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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der biologischen und
chemischen Synthese und Ablaufsteuerung. Die vorliegende Erfindung
bezieht sich auf Verfahren zum Auswählen von Oligonukleotiden im Hinblick
auf eine geringe Mischhybridisierung. Die vorliegende Erfindung
kann auf dem Gebiet der chemischen oder biologischen Synthese, Diagnosestellung
und Therapeutik zum Einsatz kommen, ist aber nicht darauf beschränkt.
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Die
vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität aus der vorläufigen US-Patentanmeldung
mit der Anmeldenummer 60/116,956, eingereicht am 25. Januar 1999.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Auf
dem Gebiet der biologischen und chemischen Ablaufsteuerung und Synthese
ergeben sich laufend Fortschritte. Es werden viele neuartige und
verbesserte Festphasenarrays oder „Genbausteine" entwickelt, die
schnell arbeitende Verfahren zum Synthetisieren von chemischen und
biologischen Stoffen bereitstellen. Beispiele für solche Technologien umfassen
die von Pirrung et al. im US-Patent Nr. 5,143,854 beschriebenen,
die von Southern in WO 93/22480 beschriebenen, die von Heller in
WO 95/12808 beschriebenen und die von Montgomery in PCT/US97/11463
beschriebenen. Man kann also immer größere Mengen genetischen Materials
synthetisieren, verarbeiten und untersuchen. Außerdem ist es möglich, gleichzeitig
mit immer größeren Mengen
genetischen Materials zu arbeiten, und diese zu analysieren und
zu untersuchen.
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Je
nachdem, ob ihre Sequenzen mehr oder weniger komplementär sind oder
nicht, können
Oligonukleotide mit anderen Oligonukleotiden hybridisieren bzw.
sich mit diesen verbinden. Manchmal ist es wünschenswert, eine Gruppe von
Oligonukleotiden zu ermitteln, die innerhalb eines gegebenen Rahmens
von Zwangsbedingungen weitestgehend nicht miteinander hybridisieren
bzw. sich miteinander verbinden. Bei der Auswahl einer solchen Gruppe
von Oligonukleotiden können
Optimierungsverfahren hilfreich eingesetzt werden.
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Es
bestehen viele Möglichkeiten,
wie man aus einem längeren
Oligonukleotid ein Oligonukleotid oder Oligonukleotide bilden kann.
Man kann z.B. das lange Oligonukleotid zerschneiden oder ein Segment
oder Segmente daraus auswählen,
um ein kleineres Oligonukleotid zu bilden. Diese kleineren Oligonukleotide,
die durch diese und andere, dem Fachmann bekannte Verfahren gebildet
werden, können
als „Teilkettensequenzen" bezeichnet werden.
Es besteht eine große
Flexibilität
dahingehend, welche Teilkette des Oligonukleotids als Targetsequenz
zur Anbindung ausgewählt
wird.
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Im
US-Patent Nr. 5,556,749 von Mitsuhashi et al. ist ein computerisiertes
Verfahren zur Entwicklung von optimalen DNA-Proben beschrieben.
Mit dem Verfahren sollen Proben erzeugt werden, die zur Diagnose und
medizinischen Überwachung
bestimmt sind. Das dort beschriebene Verfahren zieht jedoch nicht
die Auswahl mehr als einer Probe zum gleichzeitigen Einsatz mit
einer anderen Probe in Betracht, wonach eine Interaktion und Mischhybridisierung
minimiert ist.
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Die
EP 0 799 897 A1 bezieht
sich auf ein Verfahren zum Auswählen
von Nukleinsäuremarkierungsstellen
und entsprechenden Proben für
Mikroarrays. Die Markierungsstellen werden dazu verwendet, Verbindungen
einschließlich
Zellen und Viren zu kennzeichnen und zu erfassen. Die Bestandteile
werden mit solchen ausgewählten
Nukleinsäuremarkierungsstellen
gekennzeichnet und das Vorhandensein einzelner Markierungsstellen
wird durch Hybridisierung mit einem Probenarray überwacht. So dienen die Markierungsstellen-Nukleinsäuren als
Kennzeichnungen für
die einzelnen Bestandteile. Die Markierungsstellen-Nukleinsäuren werden
synthetisiert. Daher können
die Markierungsstellen-Nukleinsäuren
frei aus allen möglichen
Basenkombinationen ausgewählt
werden. Markierungsstellen werden ausgewählt, indem diejenigen von ihnen
eliminiert werden, die sich mit ähnlicher
Hybridisierungsenergie mit demselben Target verbinden. Markierungsstellen hängen sich
an komplementäre
Nukleinsäuren
mit einer ähnlichen
Hybridisierungsenergie an, wenn sich eine zu einer Markierungsstelle
komplementäre
Nukleinsäure
mit einer anderen Markierungsstelle mit einer Energie verbindet,
die über
einen bestimmten Schwellenwert hinausgeht. Dabei sollte eine Mischhybridisierung
verhindert werden. Diese Markierungsstellen werden zur Kennzeichnung
von Zellen und Viren verwendet. Sie werden sogar zur Kennzeichnung
von DNA-Sequenzen, z.B. „Deletionsmutanten", verwendet. Durch
dieses bekannte Verfahren wird ein Satz von Markierungsstellen und
ein Probensatz bereitgestellt, die zueinander komplementär und so
konzipiert sind, dass eine Mischhybridisierung vermieden sein sollte.
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In
der
US 5,403,707 ist
der Einsatz eines Oligonukleotids als „Probe" offenbart, die zu einer Nukleinsäuresequenz
einer Target-Nukleinsäure
im Wesentlichen komplementär
ist und zur Erfassung oder zum Einfangen einer amplifizierten Target-Nukleinsäure verwendet
wird. Wenn viele Proben parallel zum Einfangen einer Vielzahl von
amplifizierten Target-Nukleinsäuren
verwendet werden, haben alle Einfangproben T
m's, die sich um nicht
mehr als ca. 15°C
voneinander unterscheiden. Vorzugsweise unterscheiden sich die T
m's
der gleichzeitig verwendeten Einfangproben um nicht mehr als ca.
5°C.
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Die
US 5,716,784 lehrt ein Verfahren
zur Replikation und homogenen Assay-Erfassung einer Target-Nukleinsäuresequenz
in einem Prüfgut,
wobei eine analytische Probe eines Oligonukleotids und eine Erfassungsprobe
eines Oligonukleotids verwendet werden, die sich in der Nukleotidlänge unterscheiden,
so dass die T
m's mindestens um 10°C auseinanderliegen. Bei diesem
Verfahren wird ein aus zwei Komponenten bestehendes Fluoreszenz-Reportergen
eingesetzt, wobei ein Bestandteil auf jeder Probenart zu einer Veränderung
der Fluoreszenz führt,
wenn die analytische Probe mit der Target-Nukleinsäure hybridisiert.
Durch den Längenunterschied
der beiden Proben ist sichergestellt, dass sich bei Vorhandensein
eines Targets die beiden Proben trennen, wobei die längere analytische
Probe mit dem Target hybridisiert.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Auswählen von
komplementären Teilketten
aus Target-Oligonukleotiden so bereitzustellen, dass die Teilketten
sich relativ gut mit ihren Target-Oligonukleotiden verbinden, sich aber
mit anderen Oligonukleotiden in einem Prüfgut im Wesentlichen nicht
verbinden. Beispielsweise ist es bei einem gegebenen langen Oligonukleotid
(z.B. eine Kette einer RNA, mRNA, DNA oder cDNA) möglich, für ein späteres Experiment
ein Teilstück
oder Teilstücke
daraus z.B. als Einfangprobe auszuwählen. Im Falle einer immobilisierten
Einfangprobe ist es wünschenswert,
dass die Oligonukleotid-Teilkettensequenz eine Bindung mit dem langen
Oligonukleotid eingeht, von dem sie abstammt, aber nicht mit anderen
Oligonukleotiden, die in einem Prüfgut vorhanden sein könnten. Oftmals
ist es wünschenswert,
einen Array von derartigen immobilisierten Einfangproben herzustellen,
so dass jede einzelne mit ihrem spezifischen Target eine Bindung
eingeht bzw. hybridisiert, sich aber nicht an irgendwelche der anderen in
der Lösung
vorhandenen Targets anhängt
bzw. mit diesen hybridisiert. Ein Array von immobilisierten, gemäß den beschriebenen
Verfahren aufgebauten Einfangproben gestattet den Einsatz eines
kleineren Arrays von Einfangproben zum Herausziehen eines gewünschten
Satzes von Targets, weil bei diesem Array zum Herausarbeiten von
Datenpunkten nicht derselbe Grad an Redundanz wie bei anderen Arrays
benötigt
wird, wo die Bindung nicht so klar erfassbar ist.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In
einem ersten Aspekt zeigt die vorliegende Erfindung Verfahren zur
Bereitstellung eines Satzes von Proben auf, die mit ihren spezifischen
Targets relativ gut hybridisieren bzw. relativ gut eine Bindung
eingehen, sich aber mit unspezifischen Targets im Wesentlichen nicht
verbinden. Die Eigenschaft, relativ gut mit spezifischen Targets
zu hybridisieren bzw. mit diesen eine Bindung einzugehen, nicht
aber mit unspezifischen Targets, wird gemäß den Verfahren der vorliegenden
Erfindung mittels einer Delta Tm (Unterschied der Schmelztemperaturen)
quantifiziert. Eine Probe mit einer relativ kleinen Delta Tm hybridisiert
mit zumindest einem unspezifischen Target ganz gut. Für eine Probe
mit einer relativ großen
Delta Tm gibt es im Wesentlichen keine unspezifischen Targets, mit
denen sie in größerem Maße hybridisiert.
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Das
in den Ansprüchen
definierte Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt folgende Merkmale.
- 1. Bestimmen
eines Satzes von Targets. In einigen Fällen, wo nicht klar ist, wie
die Kennung aller in einer bestimmten Lösung vorhandenen Targets lauten
könnte,
ist es möglich,
eine Liste von einigen der Targets zu bestimmen, die in der bestimmten
Lösung
vorhanden sein könnten,
und diese Liste in die Gruppe von Targets aufzunehmen. Wenn sich
in der Liste einige Targets befinden, die in der Lösung gar
nicht vorhanden sind, setzt dies die Qualität der gemäß den vorliegenden Verfahren
ausgewählten
Proben nicht herab.
- 2. Auswählen
eines bestimmten Targets aus dem Satz von Targets. Dieses wird zu
dem aktuellen Target.
- 3. Auswählen
einer Sequenzteilkette aus dem aktuellen Target und Bereitstellen
ihrer Komplementärsequenz.
Dies ist eine Kandidatenprobe bzw. Probe engerer Wahl. Das Auswählen einer
Sequenzteilkette kann so erfolgen, dass man an einem bestimmten
Punkt im aktuellen Target beginnt und dann jedes Mal, wenn eine
neue Teilkette ausgewählt
wird, der Startpunkt um einen bestimmten Betrag weiter verschoben wird,
und der Startpunkt dann wieder auf den vorderen Abschnitt des aktuellen
Targets zurückgeführt wird, wenn
eine weitere Verschiebung über
das Ende des Targets hinausgehen würde. Um zu bestimmen, welche
Teilkette auszuwählen
ist, kann diese entweder per Zufall ausgewählt werden, oder es kann irgendeine beliebige
Funktion zur Anwendung kommen. Befinden sich im aktuellen Target
eine oder mehrere Teilketten, die noch nicht ausprobiert wurden,
ist Folgendes empfehlenswert: (i) die beste bisher ausgewählte Probe
engerer Wahl zu verwenden, wobei zu beachten wäre, dass dieses Target nicht
so selektiv eingefangen worden sein könnte wie erwünscht, (ii)
für dieses
Target keine weiteren Proben mehr herauszugreifen, und (iii) zu
Schritt 2 zurückzukehren,
supra. Andernfalls empfiehlt sich der Einsatz der wie bestimmten
Probe engerer Wahl und das Fortfahren mit Schritt 4, infra.
- 4. Bestimmen, ob die Probe engerer Wahl alle Kriterien erfüllt, die
für den
Probensatz erforderlich oder gewünscht
sind. Wenn sie diese Kriterien nicht erfüllt, dann Rückkehr zu Schritt 3 und Auswahl
einer neuen Probe engerer Wahl. Wenn sie diese Kriterien erfüllt, dann
Fortfahren mit Schritt 5.
- 5. Berechnen der Tm für
die Probe engerer Wahl mittels des Hybridisierungsmodells. Berechnen
von im Wesentlichen allen möglichen
Misch-Tm's der Probe engerer
Wahl, die mit allen unspezifischen Targets hybridisiert und Ermitteln
der höchsten
Misch-Tm. Berechnen von Delta Tm. Es ist zu beachten, dass der Satz aller
unspezifischen Targets zuvor herausgegriffene Proben umfasst, wenn
sich im Gegensatz zu einer Fixierung an einem Träger auch diese in Lösung befinden
sollen.
- 6. Fortfahren mit Schritt 7, wenn Delta Tm annehmbar groß ist. Rückkehr zu
Schritt 3 und Auswahl einer neuen Probe engerer Wahl, wenn Delta
Tm nicht annehmbar groß ist.
- 7. An diesem Punkt ist eine geeignete Probe ausgewählt. Die
vorgenannte Prozedur kann noch weitere Male wiederholt werden, um
für hinzukommende
Targets weitere Proben auszuwählen,
oder um ggf. zusätzliche
Proben für
ein Target auszuwählen,
für das
sich bereits eine oder mehrere Proben gefunden hat.
-
In
einem zweiten Aspekt zeigt die vorliegende Erfindung ein programmiertes
Computersystem auf, um die Sequenzen eines Satzes von Proben bereitzustellen,
die mit ihren spezifischen Targets relativ gut hybridisieren bzw.
sich mit diesen relativ gut verbinden, aber sich mit unspezifischen
Targets im Wesentlichen nicht verbinden.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung zeigt Verfahren zur Bereitstellung eines Satzes
von Proben auf, die mit ihren spezifischen Targets relativ gut hybridisieren
bzw. sich relativ gut mit diesen verbinden, aber mit unspezifischen Targets
im Wesentlichen keine Bindung eingehen. Die Eigenschaft, mit spezifischen
Targets relativ gut zu hybridisieren bzw. sich relativ gut mit diesen
zu verbinden, nicht aber mit unspezifischen Targets, wird gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung mittels einer Delta Tm quantifiziert.
Eine Probe mit einer kleinen Delta Tm hybridisiert mit zumindest
einem unspezifischen Target im Allgemeinen relativ gut. Bei einer
Probe mit einer großen
Delta Tm finden sich im Wesentlichen keine unspezifischen Targets,
mit denen sie relativ gut hybridisiert.
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt folgende Merkmale:
- 1. Bestimmen
eines Satzes von Targets. In einigen Fällen, wo nicht klar ist, wie
die Kennung aller in einer bestimmten Lösung vorhandenen Targets lauten
könnte,
ist es möglich,
eine Liste von einigen der Targets zu bestimmen, die in der bestimmten
Lösung
vorhanden sein könnten,
und diese Liste in die Gruppe von Targets aufzunehmen. Wenn sich
in der Liste einige Targets befinden, die in der Lösung gar
nicht vorhanden sind, setzt dies die Qualität der gemäß den vorliegenden Verfahren
ausgewählten
Proben nicht herab.
- 2. Auswählen
eines bestimmten Targets aus dem Satz von Targets. Dieses wird zu
dem aktuellen Target, für
welches man eine Probe haben möchte.
- 3. Auswählen
einer Sequenzteilkette aus dem aktuellen Target und Bereitstellen
ihrer Komplementärsequenz.
Dies ist eine Kandidatenprobe bzw. Probe engerer Wahl. Das Auswählen einer
Sequenzteilkette kann so erfolgen, dass man an einem bestimmten
Punkt im aktuellen Target beginnt und dann jedes Mal, wenn eine
neue Teilkette ausgewählt
wird, der Startpunkt um einen bestimmten Betrag weiter verschoben wird,
und der Startpunkt dann wieder auf den vorderen Abschnitt des aktuellen
Targets zurückgeführt wird, wenn
eine weitere Verschiebung über
das Ende des Targets hinausgehen würde. Um zu bestimmen, welche
Teilkette auszuwählen
ist, kann diese entweder per Zufall ausgewählt werden, oder es kann irgendeine beliebige
Funktion zur Anwendung kommen. Befinden sich im aktuellen Target
eine oder mehrere Teilketten, die noch nicht ausprobiert wurden,
ist Folgendes empfehlenswert: (i) die beste bisher ausgewählte Probe
engerer Wahl zu verwenden, wobei zu beachten wäre, dass dieses Target nicht
so selektiv eingefangen worden sein könnte wie erwünscht, (ii)
für dieses
Target keine weiteren Proben mehr herauszugreifen, und (iii) zu
Schritt 2 zurückzukehren,
supra. Andernfalls empfiehlt sich der Einsatz der wie bestimmten
Probe engerer Wahl und das Fortfahren mit Schritt 4, infra.
- 4. Bestimmen, ob die Probe engerer Wahl alle Kriterien erfüllt, die
für den
Probensatz erforderlich oder gewünscht
sind. Wenn sie diese Kriterien nicht erfüllt, dann Rückkehr zu Schritt 3 und Auswahl
einer neuen Probe engerer Wahl. Wenn sie diese Kriterien erfüllt, dann
Fortfahren mit Schritt 5.
- 5. Berechnen der Tm für
die Probe engerer Wahl mittels des Hybridisierungsmodells. Berechnen
von im Wesentlichen allen möglichen
Misch-Tm's der Probe engerer
Wahl, die mit allen unspezifischen Targets hybridisiert und Ermitteln
der höchsten
Misch-Tm. Berechnen von Delta Tm. Es ist zu beachten, dass der Satz aller
unspezifischen Targets zuvor herausgegriffene Proben umfasst, wenn
sich im Gegensatz zu einer Fixierung an einem Träger auch diese in Lösung befinden
sollen.
- 6. Fortfahren mit Schritt 7, wenn Delta Tm annehmbar groß ist. Rückkehr zu
Schritt 3 und Auswahl einer neuen Probe engerer Wahl, wenn Delta
Tm nicht annehmbar groß ist.
- 7. An diesem Punkt ist eine geeignete Probe ausgewählt. Die
vorgenannte Prozedur kann noch weitere Male wiederholt werden, um
für hinzukommende
Targets weitere Proben auszuwählen,
oder um ggf. zusätzliche
Proben für
ein Target auszuwählen,
für das
sich bereits eine oder mehrere Proben gefunden hat.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen,
bei denen sich sowohl die Proben als auch die Targets in Lösung befinden
(d.h. die Proben sind nicht an einen Träger gebunden), ist es vorzuziehen,
vor der Berechnung der Delta Tm für die aktuelle Probe engerer
Wahl jede zuvor angenommene Probe in die Liste von Targets aufzunehmen.
Den Fachleuten auf diesem Gebiet wird sofort klar sein, dass eine
solche Vorgehensweise vorzuziehen ist, weil die Proben miteinander
sowie mit den Targets hybridisieren können, und daher bei jeder Berechnung
der Stärke
von unspezifischen Hybridisierungen einbezogen werden sollten. Fachleuten
wird ohne Weiteres einleuchten, dass dieses Merkmal bedeutet, dass
mit der vorliegenden Erfindung Proben bereitgestellt werden, die
miteinander eine reduzierte Mischhybridisierung an den Tag legen.
Von daher ist die vorliegende Erfindung besonders auf Fälle anwendbar,
wo in einer Lösung
gleichzeitig viele Proben verwendet werden. Dies ist oftmals der
Fall, wo Primer zur Amplifizierung oder zum Kopieren von Abschnitten
von genetischem Material verwendet werden. In diesem Fall sollen
sich „Probe" und „Primer" auf dasselbe Oligonukleotid
beziehen.
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Das
Hinzunehmen von Targets bei fortschreitender Anwendung der Verfahren
gemäß der vorliegenden
Erfindung kann der Fähigkeit
zur Ermittlung einer Probe für
ein bestimmtes Target entgegenstehen, und zwar nicht wegen eines
Konfliktes mit anderen Targets, sondern wegen eines Konfliktes (eine
zu starke Hybridisierung) mit zuvor herausgegriffenen Proben. Wenn
das Ausführen
der in der vorliegenden Erfindung umrissenen Verfahren zeigt, dass
relativ viele nicht annehmbare Proben ermittelt wurden, und wenn
diese Proben dann noch ungeeignet sind, weil sie sich zu stark mit
anderen Proben verbinden, ist es allgemein vorzuziehen, das Verfahren
von Neuem unter Einsatz einer anderen Reihenfolge des Herausgreifens
von aktuellen Targets zu beginnen. Dies führt allgemein zu einer anderen
Reihenfolge des Herausgreifens von Proben und kann zu einem Satz
von Proben führen,
die sich gegenseitig in einem größeren Grad
ausschließen.
Wenn z.B. die Proben für
Targets beim ersten Mal in der Reihenfolge Target 1, Target 5, Target
2, Target 4, Target 3 herausgegriffen werden, und die besten Proben
für Target
2 und Target 3 keine annehmbare Delta Tm haben, weil sie sich relativ
gut mit Proben für
Target 1 und Target 5 verbinden, ist es möglich, die Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung erneut zu wiederholen, indem Proben für Targets in beispielsweise
der folgenden Reihenfolge herausgegriffen werden: Target 2, Target
3, Target 5, Target 4, Target 1. In der Tat kann die Abfolge der Auswahl
von Targets innerhalb der vorliegenden Verfahren modifiziert werden.
Alternativ dazu ist es möglich, mit
dem bisher aufgefundenen Probensatz zu beginnen, die Probe zu betrachten,
die sich als alles andere als ideal herausgestellt hat, herauszufinden,
mit welchen anderen Proben sie zu stark hybridisiert, diese Proben zu überarbeiten,
und diesen Prozess zu wiederholen, bis ein kompatibler Probensatz
ermittelt ist. Es sei beispielsweise angenommen, dass ein Satz von
Proben ermittelt wurde, aber die Proben 2 und 5 keine annehmbare
Delta Tm haben, weil sie zu stark mit Probe 1 bzw. 3 hybridisieren.
Nun ist es möglich,
die Probe 1 zu eliminieren und gemäß den Verfahren der vorliegenden
Erfindung wieder bei Target 1 fortzufahren, wobei der Rest der Proben
in seinem Istzustand belassen wird, und für Target 1 eine neue annehmbare
Probe ermittelt wird, die vielleicht mit der Probe 2 nicht kollidiert.
Dann kann ein Fachmann dasselbe für die Probe 3 durchführen. Dieser
Prozess (des Überarbeitens
der vorher ermittelten Proben, die sich später als Proben herausstellen,
die mit anderen Proben kollidieren) kann iterativ durchgeführt werden,
bis eine gute Lösung
gefunden ist. Wenn keine geeigneten Proben ermittelt werden, können aus
der betreffenden Lösung
ein oder mehrere Targets eliminiert werden.
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Durch
das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Satz von Proben
bereitgestellt, die mit ihren spezifischen Targets relativ gut hybridisieren
bzw. sich mit diesen relativ gut verbinden, aber mit unspezifischen Targets
im Wesentlichen keine Bindung eingehen. Die Eigenschaft, relativ
gut mit spezifischen Targets zu hybridisieren bzw. eine Bindung
einzugehen, nicht aber mit unspezifischen Targets, kann mittels
einer Delta Tm quantifiziert werden. Eine Probe mit einer kleinen
Delta Tm hybridisiert im Allgemeinen mit zumindest einem unspezifischen
Target ganz gut. Für
eine Probe mit einer relativ großen Delta Tm gibt es im Wesentlichen
keine unspezifischen Targets, mit denen sie in größerem Maße hybridisiert.
Von daher kann der Probensatz gemäß der vorliegenden Erfindung
beispielsweise eine Delta Tm von 5°C, 10°C oder, für eine grö ßere Separation, 20°C haben.
Im Allgemeinen gilt, dass unspezifische Targets umso leichter dehybridisiert
werden können,
je größer Delta
Tm ist, während
die spezifischen Targets von den Proben in dem betrachteten Probensatz
hybridisiert bleiben.
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In
einem zweiten Aspekt zeigt die vorliegende Erfindung ein programmiertes
Computersystem zum Bereitstellen der Sequenzen eines Satzes von
Proben auf, die mit ihren spezifischen Targets relativ gut hybridisieren
bzw. sich mit diesen relativ gut verbinden, aber mit unspezifischen
Targets im Wesentlichen keine Bindung eingehen. Ein derartiges programmiertes
Computersystem kann irgendein Programm aus einer großen Anzahl
möglicher
Softwareprogramme umfassen, die von Fachleuten ohne einen übermäßig großen experimentellen
Aufwand entwickelt werden können.
Ein derartiges programmiertes Computersystem umfasst eine Einrichtung
zum Bestimmen oder Kennzeichnen eines oder mehrerer bestimmter Targets
aus einem Satz von Targets, die zu untersuchen sind (ein aktuelles
Target), eine Einrichtung zum Bestimmen oder Kennzeichnen einer
Sequenzteilkette aus dem aktuellen Target, und Bestimmen seiner
Komplementärsequenz
(eine Probe engerer Wahl). Die Einrichtung zum Auswählen einer
Sequenzteilkette kann so arbeiten, dass sie an einem bestimmten
Punkt im aktuellen Target beginnt und dann jedes Mal, wenn eine
neue Teilkette gewählt
wird, den Startpunkt um einen bestimmten Betrag weiterrückt. Um
auszuwählen,
welche Teilkette von der Computereinrichtung herauszugreifen ist,
kann eine Teilkette per Zufall ausgewählt werden, oder es kann irgendeine
beliebige Funktion angewendet werden. Darüber hinaus umfasst das Computersystem
eine Einrichtung zur Bestimmung, ob die Probe engerer Wahl alle
Kriterien erfüllt,
die für
die Proben erforderlich oder erwünscht
sind, und eine Einrichtung zur Berechnung der Tm für die Probe
engerer Wahl unter Verwendung eines Hybridisierungsmodells.
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So
wie sie hier verwendet werden, soll unter den folgenden Ausdrücken Folgendes
verstanden sein:
Ein „Target" ist ein Oligonukleotid
in einem Prüfgut.
Eine „Probe" ist ein Oligonukleotid,
das sich mit einem Target verbinden bzw. mit diesem hybridisieren
soll. Es wäre
festzuhalten, dass in Fällen,
wo sich Proben und Targets in Lösung
befinden, ein bestimmtes Oligonukleotid sowohl eine Probe als auch
ein Target sein kann. Ein „Pro bensatz" soll zwei oder mehr
Proben umfassen. Vorzugsweise umfasst ein „Probensatz" 10 oder mehr Proben.
Bevorzugter umfasst ein „Probensatz" 100 oder mehr Proben.
Noch bevorzugter umfasst ein „Probensatz" 1000 oder mehr Proben.
Das „spezifische
Target" einer Probe
ist das Target, welches so gestaltet ist, dass es mit ihr am besten
hybridisiert. Im Allgemeinen wird dies das Target sein, von dem
die Probe eine komplementäre
Teilkette ist. Wenn z.B. GATTACAGATTACA ein bestimmtes, in Lösung befindliches
Oligonukleotid (oder Target) ist, ist eine mögliche Teilkette CAGAT. Das
Komplement der Teilkette CAGAT ist ATCTG, und somit kann ATCTG eine
Probe sein, um mit dem spezifischen Target GATTACAGATTACA zu hybridisieren.
Ein „unspezifisches
Target" ist ein
Target, das sich vom spezifischen Target unterscheidet.
„Mischhybridisierung" ist eine Hybridisierung
einer Probe mit einem Target, das nicht seinem spezifischen Target
entspricht, oder mit einer anderen Probe.
„Tm" ist am bevorzugtesten die Schmelztemperatur
der Hybridisierung einer Probe mit ihrem spezifischen Target. In
der wissenschaftlichen Literatur ist die Schmelztemperatur genau
festgelegt, und wird hier zur Beschreibung eines Maßes verwendet,
wie stark eine Probe mit einem Target hybridisiert.
„Misch-Tm" ist die Schmelztemperatur
der Hybridisierung einer Probe mit einem unspezifischen Target (oder einer
anderen Probe). Für
Schmelztemperaturmodelle, die ortsabhängig sind, ist es vorzuziehen,
den Ort zu verwenden, wo die Schmelztemperatur der Hybridisierung
am höchsten
ist.
„Zwangsbedingungen" sind die Voraussetzungen
oder Bedingungen, die bei der Auswahl von Proben im Wesentlichen
bestehen müssen.
In den meisten Fällen
beziehen sich die „Zwangsbedingungen" auf ein Merkmal oder
eine Eigenschaft der Probe. So könnte
es z.B. wünschenswert
sein, nur diejenigen Proben auszuwählen, die eine Tm zwischen
ca. 50° und
60°C haben,
oder die nicht mehr als drei G's
hintereinander enthalten. Es können
beliebig viele heuristische Herangehensweisen oder Zwangsbedingungen
bestehen, die aufgrund der Vorlieben des Ausübenden bezüglich der Verwendung des Probensatzes
auferlegt werden. Einige beispielhafte Zwangsbedingungen umfassen
all diejenigen Proben, die eine bestimmte Länge haben (z.B. eine Länge von 20
Basen oder eine Länge
von 30 Basen), oder all diejenigen Proben, deren Tm's innerhalb eines
bestimmten Bereichs liegen (z.B. innerhalb von 5°C zueinander oder innerhalb
von 2°C
einer mittleren Tm für
Proben mit einer bestimmten Länge).
Für den
Fall, dass Proben als Primer verwendet werden, können typischerweise die Zwangsbedingungen
herrschen, dass sich die Probe an die Targetsequenz innerhalb eines
bestimmten Bereichs anhängen
muss (um die Aufgabe des Primens bzw. Markierens ordnungsgemäß auszuführen). Andere Zwangsbedingungen
könnten
dahingehend lauten, dass die Probe keine G's und C's innerhalb der letzten vier Basenpositionen
von ihrem 3'-Ende
haben darf, usw.
„Delta
Tm" ist für eine bestimmte
Probe der Unterschied zwischen Tm und der maximalen Misch-Tm.
Ein „Hybridisierungsmodell" ist ein mathematisches
Modell, mittels dem man eine geschätzte Tm oder eine auf der Probe
basierende Misch-Tm
berechnet, das Oligonukleotid, mit welchem sie hybridisiert und
möglicherweise
noch die Position der Hybridisierung. Das Hybridisierungsmodell
kann auch die Eingabe von Lösungskonzentrationen
oder zusätzlichen
Faktoren erfordern. Ein wichtiges Merkmal eines „Hybridisierungsmodells" besteht darin, dass
es einen Schätzwert
einer Tm oder Misch-Tm auf algorithmischem Wege bereitstellt. Es
gibt viele Hybridisierungsmodelle, die in der wissenschaftlichen
Literatur erläutert
werden und von denen man ausgeht, dass sie innerhalb des Umfangs
der Verfahren der vorliegenden Erfindung anwendbar sind. Es können aber
auch weitere, nach Kundenwunsch konzipierte Hybridisierungsmodelle
geschaffen werden.
Die „annehmbare
Delta Tm" ist die
kleinste Delta Tm, die für
eine Probe als annehmbar festgelegt wird, um gemäß den Verfahren der vorliegenden
Erfindung angenommen zu werden. Eine annehmbare Delta Tm könnte beispielsweise
5°C, 10°C oder, für eine größere Separation,
20°C betragen.
Eine annehmbare Delta Tm könnte
gleichfalls als irgendwo zwischen diesen Größen liegend angenommen werden.
Im Allgemeinen gilt, dass es umso leichter ist, nicht annehmbare
von annehmbaren Proben zu trennen, je größer Delta Tm ist. Entsprechend
gilt auch, dass es umso leichter ist, unspezifische Target zu dehybridisieren
(während
die spezifischen Targets hybridisiert bleiben), je größer die
Delta Tm ist.
So wie der Ausdruck „sich relativ gut mit spezifischen
Targets verbinden" hier
verwendet wird, soll er ein Merkmal beschreiben, gemäß dem sich
unter normalen Betriebsbedingungen eine Probe nicht von einer Targetsequenz
löst, sondern
vielmehr mit dieser hybridisiert bleibt. Ein bevorzugtes Beispiel
für solch
ein Merkmal ist eine absolut komplementäre Probe, die sich bei Temperaturen
unter 80°C
nicht von einer Targetsequenz löst, sondern
vielmehr mit ihr hybridisiert bleibt.
So wie der Ausdruck „geht mit
unspezifischen Targets im Wesentlichen keine Bindung ein" hier verwendet wird, soll
er ein Merkmal beschreiben, gemäß dem eine
Probe nur mit solchen Targetsequenzen hybridisiert, gegenüber denen
sie unter normalen Betriebsbedingungen einen hohen Grad an Komplementarität hat. Ein
bevorzugtes Beispiel für
solch ein Merkmal ist eine absolut komplementäre Probe, die sich bei Temperaturen
unter 80°C
nicht von einer Targetsequenz löst,
sondern vielmehr mit dieser hybridisiert bleibt. Dieselbe Probe
verbindet sich aber nicht mit einer Targetsequenz bzw. löst sich
auch nicht leicht von einer Targetsequenz, gegenüber der sie keinen hohen Grad
von Komplementarität
aufweist; und zwar gilt dies für
Temperaturen, die über einer
bestimmten Temperatur liegen, die deutlich unterhalb 80°C liegt,
wie z.B. über
70°C, über 65°C, über 60°C, über 50°C etc. Das
Merkmal soll eine minimale Hybridisierung mit einschließen, die
durch Verrühren oder
Erwärmen
auf eine Temperatur über
Raumtemperatur rückgängig gemacht
werden kann.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Die
folgenden Angaben werden lediglich beispielhaft gegeben und sollen
den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken.
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BEISPIEL 1
-
Auswahl von Oligonukleotiden
im Hinblick auf eine geringe Mischhybridisierung
-
Es
folgt eine Prüfgutliste
von Targets zum Entwickeln von Proben. Die Proben waren zum Aufbau
auf solch einem DNA-Baustein bestimmt, wie sie gemäß dem von
Montgomery in WO 98/01221 beschriebenen Verfahren verwendet werden,
wobei auf eine Lage an der Oberfläche des Bausteins irgendein
anderer Träger angebracht
wurde, so dass die Proben selbst nicht frei in der Lösung schwebten.
Somit berücksichtigten
wir während
der Ausführung
des Verfahrens keine Proben im Targetsatz.
- >gi|6717738|gb|AW305385.1|AW305385
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- >gi|6717590|gb|AW305237.1|AW305237
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- >gi|6714107|gb|AW304418.1|AW304418
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- >gi|6713507|gb|AW303818.1|AW303818
xr23d05.x1 NCI_CGAP_Ut4 Homo sapiens cDNA-Klon Bild:2760969 3', mRNA-Sequenz
- >gi|6712898|gb|AW303218.1|AW303218
xr59g03.x1 NCI_CGAP_Ov26 Homo sapiens cDNA-Klon Bild:2764468 3' ähnlich zu/enthält Alu-repetitives
Element; mRNA-Sequenz
- >gi|6711895|gb|AW302218.1|AW302218
xs03d05.x1 NCI_CGAP_Kid11 Homo sapiens cDNA-Klon Bild:2768553 3' ähnlich zu TR:Q14934 Q14934
NF-AT3.;, mRNA-Sequenz
- >gi|6710695|gb|AW301018.1|AW301018
xk11e01.x1 NCI_CGAP_Co20 Homo sapiens cDNA-Klon Bild:2666424 3'. mRNA-Sequenz
- >gi|6710495|GB|AW300818.1|AW300818
xk06e09.x1 NCI_CGAP_Co19 Homo sapiens cDNA-Klon Bild:2665960 3' ähnlich zu TR:O88814 O88814
HEME-BINDEPROTEIN.;, mRNA-Sequenz
- >gi|6705458|gb|AW298822.1|AW298822
UI-H-BW0-ajq-h-09-O-UI.s1 NCI_CGAP_Sub6 Homo sapiens cDNA-Klon Bild:2732800
3', mRNA-Sequenz
-
Wir
verwendeten die folgenden Zwangsbedingungen: Die Proben müssen eine
Länge von
20 Basen haben. Die Proben müssen
eine Tm innerhalb von 1°C
im Hinblick auf die gemäß dem verwendeten
Hybridisierungsmodell erwartete Tm für ein 20-mer haben (in diesem
Fall 68,25°C).
-
Wir
verwendeten folgendes Hybridisierungsmodell: Tm = 81,5 + 0,41·Pgc – 675/N – Pmm, wobei
Pgc der prozentuale GC-Gehalt der Probe ist = (Anzahl G's + Anzahl von C's)/N·100, N
ist die Länge
der Probe in Basen angegeben, und Pmm ist der prozentuale Grad von
Fehlanpassungen = (Anzahl der Fehlanpassungen)/N·100.
-
Wir
wählten
eine annehmbare Delta Tm von 20°C.
-
Der
Algorithmus arbeitete wie folgt. Wir begannen mit Target 1. An einer
zufällig
ausgewählten
Stelle griffen wir ein 20-mer daraus heraus und ermittelten sein
Komplement als Probe engerer Wahl. Wir überprüften, dass die Probe engerer
Wahl die Zwangsbedingungen erfüllt.
Falls dem nicht so ist, wird von uns ein anderes 20-mer aus einer
zufällig
ausgewählten
Stelle gewählt.
Waren die Bedingungen erfüllt,
dann berechneten wir die Tm's
für diese
Probe, die mit allen anderen Targets an allen anderen Stellen hybridisierte,
und benutzten diese Daten zur Ermittlung der maximalen Misch-Tm
und somit der Delta Tm. Wenn Delta Tm größer oder gleich 20°C war, behielten
wir diese Probe und beschafften eine Probe für das nächste Target (Target 2). Wenn
dies nicht der Fall war, wurde von uns ein anderes 20-mer aus einer
anderen zufällig
gewählten
Stelle ausgesucht. Wir wiederholten diesen Prozess, bis wir für jedes
Target eine annehmbare Probe ermittelt hatten.
-
Es
folgt die Liste von Proben, die durch diesen Prozess ermittelt wurden.
Nachstehend wird für
jede Probe eine Kopfzeileninformation angegeben, die anzeigt, von
welchem Target sie stammt (d.h. welches ihr spezifisches Target
ist), von wo im Target die Probe stammt (d.h. bei welchem Offset
im spezifischen Target), die die Tm der Probe sowie ihre maximale
Misch-Tm angibt, und besagt, durch welches unspezifische Target die
maximale Misch-Tm verursacht wird, und wo in diesem unspezifischen
Target die maximale Misch-Tm auftritt (bei welchem Offset).
-
Man
beachte, dass die angegebenen Tm-Werte alle exakt übereinstimmen.
Die experimentell bestimmten Tm's
stimmen nicht zwangsweise genau überein – die angegebenen
Tm's sind aus dem
Hybridisierungsmodell abgeleitete Tm's, was in diesem Fall dazu führt, dass
man bei den beschriebenen Verfahren in der Lage ist, Proben zu ermitteln,
die in der geschätzten
Tm alle genau übereinstimmen.
- > Probe 1 von
Target 1 bei Offset 359; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 33,3 von Target
9 bei Offset 253
ATTCCGGATACCAAGACGCA
- > Probe 2 von
Target 2 bei Offset 2; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 48,3 von Target
6 bei Offset –3
CTTCTCGCAGCCGTATAGTA
- > Probe 3 von
Target 3 bei Offset 145; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 28,3 von Target
5 bei Offset 272
AAGCTTGGCCTGTTCAGTCA
- > Probe 4 von
Target 4 bei Offset 239; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 23,3 von Target
1 bei Offset 176
AAGTGACGAAGGAGCACCAT
- > Probe 5 von
Target 5 bei Offset 424; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 28,3 von Target
1 bei Offset 25
GAGCGAAACTCTGTCTCCAA
- > Probe 6 von
Target 6 bei Offset 36; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 28,3 von Target
1 bei Offset 225
AAAGGTGTACTCAGGCCTCA
- > Probe 7 von
Target 7 bei Offset 333; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 28,3 von Target
1 bei Offset 314
ACGTGAACTGTCATCACCTG
- > Probe 8 von
Target 8 bei Offset 352; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 28,3 von Target
5 bei Offset 24
CATTCCATGGTGATTCCTGG
- > Probe 9 von
Target 9 bei Offset 210; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 33,3 von Target
4 bei Offset 79
AGCCAAGATATGCAGCATCC
- > Probe 10 von
Target 10 bei Offset 350; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 28,3 von Target
1 bei Offset 175
ACAGACAAAGCGTCCCTCAA
-
Beispiel 2
-
Bei
diesem Beispiel war die Liste von Targets dieselbe wie in Beispiel
1. Gleichfalls waren alle Parameter und das zur Berechnung von Tm
verwendete Modell dieselben wie in Beispiel 1. Der einzige Unterschied bestand
darin, dass wir eine Abwandlung des Verfahrens verwendeten.
-
Wir
begannen mit Target 1. An einer zufällig ausgewählten Stelle griffen wir ein
20-mer daraus heraus und ermittelten sein Komplement als Probe engerer
Wahl. Wir stellten fest, dass die Probe engerer Wahl die Zwangsbedingungen
erfüllt.
Falls dies nicht der Fall war, griffen wir von der „nächsten" Stelle ein anderes 20-mer
heraus, supra. Waren die Be dingungen erfüllt, berechneten wir die Tm's für diese
Probe, die an allen anderen Stellen mit allen anderen Targets hybridisierte
und verwendeten diese Daten dazu, die maximale Misch-Tm und somit
Delta Tm zu ermitteln. Wenn Delta Tm größer oder gleich 20°C war, behielten
wir diese Probe bei und gingen zur Gewinnung einer Probe für das nächste Target
(Target 2) über.
Wenn Delta Tm nicht größer oder
gleich 20°C
war, gingen wir einen Schritt zurück und griffen von der „nächsten" Stelle ein anderes 20-mer
heraus (siehe unten). Wir wiederholten diesen Prozess, bis wir für jedes
Target eine annehmbare Probe ermittelt hatten.
-
An
der „nächsten Stelle" wendeten wir folgenden
Prozess an: Wir wählten
eine neue Probe engerer Wahl aus, und zwar ausgehend an einer Stelle,
die in Bezug auf das vorige Herausgreifen um eine Base nach rechts
(in der 3'-Richtung)
verschoben war. Für
den Fall, dass eine solche Stelle zur Beschaffung einer Probe engerer
Wahl nicht ausreichend viele Basen zeigte (z.B. wenn die nächste Stelle
zu nahe am Ende des Targets liegt, so dass nicht mehr genügend Basen übrig sind,
um eine Probe mit der gewünschten
Länge herzustellen), starteten
wir bei Stelle 1 des Targets. Somit startete der Prozess des Absuchens
eines Targets nach einer annehmbaren Probe bei einem zufällig ausgewählten Punkt
und wurde dann schrittweise entlang des Targets fortgesetzt, wobei
ein Rücksprung
zum Anfang des Targets erfolgte, wenn das Ende erreicht war.
-
Dieser
Prozess bietet ein gründliches
Absuchen eines Targets nach einer annehmbaren Probe. Wenn es eine
annehmbare Probe gibt, findet man diese damit auch heraus. Somit
ist dies ein gutes Suchverfahren nach einer Probe engerer Wahl,
und zwar für
Situationen, wo sich die Targets mit Ausnahme von kleinen Unterschieden
(vielleicht Mutationen) an bestimmten Stellen im Oligonukleotid
sehr ähnlich
sein könnten.
-
Dieser
Prozess ergab den folgenden ermittelten Probensatz:
- > Probe 1 von Target
1 bei Offset 62; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 33,3 von Target 3 bei
Offset 372
CCCAAAGCCAAGGTTTGGTA
- > Probe 2 von
Target 2 bei Offset 0; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 38,3 von Target
6 bei Offset –5
TCTCGCAGCCGTATAGTAGT
- > Probe 3 von
Target 3 bei Offset 115; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 33,3 von Target
6 bei Offset 173
TATGTTCCGGTGCCTTGGAT
- > Probe 4 von
Target 4 bei Offset 234; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 33,3 von Target
1 bei Offset 399
ACGAAGGAGCACCATTGAAG
- > Probe 5 von
Target 5 bei Offset 292; Tm – 68,3;
max. Misch-Tm = 33,3 von Target 7 bei Offset 111
GGAGCCTTACAACTTAGGCA
- > Probe 6 von
Target 6 bei Offset 154; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 33,3 von Target
3 bei Offset 73
TTAAACTCCTGGGCTCAAGC
- > Probe 7 von
Target 7 bei Offset 265; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 28,3 von Target
4 bei Offset 93
AGTGGTGGCTACAGAAGCTT
- > Probe 8 von
Target 8 bei Offset 379; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 28,3 von Target
1 bei Offset 59
ATCTCCAGGGCCTGGTTATT
- > Probe 9 von
Target 9 bei Offset 438; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 38,3 von Target
4 bei Offset 194
CGCAATGAGATCTGGCTGTT
- > Probe 10 von
Target 10 bei Offset 350; Tm = 68,3; max. Misch-Tm = 28,3 von Target
1 bei Offset 175
ACAGACAAAGCGTCCCTCAA
