ES2260003T3 - Un procedimiento para seleccionar oligonucleotidos con una baja hibridcion cruzada. - Google Patents
Un procedimiento para seleccionar oligonucleotidos con una baja hibridcion cruzada.Info
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Abstract
Un procedimiento para proporcionar un conjunto de sondas para una matriz para secuestrar un conjunto deseado de objetivos en el que las sondas hibridan con sus objetivos pretendidos pero no hibridan sustancialmente con objetivos no pretendidos en una mezcla de muestra de objetivos pretendidos y objetivos no pretendidos, que comprende las etapas de: (a) determinar un conjunto de objetivos; (b) determinar un objetivo actual en particular de entre el conjunto de objetivos para sondear; (c) elegir una subcadena de una secuencia del objetivo actual y proporcionar su secuencia complementaria, que se convierte en la sonda candidata; (d) determinar que una sonda candidata satisface cualquier criterio deseado o requerido para las sondas; (e) calcular la Tm para la sonda candidata usando un modelo de hibridación; (f) calcular sustancialmente todas las posibles Tm de cruzamiento de la sonda candidata hibridando con todos los objetivos no pretendidos, y hallar la Tm de cruzamiento máximo; (g) calcularla delta Tm; (h) determinar si la delta Tm es de al menos 5°C; y (i) repetir las etapas (b) hacia delante hasta que se encuentren las sondas deseadas.
Description
Un procedimiento para seleccionar
oligonucleótidos con una baja hibridación cruzada.
La presente invención se incluye en el campo de
la síntesis y el procesado biológico y químico. La presente
invención se refiere a procedimientos para seleccionar
oligonucleótidos por baja hibridación cruzada. La presente invención
puede aplicarse, pero no se limita a, el campo de la síntesis, el
diagnóstico y la terapéutica químicos o biológicos.
La presente solicitud reivindica prioridad sobre
la solicitud de patente provisional de EE.UU. con nº de serie
60/116.956 presentada el 25 de enero de 1999.
Continuamente están surgiendo avances en el
campo del procesado y la síntesis biológico y químico. Se están
desarrollando muchas matrices en fase sólida o "genochips"
nuevos y perfeccionados que proporcionan procedimientos rápidos para
sintetizar material químico y biológico. Algunos ejemplos de dichas
tecnologías incluyen los descritos por Pirrung y col., la patente de
EE.UU. nº 5.143.854, los descritos por Southern en el documento
WO93/22480, los descritos por Heller en el documento WO95/12808 y
los descritos por Montgomery en el documento PCT/US97/11463. Por lo
tanto, es posible sintetizar, manipular y examinar cantidades aún
crecientes de material genético. Además, es posible trabajar
simultáneamente, analizar y probar cantidades aún mayores de
material genético.
Los oligonucleótidos pueden hibridar o unirse
con otros oligonucleótidos dependiendo de si sus secuencias son o no
más o menos complementarias. A veces es deseable encontrar un
conjunto de oligonucleótidos que, tanto como sea posible en un
conjunto dado de restricciones, no hibriden ni se unan entre sí.
Pueden usarse procedimientos de optimización para ayudar a
seleccionar dicho conjunto de oligonucleótidos.
Hay muchas posibilidades sobre cómo crear un
oligonucleótido u oligonucleótidos a partir de un oligonucleótido
más largo. Por ejemplo, se puede cortar el oligonucleótido largo o
seleccionar un segmento o segmentos a partir de los cuales se forme
un oligonucleótido más pequeño. Estos oligonucleótidos más pequeños,
formados mediante estos y otros procedimientos conocidos por los
expertos en la materia, pueden denominarse "secuencias
subcadena". Hay una gran flexibilidad sobre qué subcadena del
oligonucleótido seleccionar como secuencia objetivo para la
unión.
Mitsuhashi y col., patente de EE.UU. nº
5.556.749 describen un procedimiento informatizado para diseñar
sondas óptimas de ADN. El procedimiento está destinado a producir
sondas diseñadas para el diagnóstico y la monitorización. Sin
embargo, el procedimiento descrito en ese documento no contempla la
elección de más de una sonda para su uso simultáneo con otra sonda,
mediante lo cual se minimiza la interacción y la hibridación
cruzada.
El documento EP0799897 A1 concierne a un
procedimiento de selección de etiquetas de ácidos nucleicos y de las
correspondientes sondas para micromatrices. Las etiquetas se usan
para marcar y detectar composiciones que incluyen células y virus.
Los componentes se marcan con dichas etiquetas de ácidos nucleicos
seleccionadas, y la presencia de las etiquetas individuales es
monitorizada mediante la hibridación con una matriz de sonda. Por lo
tanto, los ácidos nucleicos etiqueta son marcadores de los
componentes individuales. Se sintetizan los ácidos nucleicos
etiqueta. Por lo tanto, los ácidos nucleicos etiqueta pueden
seleccionarse libremente de entre todas las posibles combinaciones
de bases. Las etiquetas son seleccionadas eliminando las etiquetas
que se unen al mismo objetivo con una energía de hibridación
similar. Las etiquetas se unen a ácidos nucleicos complementarios
con una energía de hibridación similar cuando un ácido nucleico
complementario de una etiqueta se une a otra etiqueta con una
energía que supera un valor umbral específico. Por consiguiente,
debería evitarse la hibridación cruzada. Estas etiquetas se usan
para marcar células y virus. Incluso se usan para marcar secuencias
de ADN, por ejemplo, "mutantes de deleción". Este conocido
procedimiento proporciona un conjunto de etiquetas y un conjunto de
sondas que son complementarias entre sí y que están diseñadas de una
forma tal que debería evitarse la hibridación cruzada.
El documento US 5.403.707 describe el uso de un
oligonucleótido como "una sonda" que es sustancialmente
complementaria a una secuencia de ácido nucleico de un ácido
nucleico objetivo, y que se usa para la detección o la captura de un
ácido nucleico objetivo amplificado. Cuando se usa simultáneamente
una multiplicidad de sondas para capturar una multiplicidad de
ácidos nucleicos objetivo amplificados, todas las sondas de captura
tienen unas T_{m} que no difieren en más de aproximadamente 15°C.
Preferiblemente, las T_{m} de las sondas de captura usadas
simultáneamente no difieren en más de aproximadamente 5°C.
El documento US 5.716.784 enseña un proceso para
la replicación y la detección homogénea en ensayo de una secuencia
de un ácido nucleico objetivo en una muestra, en la que se usa una
sonda analítica de oligonucleótido y una sonda de detección de
oligonucleótido, que difieren en la longitud de los nucleótidos de
forma que las T_{m} están separadas al menos 10°C. Este
procedimiento emplea un indicador de fluorescencia bicomponente con
un componente en cada tipo de sonda, que dan como resultado una
alteración de la fluorescencia cuando la sonda analítica hibrida con
el ácido nucleico objetivo. La diferencia en la longitud de las dos
sondas asegura que en presencia de un objetivo las dos sondas se
separan, hibridando la sonda analítica más larga con el
objetivo.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para elegir subcadenas complementarias
de entre oligonucleótidos objetivo de forma que las subcadenas se
unan relativamente bien a sus oligonucleótidos objetivo pero no se
unan sustancialmente a otros oligonucleótidos de una muestra. Por
ejemplo, dado un oligonucleótido largo (por ejemplo, una cadena de
ARN, ARNm, ADN o ADNc) es posible seleccionar una porción o
porciones de ella para un experimento posterior, por ejemplo, como
una sonda de captura. En el caso de una sonda de captura
inmovilizada, es deseable que la secuencia de la subcadena del
oligonucleótido se una al oligonucleótido largo del que procedía,
pero no a otros oligonucleótidos que pudiera haber presentes en una
muestra. A menudo es deseable preparar una matriz de dichas sondas
de captura inmovilizadas de forma que cada una se una o hibride con
su objetivo pretendido, pero que no se una ni hibride fuertemente
con ninguno de los otros objetivos de la disolución. Una matriz de
sondas de captura inmovilizadas construidas según los procedimientos
descritos permite usar una matriz de sondas de captura menor para
secuestrar un conjunto deseado de objetivos, porque la matriz no
requiere tanta redundancia para elucidar puntos de datos, como en
otras matrices en las que la unión no es claramente
distinguible.
distinguible.
En un primer aspecto, la presente invención
presenta procedimientos para proporcionar un conjunto de sondas que
hibridan o se unen relativamente bien a sus objetivos pretendidos,
pero que no se unen sustancialmente a objetivos no pretendidos. La
calidad de la hibridación o la unión relativamente buena a los
objetivos pretendidos pero no a los objetivos no pretendidos se
cuantifica usando la delta T_{m} (diferencia en las temperaturas
de fusión) según los procedimientos de la presente invención. Una
sonda con una delta T_{m} relativamente pequeña hibrida
generalmente sustancialmente bien con al menos un objetivo no
pretendido. Una sonda con una delta T_{m} relativamente grande no
tiene sustancialmente objetivos no pretendidos con los que hibridar
sustancialmente bien.
El procedimiento según la presente invención,
que está definido en las reivindicaciones, se caracteriza por:
1. La determinación de un conjunto de
objetivos. En algunas circunstancias en las que no está clara cuál
podría ser la identidad de todos los objetivos en una disolución en
particular, es posible determinar una lista de algunos de los
objetivos que podrían estar en la disolución en particular e incluir
esa lista en el conjunto de objetivos. Si hay algunos objetivos en
la lista que no estuvieran realmente en la disolución, no
perjudicaría a la calidad de las sondas seleccionadas según los
presentes procedimientos.
2. La selección de un objetivo en particular
del conjunto de objetivos. Este se convierte en el objetivo
actual.
3. La elección de una subcadena de una
secuencia del objetivo actual y la aportación de su secuencia
complementaria. Esta es una sonda candidata. La elección de una
subcadena de una secuencia puede realizarse partiendo de un punto en
particular en el objetivo actual, e incrementando después el punto
de partida en cierta cantidad cada vez que se elige una nueva
subcadena, cubriendo el punto de partida hacia la porción frontal
del objetivo actual, cuando un incremento desprendería de otro modo
el extremo del objetivo. Una subcadena puede elegirse
aleatoriamente, o puede aplicarse cualquier función arbitraria con
objeto de determinar qué subcadena elegir. Si ya no hay más
subcadenas en el objetivo actual que no hayan sido probadas, se
recomienda: (i) usar la mejor sonda candidata seleccionada hasta el
momento, teniendo en cuenta que este objetivo podría no ser
capturado tan selectivamente como se desea, (ii) no hacer más
elecciones de sondas para este objetivo, y (iii) volver a la etapa
2, más arriba. En caso contrario, usar la sonda candidata según se
determinó y proceder a la etapa 4, más abajo.
4. La determinación de si la sonda candidata
satisface cualquier criterio requerido o deseado para el conjunto de
sondas. Si no cumple dichos criterios, volver a la etapa 3 y elegir
una nueva sonda candidata. Si cumple dichos criterios, proceder a la
etapa 5.
5. El cálculo de la T_{m} para la sonda
candidata usando el modelo de hibridación. Calcular sustancialmente
todas las posibles T_{m} de cruzamiento de la sonda candidata que
hibriden con todos los objetivos no pretendidos y hallar la T_{m}
de cruzamiento máximo. Calcular la delta T_{m}. Téngase en cuenta
que el conjunto de todos los objetivos no pretendidos incluirá las
sondas escogidas previamente si las sondas también van a estar en
disolución, por oposición a fijadas a un soporte.
6. Proceder a la etapa 7 si la delta T_{m}
es aceptablemente grande. Volver a la etapa 3 y elegir una nueva
sonda candidata si la delta T_{m} no es aceptablemente grande.
7. En este punto se ha elegido una sonda
adecuada. El modo de operación anterior puede repetirse varias veces
para elegir otras sondas para objetivos adicionales o, si se desea,
sondas adicionales para un objetivo para el cual ya se han
encontrado una o más sondas.
En un segundo aspecto, la presente invención
presenta un sistema informático programado para proporcionar las
secuencias de un conjunto de sondas que hibridan o se unen
relativamente bien con sus objetivos pretendidos pero que no se unen
sustancialmente a sus objetivos no pretendidos.
\newpage
La presente invención presenta procedimientos
para proporcionar un conjunto de sondas que hibridan o se unen
relativamente bien a sus objetivos pretendidos, pero que no se unen
sustancialmente a objetivos no pretendidos. La calidad de la
hibridación o la unión relativamente buena a los objetivos
pretendidos pero no a los objetivos no pretendidos se cuantifica
usando la delta T_{m} según los procedimientos de la presente
invención. Una sonda con una delta T_{m} pequeña hibrida
generalmente relativamente bien con al menos un objetivo no
pretendido. Una sonda con una delta T_{m} grande no tiene
sustancialmente objetivos no pretendidos con los que hibridar
relativamente bien.
Los procedimientos según la presente invención
presentan:
1. La determinación de un conjunto de
objetivos. En algunas circunstancias en las que no está clara cuál
podría ser la identidad de todos los objetivos en una disolución en
particular, es posible determinar una lista de algunos de los
objetivos que podrían estar en la disolución en particular e incluir
esa lista en el conjunto de objetivos. Si hay algunos objetivos en
la lista que no estuvieran realmente en la disolución, no
perjudicaría a la calidad de las sondas seleccionadas según los
presentes procedimientos.
2. La selección de un objetivo en particular
de entre el conjunto de objetivos. Este se convierte en el objetivo
actual para el cual se desea una sonda.
3. La elección de una subcadena de una
secuencia del objetivo actual y la aportación de su secuencia
complementaria. Esta es una sonda candidata. La elección de una
subcadena de una secuencia puede realizarse partiendo de un punto en
particular en el objetivo actual, e incrementando después el punto
de partida en cierta cantidad cada vez que se elige una nueva
subcadena, cubriendo el punto de partida hacia la porción frontal
del objetivo actual, cuando un incremento desprendería de otro modo
el extremo del objetivo. Una subcadena puede elegirse
aleatoriamente, o puede aplicarse cualquier función arbitraria con
objeto de determinar qué subcadena elegir. Si ya no hay más
subcadenas en el objetivo actual que no hayan sido probadas, se
recomienda: (i) usar la mejor sonda candidata seleccionada hasta el
momento, teniendo en cuenta que este objetivo podría no ser
capturado tan selectivamente como se desea, (ii) no hacer más
elecciones de sondas para este objetivo, y (iii) volver a la etapa
2, más arriba. En caso contrario, usar la sonda candidata según se
determinó y proceder a la etapa 4, más abajo.
4. La determinación de si la sonda candidata
satisface cualquier criterio requerido o deseado para el conjunto de
sondas. Si no cumple dichos criterios, volver a la etapa 3 y elegir
una nueva sonda candidata. Si cumple dichos criterios, proceder a la
etapa 5.
5. El cálculo de la T_{m} para la sonda
candidata usando el modelo de hibridación. Calcular sustancialmente
todas las posibles T_{m} de cruzamiento de la sonda candidata que
hibriden con todos los objetivos no pretendidos y hallar la T_{m}
de cruzamiento máximo. Calcular la delta T_{m}. Téngase en cuenta
que el conjunto de todos los objetivos no pretendidos incluirá las
sondas escogidas previamente si las sondas también van a estar en
disolución, por oposición a fijadas a un soporte.
6. Proceder a la etapa 7 si la delta T_{m}
es aceptablemente grande. Volver a la etapa 3 y elegir una nueva
sonda candidata si la delta T_{m} no es aceptablemente grande.
7. En este punto se ha elegido una sonda
adecuada. El modo de operación anterior puede repetirse varias veces
para elegir otras sondas para objetivos adicionales o, si se desea,
sondas adicionales para un objetivo para el cual ya se han
encontrado una o más sondas.
En las formas de realización particulares en las
que tanto las sondas como los objetivos están en disolución (es
decir, las sondas no están sujetadas a un soporte) es preferible
incluir cada sonda previamente aceptada en la lista de objetivos
antes de calcular la delta T_{m} para la actual sonda candidata.
Los expertos en la materia entenderán fácilmente que es preferible
hacerlo así, ya que las sondas son capaces de hibridar entre sí así
como con los objetivos y por lo tanto deberían estar incluidas en
cualquier cálculo de la fuerza de las hibridaciones no pretendidas.
Los expertos en la materia entenderán fácilmente que esta
característica significa que la presente invención proporciona
sondas con una reducida hibridación cruzada entre sí. Por lo tanto,
la presente invención es particularmente aplicable a los casos en
los que se usan múltiples sondas simultáneamente en disolución. Este
es a menudo el caso cuando se están usando cebadores, como para
amplificar o copiar secciones de material genético. En este caso, se
entiende que "sonda" y "cebador" se refieren al mismo
oligonucleótido.
La adición de objetivos según progresan los
procedimientos según la presente invención puede interferir con la
capacidad para encontrar una sonda para un objetivo en particular,
no debido al conflicto con otros objetivos, sino debido al conflicto
(una hibridación demasiado fuerte) con sondas previamente escogidas.
Si la ejecución de los procedimientos esquematizados en la presente
invención revela que hay un número relativamente grande de sondas
inaceptables encontradas, y si estas sondas no son adecuadas porque
se unen demasiado fuertemente con otras sondas, generalmente es
preferible comenzar el procedimiento desde el principio usando un
orden diferente para escoger los objetivos actuales. Esto
generalmente da como resultado un orden diferente de elección de
las sondas, y puede dar como resultado un conjunto de sondas que son
más mutuamente excluyentes. Por ejemplo, si la primera vez las
sondas para los objetivos son escogidas en el siguiente orden:
objetivo 1, objetivo 5, objetivo 2, objetivo 4, objetivo 3, y las
mejores sondas para el objetivo 2 y el objetivo 3 no tienen una
delta T_{m} aceptable porque se unen relativamente bien a las
sondas del objetivo 1 y del objetivo 5, es posible repetir los
procedimientos según la presente invención de nuevo, escogiendo las
sondas para los objetivos en, por ejemplo, el siguiente orden:
objetivo 2, objetivo 3, objetivo 5, objetivo 4, objetivo 1. En
efecto, en los presentes procedimientos la secuencia de elección de
los objetivos puede modificarse. Alternativamente, es posible
comenzar con el conjunto de sondas encontradas hasta el momento,
fijarse en la sonda que se encontró que era menor que la ideal,
encontrar con qué otras sondas hibridan demasiado fuertemente,
rehacer estas sondas y repetir este proceso hasta que se encuentre
un conjunto de sondas compatible. A modo de ejemplo, supongamos que
se encuentra un conjunto de sondas, pero que las sondas 2 y 5 no
tienen una delta T_{m} aceptable porque hibridan demasiado
fuertemente con las sondas 1 y 3, respectivamente. Es posible
eliminar la sonda 1 y proceder según los procedimientos de la
presente invención de nuevo para el objetivo 1, dejando el resto de
las sondas como tal, encontrando una nueva sonda aceptable para el
objetivo 1 que quizá no esté en conflicto con la sonda 2. Entonces
el artesano experto puede hacer lo mismo para la sonda 3. Este
proceso (de rehacer las sondas encontradas previamente que más tarde
resultan estar en conflicto con otras sondas) puede iterarse hasta
que se encuentre una buena solución. Si no se encuentran sondas
adecuadas, pueden eliminarse uno o más objetivos de una disolución
de interés.
El procedimiento de la presente invención
proporciona un conjunto de sondas que hibridan o se unen
relativamente bien con sus objetivos pretendidos pero no se unen
sustancialmente a objetivos no pretendidos. La calidad de la
hibridación o la unión relativamente buena a los objetivos
pretendidos pero no a los objetivos no pretendidos puede
cuantificarse usando la delta T_{m}. Una sonda con una delta
T_{m} pequeña hibrida generalmente sustancialmente bien con al
menos un objetivo no pretendido. Una sonda con una delta T_{m}
grande no tiene sustancialmente objetivos no pretendidos con los que
hibridar relativamente bien. Por lo tanto, el conjunto de sondas
según la presente invención puede tener, por ejemplo, una delta
T_{m} de 5°C, de 10°C o, para una separación mayor, de 20°C. En
general, cuanto mayor sea la delta T_{m}, más fácil será
deshibridar los objetivos no pretendidos mientras se mantienen los
objetivos pretendidos hibridados por las sondas en el conjunto de
sondas en cuestión.
En un segundo aspecto, la presente invención
presenta un sistema informático programado para proporcionar las
secuencias de un conjunto de sondas que hibridan o se unen
relativamente bien con sus objetivos pretendidos pero que no se unen
sustancialmente a objetivos no pretendidos. Dicho sistema
informático programado puede comprender uno cualquiera de un gran
número de posibles programas informáticos que pueden estar diseñados
por los expertos en la materia sin experimentación indebida. Dicho
sistema informático programado comprende un medio para determinar o
designar uno o más objetivos en particular a partir de un conjunto
de objetivos que se van a sondear (un objetivo actual), un medio
para determinar o designar una subcadena de una secuencia a partir
del objetivo actual y determinar su secuencia complementaria (una
sonda candidata). El medio para elegir una subcadena de una
secuencia puede funcionar partiendo de un punto en particular en el
objetivo actual, e incrementando después el punto de partida en
cierta cantidad cada vez que se elige una nueva subcadena. Una
subcadena puede elegirse aleatoriamente, o puede aplicarse cualquier
función arbitraria con objeto de elegir qué subcadena escoger
mediante el medio informático, un medio para determinar si la sonda
candidata satisface cualquier criterio requerido o deseado para las
sondas, y un medio para calcular la T_{m} de la sonda candidata
usando un modelo de hibridación.
Según se usa en este documento, se entiende que
los siguientes términos significan lo siguiente:
un "objetivo" es un oligonucleótido en una
muestra.
Una "sonda" es un oligonucleótido que
pretende unirse o hibridar con un objetivo. Téngase en cuenta que en
los casos en los que las sondas y los objetivos están en disolución,
un oligonucleótido en particular puede ser tanto una sonda como un
objetivo. Se pretende que un "conjunto de sondas" incluya dos o
más sondas. Preferiblemente, un "conjunto de sondas" incluye 10
o más sondas. Más preferiblemente, un "conjunto de sondas"
incluye 100 o más sondas. Incluso más preferiblemente, un
"conjunto de sondas" incluye 1000 o más sondas.
El "objetivo pretendido" de una sonda es el
objetivo que está diseñado para hibridar mejor con ella.
Generalmente, este será el objetivo del que la sonda es una
subcadena complementaria. Por ejemplo, si GATTACAGATTACA es un
oligonucleótido en particular en disolución (u objetivo), una
posible subcadena es CAGAT. El complemento de la subcadena CAGAT es
ATCTG, y por lo tanto ATCTG puede ser una sonda para hibridar con el
objetivo pretendido GATTACAGATTACA.
Un "objetivo no pretendido" es un objetivo
distinto al objetivo pretendido.
"Hibridación cruzada" es la hibridación de
una sonda con un objetivo distinto a su objetivo pretendido, o con
otra sonda.
"T_{m}" es muy preferiblemente la
temperatura de fusión de la hibridación de una sonda con su objetivo
pretendido. La temperatura de fusión está definida en la
bibliografía científica y se usa en este documento para describir
una medida de lo fuertemente que hibrida una sonda con un
objetivo.
"T_{m} cruzada" es la temperatura de
fusión de la hibridación de una sonda con un objetivo no pretendido
(o con otra sonda). Para los modelos de temperatura de fusión que
son dependientes de la ubicación, es preferible usar la ubicación en
la que la temperatura de fusión de la hibridación sea la mayor.
"Restricciones" son las condiciones o
aptitudes que deben cumplirse sustancialmente cuando se eligen las
sondas. En la mayoría de los casos, "restricciones" se refiere
a una característica o propiedad de la sonda. Por ejemplo, podría
ser deseable seleccionar sólo aquellas sondas con una T_{m} de
entre aproximadamente 50° y 60°C, o que no contengan más de tres G
en una fila. Puede haber cualquier número de heurísticas o
restricciones impuestas por las preferencias del usuario para usar
el conjunto de sondas. Algunos ejemplos de restricciones incluyen
todas aquellas sondas con una longitud en particular (por ejemplo,
20 bases de longitud o 30 bases de longitud), o que todas las sondas
tengan una T_{m} dentro del intervalo en particular (por ejemplo,
de 5°C entre sí o de 2°C de una T_{m} media para sondas con una
longitud en particular). En el caso de usar sondas como cebadores,
típicamente pueden ser unas restricciones tales que la sonda debe
unirse a la secuencia objetivo en una zona determinada (con objeto
de realizar la tarea de cebado correctamente). Otras restricciones
podrían ser que la sonda no tenga G ni C en las últimas cuatro
posiciones de bases de su extremo 3', y así sucesivamente.
"Delta T_{m}" es la diferencia, para una
sonda en particular, entre la T_{m} y la T_{m} de cruzamiento
máximo.
Un "modelo de hibridación" es un modelo
matemático mediante el cual se calcula una T_{m} estimada o una
T_{m} de cruzamiento basada en la sonda, el oligonucleótido con el
que hibrida y posiblemente la posición de la hibridación. El modelo
de hibridación también puede requerir la entrada de las
concentraciones de la disolución o de factores adicionales. Una
característica importante de un "modelo de hibridación" es que
proporciona una estimación de la T_{m} o de la T_{m} de
cruzamiento algorítmicamente. Existen muchos modelos de hibridación
discutidos en la bibliografía científica, y se cree que son
aplicables en el ámbito de los procedimientos de la presente
invención. Asimismo, pueden crearse modelos adicionales de
hibridación personalizados.
"Delta T_{m} aceptable" es la delta
T_{m} más pequeña que se determina como aceptable para que una
sonda sea aceptada según los procedimientos de la presente
invención. Por ejemplo, una delta T_{m} aceptable podría ser de
5°C, 10°C o, para una separación mayor, 20°C. Asimismo, una delta
T_{m} aceptable podría elegirse como cualquier número intermedio.
En general, cuanto mayor sea la delta T_{m}, más fácil será
separar sondas inaceptables de aceptables. De forma similar, cuanto
mayor sea la delta T_{m}, más fácil será deshibridar los objetivos
no pretendidos mientras se mantienen los objetivos pretendidos
hibridados.
Según se usa en este documento, se entiende que
el término "unirse relativamente bien a los objetivos
pretendidos" describe una característica mediante la cual una
sonda no se separa, sino que más bien permanece hibridada a una
secuencia objetivo en unas condiciones operativas normales. Un
ejemplo preferido de dicha característica es una sonda perfectamente
complementaria que no se separa, sino que más bien permanece
hibridada a una secuencia objetivo a unas temperaturas menores de
80°C.
Según se usa en este documento, se entiende que
el término "no se une sustancialmente a objetivos no
pretendidos" describe una característica mediante la cual una
sonda no hibrida con secuencias objetivo distintas a aquellas para
las que posee un alto grado de complementariedad, en unas
condiciones operativas normales. Un ejemplo preferido de dicha
característica es una sonda perfectamente complementaria que no se
separa, sino que más bien permanece hibridada con una secuencia
objetivo a unas temperaturas por debajo de 80°C. Sin embargo, la
misma sonda no se une, o se separa fácilmente, de una secuencia
objetivo para la cual no posee un alto grado de complementariedad a
unas temperaturas mayores que alguna temperatura significativamente
por debajo de 80°C, tal como mayor de 70°C, mayor de 65°C, mayor de
60°C, mayor de 50ºC, etc. La característica pretende incluir una
hibridación mínima que puede ser revertida mediante agitación o
calentamiento por encima de la temperatura ambiente.
Las siguientes se proporcionan únicamente a modo
de ejemplo, y no pretenden limitar el alcance de la presente
invención.
La siguiente es una lista de muestra de
objetivos para diseñar sondas. Las sondas iban a ser construidas
sobre un chip de ADN, tales como aquellos usados según el
procedimiento descrito por Montgomery en el documento WO98/01221,
acopladas a una capa de la superficie de un chip u otro sustrato, de
forma que las propias sondas no estén flotando en la disolución. Por
lo tanto, no respondemos de las sondas del conjunto de objetivos
durante la operación del procedimiento.
\newpage
>gi|6717738|gb|AW305385.1|AW305385xv93h12.x1
NCI_CGAP_Brn53
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2826119 3', secuencia de ARNm
>gi|6717590|gb|AW305237.1|AW305237
xr79h11.xl NCI_CGAP_Lu26
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2766405 3', secuencia de ARNm
>gi|6714107|gb|AW304418.1|AW304418
xv60f12.x1 NCI_CGAP_Lu28
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2817551 3', secuencia de ARNm
>gi|6713707|gb|AW304018.1|AW304018xv15h11.x1
Soares_NFL_T_GBC_S1
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2813253 3', secuencia de ARNm
>gi|6713507|gb|AW303818.1|AW303818
xr23d05.x1 NCI_CGAP_Ut4
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2760969 3', secuencia de ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
>gi|6712898|gb|AW303218.1|AW303218
xr59g03.x1 NCI_CGAP_Ov26
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2764468 3' similar a, contiene elemento repetitivo Alu; secuencia de
ARNm
\vskip1.000000\baselineskip
>gi|6711895|gb|AW302218.1|AW302218
xs03d05.xl NCI_CGAP_Kid11
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2768553 3' similar a TR: Q14934 Q14934 NF-AT3.;
secuencia de ARNm
\newpage
>gi|6710695|gb|AW301018.1|AW301018
xk11e01.x1 NCI_CGAP_Co20
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2666424 3', secuencia de ARNm
>gi|6710495|gb|AW300818.1|AW300818
xk06e09.x1 NCI_CGAP_Co19
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2665960 3' similar a TR: O88814 O88814 PROTEÍNA DE UNIÓN AL GRUPO
HEMO; secuencia de ARNm
>gi|6705458|gb|AW298822.1|AW298822
UI-H-BW0-ajq-h-09-0-UI.s1
NCI_CGAP_Sub6
Clon de ADNc de Homo sapiens IMAGEN:
2732800 3', secuencia de ARNm
Usamos las siguientes restricciones. Las sondas
deben tener 20 bases de longitud. Las sondas deben tener una T_{m}
de 1°C de la T_{m} esperada para un eicosámero según el modelo de
hibridación usado (en este caso 68,25°C).
Usamos el siguiente modelo de hibridación:
T_{m} = 81,5 + 0,41 * Pgc - 675 / N - Pmm, en el que Pgc es el
porcentaje de GC contenidos en la sonda = (número de G + número de
C) / N * 100, N es la longitud de la sonda en bases, y Pmm es el
porcentaje de errores de emparejamiento = (número de errores de
emparejamiento) / N * 100.
Elegimos una delta T_{m} aceptable de
20°C.
El algoritmo funcionó como sigue. Comenzamos con
el objetivo 1. Escogimos un eicosámero de él en una ubicación
seleccionada aleatoriamente y hallamos su complemento como una sonda
candidata. Comprobamos que la sonda candidata satisfacía las
restricciones. Si no, elegimos otro eicosámero de una ubicación
aleatoria. Si lo hacía, calculamos entonces la T_{m} para esta
sonda hibridando con todos los demás objetivos en todas las demás
ubicaciones, y usamos esos datos para hallar la T_{m} de
entrecruzamiento máxima, y por lo tanto la delta T_{m}. Si la
delta T_{m} era mayor o igual a 20°C, conservamos esta sonda y
obtuvimos una sonda para el siguiente objetivo (objetivo 2). Si no,
elegimos otro eicosámero de una ubicación aleatoria. Repetimos este
proceso hasta que encontramos una sonda aceptable para cada
objetivo.
La siguiente es la lista de sondas encontradas
mediante este proceso. A continuación hay una información de
encabezamiento dada para cada sonda que indica de qué objetivo
procede (es decir, cuál es su objetivo pretendido), de dónde
procede, en ese objetivo, la sonda (es decir, con qué separación en
el objetivo pretendido), la T_{m} de la sonda, la T_{m} de
cruzamiento máximo de la sonda, qué objetivo no pretendido
proporciona la T_{m} de cruzamiento máximo y dónde se produce, en
ese objetivo no pretendido, la T_{m} de cruzamiento máximo (con
qué separación).
Téngase en cuenta que los valores de la T_{m}
dados coinciden todos exactamente. La T_{m} determinada
experimentalmente no coincidirá necesariamente exactamente, las
T_{m} dadas son T_{m} estimadas procedentes del modelo de
hibridación, que en este caso dan como resultado que los
procedimientos descritos son capaces de encontrar sondas que
coinciden todas exactamente en la T_{m} estimada.
> sonda 1 del objetivo 1 a una separación de
359; T_{m} = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 33,3 del
objetivo 9 a una separación de 253
ATTCCGGATACCAAGACGCA
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 2 del objetivo 2 a una separación de
2; T_{m} = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 48,3 del objetivo
6 a una separación de -3
CTTCTCGCAGCCGTATAGTA
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 3 del objetivo 3 a una separación de
145; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 28,3 del objetivo 5
a una separación de 272
AAGCTTGGCCTGTTCAGTCA
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 4 del objetivo 4 a una separación de
239; T_{m} = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 23,3 del
objetivo 1 a una separación de 176
AAGTGACGAAGGAGCACCAT
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 5 del objetivo 5 a una separación de
424; T_{m} = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 28,3 del
objetivo 1 a una separación de 25
GAGCGAAACTCTGTCTCCAA
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 6 del objetivo 6 a una separación de
36; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 28,3 del objetivo 1 a
una separación de 225
AAAGGTGTACTCAGGCCTCA
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 7 del objetivo 7 a una separación de
333; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 28,3 del objetivo 1
a una separación de 314
ACGTGAACTGTCATCACCTG
\newpage
> sonda 8 del objetivo 8 a una separación de
352; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 28,3 del objetivo 5
a una separación de 24
CATTCCATGGTGATTCCTGG
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 9 del objetivo 9 a una separación de
210; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 33,3 del objetivo 4
a una separación de 79
AGCCAAGATATGCAGCATCC
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 10 del objetivo 10 a una separación
de 350; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 28,3 del objetivo
1 a una separación de 175
ACAGACAAAGCGTCCCTCAA
En este ejemplo, la lista de objetivos era la
misma que en el Ejemplo 1. Asimismo, todos los parámetros y el
modelo usados para calcular la T_{m} eran los mismos que en el
Ejemplo 1. La única diferencia era que usamos una variación del
procedimiento.
Comenzamos con el objetivo 1. Escogimos un
eicosámero de él en una ubicación seleccionada aleatoriamente, y
hallamos su complemento como una sonda candidata. Determinamos que
la sonda candidata satisfacía las restricciones. Si no, escogimos
otro eicosámero de la "siguiente" ubicación, más arriba. Si lo
hacía, calculamos las T_{m} para esta sonda hibridando con todos
los demás objetivos en todas las demás ubicaciones, y usamos esos
datos para hallar la T_{m} de entrecruzamiento máximo, y por lo
tanto la delta T_{m}. Si la delta T_{m} era mayor o igual a
20°C, conservamos esta sonda y seguimos adelante para conseguir una
sonda para el siguiente objetivo (objetivo 2). Si la delta T_{m}
no era mayor o igual a 20°C, volvimos atrás y escogimos otro
eicosámero de la "siguiente" ubicación (véase más abajo).
Repetimos este proceso hasta que encontramos una sonda aceptable
para cada objetivo.
Para la "siguiente ubicación," aplicamos el
siguiente proceso. Seleccionamos una nueva sonda candidata partiendo
de una ubicación una base a la derecha (en la dirección 3') de la
escogida previamente. Si resultaba que dicha ubicación no tenía las
suficientes bases como para crear una sonda candidata (como cuando
la siguiente ubicación está demasiado cerca del extremo del
objetivo, de forma que no quedan suficientes bases para crear una
sonda de la longitud deseada), partimos de la ubicación 1 del
objetivo. Por lo tanto, el proceso de cribado de un objetivo para
una sonda aceptable comenzó en un punto seleccionado aleatoriamente
y después progresó en incremento a lo largo del objetivo cubriendo
la parte frontal del objetivo, cuando se alcanzaba el extremo.
Este proceso proporciona una búsqueda exhaustiva
de un objetivo para una sonda aceptable. Encontrará una sonda
aceptable si existe una. Por lo tanto, es un buen procedimiento
candidato de búsqueda para situaciones en las que los objetivos
podrían ser muy similares excepto por pequeñas diferencias (quizás
mutaciones) en zonas particulares del oligonucleótido.
Este proceso dio como resultado el hallazgo del
siguiente conjunto de sondas.
> sonda 1 del objetivo 1 a una separación de
62; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 33,3 del objetivo 3 a
una separación de 372
CCCAAAGCCAAGGTTTGGTA
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 2 del objetivo 2 a una separación de
0; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 38,3 del objetivo 6 a
una separación de -5
TCTCGCAGCCGTATAGTAGT
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 3 del objetivo 3 a una separación de
115; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 33,3 del objetivo 6
a una separación de 173
TATGTTCCGGTGCCTTGGAT
\newpage
> sonda 4 del objetivo 4 a una separación de
234; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 33,3 del objetivo 1
a una separación de 399
ACGAAGGAGCACCATTGAAG
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 5 del objetivo 5 a una separación de
292; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 33,3 del objetivo 7
a una separación de 111
GGAGCCTTACAACTTAGGCA
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 6 del objetivo 6 a una separación de
154; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 33,3 del objetivo 3
a una separación de 73
TAAACTCCTGGGCTCAAGC
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 7 del objetivo 7 a una separación de
265; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 28,3 del objetivo 4
a una separación de 93
AGTGGTGGCTACAGAAGCTT
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 8 del objetivo 8 a una separación de
379; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 28,3 del objetivo 1
a una separación de 59
ATCTCCAGGGCCTGGTTATT
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 9 del objetivo 9 a una separación de
438; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 38,3 del objetivo 4
a una separación de 194
CGCAATGAGATCTGGCTGTT
\vskip1.000000\baselineskip
> sonda 10 del objetivo 10 a una separación
de 350; Tm = 68,3; T_{m} de cruzamiento máximo = 28,3 del objetivo
1 a una separación de 175
ACAGACAAAGCGTCCCTCAA
Claims (11)
1. Un procedimiento para proporcionar un
conjunto de sondas para una matriz para secuestrar un conjunto
deseado de objetivos en el que las sondas hibridan con sus objetivos
pretendidos pero no hibridan sustancialmente con objetivos no
pretendidos en una mezcla de muestra de objetivos pretendidos y
objetivos no pretendidos, que comprende las etapas de:
(a) determinar un conjunto de objetivos;
(b) determinar un objetivo actual en particular
de entre el conjunto de objetivos para sondear;
(c) elegir una subcadena de una secuencia del
objetivo actual y proporcionar su secuencia complementaria, que se
convierte en la sonda candidata;
(d) determinar que una sonda candidata
satisface cualquier criterio deseado o requerido para las
sondas;
(e) calcular la T_{m} para la sonda candidata
usando un modelo de hibridación;
(f) calcular sustancialmente todas las posibles
T_{m} de cruzamiento de la sonda candidata hibridando con todos
los objetivos no pretendidos, y hallar la Tm de cruzamiento
máximo;
(g) calcular la delta T_{m};
(h) determinar si la delta T_{m} es de al
menos 5°C; y
(i) repetir las etapas (b) hacia delante hasta
que se encuentren las sondas deseadas.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en
el que la elección de una subcadena de una secuencia se realiza
comenzando en un punto en particular del objetivo actual, y
cambiando después el punto de partida en una base en la dirección 3'
cada vez que se elige una nueva subcadena.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 en
el que la subcadena se elige aleatoriamente.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 en
el que la delta T_{m} es de al menos 20°C.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 en
el que la delta T_{m} es de al menos 10°C.
6. El procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que los objetivos son secuencias
de ADN o secuencias de ARN y las sondas son oligonucleótidos.
7. El procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el conjunto de sondas incluye 100
o más sondas.
8. El procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el conjunto de sondas incluye 1000
o más sondas.
9. El procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que cada sonda encontrada está
incluida en el conjunto de objetivos definido en la etapa (a) y
considerado repitiendo las etapas (b) hacia delante.
10. El procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, en el que las sondas se usan como
sondas de captura inmovilizadas.
11. Un sistema informático programado para
proporcionar las secuencias de un conjunto de sondas que hibridan
con sus objetivos pretendidos pero que no hibridan sustancialmente
con objetivos no pretendidos en una mezcla de muestra de objetivos
pretendidos y objetivos no pretendidos, en el que el sistema
informático programado ejecuta el procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9.
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