DE10113711A1 - Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen und Messträger zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen und Messträger zur Durchführung des Verfahrens

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Abstract

Zum Nachweis biochemischer Reaktionen wird vorgeschlagen, auf einen Messträger, der in Form und Größe einer CD oder dergleichen entspricht, bestimmte Detektormoleküle aufzubringen. Diese können mit Bestandteilen einer zu untersuchenden Probe reagieren. Anschließend werden signalgebende Elemente wie beads an die Reaktionsprodukte gebunden und der Messträger nachverspiegelt. Aufgrund der Reflexionseigenschaften der signalgebenden Elemente im Vergleich zu den glatten verspiegelten Flächen lässt sich die Zahl der signalgebenden Elemente entsprechend der Zahl der punktförmigen Stellen mit Reaktionen auszählen. Zum Zählen wird ein CD-/DVD-Player oder sonstiges Lesegerät verwendet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem biochemische Nachweisreaktionen durchgeführt werden können. Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Messträger, der zur Durchführung des Verfahrens verwendet werden kann.
Beim Stand der Technik wird die Bindung von Reaktionspartnern in der Biochiptechnologie fluorophotometrisch nachgewiesen. Für jeden Spot, bei dem eine solche Reaktion auftreten kann, muss die Intensität des Fluoreszenzsignals und seine Farbe gemessen werden. Dazu muss über den gesamten Spot integriert werden. Weiterhin muss darauf geachtet werden, dass benach­ barte Spots nicht mit in die Messung einbezogen werden. Wenn der Spot keine scharfe Begrenzung aufweist, verschoben ist oder eine nicht konstante Größe aufweist, treten bei den bekannten Verfahren Messfehler auf. Durch diese Wahrschein­ lichkeit des Auftretens von Fehlern und durch das auslesbare Fluoreszenzsignal ist die Dynamik der bisherigen Genchips be­ grenzt. Insbesondere ist die Skalierung des Verfahrens hin zu immer kleineren Probenvolumina und Spotdimensionen nicht be­ liebig möglich.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen zu schaffen, das genauere Ergebnisse mit geringem Aufwand und weitgehend beliebiger Skalierung ermöglicht. Der Erfindung liegt ebenfalls die Aufgabe zu Grunde, einen Messträger zu schaffen, mit dessen Hilfe oder auf dem das Verfahren durchgeführt werden kann.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung ein Verfahren mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen vor. Die Erfindung schlägt ebenfalls einen Messträger mit den im Anspruch 9 ge­ nannten Merkmalen vor. Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand von Unteransprüchen, deren Wortlaut ebenso wie der Wortlaut der Zusammenfassung durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht wird.
Das Verfahren verläuft also folgendermaßen ab. Auf einem Messträger wird eine Vielzahl von exakt definierten diskreten punktförmigen Stellen mit einem bestimmten Detektormolekül, beispielsweise einem Oligonukleotid, versehen. Unter punkt­ förmigen Stellen sind solche Stellen zu verstehen, die in der Größenordnung der Pits einer CD oder darunter liegen. Als Beispiel sei eine Größe von 0,6.0,9 µm genannt. Das Auf­ bringen des Detektormoleküls kann beispielsweise mit Hilfe eines Stempels erfolgen, der sich in der benötigten Genauig­ keit herstellen lässt.
Anschließend wird der Messträger mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht. Die Probe kann auch schon vor­ behandelt sein. Die Probe ist normalerweise in wässriger Lösung enthalten. Wenn das Detektormolekül mit seinem Bin­ dungspartner in der Probe in Kontakt gebracht wird, so findet eine Reaktion statt. Bei der Vielzahl von punktförmigen Stellen, die mit dem Detektormolekül versehen sind, findet nicht an allen punktförmigen Stellen eine Reaktion statt.
Dies bedeutet, daß man aus dem Verhältnis der Zahl der punktförmigen Stellen mit einer Reaktion zu der Gesamtzahl von punktförmigen Stellen mit dem Detektormolekül Rück­ schlüsse über den Bindungspartner ziehen kann, beispielsweise auf dessen Konzentration in der Probe oder seine Bindungs­ affinität zu dem oder den Detektormolekül(en).
In Weiterbildung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass nach dem Benetzen des Messträgers mit der Probe signalgebende Elemente, insbesondere sogenannte beads, insbesondere an die Bindungspartner gebunden werden. Bei den sogenannten beads handelt es sich um kleine Kugeln, die mit den Bindungspart­ nern eine weitere Bindung eingehen und sich dadurch an den punktförmigen Stellen anlagern, an denen eine Wechselwir­ kung/Bindung zwischen Detektormolekül und Bindungspartner stattgefunden hat. Die signalgebenden Elemente dienen allge­ mein dazu, die in Frage kommenden punktförmigen Stellen genauer erkennbar zu machen und können für die Generierung der Messignale entscheidend sein.
Die signalgebenden Elemente, insbesondere die beads, können auch dazu dienen, eine bessere optische Unterscheidung zwi­ schen den in Frage kommenden punktförmigen Stellen und ihrer Umgebung herzustellen. Hierzu kann erfindungsgemäß in Weiter­ bildung vorgesehen sein, dass die Oberfläche des Messträgers ggf. zusätzlich verspiegelt wird. Dies kann in einem chemi­ schen Verfahren erfolgen. Die zwischen den signalgebenden Elementen vorhandenen glatten Flächen wirken dann spiegelnd, während die signalgebenden Elemente selbst trotz ihrer spiegelnden Oberfläche eine stark streuende Reflexion er­ zeugen.
Anstelle von Reflexion sind auch andere nichtresonante Wechselwirkungen wie Streuung oder Beugung verwendbar. Ebenso können resonante Wechselwirkungen wie Adsorption oder Fluo­ reszenz erfindungsgemäß ausgenutzt werden, bei denen eine Energieübertragung in das Molekülsystem stattfindet. In der nachfolgenden Beschreibung seien mit der Verwendung des Begriffs Reflexion alle diese alternativen Wechselwirkungs­ formen stellvertretend eingeschlossen. Ebenso ist es denkbar, abweichend von dem in der vorliegenden Beschreibung verwen­ deten Paradigma einer spiegelnden Fläche mit Störungen, andere kontrastgebende Verfahren zu verwenden. Dazu gehören z. B. Durchlichtverfahren, zur CD invertierte Kontrastverfah­ ren, farbgebende und fluoreszensbasierte Verfahren. In der Beschreibung seien alle diese Verfahren stellvertretend eingeschlossen.
Alternativ zu optischen Wechselwirkungen können die signal­ gebenden Elemente auch magnetisiert sein, und die Detektion erfolgt mittels magnetischer Verfahren. In der nachfolgenden Beschreibung seien durch die Diskussion der optischen Verfah­ ren stellvertretend auch die Verfahren mittels magnetischer Wechselwirkungen eingeschlossen. Die Verwendung von optischen Gerätschaften in der Beschreibung schließt damit die Geräte basierend auf magnetischen Wechselwirkungen stellvertretend ein.
Das Zählen der punktförmigen Stellen, an denen eine Reaktion stattgefunden hat, geschieht vorzugsweise mit Hilfe optischer Verfahren, bei denen das Vorhandensein oder Fehlen einer Reflexion ausgenutzt wird.
In Weiterbildung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass benachbart zu den für die Reaktion verwendeten punktförmigen Stellen zusätzliche punktförmige Stellen vorhanden sind, die mit Kontrollinformationen versehen sind. Dadurch lässt sich eine Kalibrierung des Messergebnisses durchführen.
Zur weiteren Steigerung der Genauigkeit kann vorgesehen sein, dass innerhalb der Fläche des Messträgers Gradienten zur Berücksichtigung unterschiedlicher Reaktionsbedingungen vorgesehen werden.
Vorzugsweise kann in Weiterbildung der Erfindung vorgesehen werden, dass das Zählen mit Hilfe eines CD-Players, eines magneto-optischen Laufwerks, eines Magnetkartenlesers oder eines ähnlichen Geräts erfolgt, bei dem eine bekannte Techno­ logie zum Auslesen und zur Spurführung ausgenutzt wird, während die eigentliche Auswertung mit Hilfe eines Computers oder einer sonstigen elektronischen Anlage erfolgen kann.
Der von der Erfindung vorgeschlagene Messträger enthält eine Vielzahl von diskreten punktförmigen Stellen, die mit einem bestimmten Detektormolekül versehen sind. Die punktförmigen Stellen sind voneinander durch glatte Flächen getrennt, deren Flächenanteil groß ist gegenüber dem Flächenanteil der punkt­ förmigen Stellen. Die punktförmigen Stellen sind vorzugs­ weise innerhalb eines zusammenhängenden Bereichs des Mess­ trägers angeordnet.
Der Messträger kann in Weiterbildung benachbart zu den mit dem Detektormolekül versehenen punktförmigen Stellen weitere punktförmige Stellen aufweisen, die mit Kontrollinformationen versehen sind. Diese können der Kalibrierung und Eichung des Messergebnisses dienen.
Die Zahl der mit einem bestimmten Detektormolekül versehenen punktförmigen Stellen kann erfindungsgemäß in den Größen­ ordnungen von 1 bis einigen 100.000 liegen.
Insbesondere günstig ist es, wenn der Messträger, wie die Erfindung als Möglichkeit vorschlägt, die Form und Größe einer CD, einer Magnetkarte oder ähnlicher Datenträger auf­ weist.
Die Erfindung lässt sich nochmals wie folgt zusammenfassend darstellen. Statt einer fluorophotometrischen Auslesung einzelner Spots werden Wechselwirkungen oder Bindungsreak­ tionen auf sehr kleinen punktförmigen Stellen detektiert, vorzugsweise mit Hilfe der zusätzlichen Bindung einzelner signalgebender Elemente wie beads. Die Bindung eines signal­ gebenden Elements erfolgt zum Beispiel an biotinylierte DNA, die an Oligonukleotide auf den punktförmigen Stellen hybridi­ siert haben. Die Reaktion kann so eingestellt werden, dass die Bindungswahrscheinlichkeit der signalgebenden Elemente niedrig, aber proportional zum Grad der DNA-Hybridisierung ist. Das Auslesen erfolgt dann digital (!). Es werden bei­ spielsweise 100.000 punktförmige Stellen auf einem spiralför­ migen Track mit gleichen Oligonukleotiden beschickt und die Zahl der gebundenen signalgebenden Elemente gezählt. Die Zählung erfolgt exakt mittels CD-Player readout. Wenn bei optimaler Hybridisierung zum Beispiel 20.000 punktförmige Stellen ein signalgebendes Element gebunden haben, beträgt die Standardabweichung beispielsweise 141. Geht die Hybridi­ sierung bei einer anderen DNA-Probe um den Faktor 2.000 zurück, würden nur noch 10 signalgebende Elemente binden. Die Standardabweichung wäre dann etwa 3. Daraus ergibt sich, dass bei 100.000 punktförmigen Stellen einer Sorte der dynamische Bereich etwa 1.000 ist. Dies ist mindestens 10 fach besser als bei den herkömmlichen Biochips. Eine CD enthält etwa 5.109 pits, weshalb etwa 10.000 Detektionen in diesem Be­ reich möglich wären. Der dynamische Bereich kann noch weiter gesteigert werden, indem auf der CD während der Hybridisie­ rung Gradienten angewendet werden. Bei allen möglichen Be­ dingungen kann immer neben einem Track mit der Probe ein Kontrolltrack gelesen werden, mittels dessen die Reaktion skaliert werden kann. So können die normalerweise bei Gen­ chips auftretenden Fehlermöglichkeiten eliminiert werden.
Beschreibung eines Durchführungsbeispiels
CD-Player lesen in einer Spur immer Pit oder Land. Ein Pit bedeutet, dass der vom Laser ausgehende Strahl nicht reflek­ tiert wird, während ein Land zu einer Reflexion führt. Die eingangs erwähnten punktförmigen Stellen sind unverspiegelte Stellen auf der CD, die geometrisch abgegrenzt sind. Auf diesen Stellen wird eine Bindungsreaktion durchgeführt. Anschließend wird eine Bindung von Latex- oder Glas-beads mittels Biotin-Streptavidin-Bindungen zur Detektion nachge­ schaltet. Nach Bindung der signalgebenden Elemente wird chemisch nachverspiegelt. An den punktförmigen Stellen, an denen signalgebende Elemente gebunden sind, bleibt die Verspiegelung gestört, während diejenigen punktförmigen Stellen, die keine signalgebenden Elemente gebunden haben, vollständig verspiegelt werden. Die erstgenannten Stellen werden daher von dem CD-Player als Pits erkannt, die anderen als Lands. Der CD-Player ist so in der Lage, die Zahl der signalgebenden Elemente, die gebunden haben, genau zu zählen. Die Wahrscheinlichkeit, mit der ein signalgebendes Element bindet, ist proportional zu der Bindungsaffinität bzw. zur Zahl der Bindungsstellen pro punktförmigen Stellen. Wenn die Redaktion so skaliert wird, dass keine Sättigung der Bindung eintritt, ist die Zahl der signalgebenden Elemente proportio­ nal zu der Zahl der Bindungsstellen und damit zum Beispiel zum Grad der Bindung.
Die punktförmigen Stellen, die für eine chemische Detektion beschichtet werden, liegen beispielsweise auf einer spiral­ förmigen Spur der CD. Die Kontrollreaktion wird vorzugsweise auf der benachbarten Spur aufgebracht. Dies sorgt dafür, dass lokale Schwankungen der Bindungsbedingungen, wie man sie bei Genchips häufig findet, durch das digitale Verfahren wegge­ mittelt werden. Weiterhin besteht die Möglichkeit, innerhalb der CD-Fläche Gradienten zu definieren, die die Reaktionsbe­ dingungen variieren, beispielsweise die Temperatur, die Ionenstärke oder den pH. Benachbarte Tracks werden trotz­ dem beinahe gleiche Reaktionsbedingungen und damit entspre­ chende Gradienten haben. Durch solche Gradienten kann der dynamische Bereich der Bindungsreaktion noch weiter ver­ größert werden. Da die Position jeder einzelnen punktförmigen Stelle auf der CD bekannt ist, ist die Gewichtung der gezähl­ ten punktförmigen Stellen sogar bei sehr steilen, bis zu logarithmischen Gradienten möglich. Da eine CD mehr als 20.000 Spuren besitzt, können auf diese Weise mehr als 10.000 Bindungsreaktionen verglichen werden.

Claims (15)

1. Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen, mit folgenden Verfahrensschritten:
  • 1. 1.1 auf einem Messträger wird eine Vielzahl exakt definierter diskreter punktförmiger Stellen mit einem bestimmten Detektormolekül versehen,
  • 2. 1.2 der Messträger wird mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht, vorzugsweise benetzt,
  • 3. 1.3 es wird der Eintritt der möglichen Wechselwirkung oder Bindungsreaktion zwischen dem Detektormolekül und der Probe abgewartet,
  • 4. 1.4 die punktförmigen Stellen, an denen eine Reaktion auftrat, werden digital ausgelesen, vorzugsweise gezählt, und mit der Gesamtzahl der punktförmigen Stellen verglichen, und
  • 5. 1.5 die so erhaltenen digitalen Daten zur Ermittlung der Parameter der Bindungsreaktion vorzugsweise statistisch ausgewertet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem nach dem in Kontakt­ bringen des Messträgers mit der Probe signalgebende Elemente als Detektorstrukturen an das Reaktionsprodukt gebunden werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den signalgebenden Elementen um sogenannte beads handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem nach dem Auf­ bringen der signalgebenden Elemente die Oberfläche des Messträgers ggf. zusätzlich verspiegelt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Auslesen der punktförmigen Stellen mit Hilfe optischer Verfahren erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem für das Auslesen die Reflexionseigenschaften der punktförmigen Stellen im Vergleich zu den Reflexionseigenschaften der die punkt­ förmigen Stellen umgebenden Flächen ausgenutzt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem benachbart zu den für den Nachweis verwendeten punktförmigen Stellen weitere exakt definierte diskrete punktförmige Stellen mit Kontrollinformationen vorge­ sehen werden.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem innerhalb der Fläche des Messträgers Gradienten zur Berücksichtigung unterschiedlicher Reaktionsbedingungen vorgesehen werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, bei dem das Auslesen der punktförmigen Stellen mit Hilfe eines Lesegeräts für CD, CD-R, DVD oder magneto-optische und magnetische Träger erfolgt.
10. Messträger, enthaltend eine Vielzahl von diskreten punktförmigen Stellen, die mit mindestens einem bestimm­ ten Detektormolekül versehen sind.
11. Messträger nach Anspruch 10, bei dem die punktförmigen Stellen innerhalb eines zusammenhängenden Bereichs des Messträgers angeordnet und durch glatte Flächen von­ einander getrennt sind.
12. Messträger nach Anspruch 10 oder 11, mit benachbart zu den mit dem Detektormolekül versehenen punktförmigen Stellen angeordneten punktförmigen Stellen mit Kon­ trollinformationen.
13. Messträger nach einem der Ansprüche 10 bis 12, bei dem die Zahl der mit einem bestimmten Detektormolekül ver­ sehenen punktförmigen Stellen im Größenordnungsbereich von 100.000 liegt.
14. Messträger nach einem der Ansprüche 10 bis 13, bei dem der Messträger die Form und Größe einer CD oder deren Abkömmlingen aufweist.
15. Messträger nach einem der Ansprüche 10 bis 14, mit einer Vielzahl von Bereichen mit unterschiedlichen Detektor­ molekülen.
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