DE19713556A1

DE19713556A1 - Verfahren zur Identifizierung von eukaryontischen und viralen Spezies durch Bestimmung relativer und absoluter Oligonukleotidhäufigkeiten

Info

Publication number: DE19713556A1
Application number: DE19713556A
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr Fislage
Original assignee: Rainer Dr Fislage
Current assignee: FISLAGE, RAINER, DR., 66606 SANKT WENDEL, DE
Priority date: 1997-04-02
Filing date: 1997-04-02
Publication date: 1998-10-08

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von eukaryontischen, prokaryontischen und viralen Spezies durch Bestimmung relativer und absoluter Oligonukleotidhäufigkeiten gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1. Die Erfindung findet Anwendung im Bereich der medizinischen Diagnostik, Lebensmittelüberwachung und Umweltanalytik.

Bisher erfolgt die Identifizierung von Spezies überwiegend auf der Basis biochemischer oder immunologischer Merkmale. So wird im Bereich der medizinisch mikrobiologischen Diagnostik beispielsweise das "Api"-System der Firma BioMerieux zur Identifizierung bakterieller Spezies eingesetzt. Dabei werden biochemische Reaktionen benutzt, um das Vorhandensein oder Fehlen verschiedenster Stoffwechselleistungen zu beurteilen. Die Zuordnung einer Probe zu einem bekannten Organismus erfolgt durch die Auswertung eines binären Schlüssels, der sich nach der Auswertung aller Testreaktionen mit einem Ja/Nein Schema ergibt. Eine zwingende Voraussetzung für die Anwendung dieser Bestimmungsmethode ist das Vorliegen einer Reinkultur. Durch kombinierte Tests dieser Art kann eine unbekannte Probe gleichzeitig gegen sehr viele bekannte Organismen getestet werden.

Eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung einzelner Erreger oder kleiner Gruppen von Organismen bietet die Prüfung auf bestimmte Oberflächenmarker mit Hilfe der Antigen-Antikörpererkennung.

Zunehmend wird auch die Polymerasekettenreaktion zur Erreger-Identifizierung eingesetzt. Sie zeichnet sich durch hohe Sensitivität und Spezifität aus, erfordert jedoch gerade aufgrund ihrer Sensitivität einen hohen Kontrollaufwand um falsch positive Reaktionen zu vermeiden.

In den letzten Jahren wurden bereits Hybridisierungsverfahren gegen Oligonukleotidarrays entwickelt [1, 2], die das Ziel haben, die DNA-Sequenz einer unbekannten Probe zu bestimmen [3], oder Mutationen darin nachzuweisen [4]. Im ersten Fall sind nur DNA-Sequenzen mit beschränkter Länge analysierbar, da die verwendeten Oligonukleotide im statistischen Mittel nur mit einfacher Kopie in der Zielsequenz vorkommen sollen. Im zweiten Fall werden in der Regel längere Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Sequenzvarianten verwendet. Beide Ansätze unterscheiden sich grundlegend von dem hier beschriebenen Verfahren, das die Oligonukleotidzusammensetzung komplexer DNA-Proben mit kurzen Oligonukleotiden bestimmt.

In den folgenden Literaturstellen sind die zitierten Grundlagen der Erfindung beschrieben:

1. Cantor C. R., Mirzabekov A., Southern E. Report on the sequencing by hvbridization workshop. Genomics (1992), 13(4), 1378-1383
2. Southern, E.M. DNA fingerprinting by hybridisation to oligonucleotide arrays. Electrophoresis (1995), 16(9), 1539-1542
3. Southern E.M., Maskos u., Eder J.K. Analyzing and comparing nucleic acid sequences by hybridization to arrays of oligonucleotides: evaluation using experimental models. Genomics 1992, 13(4), 1008-1017
4. Southern E. M, Case-Green S. C., Elder J.K., Johnson M., Mir K. U., Wang L., Williams J. c. Arrays of complementary oligonucleotides for analysing the hybridisation behaviour of nucleic acids. Nucleic Acids Res. 1994 Apr 25;22(8): 1368-73
5. Maskos U., Southern E. M. A study of oligonucleotide reassociation using large arrays of oligonucleotides synthesised on a glass support. Nucleic Acids Res. (1993) 21(20), 4663-4669
6. Paterson D. Electric genes. Current flow in DNA could lead to faster genetic testing. Science (1995), 272(5), 33-34
7. Murphy C. J., Arkin M. R., Jenkins Y., Ghatlia N. D., Bossmann S. H., Turro N. J., Barton J. K. Long-range photoinduced electron transfer through a DNA helix. Science (1993) 262(5136), 1025-1029
8. Meade T. J., Kayyem J. F. Electron transfer through DNA: Site-specific modification of duplex DNA with Ruthenium donors and acceptors. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1995), 34(3), 352-354
9. Yang H., Leland J. K., Yost D., Massey R. J. Electrochemiluminescence: a new diagnostic and research tool. ECL detection technology promises scientists new "yardsticks" for quantification. Biolechnology (N. Y.) (1994), 12(2), 193-194
10. Schutzbank T. E., Smith J. Detection of human immunodeficiencv virus type 1 proviral DNA by PCR using an electrochemiluminescence-tagged prooe. J. clin. Microbiol. (1995), 33(8), 2036-2041
11. Nielsen P. E., Egholm M., Berg R. H., Buchardt O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine substituted polyamide. Science (1991), 254(5037), 1497-1500
12. Wood W. I., Gitschier J., Lasky L., A., Lawn R. M. Base composition-independent hybridization in tetramethylammonium chloride: a method for oligonucleotide screening of highlv complex gene libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985), 82(6), 1585-1588
13. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press

Die Erfindung erlaubt die Zuordnung von beliebigen Isolaten zu bereits bekannten Organismen durch die Bestimmung der relativen oder absoluten Häufigkeitsverteilung von kurzen Oligonukleotiden innerhalb der genomischen DNA oder RNA dieser Organismen.

Bisher werden für eine Speziesbestimmung mit Hilfe molekularbiologischer Methoden spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen eingesetzt. Vergleicht man diese Sequenzen mit Längen von vierzig bis zu einigen hundert Basenpaaren, so findet man, je nach Typ und chromosomaler Lokalisation der Sequenz signifikante Unterschiede, die für eine Speziesidentifizierung benutzt werden können. Ein wesentliches Problem stellt hier jedoch die Tatsache dar, daß für jede Spezies mindestens eine Sequenz identifiziert werden muß, die sich von homologen Sequenzen aller anderen Spezies unterscheidet oder bei ihnen nicht vorhanden sein darf. Die entsprechenden Sequenzen müssen zunächst isoliert und sequenziert werden und stehen erst dann für eine technische Anwendung zur Verfügung. Hier will die Erfindung Abhilfe schaffen.

Der in den Patentansprüchen angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, eine Möglichkeit zur Speziesidentifizierung zu schaffen, die mit möglichst geringem Materialaufwand und ohne Kenntnis von spezifischen Sequenz informationen arbeitet.

Erfindungswesentlich ist die Auswertung der absoluten oder relativen Häufigkeitsverteilung von kurzen Oligonukleotiden, die auf Grund ihrer geringen Länge in allen untersuchbaren Genomen vorhanden sind, jedoch in unterschiedlicher Häufigkeit auftauchen. Die Häufigkeitsverteilung wird mit Hilfe von Hybridisierungsverfahren untersucht, bei denen fragmentierte, denaturierte genomische DNA oder RNA der Probe gegen immobilisierte Oligonukleotide hybridisiert wird oder umgekehrt die Oligonukleotide gegen immobilisierte DNA bzw. RNA der Probe hybridisiert werden. Der Nachweis der Menge an gebundenen DNA bzw. RNA Fragmenten oder an gebundenen Oligonukleotiden kann durch eine radioaktive Markierung [5] des nicht-immobilisierten Reaktionspartners erfolgen. Darüberhinaus kann die Reassoziation der jeweils einzelsträngigen Reaktionspartner zum Doppelstrang durch eine Veränderung der Elektronenleitfähigkeit durch die Doppelbeiikale Struktur der DNA bzw. RNA nachgewiesen werden [6-8]. Auch Verfahren, auf der Basis der Elektrochemolumineszens [9, 10] kommen für eine Detektion in Frage. Generell sind alle physikalischen oder chemischen Verfahren verwendbar, die geeignet sind die Bindung einzelsträngiger DNA oder RNA der Probe an einzelsträngige Oligonukleotide oder ihre Derivate zu quantifizieren.

Hinsichtlich der verwendeten Oligonukleotide muß zur vollständigen Beschreibung eines doppelsträngig vorliegenden Genoms einer beliebigen Spezies nur die Hälfte aller theoretisch notwendigen Permutationen verwendet werden. Für ein 8-mer Oligonukleotid aus den vier Desoxyribonukleotiden (Deso)cyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin, Desoxycytosin) müssen statt der 4⁸ möglichen Permutationen nur 0.5 × 4⁸ Oligonukleotide eingesetzt werden, da Oligonukleotide, die komplementär zu einem gegebenen 8-mer sind, auf dem Gegenstrang in Form des gegebenen Oligomers vorliegen. Dadurch weisen Oligomer und komplementäres Oligomer jeweils die gleiche Häufigkeit in einem gegebenen doppelsträngigen Genom auf, so daß die Doppelmessung entfallen kann, aber nicht entfallen muß. Die Halbierung der Anzahl der theoretisch benötigten Oligomere führt jedoch zu einer Halbierung der aufzuwendenden Kosten beim Einsatz des Verfahrens.

Hinsichtlich der Länge der verwendeten Oligonukleotide können n-mere mit Längen von 8, 9 oder 10 zur Anwendung kommen. Längere Sequenzen sind nicht verwendbar, da sie in prokaryontischen Genomen in der Mehrzahl nur noch mit einfacher Kopienzahl vorkommen und die Zahl der zu synthetisierenden Oligonukleotide mit 4ⁿ wächst. Kürzere Oligonukleotidderivate können verwendet werden, wenn der Doppelstrang mit dem komplementären Oligonukleotid der Probe einen Schmelzpunkt von mehr als 10°C aufweist. Als ein mögliches Beispiel seien Oligonukleotidanaloga auf der Basis von PNA [11] genannt.

Die Längenangaben der Oligonukleotide und ihrer Derivate beziehen sich auf eine wirksame Länge, das heißt auf jenen Bereich des Moleküls, der bei der Reassoziation zum Doppelstrang an der spezifischen Bindung beteiligt ist.

Der Begriff des Oligonukleotids wird in dieser Patentschrift stellvertretend für alle in Anspruch 1.-5. genannten Desoxyribonukleotide, Ribonukleotide sowie ihre chemischen Derivate und Analoga verwendet, wohingegen er sich im allgemeinen Sprachgebrauch zumeist nur auf Oligodesoxyribonukleotide bezieht.

Erfindungsgemäß erfolgt die Identifizierung einer Spezies durch Vergleich der relativen oder absoluten Intensitätsverteilungen zwischen einer Referenzprobe und der unbekannten Probe. Im Falle der Auswertung relativer Intensitäten wird eine Dreiecksmatrix erstellt, die die Quotienten der gemessenen Intensitäten für jedes Oligonukleotid im Vergleich zu allen anderen Oligonukleotiden enthält. Die Werte dieser Matrix sind unabhängig von der absoluten Menge der eingesetzten Proben-DNA oder -RNA, wenn fragmentierte genomische DNA gegen eine Anordnung von Oligonukleotiden hybridisiert wird, so daß in diesem Fall keine absolute Kalibrierung des Systems nötig ist. Die Werte der Matrix sind konstant und spezifisch für eine Spezies, so daß eine unbekannte Probe mit den gespeicherten Werten einer einmalig zu erfassenden Bibliothek von Referenzproben verglichen werden kann.

Das beschriebene Verfahren hat gegenüber den bisher verwendeten molekularbiologischen Verfahren den Vorteil, daß keine Sequenzinformation für die Identifizierung einer Spezies benötigt wird und daß derselbe Satz von Oligonukleotiden zur Identifizierung beliebiger bekannter Spezies verwendet werden kann. Wird die Erhöhung der Elektronenleitfähigkeit bei der Bildung von DNA-Doppelsträngen für den Detektionsvorgang benutzt, kann darüberhinaus eine Echtzeiterfassung des Hybridisierungsvorgangs erfolgen, der wesentlich verringerte Analysezeiten im Bereich von wenigen Stunden bis zu einigen Minuten erlaubt.

Die Erfindung wird anhand von mehreren Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

1. Aus Reinkulturen von H. influenzae, E. coli, und B. subtilis wird DNA isoliert, denaturiert und auf einer Nylonmembran so immobilisiert, daß jeweils die gleiche Anzahl von Genomäquivalenten eingesetzt wird. Die maximale Beladung der Membran beträgt 10 µg. Die Beladung der Membran kann, unter Berücksichtigung ihrer maximalen Bindungskapazität für DNA, höher oder niedriger sein.
2. Ein DNA-Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-TCGCCGGG-3' wird in einer Menge von 1 pmol mit 80 µCi γ-³²P-ATP unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase radioaktiv markiert und nach Abtrennung der nichteingebauten Nukleotide in einem 3.5 M Tetramethylammonium chloridsystem (TMACl) [3, 12] gegen eine Nylonmembran mit immobilisierter DNA der genannten Spezies bei 25°C für zwei Stunden hybridisiert und unter Überwachung durch ein geeignetes Zählrohr zunächst mit Hybridisierungslösung' dann mit Waschlösung (2 × SSC [13], 0.1% SDS) gewaschen.
3. Nach einer Exposition gegen einen Röntgenfilm oder eine geeignete Detektionsvorrichtung, wie z. B. einen Phosphoimager werden die Signalintensitäten ausgewertet.
4. Die relativen Signalintensitäten im Experiment betrugen: 1 (E. coli) : 0.3 (B. subtills) : 0 (H. influenzae). Die angegebenen relativen Werte können von der Sequenz des verwendeten Oligonukleotids und von den Hybridisierungsbedingungen abhängen, sind innerhalb eines gegebenen Systems jedoch reproduzierbar. Bei der Auswertung von Signalintensitäten für eine hinreichende Zahl verschiedener Oligonukleotide erhält man ein singuläres Intensitätsmuster für jede bekannte Genospezies. Das hier beschriebene Vorgehen stellt eine von vielen Möglichkeiten zur Messung der Oligonukleotidfrequenz dar. Die Patentansprüche beschränken sich jedoch nicht auf die hier dargestellte Methode.

Beispiel 2

1. Gegeben seien die Signalintensitäten in relativen Einheiten für verschiedene Spezies und Oligonukleotide (Tabelle 1), wie sie nach Beispiel 1 erhalten werden. Die Werte können sich in Abhängigkeit von den gewählten experimentellen Bedingungen hinsichtlich ihrer relativen und absoluten Verhältnisse ändern, sind unter definierten Bedingungen jedoch reproduzierbar.

Häufigkeitsverteilung für 8-mere bei drei Bakterienspezies

Für eine Speziesbestimmung werden nicht nur die hier angegebenen Oligonukleotide benutzt, sondern gemäß Patentanspruch 1.-5. eine erheblich größere Zahl von Oligonukleotiden.

2. Neben der Auswertung innerhalb der Matrixzeilen können auch die Matrixspalten als Dreiecksmatrix miteinander verglichen werden. Die Auswertung dieser Signalintensitäten sei am Beispiel von H. influenzae und E. coli gezeigt. Die Auswertungen für andere Spezies erfolgen in analoger Weise. Die Werte der resultierenden Matrizen sind spezifisch für eine Spezies, so daß eine unbekannte Spezies durch Vergleich gegen eine Datenbank mit Dreiecksmatrizen aller bekannten Spezies identifiziert werden kann. Bei den Werten handelt es sich um relative Intensitäten. Sie sind unabhängig von der Probenkonzentration, wenn die Probe gegen eine Anordnung der Oligonukleotide hybridisiert und die Bindung quantifiziert wird und wenn für die Bindung an alle Oligonukleotide die Nachweisgrenze der Detektion überschritten ist. Die Zahl der verwendeten Oligonukleotide für die Untersuchung von Erregern mit doppelsträngigem Erbmaterial beträgt im ungünstigsten Fall 0.5 × 4ⁿ, wobei n für die Anzahl der Monomere im Oligomer steht.

Relative Intensitätsverteilung nach einer Hybridisierung von 8-meren gegen E.coll DNA

Relative Intensitätsverteilung nach einer Hybridisierung von 8-meren gegen H. influenzae DNA

Brüche mit einem Wert von Null im Nenner sind mathematisch nicht definiert und werden in einer Datenbank durch ein geeignetes Hinweiszeichen wie z. B."∞" ersetzt. Die angegebenen Zahlenwerte ändern sich in Abhängigkeit von der gewählten Hybridisierungs- und Detektionsmethode, sind innerhalb eines gegebenen Systems jedoch konstant und liefern für jede Spezies eine Dreiecksmatrix, die diese Spezies von allen anderen unterscheidet. Die mathematische Behandlung der Meßwerte beschränkt sich nicht auf die Division. Alle Operationen, die zu speziesspezifisch unterscheidbaren Matrizen führen, können verwendet werden. Auch kann die absolute Auswertung mit der relativen Auswertung verknüpft werden.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung von eukaryontischen, prokaryontischen und viralen Spezies durch Bestimmung relativer und absoluter Oligonukleotidhäufigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß fragmentierte genomische DNA oder RNA einer Probe denaturiert und gegen eine Anordnung von immobilisierten einzelsträngigen 8-, 9-, oder 10-mer Oligodesoxyribonukleotiden, bestehend aus allen nicht zueinander komplementären Permutationen der konstituierenden Basen, hybridisiert wird und die relative oder absolute Mengenverteilung der spezifisch gebundenen genomischen Fragmente gemessen und ausgewertet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, daß Derivate von Oligodesoxyribonukleotiden mit Längen von 5, 6, oder 7 Monomereinheiten verwendet werden, deren Schmelzpunkte, bezogen auf die Doppelstrangform, oberhalb von 10°C liegen.

3. Verfahren nach Anspruch 1. und Anspruch 2., dadurch gekennzeichnet, daß Analoga oder Derivate der natürlich vorkommenden Oligodesoxyribonukleotide oder Oligoribonukleotide eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1. bis 3., dadurch gekennzeichnet, daß alle Permutationen der n-mer Oligonukleotide verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1. bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Teilmengen der in Anspruch 1. und 4. beschriebenen Oligonukleotidpermutationen verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1. bis 5., dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA oder RNA denaturiert und immobilisiert wird und einzelsträngige Oligonukleotide eingesetzt werden, die an ihre komplementären Sequenzen binden.