DE10003763A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von DNA-Sequenzen in gentechnisch veränderten Organismen - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von DNA-Sequenzen in gentechnisch veränderten OrganismenInfo
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Abstract
Für eine besonders einfache und schnelle Detektion von DNA-Sequenzen (D) mindestens eines gentechnischen veränderten Organismus aus einer Probe (P) eines Stoffes, insbesondere eines Lebensmittels, werden erfindungsgemäß bei einem Verfahren eine Vielzahl von DNA-Sequenzen (D) verschiedener Länge aus der Probe (P) extrahiert, wobei die DNA-Sequenzen (D) mit einem kennzeichnenden Signal (F) markiert, auf eine Trägereinheit (1) aufgebracht und mit auf der Trägereinheit (1) angeordneten Referenz-DNA-Sequenzen (R) der Trägereinheit (1) hybridisiert werden, wobei anschließend hybridisierte DNA-Sequenzen (H) selektiert und anhand des Signals (F) ein Maß für die hybridisierten DNA-Sequenzen (H) bestimmt wird.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung
zur Detektion von DNA-Sequenzen (Deoxyribonucleic acid = DNA)
eines gentechnisch veränderten Organismus, z. B. einer
Sojabohne oder Papaya. Alternativ oder zusätzlich dient das
Verfahren zur Detektion von RNA-Sequenzen (Ribonucleic acid =
RNA). Dabei wird der gentechnisch veränderte Organismus
insbesondere aus einer Probe eines Lebensmittels, z. B. Müsli,
Schokoriegel, Fleisch- oder Agrarerzeugnis, extrahiert.
Lebensmittel umfassen beispielsweise anteilmäßig gentechnisch
veränderte Organismen oder Zusatzstoffe, welche aus
gentechnisch veränderten Organismen hergestellt wurden oder
diese wiederum enthalten beispielsweise in Form von Enzymen
oder Sojalecithin.
Gentechnische Veränderungen von Organismen werden durch
Veränderungen des Erbguts verursacht, indem neue
Erbinformationen, z. B. ein Gen, ein sogenanntes Struktur-Gen,
für die Resistenz gegen Pestizide oder, z. B. bei Mais, ein Gen
für die Resistenz gegen Maiszünsler, in das Erbgut mittels
sogenannter Vektoren eingebracht werden. Der Vektor umfaßt ein
entsprechendes Struktur-Gen, das in die Pflanze eingebracht
wird, einen Promotor, welcher eine Erkennungs- bzw.
Bindestelle für eine RNA-Polymerase (Ribonucleic acid)
darstellt und damit eine Expression des jeweiligen Struktur-
Genes reguliert, sowie häufig sogenannte Terminatoren, die als
Stopstellen für die RNA-Polymerase fungieren und somit
ebenfalls die Expression des Struktur-Genes regulieren.
Zusätzlich zu dem Struktur-Gen werden sogenannte Reporter-
oder Marker-Gene eingebracht, wodurch transformierte Zellen
identifiziert werden. Gegenwärtig wird beispielsweise das
Antibiotikaresitenz-Gen nptII aus dem bakteriellen Transposon
Tn 5 verwendet.
Üblicherweise werden für verschiedene gentechnischen
Veränderungen und somit für verschiedene Gene ein- und
derselbe Promotor sowie derselbe Terminator verwendet. Bei
gentechnisch veränderten Pflanzen dient als Promotor meistens
der sogenannte Blumenkohlmosaik-Virus (auch CaMV 35S-Promotor
genannt). Als Terminator wird meistens die Sequenz verwendet,
die für die Transkriptionstermination des Nopalin-Synthase-
Gens aus Agrobacterium tumefaciens, der sogenannte NOS-
Terminator, verantwortlich ist.
Für eine detaillierte Analyse wird standardmäßig die DNA aus
einer Probe der Pflanze oder des Lebensmittels extrahiert. Die
DNA umfaßt die gesamte DNA (auch genomische DNA genannt) der
jeweiligen Probe, z. B. die genomische DNA aus Mais oder
Kartoffeln. In dieser genomischen DNA ist dann auch die
gentechnische Veränderung in Form einer neuen DNA-Sequenz (=
Gen und Promotor sowie häufig Terminator) vorhanden, die in
den Organismus eingebracht wurde. Der Anteil dieser neuen DNA-
Sequenz im Verhältnis zur Gesamt-DNA ist sehr gering,
insbesondere bei Lebensmitteln mit einem sehr kleinen Anteil
an gentechnisch veränderten Organismen, z. B. bei einem
Schokoriegel mit Soja-Lecithin oder bei Maismehlprodukten wie
Maischips. Ein Nachweis solch geringer Mengen an neuer oder
veränderter DNA-Sequenz ist komplex und sehr aufwendig.
Üblicherweise werden daher derartige gentechnische
Veränderungen in Organismen mittels eines Screening-Verfahrens
anhand einer Polymerase-Ketten-Reaktion (im weiteren kurz PCR
genannt) nachgewiesen. Dabei wird in einer Probe mittels
verschiedener Primer der Promotor, der Terminator, die
Reporter- oder Marker-Gene, deren Sequenzen bekannt sind,
gesucht. Somit ist die Detektion des Promotors, des
Terminators oder des Reporter- bzw. Marker-Gens ein Nachweis
für die gentechnische Veränderung. Dieses Verfahren ist sehr
ungenau und erlaubt keine genaue Analyse der gentechnischen
Veränderung. Es besteht die Möglichkeit, daß Mikroorganismen,
welche die in die Pflanze eingeführten Gene natürlicherweise
besitzen, dem jeweiligen Probenmaterial anhaften und
demzufolge ein falsches Signal verursachen. Beispielsweise
können Bodenbakterien, die natürlicherweise das Transposon Tn
5 enthalten, an Kartoffelknollen anhaften und dadurch bei
einer PCR ein falsch-positives Signal ergeben. Somit sind noch
weitere Analysen erforderlich. Als Nachweis eignen sich
hierbei DNA-Sequenzen aus Übergängen (die sogenannten
Fusionsstellen) zwischen Struktur- und Marker-Gen oder
Promotor und Struktur-Gen etc. Nachteilig ist jedoch, daß für
das Screening-Verfahren sowie für den spezifischen Nachweis
der Fusionstellen die Probe ein amplifizierbares DNA-Molekül
umfaßt. Bei der Herstellung von tierischen oder pflanzlichen
Lebensmitteln ist es darüber hinaus möglich, daß durch
chemische und/oder physikalische Herstellungsverfahren (Druck,
Hitze, der Einsatz von Säuren oder Oxidationsmitteln) die DNA
stark zerstört wird und dadurch eine gentechnische Veränderung
nicht detektierbar ist, so daß die Analyse mittels PCR hierbei
versagt. Bedingt durch eine lediglich auf den Promotor,
Terminator, Reporter- oder Marker-Gen eingegrenzte Detektion
des Screening-Verfahrens ist dieses als Nachweisverfahren
völlig unzureichend. Insbesondere ist die Detektion von
spezifischen Struktur-Genen dadurch nicht ermöglicht. Darüber
hinaus ist das Nachweisverfahren mittels PCR in bezug auf
Probendurchsatz mengenmäßig limitiert.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur
Detektion von DNA-Sequenzen anzugeben, welches die Nachteile
im Stand der Technik überwindet, und welches insbesondere
neben dem Promotor, Terminator, Reporter- bzw. Marker-Gen
gleichzeitig auch das die Veränderung verursachende Struktur-
Gen bestimmt sowie einen Nachweis bei partiell zerstörter DNA
ermöglicht. Darüber hinaus ist eine für die Durchführung des
Verfahrens besonders geeignete Vorrichtung anzugeben.
Die erstgenannte Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein
Verfahren zur Detektion von DNA-Sequenzen mindestens eines
gentechnisch veränderten Organismus aus einer Probe eines
Stoffes, insbesondere eines Lebensmittels, bei dem eine
Vielzahl von DNA-Sequenzen verschiedener Größe extrahiert
werden, wobei die DNA-Sequenzen mit einem kennzeichnenden
Signal markiert, auf eine Trägereinheit aufgebracht und mit
auf der Trägereinheit angeordneten Referenz-DNA-Sequenzen
hybridisiert werden. Das kennzeichnende Signal wird bevorzugt
zur Analyse der hybridisierten DNA-Sequenzen derart verwendet,
daß ein Maß für den Grad der Hybridisierung und somit ein Maß
für die Anzahl der hybridisierten DNA-Sequenzen bestimmt wird.
Durch die Hybridisierung einer Vielzahl von DNA-Sequenzen der
Probe mit entsprechenden Referenz-DNA-Sequenzen, insbesondere
mit einigen hunderten bis tausenden Referenz-DNA-Sequenzen,
auf einer einzelnen Trägereinheit ist die gesamte eingebrachte
und veränderte DNA-Sequenz (= Gesamtheit des Promotors,
Terminators, des Struktur-Gens sowie eventuelle Reporter- und
Marker-Gene) nachweisbar. Somit ist selbst beispielsweise bei
Lebensmitteln, bei denen größere Teilbereiche der
nachzuweisenden DNA zerstört sind, eine Detektion der
restlichen, intakten DNA-Bereiche und somit auch die
Anwesenheit der veränderten in den Organismus eingebrachten
DNA-Sequenz ermöglicht, da diese an die Referenz-DNA-Sequenzen
gebunden werden. Ein weiterer Vorteil ist, daß mittels einer
einzelnen Trägereinheit verschiedene und/oder mehrere
gentechnische Veränderungen ermittelt werden. So ist
beispielsweise auf ein- und derselben Trägereinheit der
Nachweis verschiedener gentechnischer Veränderungen einer
Sojapflanze möglich. Darüber hinaus ist gegenüber dem PCR-
Verfahren des Standes der Technik eine höhere Auflösung und
somit Genauigkeit in der Meßmethode gegeben. Je nach Art und
Ausführung des Verfahrens ist dieses besonders kostengünstig
und zeitsparend.
Zweckmäßigerweise werden die Referenz-DNA-Sequenzen der
Trägereinheit für verschiedene Abschnitte der zu
detektierenden DNA-Sequenzen vorgegeben. Unter einem einzelnen
Abschnitt wird mindestens ein Teil der jeweiligen Sequenz des
Promotors, des Terminators, des Marker- bzw. Reporter-Gens,
des Struktur-Gens bzw. Übergänge, z. B. zwischen Promotor und
Struktur-Gen, verstanden. Hierdurch ist gewährleistet, daß die
gesamte in den Organismus eingebrachte DNA-Sequenz
identifiziert wird. Dazu wird sowohl für den Promotor, den
Terminator, das Marker- bzw. Reporter-Gen als auch für das
Struktur-Gen der eingebrachten DNA-Sequenz eine zugehörige,
insbesondere komplementäre Referenz-DNA-Sequenz bestimmt, die
auf die Trägereinheit aufgebracht wird. Somit werden aufgrund
der verschiedenen zu detektierenden DNA-Sequenzen verschiedene
Typen von komplementären Referenz-DNA-Sequenzen vorgegeben und
auf der Trägereinheit immobilisiert. Vorzugsweise werden als
Referenz-DNA-Sequenzen vorgebbare Nucleotide, insbesondere
Oligonucleotide oder doppelsträngige DNA-Sequenzen verwendet.
Oligonucleotide sind spezifische DNA-Sequenzen mit einer Länge
von ca. 15-20 Nucleotiden. Je nach Art der Probe kann die
Länge der Oligonucleotide auf bis zu 60 Nucleotide variieren.
Die Länge der doppelsträngigen DNA-Sequenzen variiert zwischen
100 und 2000 Nucleotiden. Der Aufbau der Referenz-DNA-Sequenz
ist dabei abhängig von dem zu identifizierenden Abschnitt der
eingebrachten DNA-Sequenz, z. B. von einem einzelnen Abschnitt
des Promotors oder des Gens.
Mindestens einem auf der Trägereinheit angeordneten Typ von
komplementärer Referenz-DNA-Sequenz wird bevorzugt eine
weitere Referenz-DNA-Sequenz zugeordnet, die sich beide in
mindestens einem Baustein (= Nucleotid) voneinander
unterscheiden, wobei die weitere Referenz-DNA-Sequenz nicht
komplementär zu der detektierenden DNA-Sequenz ist. Dieses
Verfahren wird Punktmutation genannt. Durch eine solche
Punktmutation ist eine Bindung der eingebrachten DNA-Sequenz
an diese weitere und nicht exakt komplementäre Referenz-DNA-
Sequenz nicht ermöglicht, so daß die zu detektierende DNA-
Sequenz keine oder nur eine sehr schwache Bindung hervorruft.
Somit werden beim Waschen der Trägereinheit nach dem
Hybridisierungsprozeß diese schwach oder nicht gebundenen DNA-
Sequenzen von der Referenz-DNA-Sequenz auf der Trägereinheit
wieder abgelöst. Dies führt demzufolge zu keinem oder nur sehr
schwachem Signal bei der anschließenden Detektion.
Bei Aufbringung doppelsträngiger DNA-Sequenzen der zuvor
genannten Länge ist es nicht erforderlich, eine weitere
Referenz-DNA-Sequenz mit einer Punktmutation auf die
Trägereinheit aufzubringen, da die Genauigkeit der
Hybridisierung der exakt komplementären Proben-DNA-Sequenzen
an die Referenz-DNA-Sequenz durch die Stringenz bei den
Hybridisierungs- und Waschbedingungen der Trägereinheit
beeinflußt wird.
Vorteilhafterweise wird das die jeweilige hybridisierte DNA-
Sequenz kennzeichnende Signal mit einem Referenzwert für den
Grad der Hybridisierung der hybridisierten DNA-Sequenz mit der
zugehörigen Referenz-DNA-Sequenz verglichen. Dazu wird das
Signal anhand herkömmlicher Meßverfahren, z. B. Array-Scanning,
Fluoreszenz-Scanning etc. bestimmt. Als kennzeichnendes Signal
oder Signatur wird beispielsweise ein fluoreszierender,
chemolumineszierender oder radioaktiver Stoff an die zu
detektierende DNA-Sequenz angelagert. Insbesondere durch die
Intensität des Signals wird der Grad der Hybridisierung
ermittelt und somit der Nachweis von neu eingebrachten DNA-
Sequenzen ermöglicht. Als Grad für die Hybridisierung wird die
Anzahl der hybridisierten DNA-Sequenzen (= starkes Signal)
und/oder die Intensität des Signals verwendet.
Die zweitgenannte Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
eine Vorrichtung zur Detektion von DNA-Sequenzen mindestens
eines gentechnisch veränderten Organismus aus einer Probe
eines Stoffes, insbesondere eines Lebensmittels, mit einer
Trägereinheit zur Hybridisierung der DNA-Sequenzen der Probe
mit Referenz-DNA-Sequenzen der Trägereinheit zu hybridisierten
DNA-Sequenzen und mit einer Analyseeinheit zur Analyse der
hybridisierten DNA-Sequenzen.
Zweckmäßigerweise ist eine Aufbringeinheit zum Aufbringen der
Referenz-DNA-Sequenzen auf die Trägereinheit vorgesehen. Als
Aufbringeinheit ist beispielsweise ein sogenannter Spotting-
Roboter vorgesehen. In vorteilhafter Ausgestaltung der
Vorrichtung sind eine Vielzahl von Referenz-DNA-Sequenzen in
Form eines Arrays auf der Trägereinheit angeordnet. Darüber
hinaus ermöglicht die Trägereinheit die Aufbringung einer
Vielzahl von punktmutierten Referenz-DNA-Sequenzen, wodurch
eine Plausibilitätskontrolle im Hinblick auf eingebrachte,
veränderte DNA-Sequenzen ermöglicht ist.
Zweckmäßigerweise ist die Trägereinheit aus Glas, Nylon,
Polypropylen oder Silizium gebildet. Dieses Material zeichnet
sich insbesondere aus durch eine hohe Robustheit, chemische
Beständigkeit, Temperaturfestigkeit, Bindungsfestigkeit,
Haftungsfestigkeit sowie sehr geringe Eigenfluoreszenz (außer
bei Nylon) und niedriger Neigung des beschriebenen Materials
zur unspezifischen Bindung von nicht immobilisierter DNA- oder
RNA-Sequenzen. Des weiteren ermöglichen die genannten
Materialien der Trägereinheit, die Referenz-DNA sowohl
kovalent als auch nichtkovalent auf den Trägermaterialien zu
immobilisieren. Somit sind die Referenz-DNA-Sequenzen
besonders einfach und besonders haftungssicher aufbringbar,
wodurch wiederum ein hoher Hybridisierungsumsatz gewährleistet
ist.
Vorteilhafterweise umfaßt die Analyseeinheit eine Meßeinheit
zur Detektion des kennzeichnenden Signals anhand der von
diesem ausgehenden radioaktiven Strahlung, Fluoreszenz-
Strahlung oder Chemolumineszenz-Strahlung und eine
Auswerteeinheit. Die Meßeinheit ist bevorzugt optisch
ausgeführt. Beispielsweise ist ein konfokales Lasermikroskop
oder ein üblicher Array-Scanner vorgesehen. Als
Auswerteeinheit dient z. B. ein Personalcomputer.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere
darin, daß durch die Hybridisierung einer Vielzahl von DNA-
Sequenzen einer Probe mit Referenz-DNA-Sequenzen auf einer
einzelnen Trägereinheit und der anschließenden Analyse der
Signalintensität der hybridisierten DNA-Moleküle verschiedene
gentechnische Veränderungen für eine einzelne Probe ermittelt
werden. Alternativ können verschiedene Proben auf einer
Trägereinheit auf unterschiedliche und/oder eine einzelne
gentechnische Veränderung geprüft werden. Darüber hinaus kann
durch entsprechende auf der Trägereinheit gebundene DNA-
Sequenzen neben der gentechnischen Veränderung bei tierischen
Lebensmitteln, wie z. B. Fleisch, oder pflanzlichen
Lebensmitteln die Differenzierung der Tierart und/oder der
Pflanzensorte und/oder die Detektion von Mikroorganismen bzw.
die Sortenreinheit bestimmt werden. Die vielfache Prüfung
einzelner oder mehrerer Proben bzw. DNA-Sequenzen auf
verschiedene Veränderungen, Reinheiten oder Sorten mittels
einer einzelnen Trägereinheit gewährleistet eine besonders
schnelle und genaue Analytik sowie einen besonders hohen
Probendurchsatz.
Das Verfahren sowie die Vorrichtung eignen sich insbesondere
zur Anwendung in der Lebensmittelanalytik, bei denen eine
Veränderung des Erbguts (DNA oder RNA) nachweisbar ist.
Darüber hinaus kann das Verfahren auch für Tabakerzeugnisse
sowie Kosmetikerzeugnisse verwendet werden.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden anhand einer
Zeichnung näher erläutert. Darin zeigt die Figur eine
Trägereinheit 1 in Draufsicht mit einer Vielzahl von in einem
Array angeordneten Referenz-DNA-Sequenzen R. Als Trägereinheit
1 ist beispielsweise eine Grundplatte aus modifiziertem Glas,
Nylon, Polypropylen oder Silizium vorgesehen.
In einem ersten Schritt S1 werden die Referenz-DNA-Sequenzen R
in einem üblichen Verfahren mittels einer Aufbringeinheit 2,
z. B. mittels Roboterprinten, auf die Trägereinheit 1
aufgebracht. Die Referenz-DNA-Sequenzen R sind Nucleotide,
insbesondere Oligonucleotide, oder doppelsträngige DNA.
Zur Detektion von DNA-Sequenzen und/oder RNA-Sequenzen D
mindestens eines Organismus mit veränderten Genen, z. B.
gentechnisch veränderte Pflanze oder gentechnisch veränderten
tierischen Lebensmitteln, werden in einem zweiten Schritt S2
aus einer Probe P eines Stoffes, z. B. eines Lebensmittels,
eine Vielzahl von DNA-Sequenzen D verschiedener Länge
extrahiert. Zusätzlich kann bei sehr geringer Anzahl der
gentechnisch veränderten DNA-Sequenzen D eine verkürzte PCR
ausgeführt werden. Dabei wird der zu untersuchende
Genabschnitt künstlich vermehrt, so daß auch eine ganz geringe
Menge an zu untersuchenden DNA-Sequenzen D eine Vielzahl von
zu prüfenden DNA-Sequenzen D erzeugt.
Bevorzugt sind die auf der Trägereinheit 1 angeordneten
Referenz-DNA-Sequenzen R komplementär zu bestimmten
Abschnitten der zu untersuchenden DNA-Sequenzen D der Probe P.
Darüber hinaus werden die Referenz-DNA-Sequenzen R für
verschiedene Abschnitte, z. B. Promotor, Terminator oder
Struktur-Gen, der zu untersuchenden DNA-Sequenzen D
vorgegeben. Dabei unterscheiden sich die verschiedenen DNA-
Sequenzen D und die verschiedenen Referenz-DNA-Sequenzen R
hinsichtlich ihrer Länge sowie ihrer einzelnen Bausteine.
Zum Nachweis der verschiedenen Abschnitte der DNA-Sequenz D
des gentechnisch veränderten Organismus werden verschiedene
Referenz-DNA-Sequenzen R in dem ersten Schritt S1 auf der
Trägereinheit 1 immobilisiert. Dazu wird als Referenz-DNA-
Sequenz R die zur betreffenden DNA-Sequenz D der Probe P
komplementäre Sequenz verwendet. Je nach Art und Vorgabe
werden verschiedene Abschnitte und/oder Übergänge der zu
untersuchenden DNA-Sequenz D analysiert. Dazu sind die
jeweiligen komplementären Abschnitte und/oder Übergänge der
Referenz-DNA-Sequenz R auf der Trägereinheit 1 angeordnet. Die
Anzahl der verschiedenen Abschnitte und/oder Übergänge der
Referenz-DNA-Sequenz R auf der Trägereinheit 1 variiert.
Beispielsweise sind zur Detektion eines einzelnen Abschnitts,
z. B. des Promotors, der DNA-Sequenz D von einigen wenigen (5)
bis hin zu 60 zugehörige komplementäre und somit identische
Referenz-DNA-Sequenzen R auf der Trägereinheit 1 angeordnet.
Durch eine derartige Redundanz von mehreren gleichartigen
Detektionen eines einzelnen Abschnitts in einem einzigen
Meßdurchgang ist ein besonders sicherer und genauer Nachweis
von gentechnischen Veränderungen in der Probe P gegeben. Bei
Verwendung doppelsträngiger DNA-Sequenzen als Referenz-DNA-
Sequenzen R auf der Trägereinheit 1 ist eine einzige für einen
genauen und sicheren Nachweis von gentechnischen Veränderungen
in der Probe P ausreichend. Zur Erhöhung der Genauigkeit
können auch mehrere doppelsträngige DNA-Sequenzen als
Referenz-DNA-Sequenzen R verwendet werden.
Als besonders einfacher Nachweis gilt die Identifizierung des
Promotor-Abschnitts in den DNA-Sequenzen D der Probe P. Dabei
werden Referenz-DNA-Sequenzen R, die spezifische Abschnitte in
der Promotor-DNA-Sequenz des Blumenkohlmosaikvirus erkennen,
auf der Trägereinheit 1 immobilisiert. Alternativ oder
zusätzlich werden jene Referenz-DNA-Sequenzen R auf die
Trägereinheit 1 aufgebracht, die zu Abschnitten des Struktur-
Genes, das in das Erbgut der Probe P neu eingebracht ist,
komplementär sind und somit diese detektieren. Alternativ oder
zusätzlich werden zur Spezifität der Hybridisierung Referenz-
DNA-Sequenzen R mit Mutationen auf der Trägereinheit 1
aufgebracht. Diese mutierten Referenz-DNA-Sequenzen R dienen
der Plausibilitätskontrolle der Meßergebnisse, indem diese im
Vergleich zu nichtmutierten Referenz-DNA-Sequenzen R nach
einer Hybridisierung ein deutlich schwächeres Signal abgeben.
Alternativ oder zusätzlich werden auf der Trägereinheit 1
Referenz-DNA-Sequenzen R zum Nachweis einer Sorte oder Art
immobilisiert. Somit ist parallel in einem einzelnen
Experiment ein Nachweis für gentechnische Veränderungen sowie
ein Nachweis für Sortenreinheit gegeben.
Die DNA-Sequenzen D der Probe P werden in einem dritten
Schritt S3 mit einem kennzeichnenden Signal F, z. B. einem
Fluoreszenzfarbstoff, markiert, indem der Farbstoff mittels
Reaktion angelagert wird. In einem vierten Schritt S4 werden
die mit dem Signal F markierten DNA-Sequenzen D auf die
Trägereinheit 1 aufgebracht und mit den Referenz-DNA-Sequenzen
R hybridisiert. Je nach Anzahl, Art und Größe der auf der
Trägereinheit 1 angeordneten Referenz-DNA-Sequenzen R sowie in
Abhängigkeit von der gentechnischen Veränderung hybridisieren
die markierten DNA-Sequenzen D weniger stark oder stark mit
den Referenz-DNA-Sequenzen R zu hybridisierten DNA-Sequenzen
H.
Zur Detektion der hybridisierten und demzufolge gentechnisch
veränderten DNA-Sequenzen H anhand der Intensität der
Hybridisierung werden diese anschließend in einem fünften
Schritt S5 von den nicht hybridisierten DNA-Sequenzen D
selektiert, indem die Trägereinheit 1 gewaschen wird.
Hierdurch werden jene markierten DNA-Sequenzen D, welche nicht
an Referenz-DNA-Sequenzen R gebunden haben, entfernt. Zur
Analyse der Hybridisierung der auf der Trägereinheit 1 an die
Referenz-DNA-Sequenz R gebundenen und somit hybridisierten
DNA-Sequenzen H der Probe P ist eine Analyseeinheit 4
vorgesehen. Die Analyseeinheit 4 umfaßt eine Meßeinheit 5 und
eine Auswerteeinheit 7. Die Intensität des die jeweilige
hybridisierte DNA-Sequenz H kennzeichnenden Signals F, welches
beispielsweise mittels der Meßeinheit 5 in Form von
radioaktiver Strahlung, fluoreszierender Strahlung oder
chemolumineszierender Strahlung in einem sechsten Schritt S6
detektierbar ist, ist ein Maß für den Grad der Hybridisierung
in jedem Punkt oder Feld des Arrays der Trägereinheit 1.
Beipielsweise ist als Meßeinheit 5 ein Array-
Fluoreszenzscanner oder ein Phosphorimager vorgesehen.
Die für die einzelnen Felder ermittelten Meßergebnisse (=
Intensität des Signals F) werden mittels der Auswerteeinheit 10
in einem siebten Schritt S7 mit Referenzwerten verglichen.
Als Referenzwerte ist beispielsweise die maximale Anzahl an
Feldern, die das kennzeichnende Signal F aufweisen, angegeben.
Beispielsweise sind zum Nachweis des Promotor-Abschnitts
mindestens 40 Felder mit der jeweils zugehörigen Referenz-DNA-
Sequenz R versehen, von denen nach der Hybridisierung
mindestens 20 Felder das Signal F aufweisen. Dies ist dann der
Nachweis für eine gentechnische Veränderung der Probe P.
Weisen weniger als 20 Felder das Signal F auf, so ist das
Meßergebnis negativ, umgekehrt bei mehr als 20 Feldern ist das
Meßergebnis positiv.
Zusätzlich oder alternativ zu der Anzahl der Farbumschläge
dient als Referenzwert auch die Intensität des jeweiligen
Farbumschlags (in der Figur durch entsprechende Schattierung
der Felder dargestellt). Je nach Art des zu detektierenden
Gens oder Abschnitts variieren die Referenzwerte und
kumulieren verschiedenartig miteinander.
Durch das beschriebene Verfahren sowie mittels der in Array-
Technologie ausgeführten Trägereinheit 1 ist der parallele
Nachweis einer Vielzahl von gentechnisch veränderten DNA-
Sequenzen D in einem einzigen Experiment ermöglicht. So können
bis zu 10.000 Referenz-DNA-Sequenzen R auf einer einzigen
Trägereinheit 1 (auch Chip genannt) immobilisiert und
nachfolgend mit den DNA-Sequenzen D aus dem Probenmaterial
oder zusätzlich aus verschiedenen Probenmaterialien
hybridisiert werden.
Darüber hinaus eignet sich die Vorrichtung 1 zur
Differenzierung von Tierarten und/oder Pflanzensorten und/oder
zur Detktion von Mikroorganismen und/oder zur Erfassung von
Sortenreinheit. Dabei werden zur Differenzierung von Tierarten
und/oder Pflanzensorten spezifisch die Tierart bzw. die
Pflanzensorte kennzeichnende Referenz-DNA-Sequenz R auf der
Trägereinheit 1 immobilisiert. Analog dazu werden zur
Erfassung der Sortenreinheit bzw. zur Detektion der
Mikroorganismen entsprechende Referenz-DNA-Sequenzen R
verwendet.
Claims (11)
1. Verfahren zur Detektion vor DNA-Sequenzen und/oder RNA-
Sequenzen (D) mindestens eines gentechnisch veränderten
Organismus aus einer Probe (P) eines Stoffes, insbesondere
eines Lebensmittels, bei dem eine Vielzahl von DNA-Sequenzen
(D) verschiedener Länge aus der Probe (P) extrahiert werden,
wobei die DNA-Sequenzen (D) mit einem kennzeichnenden Signal
(F) markiert, auf eine Trägereinheit (1) aufgebracht und mit
auf der Trägereinheit (1) angeordneten Referenz-DNA-Sequenzen
(R) der Trägereinheit (1) hybridisiert werden, wobei
anschließend hybridisierte DNA-Sequenzen (H) selektiert und
anhand des Signals (F) ein Maß für die hybridisierten DNA-
Sequenzen (H) bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Referenz-DNA-
Sequenzen (R) der Trägereinheit (1) für verschiedene
Abschnitte der DNA-Sequenzen (D) der Probe (P) vorgegeben
werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem als Referenz-DNA-
Sequenzen (R) vorgebbare Nucleotide verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem als Referenz-DNA-
Sequenzen (R) derartige Nucleotide vorgegeben werden, die
komplementär zu den DNA-Sequenzen (D) der Probe (P) sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das
Signal (F) mit einem Referenzwert für den Grad der
Hybridisierung der hybridisierten DNA-Sequenz (H) mit der
zugehörigen Referenz-DNA-Sequenz (R) verglichen wird.
6. Vorrichtung zur Detektion von DNA-Sequenzen (D) eines
gentechnisch veränderten Organismus aus einer Probe (P) eines
Stoffes, insbesondere eines Lebensmittelstoffes, mit einer
Trägereinheit (1) zur Hybridisierung der DNA-Sequenzen (D) der
Probe (P) mit Referenz-DNA-Sequenzen (R) der Trägereinheit (1)
zu hybridisierten DNA-Sequenzen (H) sowie mit einer
Analyseeinheit (4) zur Analyse der hybridisierten DNA-
Sequenzen (H).
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, bei der eine Aufbringeinheit
zum Aufbringen der Referenz-DNA-Sequenzen (R) auf die
Trägereinheit (1) vorgesehen ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, bei der eine Vielzahl
von Referenz-DNA-Sequenzen (R) in Form eines Arrays auf der
Trägereinheit (1) angeordnet sind.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei der die
Trägereinheit (1) aus Glas, Nylon, Polypropylen oder Silizium
gebildet ist.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, beider die
Analyseeinheit (4) eine Meßeinheit (5) und eine
Auswerteeinheit (7) umfaßt.
11. Verwendung der Vorrichtung nach einer der Ansprüche 6-10
zur Differenzierung von Tierarten und/oder Pflanzensorten
und/oder zur Erfassung von Sortenreinheit.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000103763 DE10003763A1 (de) | 2000-01-28 | 2000-01-28 | Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von DNA-Sequenzen in gentechnisch veränderten Organismen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000103763 DE10003763A1 (de) | 2000-01-28 | 2000-01-28 | Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von DNA-Sequenzen in gentechnisch veränderten Organismen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10003763A1 true DE10003763A1 (de) | 2001-08-09 |
Family
ID=7629075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2000103763 Withdrawn DE10003763A1 (de) | 2000-01-28 | 2000-01-28 | Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von DNA-Sequenzen in gentechnisch veränderten Organismen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10003763A1 (de) |
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|---|---|---|---|
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| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: SEIDEL, BJOERN, DR., 57392 SCHMALLENBERG, DE PAUL, |
|
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