６】本発明は集団統計学を利用して後に続く数学的分析に対して正確なデータを提
供する。標的部位のピーク強度又は面積強度及び隣接遊離標識強度の値は、試料
内の全ての部位に対して記録される。このデータは、頻度ヒストグラムとしてプ
ロットされる。正規分布適合（Gaussian fit）が集合データに与えられ、平均値
が戻される。この同一正規分布適合法は、寸法、形状、及びスペクトル特性等の
他の主要な判別手段についての頻度ヒストグラムに適用される。図１０は、バッ
クグラウンド・ノイズ閾値切り捨てに近似した強度を持つビーズ集団のピーク閾
値に対する頻度ヒストグラムを示す。それらのデータをガウス集団に適合させる
ことは、平均が検出可能な閾値以下の無視できる結果である集団の正確な表示を
与える。図１１は、同一集団の異なる測定に対するヒストグラム間の相関性を示
す。図１２は、汚染された粒子の集団の「正規分布形状（Gaussian shape）」判
別のための典型的な判別式を示す。汚染粒子の集団がそれ自身正規分布ではない
ことに注目する。

【００６７】液体メニスカスの影響に対する補正液体メニスカスは、アッセイを実行する際に問題となる。ウェル内で、及び試
料の上から走査する場合に１つのウェルから次のウェルで正確かつ再現性ある測
定を可能とするために、液体を通した一定の経路長（均一な深さ）が必要である
。メニスカスはまた、レンズとしても作用し、焦点をずらしてしまう。残念なこ
とに、同一ウェル内で可能な凸状及び凹状の両方のメニスカスを有する薬物スク
リーニングのための少量（＜１μｌ）に生ずるメニスカスを制御することは非常
に困難である。図６は、液体試料のメニスカスをプロットするための装置の能力
を説明するためのものである。この試料は、平坦なスライド上にある液滴であっ
た。システムは、上又は下から走査して、マイクロウェル内の試料のメニスカス
をプロットするためにも使用される。遊離ラベル濃度は試料の容積全体にわたっ
て実質的に一定であり、したがってＵＶＳはメニスカスをプロットするのに使用
することができ、その悪影響を訂正するためにデータに対して数学的適合を行う
ことができる。データは、動的閾値化によって検出された部位から得られた信号
からＵＶＳをプロティッグすることで大きく減少させることができる。このよう
にして、数千部位（例えば、細胞）が数千のＵＶＳ読み取りを提供し、たとえよ
り低い解像度でも、補正に十分なほどプロットされるメニスカスを可能とする。
ＰＶＳ／ＵＶＳ比はピーク強度（ＰＶＳ）及び前及び後試料の平均（ＵＶＳに関
して）によって各部位について決定することができる。

【００６８】キャリブレーション検出器から得られた信号は、レーザの直径や液体の深さに対して常に関係して
いるわけではない。例えば、以下のことがいえる。

【００６９】１．レーザ・スポットは、好ましくはウェルの底面に対して焦点が合わせられ
る。光学系のセットアップに応じて、焦点深度はスポット径によって変えること
ができる。実験系では、６μｍのレーザ・スポット寸法によって焦点深度が±２
６μｍとなる。これを１０μｍに増加させることで、±７４μｍの焦点深度が得
られる。もし液体の深さが焦点深度よりも大きければ、レーザのボリューム・エ
レメントの一部は、焦点から外れる。２．集光角度は、遠くにあるものよりもより効率的である検出器に最も近接し
た液体中の標識分子からの集光によって制限される。

【００７０】３．界面、特に液体と空気との界面での放出されたは光の反射は、液体中の標
識分子からの光の回収効率を減少させる。４．レーザの経路にある分子は、得られた信号が所定の経路長に関して濃度に
対して非線形的関係となるように励起又は発光を減衰させる。５．検出器は、その範囲のいくつかに対して非線形である。

【００７１】これらの問題は、既知の深さ及び蛍光体濃度の溶液に分散された既知の検出体
含有物及び寸法のビーズによってシステムをキャリブレーションすることで補正
することができる。得られた値はソフトウェアの「ルックアップ」テーブルで使
用することができ、又は実施例１に記載の基本的数学モデルを訂正するためにア
ルゴリズムを誘導する際に使用することができる。そのようなアルゴリズムを使
用することで、既知の蛍光体濃度からなる流体の深さ、既知の深さの流体の蛍光
体濃度、蛍光体溶液中で対象物に結合又は関連付けられた蛍光体の量を正確に推
定することができる。

【００７２】レーザ・スポットは、ビーズ又は細胞が置かれているプレートの底部に焦点が
合わせられる。磁気によってビーズがレーザの焦点面に引きずり込まれるように
、磁気ビームを使用することができる。溶液の大部分は焦点深度の範囲内にある
のではないが、光錐によって照射される。しかし、検出器のピンホールは、スポ
ット・サイズよりもかなり大きい面積を有しており、この光錐からの発光が集光
される。したがって、我々は光線を全く平行にしたとき得られるであろう信号と
類似の蛍光信号を得る。これによって、たとえレーザの焦点深度を超えても任意
の低蛍光体濃度に対する信号と液体の深さとの近線形相互関係が与えられる。

【００７３】図１３は、一定の深さ及び既知の濃度のフルオレセイン溶液による装置のキャ
リブレーションを示す。図１４は、既知のフルオレセイン含有物（シグマ・ケミ
カル（Sigma Chemical Co.））からなり、サイズが液体の既知の深さの範囲内で
あるビーズによる装置のキャリブレーションを示す図である。

【００７４】判別（Discriminants）の適用実施例２では、リガンド／受容体結合のＫ_dはたいへん低く、部位上の受容体
の濃度は相対的に高い。このモデル実験では、我々はバックグランド汚染からの
著しい干渉を予測していなかった。実際のアッセイでは、特に薬物発見の場合、
Ｋ_dがよりいっそう低く、かつ受容体の濃度がよりいっそう低くなることが一般
的である。Ｋ_dが１０^-9である場合、一般的におそらく50,000〜100,000個の受容
体が細胞に存在し、又は数十万個の受容体がビーズ上に存在する。また、コスト
削減又は受容体の飽和を避けるために低濃度の標識リガンドを使用することが望
ましい。このことによってアッセイからより少ない信号が導かれる。アッセイの
構成成分、特に細胞培養成分や標識リガンド・ストック由来の微粒子から自然に
生ずるバックグラウンドの自己発光は、アッセイしている部位と等しいか、又は
それ以上の輝度を有することができる。実地体験によれば、現実のアッセイでは
標識部位のものと同様の輝度で１μｌ中60,000ほどの汚染された対象物が存在す
ることが示される。

【００７５】バックグラウンド汚染を減少させるための生物学的試料の精製は高価であり、
しばしば活性を減少させる。最小限の成分精製でアッセイを実施可能とすること
が望まれる。

【００７６】本発明は、米国特許第5663057号に記載されたライン間の相関、寸法識別、正
規分布形状基準、色識別、及び他の識別を利用して汚染された対象物からの信号
を拒否する。これらの識別は、バックグラウンドよりもかなり明るく標識された
細菌をポジティブに特定かつ計数するために開発されたもので、標的分析物が汚
染よりも明るくはない生物化学的アッセイにおけるバックグラウンド汚染を拒否
する上で常に妥当なものとはいえない。したがって、本発明を実施するために新
たな識別がこの方法に加えられた。

【００７７】装置の感度の限界に近いバックグラウンド・ノイズは、しばしばプライマリ・
チャンネルの標的と類似の正規分布形状を示すことができる。低強度信号に対し
て、本発明は検出器間の相関を用いる。標的対象物は、電気的ノイズ等のバック
グランド・ノイズがない１つ以上の検出器チャンネルにおいて正規分布である信
号を与える。

【００７８】細菌の検出は、希に起こる現象の検出に向けられる。各現象の相対的強度は重
要ではなく、閾値以上に設けられている。本発明は、結合ラベル及び遊離ラベル
の両方に対して強度の値を必要とする。この例は、ビーズに基づくアッセイの解離定数を推定し、活性化合物によって
この結合の競合阻害の範囲を測定するために、本発明の方法がどのようにして適
用されるかを例証する。図４は測定原理を示す。

【００７９】受容体によって被覆された磁気ビーズを調製する。ビーズ上の受容体の数は、
標識リガンドからなる溶液でビーズをインキュベートすることで推定される。リ
ガンドの濃度は、結合のための予測Ｋ_dを上回る。結合リガントの量は、磁石に
よって装置の焦点にビーズを引き込み、さらに懸濁液を走査することによって測
定される。動的閾値アルゴリズムを使用してバックグラウンドよりも著しく明る
い対象物のみを検出する。半値幅、寸法、スペクトル比、ガウス形状等の複数の
識別からなる一組の識別を未加工のデータに適用し、ビーズの特徴に一致する対
象物のみが表示される。

【００８０】ビーズに対する測定の全てに対するヒストグラムをプロットし、かつパラメー
タ毎にガウス分布をチェックすることで、システムが実際にバックグラウンドの
汚染粒子からビーズが識別したことを確認する。遊離リガンドにもとづく信号は
、ビーズからの信号に隣接して測定してもよい。あるいは、閾値アルゴリズムを
バックグラウンドがゼロとなるように、またこのバックグラウンドよりも上のピ
ークのみが測定されるように設定してもよい。このようにして、遊離ラベルにも
とづく信号は、全信号から差し引かれ、ビーズの信号のみが与えられる。

【００８１】ビーズとして確認された全ての対象物のピーク又は平均強度を周波数ヒストグ
ラムにプロットする。ガウス適合は、このヒストグラムに対してなされ、分布の
中心にある強度の値は、集団に特有なものである。ビーズに結合した蛍光体（し
たがって受容体）の分子数を周知の蛍光体含有物からなるビーズに対して得られ
たキャリブレーション曲線と得られた蛍光値とを比較することによって計算され
る。

【００８２】結合のＫ_dは、予測Ｋ_dを下回る標識リガンド濃度でアッセイを繰り返すことで
推定してもよい。ピーク強度値分布の中間に対して平衡状態で結合標識リガンド
の適量が得られる。平衡状態での遊離リガンド濃度は、ビーズに隣接した溶液の
信号から得られる。ビーズの容積を推定して数学的補正をビーズに対して測定し
た半値幅に適用してもよい。

【００８３】ビーズの容積及びビーズあたりの受容体分子の平均数がここで分かる。これは
、局所濃度として表すことができる。レーザによって照明された遊離ラベルの容積及び平衡状態でのその容積の濃度
がここで分かる。結合に関する解離定数の基準は、今や以下に記述する数学的モデルを適用する
ことで計算することができる。

【００８４】単純化した数学的モデル図４を参照すると、可逆的受容体：リガンド相互作用のＫ_dは、受容体分子が
細胞又はビーズの容積全体に等しく分散されていると考えられる受容体の局所濃
度を表していると仮定することで推定される。我々はビーズ受容体濃度（Ｂ_R）
と呼ぶ。この作業仮説は、ビーズ及び細胞の寸法、さらに実際のアッセイで使用
される結合受容体数についてについて実際面で十分に作用する。よって、次のよ
うになる。

【００８５】ＢＶ＝ビーズ容積Ｎ_RB＝ビーズあたりの受容体の平均数Ｂ_R＝Ｎ_RB／（ＢＶ×アボガドロ数）

【００８６】遊離リガンド濃度は、バルク・リガンドのリガンド濃度と推定され、また実質
的に一定であると推定される（遊離リガンドの感知可能な減少なし）。Ｋ_d対Ｐ
ＶＳ／ＵＶＳの推定値を得るために、以下のように仮定する。

【００８７】Ｎ_LB＝各ビーズの標識リガンド分子の予測数（Ｌ）＝バルク遊離リガンド濃度ＩＶ＝レーザ光線の照射容積Ｎ_LB＝［Ｌ］×Ｎ_RB×ＢＶ×アボガドロ数／（Ｋ_d＋［Ｌ］）ＵＶＳに含まれるリガンド分子の数＝［Ｌ］×ＩＶ×アボガドロ数ＰＶＳ＝｛（ＩＶ−ＢＶ）×［Ｌ］×アボガドロ数｝＋Ｎ_LB

【００８８】したがって、モデルは、図４にプロットしたようにＫ_d対ＰＶＳ／ＵＶＳであ
ってもよい。このプロットが得られると、結合のＫ_dが遊離リガンド濃度の幅広
い範囲にわたって得られたＰＶＳ／ＵＶＳ信号の信号測定から推定することがで
き、結合又は遊離標識が変化している複合アッセイに適用することができる。こ
の数学的モデルは、実施例３のＰＶＳ／ＵＶＳの実験結果と良好な相関関係を示
した。

【００８９】この方法は、連続希釈を試験する必要無しに単一測定によってＫ_dの推定を可
能とするが、測定精度を改善するために連続希釈を適用してもよい。表面上の受
容体のＫ_dを溶液中のそれから変化させてよいが、受容体は最もしばしば細胞膜
上又は細胞膜内に見出される。この方法は、自然環境で生物学的分子に対するＫ _d を推定するための手段を提供する。

【００９０】この計算は、装置内のソフトウェアに実装された数学的モデルに変形可能であ
る。装置は、ビーズ又は細胞に対するメジアン・ピーク強度信号、ビーズ又は細
胞の数、それらの真の寸法、及び遊離蛍光による信号を自動的に決定する。それ
らの値を数学的モデルに適用してリアル・タイムでＫ_dの基準を計算する。装置
はまた結果の精度に関して統計的信頼度も推定することができる。

【００９１】活性化合物（例えば、候補薬物）は、化合物をモデル・アッセイに添加した時
に観察された結合：遊離信号比の変化から測定することができる。このようにし
てＩＣ５０を推定することができ、また化合物のＫｄをさらに推定することが可
能である。

【００９２】プルーフ測定実施例３と我々が言及する特異的測定例は、上記の理論的仮定を確認するため
に実行され、このことはここで図１５乃至図２１を参照して説明する。

【００９３】この実施例では、試薬は、５．５μｍ直径、結合能１．４８μｇマウスＩｇＧ
／ｍｇビーズのヤギ抗マウス抗体被覆ポリスチレン・マイクロスフェアであって
、バングズ・ラボラトリーズ社（Bang's Laboratories, Inc., 9025 Technology
Drive, Fishers, IN 46038-2866, USA.）によって供給され、４℃保存のホウ酸
緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、０．１％牛血清アルブミン、０．０５％Twee
n、１０ｍＭ EDTA、及び０．１％アジ化ナトリウムを含む）中、１．０４５×
１０⁸ビーズ／ｍｌ含まれる。

【００９４】マウスＩｇＧ、ｋ（MOPC−２１）、フルオレセイン・イソチオシアネート（FI
TC）結合体、リン酸緩衝液食塩水（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４、１％牛血清アルブ
ミン、及び１５ｍＭアジ化ナトリウム含む）中、免疫グロブリン濃度２００μｇ
／ｍｌ、タンパク質濃度２００μｇ／ｍｌ、フルオレセン／タンパク質モル比５
．８。特異性（免疫電気泳動）：抗マウス全血清、抗マウスＩｇＧ１、及び抗マ
ウスＩｇＧｋ（接合に先立って）に対比して単一円弧状の沈降。

【００９５】特異性（オークターロニー二重免疫拡散法）：抗マウスＩｇＧ１による単一円
弧状の沈降、抗マウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ又はＩｇＡと
は反応せず（接合に先立って、供給元：シグマ（Sigma, 3050 Spruce Street, S
aint Louis, Missouri 63103, USA）。 Dubelccoのリン酸緩衝液食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭ塩化ナト
リウム含む、カルシウム又はマグネシウム無し）。供給元：ライフ・テクノロジ
ー社（Life Technologies Ltd., P.O. Box 35, 3 Fountain Drive, Inchinnan B
usiness Park Paisly, PA4 9RF,UK）.

【００９６】 450,000分子当量可溶性フルオロクローム（450,000MESF）の量子蛍光ビーズ、
直径７〜１０μｍ、界面活性剤及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝
液中、約２×１０⁶ビーズ／ｍｌ（製品技術速報からの情報）。供給元、シグマ
（Sigma）。フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）異性体１、純度約９８％（HPLC
分析）。供給元、シグマ（Sigma）。

【００９７】アッセイ仮説の立証にとって最初に必要とされることは、一定の経路長での蛍
光と蛍光体濃度との相互関係、及び一定の蛍光体濃度での蛍光と経路長との相互
関係が線形であることを確立することである。立証で必要とされる２つの生化学的パラメータは、結合相互作用のＫ_d、及び
ビーズ上の利用可能な結合部位の最大数である。これらは両方とも単一ビーズ滴
定実験によって測定することができる。Ｋ_dは２つの測定のより明確なものであり、最大ビーズ蛍光の大半が生ずる蛍
光リガンドの濃度に相当し、平均ピーク高の後に部分的に過剰リガンド溶液の強
度に対して補正される。

【００９８】ビーズ上の利用可能な部位の最大数は、一定の経路長さ及びＰＭＴ利得でリガ
ンド濃度に対して遊離リガンドの凝集体蛍光をプロットすることで見出すことが
できる（アッセイは溶液の欠乏を生ずることがない条件下で行うべきである）。
リガンド濃度に対比させて蛍光をプロットした後、補正平均ピーク・ビーズ強度
の蛍光に等しい溶液蛍光を有するリガンドの濃度を得ることができる。この値及
び経路長は、適当な計算ソフトウェアに入力され、レーザ経路における蛍光リガ
ンド分子の有効数が計算される。ビーズあたりの部位有効数はこの番号に等しい
。経路長に対比した溶液蛍光の応答がこの計算に関して線形であることが重要で
ある。

【００９９】ここで注目すべきことは、レーザ光の経路が円錐状となるだろうが、我々のモ
デルはこの円錐内の蛍光体分子の有効数を、照射された容積がレーザ・スポット
の直径に等しい直径の円柱のものであると仮定することによって計算することが
できる。

【０１００】使用したビーズが半透明であることから過剰蛍光体溶液の蛍光に対してビーズ
強度の値を補正することが重要であり、それによってレーザ光による任意の過剰
蛍光体の励起が可能となる。蛍光集光用ピンホールは直径が２ｍｍであり、した
がって溶液蛍光の大部分が集光されるようにしてビーズを通過する必要がない。
このことは、一定の深さ（２０μｍ）で異なる濃度のフルオレセン溶液（ＰＢＳ
中；ブランク、０．２５μＭ、０．５μＭ、及び１．０μＭ）で450,000MESF
ビーズの蛍光を測定することで実験的に提供される。フルオレセイン濃度に対す
る未補正ビーズ蛍光のプロットによって直線が与えられ、溶液蛍光の１００％を
差し引くと、全てのビーズが同様の強度を呈した（図１７）。

【０１０１】蛍光に対する平均補正ビーズ蛍光の比を、Ｋ_d、利用可能な受容体部位、経路
長、及び蛍光体濃度の入力値を用いてソフトウェアによって予測された結合対遊
離読み取りに対してプロットすることができる。もしモデルが正確であり、Ｋ_d
及び利用可能な受容体部位の値が補正されるならば、予測した結合対遊離蛍光に
対比させた測定された結合対遊離蛍光のグラフは、勾配が１の直線とすべきであ
る。

【０１０２】蛍光と蛍光体濃度との直線的な関係の実験による確認は、一定の光電子増倍管
ゲイン、かつ一定の経路長（５００μｍ）でDubelccoのＰＢＳ中、０．１μＭか
ら１μＭまでの濃度範囲のいくつかのフルオレセイン溶液の蛍光を測定すること
によって行った。経路長は、副尺付きカリパスで所望の深さに設定された異形プ
ランジング・デバイスをフルオレセイン溶液に挿入することによって固定した。
凝集蛍光モード（遊離溶液からのデータ収集を可能とするために効果的に止まっ
た閾値化）に設定された上記装置上で溶液を走査し、蛍光読み出しが走査プロフ
ァイルから推定した平均蛍光であった。フルオレセイン濃度に対して蛍光をプロ
ットすると直線が得られる（図１５）。一定のＰＭＴゲインで用いた濃度で蛍光
と経路長との間の直線的な関係は、フルオレセインの１μＭ溶液を用い、かつ副
尺付きカリパスで設定されたプランジング・デバイスの深さを変えることで、同
様に達成された。経路長に対して蛍光をプロットすることで直線が得られた（図
１６）。

【０１０３】１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１．０μＭ
の濃度でMOPC−２１−FITC接合体からなる溶液をDubelccoのＰＢＳで調製した。
ヤギ抗マウス・ビーズをボルテックス（Vortex）混合器によって再懸濁させ、Du
belccoのＰＢＳで２，５００ビーズ／μｌの濃度まで希釈した。この希釈された
ビーズ懸濁液を次にMOPC−２１−FITC液の各々に添加した（２μｌビーズ＋１０
０μｌ溶液で最終濃度が５０ビーズ／μｌとなる）、ＰＢＳ緩衝液ブランクが含
まれた。混合後、反応管を暗所、室温で、たまに混合しながら３時間インキュベ
ートした。

【０１０４】複数のビーズ懸濁液（各々が５０μｌ）の走査は、試料の深さを２００μｍに
固定し、上記した装置で透明な底部のマイクロタイタ・プレートを用いて、下か
ら行った。

【０１０５】閾値アルゴリズムを各々のビーズをピックアップするように設定し、データを
ピーク強度及び半値幅について収集した。溶液の蛍光値（ＵＢＳ）は閾値をオフ
にし、粗粒プロファイルを走査する。溶液蛍光値を表示された走査プロファイル
の中間として取る。各溶液濃度に対する未補正ビーズ平均ピーク高蛍光強度（Ｐ
ＶＳ）を走査結果画面から、標準偏差の値、及び確認された結果の番号と共に取
った。ビーズのみによる信号を単離するために、溶液蛍光を各データ・ポイント
について平均ピーク強度蛍光値から差し引いた。次に、補正ビーズ蛍光をMOPC−
２１−FITC濃度に対してプロットした（図１８）。このプロットから、２次リガ
ンド結合が開始されて１００ｎＭの上記リガンド濃度がおそらく抗体間自己結合
によって開始されていることが明らかとなった。したがって、１００ｎＭに対す
る滴定曲線（図１９）をプロットすること、及び相互作用のＫ_d及びビーズあた
りの利用可能な受容体数を、MOPC−２１−FITC濃度に対比させて輸液蛍光をプロ
ットした後、このグラフから上記したようにして推定することが決定される（図
２０）。実験に基づく結合対遊離結果を、予測された値に対してプロットした（
図２１）。

【０１０６】結合相互作用のＫ_dは、１．２nmol／lであることがわかり、また利用可能な結
合部位／ビーズの最大数は245,000であることがわかった。予測したＰＶＳ／Ｕ
ＶＳ比に対する実験に基づく結合対遊離比のプロットは、勾配が１．８６の直線
状となった。この証明において、直線性は勾配よりもよりいっそう重要である。
なぜなら、レーザ・スポットの大きさが６μｍであると仮定され、この値の任意
の変化が直線的な様式で予測されたＢ／Ｆ値に悪影響を及ぼすと思われるからで
ある。

【０１０７】この例では、結合のＫｄ、ビーズ又は細胞の大きさ及び容積、ビーズ又は細胞
上の結合部位の数、遊離標識濃度、及びアッセイ中の結合部位の占有率を、本発
明の装置が測定及び推定するために使用可能であることを確証する。さらに、ひ
とたびキャリブレーションが行われると、本発明のシステム及び方法を使用して
、得られた測定に対して単純な数学的モデルを用いることで一連の希釈又は分離
を必要とすることなく、単一のウェル内での可逆的結合相互作用のＫＤを推定し
てもよい。この基本原理は、複合解離定数を含むより複雑な相互作用の測定に適用するこ
とができ、また競合化合物のＫＤを推定するためにも使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明を適用するために構成された装置の模式図である。

【図２】図１の装置の走査プロセスを示す図である。

【図３】２つのアッセイ部位に適用される本発明の方法及び装置の模式的
側面図である。

【図４】本発明の基本理論的要素を説明するための図である。

【図５】本発明の基本理論的要素を説明するための図である。

【図６Ａ】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階
で本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図６Ｂ】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階
で本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図６Ｃ】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階
で本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図７】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階で
本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図８】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階で
本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図９】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階で
本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図１０】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階
で本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図１１】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階
で本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図１２】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階
で本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図１３】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階
で本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図１４】アッセイが実行されているプロセスの過程における種々の段階
で本発明にもとづく装置の出力を示す一組のグラフである。

【図１５】理論的仮説を提供する第３の実施例に関連した一組のグラフで
ある。

【図１６】理論的仮説を提供する第３の実施例に関連した一組のグラフで
ある。

【図１７】理論的仮説を提供する第３の実施例に関連した一組のグラフで
ある。

【図１８】理論的仮説を提供する第３の実施例に関連した一組のグラフで
ある。

【図１９】理論的仮説を提供する第３の実施例に関連した一組のグラフで
ある。

【図２０】理論的仮説を提供する第３の実施例に関連した一組のグラフで
ある。

【図２１】理論的仮説を提供する第３の実施例に関連した一組のグラフで
ある。

【符号の説明】

１レーザ２光線３ビーム拡大器４走査ミラー５レンズ６フィルタ７アッセイ用試料８受光ユニット（光電子増倍管）９解析部１０増幅及びサンプリング用電子機器１１データ処理手段１２表示手段

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１２月１２日（２０００．１２．１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 DA02 DA06 EA01 FA02 GA02 GB03 HA01 HA02 HA15 JA02 KA09 LA02 MA01 NA01 NA02 2G045 CB01 CB21 FA11 FB02 FB03 FB07 FB12 GC15 JA01 JA07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１つの成分が他の成分に結合する量を判定する非分離アッセイ
を実施する方法であって、溶液に第一成分を提供するステップと、濃縮された第二成分が内部又はその上に置かれる複数の部位からなるアレイを
提供するステップと、前記複数の部位からなるアレイを前記溶液に浸すステップと、前記複数の部位を照射する間溶液を透過するような照射光線によって前記複数
の部位からなるアレイを走査するステップと、前記照射中に少なくとも一つの波長で前記複数の部位の各々及び前記溶液から
の受光強度を判定するステップと、前記受光強度を用いて、前記溶液のみを示す参照値と第二成分に対する第一成
分の結合量を示す値とを判定するステップとを有することを特徴とする方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法において、前記照射光は、レーザ光線に
よって生ずることを特徴とする方法。
【請求項３】請求項１又は請求項２に記載の方法において、前記受光された
光は蛍光によって生じた光であることを特徴とする方法。
【請求項４】前記請求項１〜３のいずれかに記載の方法において、複数の波
長の光を受光することを特徴とする方法。
【請求項５】前記請求項１〜４のいずれかに記載の方法において、前記受光
強度は、各部位の大きさ及び／又は容積、及び前記部位に結合した分子の数を判
定するために用いられることを特徴とする方法。
【請求項６】前記請求項１〜５のいずれかに記載の方法において、前記照射
光は、発光によって前記試料の上又は下から照射するように配置され、前記発光
は、前記照射光が前記部位と前記部位上又は前記部位に隣接した溶液の有意な容
積との両方に照射されるようにして任意の組み合わせで試料の上又は下から検出
されることを特徴とする方法。
【請求項７】前記請求項１〜６のいずれかに記載の方法において、前記光源
は、１回の走査が次の回の走査と重複部分を生ずるようにして直線上に前記溶液
及び複数の部位を走査し、それによって受光した光強度の連続測定が可能となる
ことを特徴とする方法。
【請求項８】前記請求項１〜７のいずれかに記載の方法において、前記受光
強度の関連データは、処理を用するデータ量を減少させるために固定閾値又は可
変閾値を用いてフィルタにかけられることを特徴とする方法。
【請求項９】前記請求項１〜８のいずれかに記載の方法において、閾値を用
いて、前閾値信号試料及び後閾値信号試料が個々の対象物各々に隣接した遊離標
識の基準として使用され得るようにバックグラウンド遊離標識信号から関連結合
部位を有する個々の対象物を単離するステップと、液体メニスカスの効果を補正
するステップとを有することを特徴とする方法。
【請求項１０】前記請求項１〜９のいずれかに記載の方法において、フィン
ガ−プリント又はディスクリミナントを使用して、前記結合部位に関連した前記
結合遊離信号を判定する前に、バックグラウンド汚染粒子から、関連結合部位を
有する個々の対象物の集団を検出することを特徴とする方法。
【請求項１１】溶液中の１つの成分が複数の部位からなるアレイの他の成分
と結合する量を判定する非分離アッセイを実施する装置であって、前記複数の部位を照射する間に溶液を透過するような照射光線によって前記複
数の部位からなるアレイを走査する走査手段と、前記照射中に少なくとも一つの波長で前記複数の部位の各々及び前記溶液から
の受光強度を判定する手段と、光強度を受け、前記溶液のみを示す参照値と前記第二成分に対する前記第一成
分の結合量を示す値とを判定する手段とを有することを特徴とする装置。
【請求項１２】請求項１１記載の装置において、前記走査手段はレーザ光線
を有することを特徴とする装置。
【請求項１３】請求項１１又は請求項１２に記載の装置において、複数の波
長からなる光を受光することを特徴とする装置。
【請求項１４】請求項１１〜１３のいずれかに記載の装置において、前記判
定手段は、前記受光強度を用いて、各部位の大きさ及び／又は容積、及び前記部
位に結合した分子の数を判定することを特徴とする装置。
【請求項１５】請求項１１〜１５（訳注「請求項１１〜１４」の誤記と思
われる）のいずれかに記載の装置において、前記照射光は、発光によって前記試
料の上又は下から照射するように配置され、前記発光は、前記照射光は前記部位
と前記部位上又は前記部位に隣接した溶液の有意な容積との両方に照射されるよ
うにして任意の組み合わせで前記試料の上又は下から検出されることを特徴とす
る装置。
【請求項１６】請求項１１〜１５のいずれかに記載の装置において、前記光
源は、１回の走査が次の回の走査と重複部分を生ずるようにして直線上に前記溶
液及び複数の部位を走査し、それによって受光強度の連続測定が可能となること
を特徴とする装置。
【請求項１７】請求項１１〜１６のいずれかに記載の装置において、前記受
光強度の関連データは、処理を要するデータ量を減少させるために固定閾値又は
可変閾値の前記判定手段を用いてフィルタにかけられることを特徴とする装置。
【請求項１８】請求項１１〜１７のいずれかに記載の装置において、前記受
光した光は、前記遊離標識からの前記蛍光の実質的割合を検出可能とするような
固定された又は調整可能なピンホールを介して集光されることを特徴とする装置
。