JP2002526743A

JP2002526743A - アナライト検出算出法

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Publication number: JP2002526743A
Application number: JP2000548701A
Authority: JP
Inventors: スタルジイ、ティモシイ、ダブリュ; クラーク、スコット; ロビンソン、メアリイベス
Original assignee: アクセラ８テクノロジーコーポレイション
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-13
Publication date: 2002-08-20
Also published as: IL139631A0; NZ508062A; AU4190099A; WO1999058948A2; CA2331787A1; EP1188059A2; WO1999058948A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、固相固定、信号発生に適合する特定のアナライト標識及びその利用のための対応する処理を用いたアナライト検出のための光学的方法及び装置に関する。ここに記載する算出検出法は、信号観察のための領域を狭め、それにより検出可能な信号対背景比を改良する。装置は、標識付けした試料（アナライト錯体）を結合した試料台を固定するためのプラットホーム／支持体、放射線源、放射線を発生し、前記試料にそれを向けるための光学的装置、及びデーターを収集分析するため機構からなる。その装置を連携させることにより、試料は背景信号から区別することができる信号を発生し、それらの両方を信号検出器で収集し、影像し、データー処理装置への試料像を発生する。前記装置は信号測定値を受け、今度は個々の結合事象を列挙する。発生した信号は選択した量増大により増大することができる。本発明の個々の結合事象を検出する算出検定方法は、例えば、アナライトの検出、又は研究、商業的及び注意点適用の両方での結果を確認するための分析に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、分子生物学、生化学、微生物学、及び生化学的研究、特にアナライ
ト(analyte)を検出する一般的分野に関し、一層特別には、個々の結合事象(bind
ing event)を検出するための算定検定法及び装置に関する。本発明は、量(mass)
の変化を発生、検出、及び測定することができる固相固定及び光学的信号を用い
て低い濃度の問題の特定分子（アナライト）を検出することができる。

【０００２】（背景技術）検出下限（化学的検出感度の閾値）を向上させることは、リガンド結合検定発
展の、その発端以来の主要な目的になっている。固相上の物質量との種々の光学
的相互作用の関係により定まる光学的検出方法は、特定のエリプソメトリーでは
、原理的に別の信号発生方法と比較して、標準的結合反応、例えば、酵素／基質
相互作用、蛍光発光、放射線発光、及び着色発光に対し高度の感度を与えること
ができることは以前から認識されている。結合用錯体の量を増加して、発生する
光学的信号を増幅することができることも認識されている。この目的のために、
結合用錯体に多量の物質を接合(conjugate)することに成功できることも実証さ
れている。この方法の一例は、光学的エリプソメトリー免疫検定〔オプテスト(O
pTest)(商標名)、ＤＤｘ社(DDx，Inc.)〕、即ち、生物学的試料と光との相互作
用を測定する分子微視的規模の事象についての検出装置によって与えられている
。

【０００３】従来技術では、アナライトを検出するための幾つかの影像法が報告されている
。「特殊結合事象を検出するための光散乱光学的導波管法」(Light Scattering
Optical Waveguide Method of Detecting Specific Binding Events)と題するス
ティンプソン(Stimpsom)その他による米国特許第５，５９９，６６８号明細書に
は、ビデオ影像により組合せた標識付けされた微小球（ビーズ）と肉眼観察とを
用いて、導波管へ導入した光の散乱を検出するＤＮＡハイブリッド形成(hybridi
zation)影像器が記載されている。導波管装置は固相として要求されており、影
像はＣＣＤカメラ及びフレーム・グラバー(frame grabber)ソフトウエアーによ
り達成されている。

【０００４】「デジタルアナライト検出装置」(Degital Analyte Detection System)と題す
るアレン(Allen)その他による米国特許第５，４８８，５６７号明細書は、アナ
ライト粒子の存在を、その照射に基づいてデジタル検出することに関する。試料
の明確なピクセル領域を照射し、発生した信号を検出する。

【０００５】「生物分子相互作用の可視化のための影像エリプソメトリーに基づくバイオセ
ンサーの概念」(A Biosensor Concept Based on Imaging Ellipsometry for Vis
ualization of Biomolecular Interactions)〔ジン(Jin)その他、Anal. Biochem
., 232:69 (1995)〕には、新規な光学的バイオセンサー装置が教示されている。
このバイオセンサー装置は、データーを収集するために、蛋白質パターン化表面
及び影像エリプソメトリー及びＣＣＤカメラと組合せて、生物分子相互作用の特
異性を利用している。

【０００６】ＣＣＤカメラとフレームグラバー板と組合せた影像エリプソメトリーの一般的
使用は、「微視的影像エリプソメーターの性能」(Performance of Microscopic
Imaging Ellipsometer)〔ビーグルホール(Beaglehole)、Rev. Sci. Instrum., 5
9(12):2557 (1988)〕に記載されている。生命科学又は生物学的装置の型の影像
適用については何も示唆されていない。

【０００７】「金標識付け抗体及び試験キットを用いた抗体存在の検出方法」(A Method fo
r Detecting the Presence of Antibodies using Gold-Labeled Antibodies and
Test Kit)が、ハリー(Hari)その他による米国特許第５，０７９，１７２号明細
書に教示されている。この方法論は、顕微鏡、例えば電子顕微鏡影像装置を用い
て標識付けした微粒子を検出することに関する。

【０００８】光の検出及び定量化を含めた化学的及び生化学的分析は、種々の状況で行われ
ている。一つの用途は、特定のアナライトの存在又は量を決定するためのアナラ
イト検出である。多くのアナライト分析法では、光輻射線（例えば、蛍光又は化
学ルミネッセンス）の吸収又は発光と重要な関係が存在する。そのような場合、
試料を照射し、伝送された又は発光した光に対する試料の効果を検出する。照射
により得られた発光の場合には、非アナライト分子も発光し、比較的大きな背景
ノイズを生じ、測定に実質的な誤差を生ずる結果になる。測定に伴われるノイズ
には、その他装置上の誤差も集約的に寄与することがある。

【０００９】光を含む化学的測定の品質は、アナライトの存在による試料からの光学的信号
の適当な測定値対装置に固有のためのノイズ変動の比として定義することができ
る。結果に影響を与えるノイズ源は、試料、信号源、検出器変動及び環境による
干渉を含めた光路内のどこからでも入ってくる。しかし、これらの変動は必ずし
も固有のものではなく、外部から付加されるか又は誘導された変動も含んでいる
。一般に、これらの信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）に対する議論は、特定のアナライ
トに伴われる「検出限界」を小さくするように、測定装置の感度を改良すること
に重点をおいて行われてきた。検出限界とは、試料内のアナライト濃度で、それ
より高くなるとアナライトの存在に起因する信号が希望のＳ／Ｎ比に到達するよ
うなものになるアナライト濃度を指す。実際には、この検出限界は、アナライト
濃度に関連した光学的信号を誘発するように設計された実験方法を実施すること
により確認する。特に信号及びノイズの強度に関連したデーターを、アナライト
の濃度範囲に亙って較正曲線の形でプロットし、それにより検出限界を直接決定
することができる。

【００１０】次に、未知の試料から実験的に得られた信号を較正曲線と比較することにより
、未知の試料中の濃度の決定を行う。化学的測定の典型的な濃度単位はモル／リ
ットル〔即ち、モル量（Ｍ）〕であり、１モルはアボガドロ数（６．０２２５×
１０２３）として定義されている。残念ながら、最も感度の高い従来の実験方法
でも、検出限界は約１フェムトモル（ｆＭ）の程度、即ち、１リットル当たりほ
ぼ１０９個のアナライト粒子にしかならない。

【００１１】較正曲線を参照して濃度を決定する測定方法は、本来「デジタル」よりはむし
ろ「アナログ」であるとして特徴付けることができる。即ち、アナライト濃度に
関連した信号を、最初測定装置により生じさせる。次に較正曲線を参照してアナ
ライト濃度の近似値を求める。較正曲線は濃度の関数として連続的なので、較正
曲線から誘導された濃度は一般に整数ではない。これに対し、デジタル測定デー
ターは、屡々特定の整数を明確に表す二元（即ち、２進）信号で具体化されてい
る。従って、測定のアナログ式とデジタル式との基本的差は、アナログ手段を用
いると、分析した試料に更に別の一つのアナライトが付加されても、明確に検出
することは出来ないことである。化学的測定の制度について劇的な改良が行われ
てきたが、そのような進歩は信号を増大し、ノイズを減少する基本的にアナログ
の概念に基づくものであった。

【００１２】低い濃度水準でアナライトを含む分子状試料では、デジタル測定方法は少なく
とも二つの利点を与える：較正曲線との照合がないこと及び試料中の単一分子の
検出である。列挙方法論(enumeration methodology)は、アナライト濃度が充分
に低く、各二元測定値に伴われる統計的ノイズが、連続する整数の差よりも小さ
く留まっているような試料では有用である。従って、本発明の目的は、個々の結
合事象の検出に適合する本質的にデジタル測定方式によって低い水準のアナライ
ト濃度を決定するための光学的方法を与えることである。

【００１３】今日まで、従来技術の発展は、明確なビデオピクセル（デジタル化画素の配列
）又は個々の結合部位とは対照的に、結合領域の影像化に向けられてきた。従来
技術の種々の問題は、本発明により解決される。従来技術の欠点には、例えば、
放射に基づく反応検出への限定、領域又は複数のピクセル上の反応の平均化及び
（又は）検出、信号発生及び信号不発生の両方の領域及び分布決定の必要性が含
まれる。本発明は、これらの欠点を、個々の結合事象の列挙によりアナライト検
出のための一体化した装置及び方法を与えることにより解決する。従来法は定性
的及び限定された定量的決定には適しているが、従来法の中で個々のアナライト
結合事象の正確な算定に簡単且つ効果的に用いることができるものは一つもなく
、ここに記載する向上した性能特性を教示するものはない。本発明は、改良され
た算出感度及び精度を与え、それによってここに記載した従来法に対処するもの
である。

【００１４】従来技術での研究は、本発明を開示する文献を全く挙げておらず、本発明を当
業者に容易に想到させるものではない。更に、従来法の文献の開示を組合せても
本発明を教示することはできず、そのような組合せは何等本発明を容易に想到さ
せるものではない。分子対分子に基づく固相結合アナライトの即時検出で用いら
れる新規な特性或は組合せを教示又は示唆する文献は一つもない。ここに開示す
る方法は、例えば、結合事象の頻度、密度又は分布が、慣用的免疫検定、ＤＮＡ
プローブ、及び免疫クロマトグラフ検出方法の検出可能な閾値よりも低い場合の
生物学的標識の固相検出に有用である。

【００１５】（発明の開示）本発明は、固相固定及び光学的信号発生を用いた特定分子を検出するための手
段としてアナライト検出の新規な方法に基づいている。特に本発明は、アナライ
トを検出する結果になる量変化を検出及び測定することができる光学的信号及び
検出器を使用することを含んでいる。この方法は、更に現存する検定方法と連結
し、検出を自動化するための商業的機器に関し、従って、それ自体商業的用途、
例えば、高生産性医薬スクリーニング及び注目点検出の用途に利用される。即ち
、本発明は、特別な結合相互作用により媒介される個々の結合事象の固相光学的
検出及び算出に関する。

【００１６】本発明は、アナライト固相固定、信号発生体(signal generator)、光の通路を
含めた信号キャリヤー、信号検出手段、及び新規なデーター分析により規定され
る。それは、狭い光ビーム幅を用いるか、又は大きなビームを、ダイオード配列
体又は帯電結合装置（ＣＣＤ）検出器を用いて小さな仮想ビームへ分解するか又
は分割することにより、個々の結合事象の検出性を改良する方法も包含する。種
々の光学的信号及び物理的増幅素子を使用することについてここで論ずる。

【００１７】最も広い態様として、本発明は、個々の目的アナライト結合事象の固相光学的
検出及び算出のための方法及び装置において:反射性又は透過性基体上に溶液か
ら直接アナライト錯体を固定し、然も、前記錯体が、少なくとも一つの第二アナ
ライト特異結合素子に接合(conjugate)した少なくとも一つの信号発生素子と錯
化した目的アナライトを有し；アナライト錯体が固定された基体から又はその基
体を通して電磁波を反射又は透過し；前記電磁波の反射又は透過により発生した
信号を捕捉し；そして存在するアナライトのその存在及び（又は）量についての
信号を分析する；諸工程からなる検出及び算出法及び装置に関する。

【００１８】特に、試料内のアナライト粒子の存在をデジタル検出する装置及び方法をここ
に開示する。各アナライト錯体は既知のやり方で刺激（例えば、照明）により光
学的に検出可能な応答を発生するように配置する。更に、信号発生体は受動又は
能動性にすることができる。受動信号発生体には、照明と相互作用するが、処理
、例えば吸収、散乱はしないようなものが含まれる。能動信号発生体は、状態変
化、即ち、蛍光、化学ルミネッセンス、及びプラズモン共鳴を通して光エネルギ
ーを能動的に変換するものである。刺激又は照明のために、デジタル式アナライ
ト検出装置は、試料内の多数の明確なピクセル領域を照明し、そ中に含まれてい
るアナライト錯体の各々から光学的信号、即ち、ホトンを発生させる光学的装置
を含んでいる。ここで論ずるように、スティンプソンその他及びアレンその他は
、検出する目的のためにＣＣＤ及びピクセルを使用することを採用している。本
発明では、ピクセル領域は、夫々の領域内に含まれるアナライト錯体の数が充分
小さく、各領域によって発生する光学的集合信号が最大検出閾値、好ましくはピ
クセル当たり１粒子又は１粒子当たり複数のピクセルよりも小さくなるような大
きさになっている。

【００１９】デジタル検出装置は、更に各ピクセル領域から発生する光学的信号を測定する
ための装置を有する。データー処理ネットワークは光学的信号を受け、それら信
号を定量化し、測定値に基づき各ピクセル領域内のアナライト粒子の数を計数し
、試料内のアナライト粒子の数を決定する。

【００２０】本発明の検出方法を用い、広範な種類のアナライトを検出することができる。
ここで用いる用語「光学的応答」とは、単一のアナライト錯体からの信号発生で
あるが、誘発されたものを集約的に言及するのに用いられている。更に、ここで
用いられている用語「発生した信号」とは、特定のピクセル又はピクセル領域か
ら検出された光学的応答の測定に対応する。検定試料媒体は、アナライトに結合
されていない検出可能な標識が慣用的洗浄方法により除去される、固相結合アナ
ライト錯体であるのが好ましい。

【００２１】好ましい態様として、各ピクセル領域内のアナライト粒子は、個々の信号単位
に基づいて個々に測定し、背景ノイズレベルより実質的に高い光学的応答を与え
る。各光学的応答の大きさは、用いられる特定の光検出装置が光学的応答と周囲
の背景ノイズとを区別することができるようにするのに充分な大きさである必要
がある。信号単位の一つ以上の光学的応答は、単一のアナライト粒子に伴われて
いるが、それら単位の数は各アナライト粒子について実質的に同じになる。殆ど
の部分に対し、アナライト錯体一つ当たりの信号単位数は１より大きいであろう
。

【００２２】検定試料媒体は、屡々低い濃度のアナライト、一般にピコモル以下、屡々フェ
トモル以下アナライトを含む。検定体積は通常１００μｌより少なく、屡々１０
μｌより少なく、１μｌ以下のことがある。標識を個々に検出することができる
ように、５０ｎｍより５μの大きさの範囲で信号発生標識にＣＣＤピクセルを合
わせることが望ましい。ＣＣＤピクセルの実際的大きさは、それが拡大用光学系
によって達成される点で無関係である。

【００２３】検定は通常特殊の結合対を含み、その特異な結合対により分子が補足分子を有
することが考えられており、特異の結合対のそれら素子の結合は無作為的な錯体
形成よりも実質的に高い親和力で行われる。特異の結合対の素子は、「リガンド
」及び「レセプタ」と呼ぶことができる。一般にレセプタは固相に固定され、流
体試料から問題のアナライト（リガンド）を捕捉又は固定する。このように、特
異の結合対はハプテン及び抗原（「リガンド」として言及する）及びそれらの相
補的結合用素子、例えば、抗体、酵素、表面膜蛋白質レセプタ、レクチン等（一
般に「レセプタ」として知られている）を含んでいてもよい。特異の結合対は、
天然及び合成の両方の相補的核酸配列、ＲＮＡ又はＤＮＡを含んでいてもよく、
この場合簡単にするため、核酸はリガンド及びレセプタを有する特異結合素子の
概念内に含まれるものとする。

【００２４】検定を行う場合、特異結合素子と、検出可能な個々の標識との接合が含まれる
。これらの接合体を形成する方法はよく知られており、従って、ここで論ずるこ
とはしない。アナライトにより、市販の試薬又は変性してもよいそのような試薬
に伴われる種々のプロトコルを用いることができる。

【００２５】本発明の他の特徴及び利点は、本発明の原理を例として例示する図面に関連し
て行う次の詳細な説明から明らかになるであろう。

【００２６】（好ましい態様についての詳細な説明）上の一般的記述及び次の詳細な記述の両方共、単なる例として説明するための
ものであり、特許請求される本発明を限定するものではないことは分かるであろ
う。アナライト検出、取扱い（ハイブリッド形成及び増幅）、及び光学系（レー
ザー及びエリプソメトリー）についての一般的原理及び条件は当分野でよく知ら
れている。本発明は、個々の結合事象を検出するための新規な方法について記述
する。

【００２７】ここに開示する本発明は、広い範囲の試料について行うことができることは当
業者も認めるであろう。そのような試料には、例えば、農業起源、バクテリア及
びウイルス起源、及び人又は他の動物起源から誘導された生物学的試料の外、排
水又は飲料水、農産物、加工食品及び空気のような他の試料が含まれる。本発明
は、固定された特定分子の僅かな数を検出するのに有用である。

【００２８】本発明は、試料検定領域中の量変化を検出及び測定することができる光学的信
号及び検出器を用いた方法によって具体化する。本発明の特定の用途とは無関係
に、方法論的詳細な点は。ここに開示するものと同様、当分野でよく知られたプ
ロトコルによって計算することができる。更に、前記必要な計算の精密化は、当
業者によって日常的に行われているものであり、過大な実験を行うことなく彼ら
によって日常的に行われる仕事の範囲内に入るもである。

【００２９】本願は光学的方法としてエリプソメトリーを使用することに言及し、特にそれ
について論ずるが、このやり方は便宜的なものに過ぎない。この方法論は、図１
２で引用したものを含めた或る範囲の光学的信号型に適用されることは分かるで
あろう。特に、種々の光学的方法の性能を、ここに記載する一般的方法を適用す
ることにより実質的に向上させることも考慮に入れられている。特に、散乱法は
、エリプソメトリーとは異なった種類の装置の基礎を形成する。本質的に同じ光
学的構成で、吸収、屈折率変化、及び回折のような他の効果を用い、特別な結果
の利点を与えることができる。適用した場合、光学的信号フォーマットの規定に
より、個々の結合事象を区別する目的のための適当な固定表面及び適当なデータ
ー分析法の選択が行われる。従って、固定装置及びデーター分析装置の所属は、
選択される光学的信号フォーマットの種類によって決まる。光学的信号フォーマ
ット（信号キャリヤー、信号発生体及び信号検出器の関連性）の目的は、信号を
発生し、検出することである。信号発生体標識によって発生した信号を、装置作
動の背景になるプラットホーム、固相、により生ずる信号から区別する能力は、
光学的信号フォーマットに基本的なものである。

【００３０】明細書及び特記請求の範囲を理解するのに役立つ定義が本明細書全体に亙って
含まれている。ここに与える定義は、それらの用語が次の実施例中及び本願全体
に亙って用いられた時に念頭に入れるべきである。ここで行う開示は、簡単化及
び便宜上、量の付加に関連した検定（例えば、リガンド結合検定）に限定されて
いるが、免疫検定法にも言及することができる。しかし、光学的信号検出の同じ
原理は、一般に系から量を除去する方式（例えば、溶菌又は解離検定）に適用さ
れ、従って、本発明は、量変化及びその誘導体を測定する検定に適用することが
できる。更に、本発明は、透過及び反射の両方に基づく固相検定に関する。

【００３１】当業者は、本発明がここに記載する技術分野で広範囲に適用できることを容易
に認めるであろう。次の実施例及び詳細な記述は、本発明を説明し、例示するの
に役立つ。それら実施例は本発明を何等限定するものではない。本発明の範囲内
で種々の修正を行うことができる。

【００３２】小さなビーズ、２５ｎｍ〜２０μの直径範囲のビーズの接合の開発により、新
しい形の信号検出への道が開かれた。その信号検出を本願では記述し、今後算出
法として言及する。本発明は、個々の結合事象の検出を可能にする。信号につい
て観察される領域の実際的又は仮想的大きさを狭くし、それによって真の信号対
背景信号の比を改善し、同時に、選択された量増大素子を用いて発生信号を増大
することが原理になっている。強い信号発生体だけが、分子レベルで起きる個々
の事象について検出することができる。光学的薄膜系で典型的な検出可能性の尺
度として、５０ｎｍ〜５μの範囲の量の添加は、個々の結合事象検出を可能にす
る大きな信号を発生する。更に、或る巨大分子又は細胞物体は、付加的量増大を
行うことなく、即ち第二標識又は試薬を用いなくてもそれらを検出することがで
きる程充分大きい。従って、本発明は、固相固定及び量変化を検出測定すること
ができる光学的信号を用いて、低い濃度の問題の特定分子（アナライト）の検出
問題を解決する。

【００３３】一つの態様として、そのような量変化は、リガンド結合対との立体的、形状媒
介又は他の非共有結合相互作用により、アナライトを錯化又は結合することによ
り付加的に達成又は媒介される。そのような相互作用の例には、抗原・抗体結合
、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）結合、及び他の特定の巨大分子（蛋白質、糖
蛋白質、又は炭水化物結合）相互作用が含まれる。別法として、量変化は、特定
の酵素、化学的、又は他の特定の解離又は溶菌剤によって減法的に達成される。
量変化分析もに適した特異結合又は溶菌相互作用を用いた検定方式の例には、例
えば、免疫検定、ハイブリット形成検定、蛋白質結合検定、及び酵素活性度検定
が含まれる。

【００３４】本発明の別の態様には、結合又は溶菌事象に伴われる光学的信号を、その信号
の特定の増大又は変化により増幅又は区別するのに用いられる第二試薬が含まれ
る。そのような増大には、錯体形成事象に単に量を付加すること、又は特定物質
又は過程からの区別可能な種類の信号を発生させることが含まれる。別法として
、そのような増大には、区別可能な光学的信号を発生する結合又は溶菌事象の一
つ以上の要素の変化が含まれ、或は増大は検出可能な自己集合又は凝集過程を開
始する。

【００３５】ここに記載した種類の固相検定では、典型的には、検定信号と背景ノイズとの
統計的差から結果が導かれる。この種の検定は、典型的には、液体試料又は懸濁
物をマクロ規模の体積（＞１μｌ）を用いて行われる。同様に、この種の検定の
ために典型的に用いられる固定領域もマクロ規模（＞１０００μ）になっている
。これらの検定は、多数の結合又は溶菌事象により発生する信号の検出及び測定
により、目的アナライトを検出及び（又は）定量する。個々の結合又は溶菌事象
の数万から数億により発生した信号を、典型的には一つの光学的信号路と事象の
全てとの相互作用により集合させ、一つの結果を与える。この慣用的方法の一つ
の理由は、検出すべき結合又は溶菌事象が分子の規模で起き、そのため検出可能
な信号を発生させるのにそれら事象が多数必要になることにある。更に、この大
きな数の事象は、結果に対し、統計的に意味のある根拠を与える。

【００３６】この慣用的方法の明確な限界は、アナライトの濃度が非常に低い場合に証明さ
れている。まばらな結合事象により発生する信号は、背景ノイズに対して区別さ
れるのに充分な大きさになっていなければならない。別法として、発生する信号
は、反応領域の全表面領域に亙って信号の変化を平均することにより起こされる
否定的信号の領域に対して区別できるものでなければならない。固相検定では、
この領域の信号強度は、従って、試料の体積又は反応表面の面積の関数である。
これらの場合に、まばらな結合又は溶菌事象により発生する信号は、試験面積の
遥かに大きな未影響を領域によって発生した信号を併合している。非常に低い濃
度のアナライトの場合、これは、正の信号と負の信号との非常に僅かな差しか生
じない効果をもち、そのことが達成可能な低い検出レベルを限定する。

【００３７】本発明は、結合事象の頻度、密度、又は分布が、慣用的免疫検定、ＤＮＡプロ
ーブ、免疫・クロマトグラフ又は他のリガンド結合法により検出できるもより遥
かに低い場合の生物学的標識のための固相検出方法及び装置にある。

【００３８】固定(Immobilization) 固相法は、多成分流体試料から問題のアナライト（「リガンド」又は「アナラ
イト」）を分離又は捕捉する手段として検定開発の分野でよく知られている。固
相検定は、特に問題のアナライトに結合する固相へ固定され、リガンド・レセプ
タ錯体を形成する捕捉物質(capture material)（レセプタ）を必要とする。

【００３９】リガンドとレセプタは、一般にイオン性及び疎水性相互作用、ファンデルワー
ルス力及び水素結合のような非共有結合機構により互いに特異的に結合する。或
るリガンド・レセプタの組合せは当分野でよく知られており、例えば抗体又は抗
体Ｆａｂ断片と、その抗原、ハプテン、又はエピトープとの間の免疫学的相互作
用；蛋白質又は小分子の対応するレセプタへの生化学的結合；核酸鎖間の相補的
塩基対の形成；が含まれる。

【００４０】レセプタ物質の固相固定は当分野でよく知られている。一般的種類の固定には
、例えば、吸着、共有結合、及び結合基介在(linker-mediated)が含まれるが、
それらに限定されるものではない。吸着結合は一般に非特異的なものであり、固
相と捕捉物質との非共有結合相互作用に依存する。共有結合とは、化学結合の形
成により捕捉物質が固相に結合されることを指す。結合基介在固定には、表面に
結合される第二分子及び（又は）巨大分子及び結合構造を形成するため特異的に
相互作用する捕捉物質との特別な使用を含んでいる。固定法は、一般に捕捉物質
が問題のアナライトに結合するためにその特異性を維持するように選択される。

【００４１】捕捉物質が固相に固定されたならば、その固体担体はアナライト結合に対し反
応性になる（反応性表面）。問題のアナライトを含有する流体試料を添加する前
に、その反応性表面を更に別の材料で処理して、試験される流体試料の非アナラ
イト成分の非特異結合（ＮＳＢ）を防ぐ（ブロックする）ことが必要である。典
型的なブロック材料には、例えば、カゼイン及びウシ血清アルブミンような蛋白
質、界面活性剤、及び長鎖重合体が含まれる。

【００４２】典型的には選択されたレセプタを固相に固定する。問題のアナライトを含有す
る試験溶液を、その固定レセプタと接触させ、それにより固相上にリガンド・レ
セプタ錯体を形成する。この錯体が形成されたならば、試験溶液の他の成分を全
て、通常固相を濯ぐことにより除去する。固相に結合されたアナライトは、第二
の特定のレセプタを結合することにより量増幅剤と付加的に錯化し、アナライト
錯体を形成するようにしてもよい。この錯体は、試料が反応性表面と接触する前
、又はアナライトを反応性表面に結合した後、アナライト含有流体試料中で形成
することができる。反応性表面へのアナライト又はアナライト錯体の結合が完了
した後、この結合を幾つかの手段のいずれかにより測定することができる。

【００４３】記載した固相結合用プラットホームを作るのに有用な基体には、光学的又は「
近光学的(near optical)」波長の読取りに適した反射性及び透過性材料が全て含
まれる。適当な基体には、例えば一貫した有意の結果を与えるために、光と充分
一貫した、又は正確な相互作用を与える基体である。この目的のために、高度に
吸収性の表面又は結合層を使用して、ここに開示する散乱用途で光学的コントラ
ストを生じさせることができる。

【００４４】光学的信号フォーマット本発明の光学的信号フォーマットは、少なくとも信号キャリヤー、信号発生体
、及び信号検出器からなる。

【００４５】光学的信号フォーマット：信号発生体本発明は、特に信号対非信号表面積の比率を変え、一層鋭敏な結果を与える方
法に関する。また、本発明は、特定の種類の光学的ビームと相互作用するように
選択された特定の標識を用い、増大した区別可能な又は増幅した信号を発生させ
る。

【００４６】結合検定方法の慣習的目的は、単位体積当たりの量（例えば、ｎｇ／ｍｌ）又
は当量（例えば、ＩＵ）の決定である。図１を参照して、アナライトを試料の他
の成分及び過剰の試薬から分離するために、分離プラットホームとして固相を用
いるのが典型的である。或る型の検定の場合、信号発生体は結合錯体に付着され
たままになっており、そのため固相から読取られる（例えば、論ずる赤外又は蛍
光のような光学的方法）。体積測定試料中に見出されるアナライトの量は、比例
したやり方で固相に固定された量に変換される。

【００４７】ここで用いる信号発生体とは、信号キャリヤーと相互作用して信号を生ずる本
発明の成分である。この概念に対する重要な点は、二つの間の既知の特定の予測
可能な相互作用である。信号発生体素子は、固定された目的アナライトに伴われ
る検出可能な信号を特異的に標識付け、増幅、区別、印付け又は発生し、それに
より結合をその不在部分から区別するのに用いることができる材料が含まれる。

【００４８】信号発生体の選択に対する限界は、信号キャリヤー、第二試薬接合特異性、目
的アナライト、及び物理的、化学的及び（又は）電気的反応の選択により左右さ
れる。これらの限界内で、多数の信号発生体が存在する。これらには、例えば、
アナライト錯体へかなりの量を付加する材料、自己集合性、凝集性、酵素又は化
学的に活性な材料、フイルム形成性材料、光学的信号又は明確な光学的性質、即
ち高屈折率、キラル特性、高吸収性、高度の散乱を生ずる材料が含まれる。更に
、異なった結合事象のための別々の信号を発生するのに複数の信号発生体を用い
ることもできる。

【００４９】光散乱標識ここに記載する散乱態様の信号発生体成分は、光散乱標識と呼ぶことができる
。光散乱標識は、入射光を弾性的に散乱、即ち、光エネルギーを吸収することな
く実質的に散乱させる分子又は材料、屡々粒子である。標識の例には、コロイド
状金又はセレン；赤血球；ラテックス、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート
、ポリカーボネート、又は同様な材料から作られた染色重合体粒子及び微小粒子
（ビーズ）；のような金属及び非金属標識が含まれる。そのような粒状標識の大
きさは１０ｎｍ〜１０μｍ、典型的には５０〜９００ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ
〜５μの範囲にある。粒子が大きくなる程光散乱効果は大きくなるが、これは結
合及びバルク溶液粒子について当て嵌まる。適当な粒子標識は、バングス・ラボ
ラトリーズ社(Bangs Laboratories, Inc.)及びフィシャーズ(Fishers)から入手
することができる。

【００５０】本発明では、標識は、検定のフォーマットにより、問題のアナライトに特異的
に結合する第二レセプタ（標識付けされた第二レセプタ）、又はアナライトの類
似体（標識付けされた類似体）に付ける。競合検定フォーマットの場合、標識付
けされた類似体は、問題のアナライトと競合して反応性表面と特異的に結合する
。直接サンドイッチ検定フォーマットでは、標識付けされた第二レセプタは、ア
ナライトの第二エピトープに対して特異的である。これは、アナライトを、固定
したレセプタとその標識第二レセプタとの間に「挟む(sandwich)」ことができる
。直接サンドイッチ検定フォーマットでは、第二レセプタはアナライトの第二エ
ピトープに対しても特異的であり、付加的光散乱標識と特異的に結合する材料で
標識付けする。例えば、アナライトが反応性表面によって捕捉されたならば、ビ
オチニル化抗体を用いてアナライトを挟むことができ、信号発生のためにアビジ
ン化光散乱標識を用いる。

【００５１】検定フォーマットとは無関係に、「標識付けされた接合体（labeled conjugat
e)」を形成するためにレセプタ又は類似体を光散乱標識に付着されなければなら
ない。捕捉リガンドの固相への固定と共に、光散乱標識はレセプタ又は類似体に
共有結合することができるが、これは必須のことではない。物理的吸着も適切で
ある。そのような場合には、標識付け接合体を形成するための付着は、洗浄又は
乾燥のような、後の或る検定段階での力に耐えるのに充分な強さを持ちさえすれ
ばよい。

【００５２】好ましい態様として、信号発生体は結合用試薬に接合しており、その試薬が今
度は目的アナライト、アナライト錯体、又は固定捕捉材料と特異的に相互作用す
ることができる。そのような信号発生体には、前に論じたように、例えばビーズ
及び微小粒子及びコロイド金属が含まれる。信号発生体には、自己集合性及び合
成重合体、ガラス、シリカ、シリアル(silial)化合物、シラン、液晶又は他の光
学活性物質、巨大分子、核酸、触媒化、自動触媒化、又は開始凝集体、及び内因
性又は外因性試料成分も含めることができる。有用な結合用試薬には、一般に抗
体、抗原、特異結合性蛋白質、炭水化物、レクチン、脂質、酵素、巨大分子、核
酸、及び他の特異結合性分子が含まれる。

【００５３】光学的信号フォーマット：信号キャリヤー本発明で有用な信号キャリヤーは、光学的及び近光学的行路である。これらの
行路は信号発生体と相互作用し、単一事象検出を可能にする。試料から反射した
又は試料を透過した単色又は多色波長電磁波を用いて信号の変化を検出すること
ができる。

【００５４】光学的信号フォーマット：信号検出歴史的には、表面を読取るための単一光ビーム、例えば、レーザービームを使
用する効果は、検定領域内の全ての結合事象の量変化効果を表す単一の結果を生
ずることである。固定物質に大きなビームを与え、その結果を単一検出器によっ
て積分した場合、効果的結果は同じになる。

【００５５】図２に示したように、この方法について歴史的に理想化されたモデルは、統計
的に意味のある領域又は全検定領域に亙って行われる光学的平均化であり、検定
領域に亙って結合事象のほぼ正規分布により表される。実質的に全ての実際的場
合において、検定領域に亙る結合分布は極めて不均一である。図３を参照する。
ＯＴＥＲ（商標名）（ＤＤｘ社）として今後言及する大きな単一ビーム及び単一
検出器を用いた現在の光学的エリプソメトリー読取り方法の利点は、それが本来
分布に関係なく検定領域内の全ての結合事象を積分し、無数の個々の結合事象を
単一の平均結果へ集約させることである。

【００５６】この方法の欠点は、その同じ光学的平均化効果から生ずる。図４に描いたよう
に、目的アナライトが小さな分子粒径の粒子からなる場合、又はまだらな結合事
象が存在する場合には、この方法は、その比較的大きな検定領域に亙って平均化
した時、それらの結果を統計的に無意味なものに帰結させる傾向がある。従って
、非常に低い濃度の肯定事象を含む結果は、検定装置の背景ノイズ又は可変性に
対する否定結果から区別することができない。

【００５７】本発明の一つの態様は、エリプソメトリー方法論の新規な微生物学的使用、即
ち、個々の結合事象を列挙法により決定することを含んでいる。この方法は、分
析される表面を多数の個々の「局部的」検出領域へ分割することにより、信号平
均化問題を解決する。そのような局部的読取り領域内で発生した全ての信号を、
遥かに小さな領域又は場に亙って平均化し、それによって他の点では否定的な背
景に対する「希釈(diluted)」の程度は遥かに小さくなる。

【００５８】低濃度のアナライトの場合、この方法は与えられた試験表面について無数の局
部的結果を生じ、その殆どは否定的結果を報ずる。しかし、肯定的結合が起きて
いる場合には、局部的反応領域は非常に高い肯定的信号を報ずる。全領域に亙っ
て平均しても、その肯定的信号を希釈しない。従って、非積分結果プロファイル
が発生し、それによって殆ど否定的になっていることがある全試験領域に亙って
ばらばらな肯定的結果を報告し、同時に遥かに大きな個々の信号を局部的肯定的
事象に対して発生させることができる。

【００５９】従って、列挙方法論は個々の結合事象の決定を含め、極めて感度の高い検定方
法を可能にする。この方法（図５で参照されるような）の明白な用途は、少数の
微生物を検出するための微生物学の分野である。個々の細胞又は細胞群（コロニ
ー形成単位）を検出することができることは、時間のかかる培養工程を省略する
ことを可能にする。このことは、唯一つの有機体でさえもそれが存在することが
肯定的結果と考えられなければならない病理学的有機体にとっては特に重要であ
る。即ち、許容誤差０レベルである。本発明の別の有用な用途は、反応生成物が
極めて少量しか存在しない場合のハイブリット形成検定の分野である。この場合
には個々の結合事象検出が、面倒な増幅技術、例えば、ＲＣＡ、ＮＡＳＢＡ及び
ＳＤＡの必要性を無くす。臨床的に関連のある検出閾値が、慣用的検定方法によ
り容易に達成されるものよりも低い全ての検定装置は、本発明によって恩恵を蒙
る。

【００６０】局部的読取り領域を与えるための小さなビーム直径を用いた算出法の原理は、
図５に例示されている。このビームは、遥かに小さなスポット領域に亙って平均
化されると、個々の結合事象に対して極めて高い相対的信号を与える。特に、平
行光ビームをラスター（Ｘ−Ｙ）方式で試験片上を走査する。外径（ＯＤ）約２
０μのビームを一つの細胞又は細胞群に対し走査し、検出器で受光して、反射光
の性質の劇的な変化を証明する。これらの変化の振幅は、例えば、光ビームの大
きさ及び（又は）細胞又は細胞群の大きさに依存する。特に、ビームに比較して
小さな細胞は、背景光及び検出器増幅に伴われる一般的ノイズ以上に検出するこ
とは困難であろう。ビームＯＤ及び細胞径が互いに近くなる程、光学的性質の変
化は大きくなる。本発明を適用するための実際的光源には約０．６５０〜１．５
５０μの範囲のＯＤを有するビーム、即ち、レーザーダイオードが含まれる。レ
ーザーダイオードは小型で、光を操作するのに小さな直径のレンズを用いており
、従って、例えば、ベンチトップ、ラップトップ、及び携帯装置のように種々の
装置の大きさを容易に与えることができる。更に、ＣＣＤ検出器は、感度を著し
く向上する結果を与え、検定操作時間を短くすることができる。従って、ＯＴＥ
Ｒと列挙法との基本的差は、用いられる光学的行路である。

【００６１】一般に、信号検出器は信号キャリヤーの波長で受信できなければならず、系の
情報を受信できるように構成されていなければならない。信号検出器には、ＣＣ
Ｄカメラ、単結晶珪素検出器、及びダイオード配列検出器が含まれる。ＣＣＤと
組合せたエリプソメーターは、全反応領域を見て、それを複数の領域に分割する
。従って、否定的領域を除外し、肯定的領域を総計する必要がある。ここに開示
した本発明は、反応領域のスポットを拡大し、そのスポットを複数の領域に分割
し、個々の結合事象、例えば、ビーズ、細胞、コロニー形成単位を探す。図６は
、個々の結合事象の列挙を証明する表面の位相学的解像を描いている。

【００６２】実際に、個々の又はばらばらの結合事象の同定を近似するためにこの方法を用
いるのは、結合事象を表面に亙って積分しないからである。算出法を実施するた
めの鍵は、高度に焦点を合わせた読取りのために信号の個々の領域を分断し、分
析し、隔離することができることであり、それによって否定的結果から肯定的結
果を分離する能力を増大する。信号解析は、本発明のキャリヤー特性又は検出器
特性内で行われる。これらの結果は、一連の個々の信号値として表示され、予め
定められた切り捨て点と比較し、それによりどのような局部的読み取り領域内で
も肯定的結合事象を決定する。このようにして個々の結合事象を表面上に列挙し
、解像力は読み取り領域の大きさによって決定される。真の信号対背景信号即ち
ノイズの相対的アスペクト比を変化させることは、真の信号を平均する場所の背
景の量を変化することを含む。次第に小さくなっていく背景信号について平均化
した一定の信号は次第に一層明確になり、個々の信号発生体が容易に列挙される
ようになる。

【００６３】図７及び図８は、現在のＯＴＥＲ装置の構成と、列挙可能装置構成の一つとの
差を比較できるように示している。ＯＴＥＲ構成中の交差ビームは、約１３ｍｍ
２の表面積〔Ｐｉ＊ｒ２＝ＳＡ（ｍｍ２）＝３．１４１５９×２２＝１２．６５
６６ｍｍ２〕を有し、その表面積に亙って肯定的結合事象を平均化する。遥かに
小さな直径（即ち、２０μｍ）のビームを使用することによる信号の解析は図８
に例示されている。同じ全表面領域に亙って個々の局部的読み取りを行いながら
、表面を横切ってビームを走査する。この例では、反応領域は直径２ｍｍであり
、走査ビームは直径２０μｍである。標準的換算を用いることにより（図９参照
）、全反応領域表面積は３，１４１，５９０μｍ２であるのに対し、小さな走査
ビームは、各局部的領域で３１４．１５９μｍ２を読み取る。直径に沿って１０
０個の測定点があると、２０μｍのビームでは反応領域内に１０，０００個の読
み取りが行われる。

【００６４】各結合事象により固有の信号が発生する。その信号は読み取り領域の減少によ
って変化することはない。各事象は、ＯＴＥＲ構成の場合と同じ応答を局部的に
発生する。しかし、この信号が平均される領域は１０，０００分の１に減少し、
従って、この算出装置では背景に対して信号が１０，０００倍に効果的に増幅さ
れる。この変化は否定的結果から肯定的結果を区別する能力を膨大に増大し、検
定方法の検出下限（検出の化学的感度又は閾値）を１０，０００倍効果的に改良
することを意味している。

【００６５】図９は、ＯＴＥＲ及び列挙法を用いて可能な検出限界に関する予備的計算を示
している。選択された特定の数字及び例は、開示に対して意味のあるものではな
く、その範囲を限定するものと解釈すべきではない。むしろそれらは二つの方式
の間で可能な感度の差の一例としてここに含まれている。列挙法は、単一の結合
事象を検出することができ、１００位の僅かな結合事象でも装置及び生物学的ノ
イズに対し、明確に算出できる肯定的結果を発生する。比較可能な条件下で未増
幅ＯＴＥＲシステムで予想される検出限界は２×１０６ｃｆｕ／ｍｌである。増
幅によりシステムに量を追加しても、領域平均化の拡張効果のため感度の実質的
な改良を与える結果にはならない。

【００６６】信号解析は、検出器でも行うことができる。検出装置により、集合信号を試験
片上の個々の領域に関連した個々の情報経路へ、幅の広い又は大きいビームを用
いて分割することができる。例えば、ＣＣＤ又はダイオード配列検出器をこのよ
うに用いることができる。このような場合には、解析された信号は検出及び報告
過程中、個々に比例的に維持されなければならない。拡大、焦点一致、及びキャ
リヤー：検出器位置制御は、装置全体を通して情報量を維持する方法である。一
体的又は単結晶ダイオード検出器を使用することは、信号キャリヤー内で適当な
小さな単位へ信号が分割されることを必要とする。

【００６７】小さなビーム走査方法に対する別の態様は、読取り及び一層小さな個々の信号
へレーザービームを解析するためにＣＣＤ又はダイオード配列体を用いることで
ある。この態様の目的は、大きなビームスポット領域内で小さなスポットの応答
の決定を維持することである。しかし、この場合、小さな読取り領域の定義（局
部的結果）は、交差するビームの直径によって与えられるものではなく、ビーム
を受ける検出器の構造によって与えられる。更に、光ダイオード配列体、ＣＣＤ
又は他の非積分信号受信機のような検出器は、大きなビーム中に含まれる情報を
受け、その情報を一層小さな局部的結果として保存し、処理する。これは、特定
の検出点として配列体と交差する光が通る経路によって定められる多数の仮想ビ
ームを効果的に生じ、全てが同時に操作される。全ての仮想ビームについての集
合信号は、大きなビーム信号に等しく（各仮想ビームは限定された表面領域にし
か関係しない）、結果は一緒に積分されることはない。

【００６８】この方法の利点は、それが迅速に処理（平行信号処理）されることである。走
査方法は、各読取りが連続して行われる一連の過程である。更に、この態様を実
施するための技術的困難さは、実質的には、小さなビームレーザー及び正確な走
査制御機構の開発に含まれているものほどではない。

【００６９】上で論じたように、この装置内で種々の光学的信号を用いることができる。特
定の光学的信号は、検出すべき物質の性質及び希望の解像力に基づき、情報の適
当なレベルを与えるように選択する。ここで与える実施例は、エリプソメトリー
及び散乱計数法(scatterometry)を用いている。図１１参照。しかし、ここに記
載する一般的概念及び方法論を使用することにより種々の光学的方法が実質的に
改良される。特に、吸収、屈折率変化、キラル効果、及び回折のような効果を、
本質的に同様な光学的構成内で用いることができる。図１２は可能な光学的信号
型を列挙しており、従って列挙法に順応できる範囲の方法を示している。それは
、その完全なリストを含むものではなく、それを限定するものでもない。

【００７０】量増大標識は、大きな感度でこの算出法の実施で中心的役割を果たすことがで
きる。図１３及び１４は、信号発生体として用いることができる種々の大きさの
材料のアスペクト比、又は相対的高さ：幅：広さを比例的に例示している。これ
らの図で示したように、小区画式目盛で有機体は装置内で増幅することなく非常
に顕著な信号を発生する。比較として読取り領域表面の底に沿って表された薄い
付属層は、現在のＯＴＥＲフォーマットでは明確に区別できる信号を生ずる。標
識として用いられる遥かに大きな目的物中に含まれる量によって発生する信号は
、著しく感度を改良する。

【００７１】更に、論じたような走査（小さなビーム）又は配列（仮想ビーム）法のいずれ
に対しても、光学に基づく量検出装置の独特の特性を用いて信号検出性の実質的
な改良が可能である。与えられた量増大標識の特別な性質を用いて、光学的特性
：屈折率、散乱、キラル効果、一般的吸着、波長比吸収率、及び回折に対するそ
の効果を含めた物理的特性に基づく光学的信号を変化させるのに用いることがで
きる。

【００７２】独特の又は明確な光学的効果を生ずるように選択された標識を用いることによ
り、錯体へ標識を結合することにより発生した信号を、表面背景又は特異結合事
象が存在しない所で生じた信号から区別する改良された能力を生ずる。これは、
通常の物質によって生ずる信号よりも、増大又は減衰した見かけの信号の発生に
より作動する。

【００７３】図１４は、特にエリプソメトリーフォーマットで高屈折率物質を使用すること
によるこの種の効果の例を与えている。エリプソメトリーによって検出される偏
光状態の変化は、二つの明確な因子（絶対量及び屈折率）により起こされるので
、量増大標識として高屈折率物質を用いることは、エリプソメーターにより検出
される見かけの量を効果的に増大し、これによって結合事象からの信号を増幅す
る。

【００７４】信号の強度を増幅又は増大するか、又は独特の型の信号を生ずるように設計し
た特別な種類の材料を用いた任意の数の光学的相互作用が想定され、参考として
ここに含ませる。

【００７５】散乱光の検出（散乱計数法）は、目で見て行われるか、又は光電子手段により
行われる。目で見て検出する場合、観察者の目及び脳が影像処理工程を行い、そ
れが散乱、即ち特定の場所ではない決定を与える結果になる。ここでの用語「場
所(situs)」及び「部位(site)」は、一つのリガンドによって覆われる領域を指
す。その場所が周囲の背景よりも明るく見える場合に散乱が観察される。もし部
位の数が小さく、恐らく１ダース以下であるならば、処理工程を本質的に同時に
行うことができる。もし部位の数が大きい（数百以上）ならば、光電子検出装置
が望ましい。

【００７６】光電子検出装置には、場所による光強度により変調される電気信号を用いたど
のような装置でも含まれる。例えば、光ダイオード、帯電結合装置、光トランジ
スタ、ホトレジスタ、及び光電子倍増管が適切な光電子検出装置である。好まし
くは、検出器の配列（ピクセル）は、信号解析のための反応性表面上の部位の配
列に相当し、或る検出器は場所外部分に対応する。しかし、入手可能なフレーム
グラバー及び像処理ソフトウエアーと組合された帯電結合装置（ＣＣＤ）カメラ
により行われるもののような反応性表面のデジタル表示が一層好ましい。本発明
で好ましい像処理法は、ウィンドーズ(Windows)（商標名）のためのイメージ・
プロ(Image-Pro)（登録商標名）プラス(Plus)〔メディア・サイバーメトリクス(
Media Cybermetrics)〕から誘導される。

【００７７】ＣＣＤカメラ又はビデオカメラは、全ての標識及び非標識領域を含めた全反応
性表面の像を形成し、この像をコンピューターのフレームグラバーカードへ供給
する。そのイメージは、各ピクセルに数値を当て嵌めることにより、デジタル情
報へフレームグラバーにより変換される。デジタル方式は二元系（例えば、明＝
１、暗＝０）にすることができるが、８ビットグレースケールが好ましく、この
場合０が黒い像を表し、２５５が白い像を表し、中間の数値は各ピクセルの種々
のグレー色調に相当するように数値が各ピクセルに割り当てられている。

【００７８】データー解析デジタル情報はモニターに表示するか、又は更に操作するため、例えば、影像
印刷及び保存のためにＲＡＭ又は記憶装置に記憶させる。ウィンドーズのための
イメージ・プロ・プラス（ＩＰＰ）のような像処理ソフトウエアーを用いてデジ
タル情報を分析し、各場所の境界又は輪郭を決定し、各場所での強度値を決定す
る。ＩＰＰはデジタル像獲得、処理及び分析のための市販ソフトウエアーである
。ＩＰＰは像内の目的物を自動的に計算及び測定し、然る後、例えば、角度、面
積、長さ、幅、直径、半径、円周、領域又はアスペクト比、色、位置、光学密度
、及びホール領域を含めた特性により目的物を分類する。ＩＰＰは目的物の集団
内に含まれる目的物の数を推定することもできる。

【００７９】ＩＰＰは、真のアナライト錯体粒子を他の粒子又は光学的特徴、例えば、塵、
非特異結合、固相アノモリー(anomoly)、マスキングから区別するために、特定
の一連の機能及び分析を行うようにプログラムすることができる、即ち、ここで
論じた目的測定特性を用いて、信号：非信号フィルターを形成することができる
。

【００８０】屡々、像は個々の結合事象を算出するソフトウエアーの能力を改良するため、
増強を必要とする。増強法には、例えば輝度：コントラスト調節、及び空間：形
態学的フィルターが含まれる。特に像増強には三つの基本的範疇が存在する：強
度指数変更、空間フィルター、及び影像頻度操作。

【００８１】強度指数変更は、各ピクセルの強度値を解釈する仕方の変更に関する。強度指
数の態様には、例えば、輝度、コントラスト、ガンマー修正、閾値決定、背景平
坦化、背景差引き、強度均等化が含まれる。

【００８２】空間濾過法は、小さな領域のピクセル内の像を分析し、処理する。特に、像内
の強度変化で起きる変化速度を減少又は増大することによる。この濾過には、旋
回（線状）及び非旋回（非線状）が含まれる。

【００８３】像頻度の操作は、像を一組の頻度に変換し、ノイズ問題を起こす頻度を削除す
ることにより像中の周期的又は固有のノイズを除去することに関する。このため
に用いられる一般的技術は、フーリエ変換である。

【００８４】必要なデジタル像処理機能は、全てのソフトウエアーに基づく算出工程を半自
動的及び（又は）自動的に行うために適合し、それが出来る実験室規模の装置へ
統合することも考慮されている。表面像を表示することは本発明の本質的な要素
ではない。ソフトウエアー像処理が、完全に像のデジタル化により与えられるデ
ーターを用いて行われることだけが本質的なものである。

【００８５】米国特許第５，３２９，４６１号明細書に記載されているような発明の集合制
御(clustering)法は、種々の用途で本発明と組合せて個々のアナライト粒子又は
個々の結合事象を空間的に解像し、計算するために利用するのに適合させること
ができる。例えば、分子からなるアナライト粒子の検出及び試料の像内の問題の
領域の位置を定めるため迅速な走査を行うための労働である。

【００８６】機械一般に、調製した試験片を試料台に固定し、対物レンズの中心と試験スポット
の中心とが道線状上に来るように手で配置する。試験片は多数の試験スポットを
含むように調製し、従って、１、即ち第一のものとして指定した試験スポットを
中心へ持ってきて開始する。試料台の平行移動能力を用いて、検出器を手で操作
し散乱粒子に焦点を合わせる。次に、光散乱によって生じた像を収集し、保存す
る。最後に、試料台を二つの交互になった位置、中心の左及び右に夫々一つずつ
の位置へ移動させ、像の獲得を各場所で繰り返す。検出工程では、一般にここに
記載した夫々の工程を、試験片に含まれるどのような数の試験スポットに対して
も繰り返すことができる。

【００８７】ここに記載した算出法で用いられる機械は、試料台、固定アナライト錯体に対
応する光学的信号フォーマット、及びデーター収集及び分析のための機構の３つ
の規定モジュールからなる。各モジュールは少なくとも二つの軸上で独立に平行
移動するのに適合し、それにより最適光学的効果、配列、及び焦点の一致を促進
する。機械及びそのモジュールは、例えば、固体平面状水平プラットホームへの
標準的取付け手段により互いに対し静止するように全て固定されている。図１５
に示したように、特に算出装置１００は、コンピューター８０及び試料台１０と
機能的に組合されたビデオ表示端子６０から本質的になるデーター収集のための
機構及び分析器８５；及び信号キャリヤー４０及び光散乱標識のような信号発生
体が照射された時に算出装置１００によって検出できるように構成された信号検
出器２５から本質的になる光学的信号フォーマットからなる。

【００８８】試料台１０は、取付けジグ１５を上に乗せ、固定するために適合するどのよう
な平らな台、即ちプラットホームでもよく、その上に試験片７０を乗せて取付け
ジグ１５へ固定する。試験片７０は、両面接着テープ又は機械的取付け手段のよ
うな適当な手段により固定することができる。前記台１０は、少なくともＸ−Ｙ
軸に沿って平行移動し、好ましい態様として、付加的に回転及び角度の制御機能
を有する。試験片７０は、更にここに記載するように調製された試験スポットを
有する。

【００８９】光学的信号フォーマットは、ここに記載するような試験スポットに結合された
光散乱標識のような信号発生体、信号キャリヤー４０、及び信号検出器２５から
なる。好ましい態様として、信号キャリヤー４０は電磁波源であり、一層好まし
くは回転及び角度制御機能の両方を有するように適合取付けされたレーザーダイ
オードである。信号検出器２５、一体的に接続された顕微鏡焦点管３０、及び光
検出器と機能的に接続された対物レンズ２０、及び好ましくはＣＣＤカメラ５０
が、標準的取付け手段により、試料台１０の垂直上に配置されている。信号検出
器２５は、標準的手段によりＰＣ８０及びビデオ表示端子６０からなるデーター
収集及び分析機構８５と機能的に接続されており、従ってそれらの各々は適当な
ソフトウエアー及びエレクトロニクスが装備されている。

【００９０】使用する際、ＰＣ８０及びビデオ表示端子６０、及び信号キャリヤー４０に電
力を入れ、少なくとも３０分間ウォームアップする。装置をウォームアップしな
がら、試験片７０を取付けジグ１５に接着し、そのシグを今度は試料台１０へ直
接固定し、信号検出器２５の垂直下に来るようにする。目的アナライトが結合さ
れた試験片７０の試験スポットを、次に中心に持って行き、信号検出器２５と信
号キャリヤー４０との間に配列し、焦点を結ばせる。算出機１００を連動させ、
像を得、示し且つ（又は）それによって記憶する。試験片７０は、ここに記載し
たように試験スポットの右及び左に付加的像捕捉のために配列しなおす。算出装
置１００と像捕捉との噛み合わせを、試験片７０の試験スポットの各々について
同様なやり方で繰り返す。

【００９１】算出装置１００のその噛み合わせの前に、適当なソフトウエアーの製造を行な
う。例えば、サブホールダー、省略時設定、及びマクロを組み立てる。

【００９２】一般に表面結合微小球により散乱された光を、顕微鏡対物レンズにより、収集
拡大し、ＣＣＤ配列体、例えば６４０×４８０ピクセル上に焦点を結ばせる。Ｃ
ＣＤ信号出力を白黒モニター、及びデーター・トランスレーション(Data Transl
ation)ＤＴ３１５５高精度科学フレームグラバー（データー・トランスレーショ
ン社）のようなデーター翻訳フレームグラバーの両方に送る。散乱光により形成
された像の獲得及び分析は、そのような機能に適合し且つ（又は）特別に関連し
たソフトウエアー、例えばイメージ・プロ・プラス（メディア・サイバネテクス
）によって達成される。

【００９３】像内の散乱目的物の区別及び計数を含むデーター分析は、そのような目的のた
めに設計されたソフトウエアーにより達成される。そのようなソフトウエアー中
へ、例えば、マクロプログラムにより適合される注文された機能には、フィルタ
ー、像強度平均化、及び二元フィルターにより目的物計数から非結合事象を排除
することが含まれる。本発明の好ましい態様で用いるのに適合したマクロの例に
は次のものが含まれる：光輝散乱目的物の標準３×３クロス(cross)への変換；
散乱目的物を分離するための分岐点フィルターの得られるクレス(cress)への適
用；平均像強度及びその平均の標準偏差の決定；平均像強度に基づく二元フィル
ターのための下限強度閾値の決定；下限の閾値を有する二元フィルターの適用；
及び平均直径、例えば１０ピクセル未満の得られた目的物の自動計数。各像につ
いて計算された目的物の数を、各々試験スポットについて生じた三つの像（中心
、左及び右）についての平均する。

【００９４】例１：特異結合検定全ウエーハ試験片の調製．用いた試験片は市販の５’珪素（Ｓｉ）ウエーハ
であった。標準回転被覆法を用いてウエーハの反射性表面上にポリウレタンを置
くことにより薄層ポリウレタン被覆ウエーハを製造した。簡単に述べると、それ
らウエーハは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）〔シグマ・ケミカル
社(Sigma Chemical Co.)〕中に入れたポリメディカ(Polymedica)Ｍ１０２０ポリ
ウレタン〔ポリメディカ社(Polymedica, Inc.)〕の完全に混合した１．２５％溶
液５００μｌを、５０００ｒｐｍで回転する珪素ウエーハ〔アディソン・エンジ
ニアリング(Addison Engineering)〕の中心へ添加することにより調製した。ウ
エーハを空気乾燥し、次に７０℃で１６〜２０時間焼き付けた。次にＲＴＶ１０
８シリコーンゴム接着密封材〔ＧＥシリコーンズ社(GE Silicones, Inc.)〕を被
覆した３．５″×３．５″ゴムスタンプを用いて非反射性ウエーハ表面に１０サ
ークル(circle)×１０サークル模様を適用した。得られた円状輪郭は、各円状ポ
リウレタン被覆試験スポット（〜０．２５″直径）を分離する手段として働いた
。接着剤を室温で約２４時間硬化した後、検定に使用した。

【００９５】ビオチニル化表面へのストレプタビジン(Streptavidin)被覆微小球の吸着．
ポリウレタン被覆ウエーハ試験スポットの各々を、１μｇ／ｍｌのビオチニル化
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ・ケミカル社）の２０μｌで被覆するか
、又は別法として否定対照(negative control)として用いるために非ビオチニル
化ＢＳＡで被覆した。ウエーハを３７℃で１時間、湿度１００％の室内で保温し
た。保温後、ウエーハを脱イオン水で３回濯ぎ、圧縮空気で乾燥した。ＢＳＡ固
定後、試験スポットを３％のＢＳＡ３０μｌで１時間３７℃でブロックし、次に
脱イオン水で３回濯ぎ、圧縮空気で乾燥した。

【００９６】ストレプタビジン被覆ポリスチレン微小球（直径３５０ｎｍ）〔バングス・ラ
ボラトリーズ(Bangs Laboratories)〕を連続的に硼酸塩緩衝液〔０．１Ｍ、ｐＨ
８．５＋０．０１％トウィーン(Tween)−２０〕中で希釈し、得られる希釈範囲
を１：１０〜１：１０，０００にした。次に各希釈物２０μｌをビオチニル化及
び非ビオチニル化試験スポットへ適用し、そのウエーハを３７℃で１時間保温し
、脱イオン水で１０秒間濯ぎ、圧縮空気で乾燥し、ここに記載した本発明で分析
した。その結果を表Ｉに示す。これらのデーターは、表面に結合した光散乱標識
を、本発明を用いて検出し、算出することができること；ストレプタビジン被覆
微小球はビオチニル化表面に特異的に結合すること；及び表面上で計算された微
小球の数は、表面に適用された数に依存することを示している。

【００９７】例２：ぶどう球菌エントロトキシンＢ（ＳＥＢ）検出検定全ウエーハ試験片の調製．用いた試験片は市販の５’珪素（Ｓｉ）ウエーハ
であった。標準回転被覆法を用いてウエーハの反射性表面上にポリウレタンを置
くことにより薄層ポリウレタン被覆ウエーハを製造した。簡単に述べると、それ
らウエーハは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）（シグマ・ケミカル
社）中に入れたポリメディカＭ１０２０ポリウレタン（ポリメディカ社）の完全
に混合した１．２５％溶液５００μｌを、５０００ｒｐｍで回転する珪素ウエー
ハ（アディソン・エンジニアリング）の中心へ添加することにより調製した。ウ
エーハを空気乾燥し、次に７０℃で１６〜２０時間焼き付けた。次にＲＴＶ１０
８シリコーンゴム接着密封材（ＧＥシリコーンズ社）を被覆した３．５″×３．
５″ゴムスタンプを用いて非反射性ウエーハ表面に１０サークル×１０サークル
模様を適用した。得られた円状輪郭は、各円状ポリウレタン被覆試験スポット（
〜０．２５″直径）を分離する手段として働いた。接着剤を室温で約２４時間硬
化した後、試験片上に試験スポットを取付け、検定に使用した。

【００９８】ＳＥＢ検出．完全サンドイッチ検定を、試料緩衝液中のＳＥＢを検出するた
めに用いた。一般的プロトコルは、捕捉抗体を個々の試験スポットへ被覆し、ブ
ロッキングし、種々の濃度のＳＥＢを被覆試験スポットへ添加し、ビオチニル化
二次応答抗体を適用し、結合二次抗体をアビジン化ポリスチレン微小球で標識付
けすることからなっていた。

【００９９】試験ウエーハを、各々検定試験スポットへ３０μｇ／ｍｌ（０．１ＭＰＢＳ
中、ｐＨ７．２）溶液を２０μｌ適用することにより多クローン性∝−ＳＥＢ捕
捉抗体で被覆した。ウエーハを３７℃で１時間保温し、捕捉抗体をポリウレタン
へ受動吸着させた。保温後、ウエーハを脱イオン水で３回濯ぎ、圧縮空気で乾燥
した。

【０１００】捕捉抗体固定後、後の検定工程での非特異性蛋白質吸着を減少させるため、各
試験スポットを３％ＢＳＡ溶液（０．１ＭＰＢＳ、ｐＨ７．２）４０μｌでブ
ロックした。ウエーハを３７℃で１時間保温し、次に脱イオン水で３回濯ぎ、圧
縮空気で乾燥した。

【０１０１】ＳＥＢ試料を、１ｍｇ／ｍｌストックを試料緩衝液（０．１ＭＰＢＳ＋１％
ＢＳＡ＋０．０１％トウィーン−２−、ｐＨ７．２）中へ連続的に希釈すること
により調製し、最終的トキシン濃度を０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範
囲にした。ＳＥＢを含まない緩衝液を否定対照として用いた。ウエーハ表面を横
切って別々の試験スポットへ希釈物及び否定対照の各々を２０μｌ適用した。ウ
エーハを３７℃で３０分間保温し、次に脱イオン水で３回濯ぎ、圧縮空気で乾燥
した。

【０１０２】ビオチニル化∝−ＳＥＢ抗体を試料緩衝液中に入れて４μｇ／ｍｌに希釈した
。各試験スポットをこ二次抗体希釈液２０μｌで被覆した。ウエーハを３７℃で
３０分間保温し、次に脱イオン水で３回濯ぎ、圧縮空気で乾燥した。

【０１０３】ストレプタビジンを被覆した直径３５０ｎｍのポリスチレン微小球を硼酸塩緩
衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５＋０．０１％トウィーン−２０）中に１：１００に
希釈したものを２０μｌ試験スポットに被覆した。そのウエーハを３７℃で３０
時間保温し、次に各試験スポットを１０秒間濯ぎ、圧縮空気で乾燥し、分析した
。その分析結果を表IIに示す。これらのデーターは、本発明を用いて、抗体の固
相への結合を特定の定量的やり方で算出するのに用いることができることを示し
ている。この方法の検出下限は５５０ｐｇ／ｍｌであった。

【０１０４】ここに一般的に記述したように、データー取得及び分析を行なった。ウエーハ
又は試験片を台の上に取付け、位置を定め、焦点を結び、像を捕捉した。データ
ー分析は、イメージ・プロ・プラス内でマクロプログラムを用いることを含んで
いた。

【０１０５】上の記述は多くの特殊性を含んでいるが、これらの特殊性は本発明の範囲を限
定するものと考えるべきではなく、むしろその好ましい態様の例示と考えるべき
である。即ち、本発明の前記記載は、例示及び説明のための見本である。本発明
の本質及び範囲から離れることなく、本発明を種々の用途及び条件に適合させる
ために本発明に種々の変化及び修正を当業者は行うことができる。そのようなも
のとして、それらの変更及び修正は適切に、正当に特許請求の範囲と同等の全範
囲内に入るものと考えられる。従って、本発明の範囲は、ここに与えた実施例に
よるものではなく、特許請求の範囲及びその合法的な同等ものによって決定され
るべきである。

【０１０６】

【０１０７】

【図面の簡単な説明】

【図１】標準免疫検定法での単位体積当たりの量の決定を例示する図である。

【図２】検定領域に亙って行われる光学的平均化の図である。

【図３】高度に不均質な検定領域積分を表す図である。

【図４】わずかな数の結合事象を大きな検定領域に亙って平均した場合の統計的無意味
への帰結を例示する図である。

【図５】個々の結合事象に対し大きな相対的信号を与える小さなビームのエリプソメト
リー又は散乱計数法を示す図である。

【図６】表面解像し、それにより個々の結合事象の同定に近似させる方法論的アプロー
チを例示する図である。

【図７】集合応答のレーザー決定法を例示する図である。

【図８】個々の細胞規模の読取りを決定するための走査マイクロレーザー構成の図であ
る。

【図９】検出に関連した相対的大きさを例示する図である。

【図１０】レーザービームを個々の信号に解析するのに用いられるＣＣＤ及び（又は）ダ
イオード配列ビームの図である。

【図１１】検出及び解像目的に有用な種々の光学的信号を示す図である。

【図１２】光学的信号フォーマット：過去、現在及び未来の例を示す。

【図１３】可能な走査マイクロレーザー構成の規模を例示する図である。

【図１４】光学的増大ポテンシャルの図である。

【図１５】本発明の好ましい機械の態様を例示する図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ロビンソン、メアリイベスアメリカ合衆国コロラド、ボールダー、パインストリート 1735 Ｆターム(参考） 2G045 BB14 BB48 CB21 FB15 GC11 2G059 AA05 BB12 CC16 DD13 EE01 EE02 EE05 EE11 FF01 FF03 HH02 KK04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】個々の目的アナライト結合事象の固相光学的検出及び算出法
において、反射性又は透過性基体上に溶液から直接アナライト錯体を固定し、然も、前記
錯体が、少なくとも一つの第二アナライト特異結合性素子に接合した少なくとも
一つの信号発生素子と錯化した目的アナライトを有し、アナライト錯体が固定された基体から又はその基体を通して電磁波を反射又は
透過し、前記電磁波の反射又は透過により発生した信号を捕捉し、そして存在するアナライトのその存在及び（又は）量について前記信号を分析する、
諸工程からなる検出算出法。
【請求項２】アナライト錯体の固定を、固相又は固相マトリックスへの吸
着、共有結合、立体結合、化学的に媒介された結合、結合剤による結合、自己集
合結合、又は自己集合力媒介結合により達成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】固定が、基体とアナライト錯体との間に配置された一つ又は
複数の中間層を更に用いて行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】目的アナライトが、固定により材料（単数又は複数）から分
離される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】アナライトが液相又は固相状態で錯化されている、請求項１
に記載の方法。
【請求項６】信号発生素子が、自己集合性物質、凝集性物質、酵素、化学
的活性物質、フイルム形成性物質、及び光学的特異性物質からなる群から選択さ
れる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】信号発生素子が、微粒子、コロイド金属又は非金属、重合体
、ガラス、シリアル化合物、光学活性物質、巨大分子、及び核酸からなる群から
選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】信号発生素子が、アナライト錯体に量を追加する、請求項６
に記載の方法。
【請求項９】複数の信号発生素子がアナライト錯体と錯化され、明確な結
合事象を示す複数の明確な信号を生ずる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】第二結合性素子が、抗体、抗原、巨大分子、核酸、及び特
異結合性分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】電磁波源がレーザーダイオードである、請求項１に記載の
方法。
【請求項１２】個々の目的アナライト結合事象の固相光学的検出及び算出
装置において、少なくとも一つの第二アナライト特異結合性素子に接合した少なくとも一つの
信号発生素子と錯化した目的アナライトを有するアナライト錯体が固定された基
体からなる、目的アナライトを捕捉するための機構、前記信号発生素子と既知の相互作用を及ぼし、アナライト結合事象（単数又は
複数）を証明する検出可能な信号を発生する、電磁波からなる信号キャリヤー機
構、光学的解像素子（単数又は複数）を有し、信号キャリヤーから発生した情報を
受け取るように構成された信号捕捉機構、及び前記信号捕捉機構により発生した情報を処理し、アナライトを定性的及び（又
は）定量的に検出するための信号分析機構、を具えた検出算出装置。
【請求項１３】電磁波が４００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内の単色波長を持
つ、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】電磁波が４００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲内の多重波長を持
つ、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】解像素子が、拡大、焦点一致、及び（又は）信号キャリヤ
ー機構の制御を行う、請求項１２に記載の装置。
【請求項１６】解像素子が、信号発生素子から発生した集合信号から個々
の信号を解析する、請求項１２に記載の装置。
【請求項１７】信号キャリヤー機構が、干渉、回折、反射、偏光、散乱、
複屈折、吸収、及び屈折からなる群から選択される、請求項１２に記載の装置。
【請求項１８】アナライト錯体が、目的アナライトの存在に関連した検出
信号を増幅する量増大手段を更に有する、請求項１２に記載の装置。