EP1896615A1 - Verfahren zum nachweis von nukleotidsequenzen, verwendung des verfahrens und testbesteck - Google Patents

Verfahren zum nachweis von nukleotidsequenzen, verwendung des verfahrens und testbesteck

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EP1896615A1
EP1896615A1 EP06777418A EP06777418A EP1896615A1 EP 1896615 A1 EP1896615 A1 EP 1896615A1 EP 06777418 A EP06777418 A EP 06777418A EP 06777418 A EP06777418 A EP 06777418A EP 1896615 A1 EP1896615 A1 EP 1896615A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotides
labeled
capture
amplicons
reaction chamber
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06777418A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Ehben
Christian Zilch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens AG
Original Assignee
Siemens AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Siemens AG filed Critical Siemens AG
Publication of EP1896615A1 publication Critical patent/EP1896615A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of nucleotide sequences, wherein the steps of reverse transcription and / or amplification, hybridization and detection are preferably carried out in one and the same reaction chamber.
  • These issues include e.g. the detection of a variation in the genome of an individual organism as part of genotyping. Examples of such variations are the rare point mutations in the genomic DNA or the more common point mutations at a single site of the genomic DNA (single nucleotide polymorphism, SNP). From an SNP is spoken according to the literature, if the respective mutation occurs in at least 1% of the organisms.
  • expression analysis i. the determination of the degree of activity (expression) of a gene in individual cells, tissue types or organisms.
  • microarrays In addition to the established analysis methods, such as gel electrophoresis or mass spectrometry, so-called microarrays have also been used for some years. Microarrays, sometimes referred to as “gene chips,” are the most important group of biochips.
  • sample nucleic acid sequence also refers to template nucleic acid sequence or target nucleic acid sequence
  • sample nucleic acid also refers to template nucleic acid or target nucleic acid.
  • sample preparation The sample to be analyzed (eg, blood, saliva, tissue, plant, etc.) rides suitable stor ⁇ , usually about its Anlagenrei nucleic acids to be determined ⁇ manuals and separate it from the hereafter, the determination interfering substances.
  • the Pro ⁇ ben DNA in the presence of a DNA polymerase the single four deoxyribonucleotides (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) and an oligonucleotide pair Subjected to cycles of defined temperature variations, which make it possible to carry out the individual steps of annealing, elongation and denaturation.
  • the oligonucleotide pair is usually prepared so that both oligonucleotides of the
  • Pair of about 15 to 30 deoxyribonucleotides are constructed, with their sequences chosen so that one of the two oligonucleotides complementary to the 5 'end of the sense DNA strand of the target nucleic acid sequence ("upstream”) and the other complementary to the 5 'end of the antisense DNA strand (“downstream”) of the target nucleic acid sequence.
  • the two oligonucleotides now each hybridize directly "upstream” and "downstream” of the target sequence.
  • the DNA polymerase eg Taq polymerase
  • the DNA polymerase supplements any oligonucleotide bound to the template DNA 5 'to 3' direction with incorporation of free deoxyribonucleotides in the sense of the template sequence.
  • This process initially goes beyond the end of the target sequence, so that single strands are formed, which conclude on the one hand with an oligonucleotide sequence and on the other side by the end of the template DNA are determined or with a by the duration of the amplification step certain nucleotide sequence from ⁇ conclude.
  • the amplified DNA single-stranded sequences thus present as double-stranded are called amplicons.
  • the number of amplicons doubles with each cycle, so that, for example, after 30 cycles per sample DNA, 2 30
  • the PCR protocol which sets the temperatures and the respective lengths of the PCR cycles, depends mainly on the length and sequence of the target sequence to be detected, the type of polymerase used, the concentrations of additives, e.g. Mg ions, DMSO, glycerol, etc. and the concentration of oligonucleotides in the PCR solution.
  • the target molecules eg, amplified DNA
  • molecular markers with which fe the presence or concentration of the relevant DNA molecules can be determined.
  • Optically active eg fluorescent
  • magnetic, electrochemical, biological or radioactive groups which are already linked to the oligonucleotide pairs are used as markers.
  • labeled amplicons can be obtained during the amplification by incorporation of already labeled free deoxyribonucleotides.
  • each primer pair requires specific constraints for optimal amplification efficiency (e.g., temperature, salinity, primer concentration, amplification solution composition, cycle timing). The more primer pairs contained in the solution, the greater will be the deviations of the actual amplification ratios from respective optimal reaction conditions for an increasing number of primer pairs. This leads to concentration differences between the different ones
  • RT Reverse transcription
  • the step of amplification is usually omitted, since here the cell-rich lent mRNA produced in the presence of free nucleotides deoxyribo- and is attributed to the enzyme reverse transcriptase in cDNA vice ⁇ .
  • the amount of cDNA obtained is often sufficient for the further steps.
  • the cDNA can also be amplified by means of PCR (so-called "RT-PCR").
  • labeled cDNA can be obtained in the course of reverse transcription by incorporation of already labeled free deoxyribonucleotides.
  • Labeling of amplified or cDNA is also possible in a separate step using a labeled probe.
  • This probe consists of a tagged oligonucleotide sequence that is complementary to a particular portion of the target sequence.
  • Hybridization The target molecules equipped with markers are contacted in a reaction chamber with hybridizable oligonucleotides immobilized on the inside thereof (capture oligonucleotide). After successful hybridization of a target molecule with a capture oligonucleotide, it comes to a place at the site of its immobilization
  • the signal acquisition can be inherently close to the surface. Due to the measuring method Rens signals of markers that are not bonded in the vicinity of the Substra ⁇ tes, not covered, for example in magnetic markers that affect only in the immediate vicinity of the substrate a homogeneous magnetic field, or in optical fluorescent molecules in the evanescent field. In using methods which do not allow inherent discrimination of the distance of the signal-generating label from the substrate, for example, fluorescence optical system with illumination of the entire reaction chamber usually washing steps, prior to signal detection is required, all markers are not coupled to the bottom plate ent ⁇ removed to the interfering background signal to minimize.
  • the signal detection can also be quantitative, which is indispensable for the expression analysis.
  • the intensity of the mission dimensional Sig ⁇ is thus a direct measure of the activity of a gene or gene section.
  • spots of different capture molecules can be arranged in a grid on one and the same carrier material in a known manner, so that a variety of different target nucleic acid sequences
  • oligonucleotide pairs or com ⁇ pairs of oligonucleotides can be determined simultaneously (in parallel).
  • the detected by various capture molecules sequences are thereby pletely different by degenerate oligonucleotide pairs or com ⁇ pairs of oligonucleotides during PCR amplitude-fied This is called multiplexing (see above Multiplexing).
  • multiplexing see above Multiplexing.
  • the number of pairs of oligonucleotides does not have to be exactly identical to the number of spots.
  • the capture molecules are kept at a distance from the array base plate by spacer molecules.
  • Hybridization occurs when a significant portion of the target sequence is that of the Capture sequence is complementary. In this case, there is a concentration of marker molecules near the spot in question.
  • Microarrays a ⁇ be set for different issues.
  • SNPs DNA section
  • one of the oligonucleotides must be designed so that its 3'-terminal base is complementary to the base on the original or wild-type sequence. Should a mismatch occur in the case of an SNP of this DNA sequence, the 3 'base and the complementary base on the target sequence can not bind to each other, and the DNA polymerase can not ultimately extend the oligonucleotide.
  • the signal emission as a result of a hybridization event is thus an indicator of the complete agreement of the oligonucleotide sequence with the corresponding site on the target DNA.
  • a genotyping can be performed by spots for each candidate genetic Varia ⁇ tion applies.
  • the melting temperatures of the spots vary, which can be detected by different signal emissions at different temperatures of the hybridization solution.
  • WO 01/34842 A2 a method for the analysis of PCR products on a biochip is described in which according to three types of primers are used: free labeled, free unlabeled and immobilized unlabeled scavenger primers.
  • the PCR produces labeled amplicons that are also extended on the capture primers.
  • WO 99/47701 A1 discloses a PCR method in which a single-stranded DNA molecule with a complementary primer is mixed. A second primer is complementary to the opposite strand of the DNA molecule. A third primer is immobilized and complementary to the sequence of the DNA molecule to be amplified.
  • EP 1 186 669 A1 a PCR method is described in which two free and one immobilized primer are used.
  • the functional range of the actual microarray described here is limited to the hybridization chamber required for the hybridization.
  • the steps of sample preparation (isolation of the nucleic acids and optionally the label) and the amplification take place outside the microarray and must be carried out manually.
  • the biochip in addition to the actual microarray, additionally contains microfluidic components that are used to integrate sample preparation, amplification, and labeling. This is the case, for example, with the "directif®” tablet form from November AG.
  • a large number of mechanical, fluidic and electrical components has to be integrated in a small space (“lab-on-a-chip"), which leads to high costs for the biochips, which are usually only used once.
  • the function of such an integrated, miniaturized overall system is very demanding due to its high complexity.
  • One of the main problems of the concept of micro-array is the number of individual process steps, the required pre ⁇ cision and the amount of equipment with which they must be performed.
  • the individual steps require special equipment, experience and knowledge and often provide a limiting factor for the reproducibility of the overall results of a microarray experiment.
  • a displacement ⁇ len transfer of the microarray concept from research to the diagnostic routine is this circumstance contrary.
  • the invention has for its object to establish a method for performing a microarray, which avoids the known from the prior art disadvantages.
  • the present invention is characterized by the following inde ⁇ dependent claims.
  • Preferred patentsfor ⁇ men are the subject of the dependent claims or subsequently be ⁇ written .
  • non-labeled oligonucleotides the reaction chamber of the microarray, each with the target nucleotide sequence hybridized ⁇ matable unmarked free, ie non-immobilized, oligonucleotides (hereinafter referred to as "non-labeled oligonucleotides" for short),
  • labeled oligonucleotides ge ⁇ Nannt
  • Non-labeled and immobilized oligonucleotides bound to the chamber walls of the reaction chamber or to another carrier material hereinafter referred to as "capture oligonucleotides” for short.
  • the above oligonucleotides preferably consist of 5 to 100 and especially from 10 to 30 or even only 15 to 25 nucleotides.
  • the number of nucleobases is not particularly critical, so that they can alternatively be composed of longer nucleic acid sequences.
  • the number of unlabelled oligonucleotides is greater than the sum of labeled ones
  • Oligonucleotides and capture oligonucleotides serve as the starter nachfol ⁇ constricting primer extension to form first amplicons during the first cycle at the marked and capture the Oligonukleoti-.
  • the ratio Zvi ⁇ rule unlabelled sense and antisense primers for each case a specific target sequence may be the entire area between the extreme cases "Only Sense” or just “antisense Only” are varied. This determines the degree of asymmetric asymmetry of the PCR. The higher the concentra ⁇ onsunter defencee of the non-labeled sense and antisense primers, the less the formation of double-stranded, free formed in solution amplicons. This dampens the reaction and results in a linear process because the avalanche nature of the reaction is less pronounced.
  • the primers bound to the markers are extended by means of PCR or primer extension.
  • the marker is thus immobilized according to the invention to a carrier material and can be detected with the above genann ⁇ th methods.
  • PCR multiplex reaction can be performed.
  • the multiplex degree ie the number un- ter Kunststoffmaschinemaschinen in a reaction
  • concentration ratio of non-labeled sense and antisense primers in relation to korrespondie ⁇ leaders labeled primers (Ex. Oligonucleotides to a magnetic bead)
  • all labeled sense primers are located on a bulky marker
  • Hybridization steps can be inventively after every ⁇ the PCR cycle perform when first Hybridleiterse- reignisse labeled amplicons can be expected. So he ⁇ holds a statement about the dynamic hybridization behavior by comparing detection signals of successive PCR cycles together. This provides control over whether the amplification is in an early amplification range or in saturation, and achieves much better quantification of the measurement results. In addition, this gives you a termination criterion for the entire process. A hybridization step, an amplification step to connect then possibly nachfol ⁇ quietly again.
  • the high content of unlabeled oligonucleotides and the comparatively lower required concentration of labeled oligonucleotides in the reaction solution make the use of large marker groups, e.g. magnetic beads in small reaction chambers too.
  • the invention also makes it possible the reaction solution during the process (I) to (III) no additional Reagan ⁇ zi supply. All reagents required for the reaction can thus be either premixed or stored dry in the reaction chamber.
  • the read-out should be close to the surface in the sense of the invention, since the advantage of simple fluidics is thus fully realized by eliminating washing steps.
  • the microarray or write-introduction loading in ⁇ described that there can described method can be used, reduction of the advance ⁇ that the method further comprises the features of the present invention.
  • the amplification step may be dispensed with entirely the advertising when a sufficient amount of mRNA is located in the sample before ⁇ , the step of amplifying through a re- verse transcription, the mRNA translated into cDNA with the simultaneous marking is.
  • the invention thus further relates to the presence of labeled oligo (T) nucleotides and the use of reverse transcriptase.
  • the capture oligonucleotides must u. Be chosen correspondingly extended in order to achieve he ⁇ desired hybridization and are so typically be from 20 to 100, preferably from 20 to 50 nucleobases be ⁇ .
  • the method according to the invention can be used in all fields in which nucleic acid analyzes are carried out, such. B. in medical, forensic, food and environmental analysis, in plant protection, veterinary medicine or in general in life science research.
  • Hybridizations between formed of labeled oligonucleotides and capture oligonucleotides elongated oligonucleotides according to the invention initiated by a PCR Zykluss will remain at a temperature above the denaturation Tem ⁇ hybridization temperature after the completion of denaturation ( Figure 6). This does not lead to a fixed connection of still free oligonucleotides to the respective complementary sites of the amplicons. In contrast, the capture amplicons formed on the reaction chamber wall or otherwise immobilized from the PCR now hybridize with their complementary, labeled amplicon from the reaction solution.
  • the hybridization remains stable even under the prevailing temperature, which is higher than the annealing temperature.
  • the prevailing temperature should therefore be above the melting temperature ⁇ the relatively short primer and below the melting temperature of the relatively long amplicons.
  • FIGS 1 to 6 illustrate the schematic course of the method.
  • the target sequence (SO) is limited by the sequences Sl and S2, wherein in general Sl or S2 may also still be part of the target sequence.
  • the respective complementary sequences are indicated by "S0-overline”, “Sl-overline” or “S2-overline”. In the following text these are referred to as SO *, Sl * and S2 *.
  • FIG. 1 represents the beginning of the PCR reaction, in which case the immobilized (with the sequence S1) and labeled oligonucleotides (with the sequence S2) can be present in a much lower concentration than the non-marmerous labeled oligonucleotides (Sl * and S2). They will therefore undergo amplification first of all with the target sequence (SO) or (SO *) or (S1 + S0 + S2) or (Sl * + S0 * + S2 *).
  • Figure 2 shows the course of a PCR reaction, which until then mainly generated only amplicons, which claimed the predominant non-labeled oligonucleotides (Sl * and S2).
  • Figure 4 shows the fully extended amplicons from ⁇ Fi gur. 3
  • Figure 5 shows by e.g. Temperature increase initiated division of the double strands generated in Figure 4 in its two single strands (amplicons).
  • FIG. 6 shows the hybridization according to the invention between the resulting labeled and capture amplicons from FIG. 5.
  • the unlabeled oligonucleotides dissolved in higher concentration compete with the labeled ones, this should not hinder a sufficient hybridization of labeled oligonucleotides, since the Density of the capture amplicons formed there is so high that it comes in un ⁇ indirect proximity of the spot to a decrease in concentration of amplicons and therefore a saturation of the capture of the spot is not the limiting factor in the hybridization with labeled amplicons.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleotidsequenzen unter Verwendung von nicht markierten, freien Oligonukleotiden, markierten, freien und hybridisierbaren Oligonukleotiden und nicht markierten und immobilisierten Oligonukleotiden.

Description

Beschreibung
Verfahren zum Nachweis von Nukleotidsequenzen, Verwendung des Verfahrens und Testbesteck
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleotidsequenzen, wobei die Schritte der reversen Transkription und / oder Amplifikation, Hybridisierung und Detektion vorzugsweise in ein und derselben Reaktionskammer durchgeführt werden.
In den letzten Jahren haben Fortschritte in der Molekularbiologie sowie der Abschluss des HUGO-Projektes und damit die komplette Erfassung der Basenfolge der menschlichen DNA zu neuen Fragestellungen geführt, die in der biologischen Grundlagenforschung, in der Medizin und bei der Entwicklung von Medikamenten routinemäßig bearbeitet werden.
Zu diesen Fragestellungen gehört z.B. die Detektion einer Va- riation im Erbgut eines individuellen Organismus im Rahmen einer Genotypisierung. Beispiele für derartige Variationen sind die seltenen Punktmutationen in der genomischen DNA oder die häufigeren Punktmutationen an einer einzelnen Stelle der genomischen DNA (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) . Von einer SNP wird der Literatur nach gesprochen, wenn die jeweilige Mutation in mindestens 1% der Organismen auftritt. Ein anderes Anwendungsgebiet ist die Expressionsanalyse, d.h. die Bestimmung des Grades der Aktivität (Expression) eines Gens in individuellen Zellen, Gewebetypen oder Organismen.
Beide Disziplinen führen zu Erkenntnissen über Funktionen, Störungen und Krankheiten von Organen und Geweben und werden häufig zur Bestimmung von Infektionskrankheiten oder in der Onkologie, z.B. zur Gewebetypisierung angewendet. Allgemein können diese Methoden überall dort zum Einsatz kommen, wo geeignete hybridisierbare Moleküle, wie z.B. Nukleinsäuren, be¬ stimmt werden sollen. So umfasst das Gebiet der Anwendungen nicht nur die Humanmedizin oder Tiermedizin, sondern auch die forensische Diagnostik, die Umwelt- und Lebensmit¬ telanalytik oder den Pflanzenschutz.
Neben den etablierten Analyseverfahren, wie z.B. der GeIe- lektrophorese oder Massenspektrometrie, kommen hierfür seit einigen Jahren auch so genannte Mikroarrays zum Einsatz. Mik- roarrays, manchmal auch als "Genchips" bezeichnet, sind die bedeutendste Gruppe der Biochips .
In einem Mikroarray kommt es zu chemischen Wechselwirkungen zwischen einer unbekannten Probensubstanz und bekannten Referenzsubstanzen. Durch die Auswahl geeigneter Referenzsubstanzen und die Beobachtung des Verlaufs und der Ergebnisse der Wechselwirkungen lassen sich Erkenntnisse über die unbekannte Probensubstanz erzielen. Als Referenzsubstanzen werden auf den Innenflächen der Reaktionskammern der Mikroarrays immobilisierte einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle verwendet (Fän- ger-Oligonukleotide) , die komplementär zu den zu detek- tierenden Probenukleinsäuremolekülen sind. Im Nachfolgenden bezieht sich der Begriff Probennukleinsäuresequenz auch auf Templatnukleinsäuresequenz oder Zielnukleinsäuresequenz und der Begriff Probennukleinsäure auch auf Templatnukleinsäure oder Zielnukleinsäure .
Der Ablauf eines Experimentes mit Mikroarrays besteht meist aus folgenden Schritten:
(1) Probenvorbereitung
(2) a) Amplifikation der Zielsequenz (en) , ggf. einschließlich
Markierung und/oder b) reverse Transkription der Zielsequenz (en) , ggf. einschließlich Markierung
(3) soweit unter (2) keine Markierung erfolgt ist, ggf. zusätzliche Markierung der in (2) erhaltenen Amplikons
(4) Hybridisierung der in (2) und/oder (3) erhaltenen ggf. markierten Amplikons mit unmarkierten Fänger-Oligo- nukleotiden und
(5) Detektion der in (4) entstandenen markierten Hybridmoleküle . Nachfolgend ist das Verfahren kurz detaillierter beschrieben:
(1) Probenvorbereitung: Die zu analysierende Probe (z.B. Blut, Speichel, Gewebe, Pflanzen etc.) wird geeignet aufbe¬ reitet, i.d.R. um deren zu bestimmende Nukleinsäuren anzurei¬ chern und sie von den im Nachfolgenden, die Bestimmung störenden Substanzen abzutrennen.
(2a) Amplifikation : Üblicherweise liegen die zu untersuchenden Nukleinsäuresequenzen nur in wenigen Kopien in einer Zelle vor und müssen daher zuerst vervielfacht werden. Dies ge¬ schieht häufig mit der Polymerasekettenreaktion ("Polymerase chain reaction", PCR) oder anderen dem Fachmann bekannten Verfahren.
Um eine bestimmte DNA-Sequenz im Sinne der allgemein gängigen PCR-Methode aus einer Probe zu vervielfachen, wird die Pro¬ ben-DNA in Gegenwart einer DNA-Polymerase, den einzelnen vier Deoxyribonukleotiden (dATP, dGTP, dCTP und dTTP) und einem Oligonukleotidpaar Zyklen von definierten Temperaturschwankungen unterworfen, die es ermöglichen, die einzelnen Schritte des Annealing (Anlagerung) , der Elongation (Verlängerung) und der Denaturierung auszuführen. Das Oligonukleotidpaar wird i.d.R. so hergestellt, dass beide Oligonukleotide des
Paares aus ca. 15 bis 30 Deoxyribonukleotiden aufgebaut sind, wobei ihre Sequenzen so gewählt sind, dass einer der beiden Oligonukleotide komplementär zu dem 5 ' -Ende des Sense-DNA- Stranges der Zielnukleinsäuresequenz ("upstream") und der an- dere komplementär zu dem 5 ' -Ende des Antisense-DNA-Stranges ( "downstream" ) der Zielnukleinsäuresequenz ist.
Beim Annealing hybridisieren nun die beiden Oligonukleotide jeweils unmittelbar "upstream" und "downstream" der Zielse- quenz .
Bei der Elongation ergänzt die DNA-Polymerase (z.B. Taq-Poly- merase) jedes an die Template-DNA gebundene Oligonukleotid in 5'- nach 3'- Richtung unter Einbau freier Deoxyribonukleotide im Sinne der Templatesequenz . Dieser Vorgang geht zunächst über das Ende der Zielsequenz hinaus, so dass Einzelstränge entstehen, die auf der einen Seite mit einer Oligonukleotid- sequenz abschließen und auf der anderen Seite durch das Ende der Template-DNA bestimmt sind bzw. mit einer durch die Dauer des Amplifikationsschrittes bestimmten Nukleotidsequenz ab¬ schließen. Die so als Doppelstrang vorliegenden amplifizier- ten DNA-Einzelstrangsequenzen nennt man Amplikons .
Danach folgt eine weitere Denaturierung, und es beginnt ein erneuter PCR-Zyklus, d.h. Teilung des im vorhergehenden Schritt erhaltenen DNA-Doppelstranges und die Anlagerung von Oligonukleotiden "upstream" und "downstream" der Zielsequenz. Die folgende Elongation ist nun schon zum Teil durch die Länge des Überhangs begrenzt, und es entstehen Amplikons mit beidseitig endständigen Oligonukleotiden.
Während der weiteren Zyklen wird der Anteil der Amplikons mit beidseitig endständigen Oligonukleotiden prävalent gegenüber denen, die nicht auf beiden Seiten bündig mit den Oligonukle- otidsequenzen abschließen.
Idealerweise verdoppelt sich mit jedem Zyklus die Anzahl der Amplikons, so dass z.B. nach 30 Zyklen pro Proben-DNA 230
Amplikons zur Verfügung stehen. Diese hohe Anzahl ist für die anschließende Hybridisierungsreaktion typischerweise ausrei¬ chend.
Das PCR-Protokoll, das die Temperaturen und die jeweiligen Zeitdauern der PCR-Zyklen festlegt, hängt hauptsächlich von der Länge und der Sequenz der zu detektierenden Zielsequenz, der Art der verwendeten Polymerase, den Konzentrationen von Additiven, wie z.B. Mg-Ionen, DMSO, Glycerin usw. und der Konzentration der Oligonukleotiden in der PCR-Lösung ab.
In den meisten Fällen werden die Zielmoleküle (z. B. amplifi- zierte DNA) mit molekularen Markern gekoppelt, mit deren HiI- fe das Vorhandensein oder die Konzentration der relevanten DNA-Moleküle bestimmt werden können. Als Marker werden bevorzugt optisch aktive (z. B. fluoreszierende), magnetische, e- lektrochemische, biologische oder radioaktive Gruppen einge- setzt, die bereits mit den Oligonukleotidpaaren verknüpft sind. Es ist auch bekannt, dass sich im Zuge der Amplifika- tion durch Einbau von bereits markierten freien Deoxyribo- nukleotiden markierte Amplikons erhalten lassen.
Im Zuge der Amplifizierung können nicht nur eine, sondern auch mehrere Zielsequenzen aus der Probe amplifiziert werden. Hierzu verwendet man in der Amplifikationslösung Primer für diese verschiedenen Zielsequenzen. Die Amplifikationen dieser Zielsequenzen laufen dabei simultan ab. Dieses Multiplexing ist jedoch häufig auf eine kleine Anzahl von Zielsequenzen (Kanäle; Multiplexgrad) limitiert. Hauptsächlich ist diese Limitierung dadurch bedingt, dass jedes Primerpaar für eine optimale Amplifikationseffizienz spezifische Randbedingungen benötigt (z.B. Temperatur, Salzgehalt, Primerkonzentration, Zusammensetzung der Amplifikationslösung, Zyklus-Timing) . Je mehr Primerpaare in der Lösung enthalten sind, desto größer werden für eine zunehmende Anzahl von Primerpaaren die Abweichungen der tatsächlichen Verhältnisse der Amplifikation von jeweiligen optimalen Reaktionsbedingungen. Dadurch kommt es zu Konzentrationsunterschieden zwischen den verschiedenen
PCR-Produkten (Amplikons) , die sich mit jedem PCR-Zyklus ver¬ stärken. Diese signifikanten Konzentrationsunterschiede bei den PCR-Produkten bei Abschluss der Reaktion erschweren die nachfolgende Hybridisierung erheblich, da sie dazu führen, dass die Signalintensität bei der Hybridisierung nicht reprä¬ sentativ für die Konzentration der entsprechenden zu untersuchenden Zielsequenzen ist. Die Fehlerhaftigkeit der Signal¬ emission kann sogar so weit führen, dass die Signalintensitä¬ ten den dynamischen Meßbereich der Detektion übersteigen und die Erfassung einzelner Zielsequenzen erschweren.
(2b) Reverse Transkription (RT) : Hier entfällt meist der Schritt der Amplifikation, da hier die von der Zelle reich- lieh produzierte mRNA in Gegenwart von freien Desoxyribo- nukleotiden und dem Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umge¬ schrieben wird. Die Menge der erhaltenen cDNA ist oftmals ausreichend für die weiteren Schritte. Gegebenenfalls kann weiterhin aber die cDNA auch mittels PCR amplifiziert werden (sog. "RT-PCR") .
Es ist auch hier bekannt, dass sich im Zuge der reversen Transkription durch Einbau von bereits markierten freien Deo- xyribonukleotiden, markierte cDNA erhalten läßt.
(3) Markierung: Eine Markierung von amplifizierter oder cDNA ist auch in einem gesonderten Schritt mittels einer markierten Sonde möglich. Diese Sonde besteht aus einer mit einem Marker versehenen Oligonukleotidsequenz, die zu einem bestimmten Abschnitt der Zielsequenz komplementär ist.
Die DE 198 14 001 Al beschreibt z. B. ein solches Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure durch Amplifikation eines Teilstückes der Zielsequenz mittels zweier Oligonukleotide in Anwesenheit einer Sonde mit verknüpfter Reporter- und Quen- chergruppe, womit nach erfolgreicher Hybridisierung ein Signal gemessen werden kann.
(4) Hybridisierung: Die mit Markern ausgestatteten Zielmoleküle werden in einer Reaktionskammer mit an deren Innenseite immobilisierten hybridisierbaren Oligonukleotiden (Fänger- Oligonukleotid) in Kontakt gebracht. Nach einer erfolgten Hybridisierung eines Zielmoleküls mit einem Fänger-Oligo- nukleotid kommt es am Ort seiner Immobilisierung zu einer
Häufung von Markern, deren Signalemission spezifisch für ein Bindungsereignis ist. So lässt eine hohe Signalstärke auf ei¬ ne hohe Konzentration eines Zielmoleküls und damit auf die An- oder Abwesenheit z.B. eines SNPs oder einen hohen Akti- vierungsgrad eines bestimmten Gens im Gewebe schließen.
(5) Detektion: Die Signalerfassung kann einmal inhärent oberflächennah erfolgen. Hierbei werden aufgrund des Messverfah- rens Signale von Markern, die nicht in der Nähe des Substra¬ tes gebunden sind, nicht erfasst, z.B. bei magnetischen Markern, die nur in unmittelbarer Substratnähe ein homogenes Magnetfeld beeinflussen, oder bei fluoreszierenden Molekülen im evaneszenten optischen Feld. Bei Verwendung von Verfahren, die keine inhärente Diskriminierung der Entfernung der signalgebenden Marker vom Substrat zulassen, z.B. Fluoreszenzoptik mit Durchleuchtung der gesamten Reaktionskammer, sind vor der Signaldetektion üblicherweise Waschschritte erforderlich, die alle nicht an die Bodenplatte gekoppelten Marker ent¬ fernt, um das störende Hintergrundsignal zu minimieren. Die Signaldetektion kann auch quantitativ erfolgen, was für die Expressionsanalyse unverzichtbar ist. Die Intensität der Sig¬ nalemission stellt somit ein direktes Maß für die Aktivität eines Gens oder Genabschnittes dar.
Bei typischen Mikroarrays können auf ein und demselben Trägermaterial in bekannter Weise Spots von unterschiedlichen Fängermolekülen in einem Raster angeordnet sein, so dass eine Vielfalt von unterschiedlichen Zielnukleinsäuresequenzen
(z.B. DNA oder mRNA) gleichzeitig (parallel) bestimmt werden kann. Je höher der Grad der Parallelisierung der Untersuchungen, die mit einem Array durchgeführt werden sollen, desto höher ist die erforderliche Anzahl verschiedener Spots. Die durch verschiedene Fängermoleküle nachzuweisenden Sequenzen werden dabei durch degenerierte Oligonukleotidpaare oder kom¬ plett verschiedene Oligonukleotidpaare während der PCR ampli- fiziert Dies nennt man Multiplexing (siehe oben Multiplexing) . Die Anzahl der Oligonukleotidpaare muss allerdings nicht ge- nau mit der Anzahl der Spots identisch sein. So kann es z.B. verschiedene Spots mit identischen Fängern geben, die durch ihre Redundanz die Sicherheit des Untersuchungsergebnisses verbessern .
Um räumliche Inhibition der Hybridisierung zu vermeiden, werden die Fängermoleküle durch Spacermoleküle auf Distanz zur Array-Bodenplatte gehalten. Eine Hybridisierung findet dann statt, wenn ein signifikanter Teil der Zielsequenz zu dem der Fängersequenz komplementär ist. In diesem Falle kommt es zu einer Konzentration von Markermolekülen in der Nähe des betreffenden Spots.
Mikroarrays werden für unterschiedliche Fragestellungen ein¬ gesetzt. Beim Genotyping werden z.B. Unterschiede einzelner Basen auf einem sonst identischen DNA-Abschnitt (SNPs) be¬ stimmt. In diesem Falle muss eines der Oligonukleotide so konzipiert sein, dass dessen 3 '-terminale Base komplementär zur Base auf der Original- bzw. Wildtypsequenz ist. Sollte nun im Falle eines SNPs dieser DNA-Sequenz ein 'Mismatch' auftreten, können die 3 '-Base und die dazu komplementäre Base auf der Zielsequenz keine Bindung eingehen und die DNA-PoIy- merase kann schließlich das Oligonukleotid nicht verlängern. Es entstehen also keine Amplikons, die mit den Fängeroligo- nukleotiden hybridisieren könnten und es kommt so zu einem Ausbleiben einer Signalemission. Die Signalemission als Folge eines Hybridisierungsereignisses ist also ein Indikator für die vollständige Übereinstimmung der Oligonukleotidsequenz mit der entsprechenden Stelle auf der Ziel-DNA.
Alternativ hierzu kann ein Genotyping durchgeführt werden, indem man Spots für jede in Frage kommende genetische Varia¬ tion aufbringt. Je nachdem, welche Variation in der Probe vorliegt, variieren die Schmelztemperaturen der Spots, was sich durch unterschiedlich starke Signalemissionen bei verschiedenen Temperaturen der Hybridisierungslösung erfassen lässt .
In der WO 01/34842 A2 ist ein Verfahren zur Analyse von PCR- Produkten auf einem Biochip beschrieben, bei welchem gemäß drei Primertypen verwendet werden: freie markiert, freie nicht-markierte sowie immobilisierte nicht-markierte Fänger- Primer. Bei der PCR entstehen markierte Amplikons, die auch an den Fänger-Primern verlängert werden.
Die WO 99/47701 Al offenbart ein PCR-Verfahren, bei dem ein einzelsträngiges DNA-Molekül mit einem komplementären Primer vermischt wird. Ein zweiter Primer ist komplementär zu Gegenstrang des DNA-Moleküls. Ein dritter Primer ist immobilisiert und komplementär zu der zu amplifizierenden Sequenz des DNA- Moleküls .
In der EP 1 186 669 Al ist ein PCR-Verfahren beschrieben, bei dem zwei freie und ein immobilisierter Primer verwendet werden .
Nach dem Stand der Technik beschränkt sich der hier beschriebene Funktionsumfang des eigentlichen Mikroarrays auf die für die Hybridisierung erforderliche Hybridisierungskammer . Die Schritte der Probenvorbereitung (Isolation der Nukleinsäuren und ggf. die Markierung) und der Amplifikation finden außer- halb des Mikroarrays statt und müssen manuell durchgeführt werden .
Bei einigen Konzepten beinhaltet der Biochip neben dem eigentlichen Mikroarray zusätzlich mikrofluidische Komponenten, die der Integration von Probenvorbereitung, Amplifikation und Markierung dienen. Dies ist z.B. bei der "directif®"-Platt- form der November AG gegeben. Hierbei muss eine Vielzahl von mechanischen, fluidischen und elektrischen Komponenten auf engem Raum integriert werden ( "Lab-on-a-Chip" ) , was zu hohen Kosten der meist nur einmal verwendbaren Biochips führt. Zu¬ dem ist die Funktion eines solchen integrierten, miniaturisierten Gesamtsystems aufgrund der hohen Komplexität sehr anspruchsvoll.
Einige Konzepte verzichten zur Vereinfachung des Gesamtpro¬ zesses auf eine Markierung der Zielmoleküle. Diese Verfahren kommen wegen ihrer geringen Sensitivität allerdings nicht für die Methode der Expressionsanalyse in Frage.
Da alle bisher bekannten Biochipplattformen die einzelnen
Prozessschritte sequentiell und in unterschiedlichen Reakti¬ onskammern durchführen, lassen sich einzelne Schritte nicht während ihres Ablaufes verfolgen und kontrollieren. So muss z.B. die Amplifikation immer bis zum Ende durchgeführt werden und kann nicht zu einem geeigneten früheren Zeitpunkt terminiert werden.
Eines der Hauptprobleme des Konzeptes von Mikroarrays ist die Anzahl der einzelnen Prozessschritte, die erforderliche Prä¬ zision und der Geräteaufwand, mit der sie durchgeführt werden müssen. Die Einzelschritte erfordern spezielle Ausstattung, Erfahrung und Kenntnisse und stellen häufig einen begrenzenden Faktor für die Reproduzierbarkeit des Gesamtergebnisses eines Mikroarray-Experimentes dar. Vor allem einem potentiel¬ len Transfer des Mikroarraykonzeptes von der Forschung in die diagnostische Routine steht dieser Umstand entgegen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Durchführung eines Mikroarrays zu etablieren, das die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile vermeidet.
Die vorliegende Erfindung ist durch die nachfolgenden unab¬ hängigen Ansprüche gekennzeichnet. Bevorzugte Ausführungsfor¬ men sind Gegenstand der Unteransprüche oder nachfolgend be¬ schrieben .
Nach der vorliegenden Erfindung findet die
(I) Amplifikation der Zielmoleküle,
(II) die Hybridisierung und die
(III) Detektion vorzugsweise in ein und derselben Reaktionskammer statt.
Dadurch wird ein hoher Grad an Systemintegration ermöglicht und die Prozessintegration führt zu geringeren Anfälligkeiten des Gesamtprozesses gegenüber Schwankungen der Einzelpro¬ zesse .
Vor Beginn der Amplifikation weist die Reaktionskammer des Mikroarrays, jeweils mit der Ziel-Nukleotidsequenz hybridi¬ sierbare - nicht markierte freie, d. h. nicht immobilisierte, Oligo- nukleotide (nachfolgend hier kurz „nicht-markierte Oligo- nukleotide" genannt) ,
- markierte, freie, d. h. nicht immobilisierte Oligonukleo- tide (nachfolgend hier kurz „markierte Oligonukleotide" ge¬ nannt) und
- an die Kammerwände der Reaktionskammer oder an ein anderes Trägermaterial gebundene nicht-markierte und immobilisierte Oligonukleotide (nachfolgend hier kurz „Fänger-Oligonukleo- tide" genannt) auf.
Die obigen Oligonukleotide bestehen vorzugsweise aus 5 bis 100 und insbesondere aus 10 bis 30 oder auch nur 15 bis 25 Nukleotiden. Für die Fänger-Oligonukleotide ist die Anzahl der Nukleobasen nicht besonders entscheidend, so dass diese alternativ auch aus längeren Nukleinsäuresequenzen aufgebaut sein können.
Vorzugsweise ist die Anzahl der nicht-markierten Oligonukleo- tiden übersteigt größer als dabei die Summe aus markierten
Oligonukleotiden und Fänger-Oligonukleotiden . Die nicht-markierten Oligonukleotidpaare dienen als Starter der nachfol¬ genden Primer-Extension zur Bildung erster Amplikons während der ersten Zyklen an den markierten und Fänger-Oligonukleoti- den.
Es kommen in der Lösung sowohl Sense- als auch Antisense-Pri- mer für eine bestimmte Zielsequenz vor. Das Verhältnis zwi¬ schen nicht-markierten Sense- und Antisense-Primern für je- weils eine bestimmte Zielsequenz kann im gesamten Bereich zwischen den Extremfällen „Nur Sense" oder nur „Nur Anti- sense" variiert werden. Hierdurch wird der Grad der asymetri- schenAsymmetrie der PCR bestimmt. Je höher die Konzentrati¬ onsunterschiede der nicht-markierten Sense- und Antisense- Primer, desto geringer ist die Bildung doppelsträngiger, frei in Lösung gebildeter Amplikons. Die Reaktion wird dadurch gedämpft, und es kommt zu einem linearen Prozessverlauf, da der Lawinencharakter der Reaktion weniger ausgeprägt ist. (Über- gang einer exponentiellen Amplikonbildung in eine Lineare) Diese Dämpfung und Linearisierung begünstigt die PCR-Multip- lexfähigkeit der Amplifikation, da es nicht zu lawinenartig fortpflanzenden Konzentrationsdifferenzen verschiedener Ziel- Sequenzen kommt. Eine weitere die PCR-Multiplexfähigkeit der Amplifikation begünstigende Wirkung der Asymmetrie ist das im Extremfall vollständige Fehlen unmarkierter Amplikons, die durch ihre eigene Hybridisierung die des markierten Amplikons inhibieren. Eine dritte die PCR-Multiplexfähigkeit der Ampli- fikation begünstigende Wirkung der Asymmetrie ist die mit dem Grad der Asymmetrie zunehmende Abhängigkeit des Reaktionsver¬ laufes von der Elongation markierter Primer. Diese wird begrenzt durch die Einschränkung der Diffusionsbewegung dieser Primer, die durch Masse und Volumen vor allem großer Marker, z.B. magnetischer Beads, bewirkt wird.
Erfindungsgemäß werden die an die Marker gebundenen Primer (markierte Oligonukleotide) mittels PCR oder Primer-Extension verlängert. Dies führt zu einem Einzelstrang, der im nachfol- genden mit einem zu ihm komplementären und an einer Trägeroberfläche immobilisierten Strang, gebildet aus einer weite¬ ren PCR-Reaktion oder Primer-Extension, hybridisiert und so als funktionaler Spacer (Brücke) zwischen dem Marker und der Trägeroberfläche wirkt. Der Marker wird somit erfindungsgemäß an ein Trägermaterial immobilisiert und kann mit oben genann¬ ten Methoden detektiert werden.
Zusätzlich kann durch die Wahl unterschiedlicher Primerpaare (Sense- und Antisense-Primer) eine PCR-Multiplex-Reaktion durchgeführt werden. Der Multiplex-Grad (d.h. die Anzahl un- terschiedlicher PCR-Produkte in einer Reaktion) wird durch ein unausgewogenes Konzentrationsverhältnis nicht-markierter Sense- und Antisense-Primer im Verhältnis zum korrespondie¬ renden markierten Primern (Bsp. Oligonukleotide an einem magnetischen Bead) begünstigt. Befinden sich sämtliche markier- ten Sense-Primer beispielsweise an einem voluminösen Marker
(Bsp. Bead-Träger) und der Antisense-Primer liegt frei in Lösung vor, so geht die PCR nach Elongation der meisten gebundenen Primer zunehmend in die lineare Amplifikationsphase . Die Konzentrationsunterschiede der gebildeten Amplikons einer jeden Sequenz sind dann nicht so hoch als bei einer konventi¬ oneller PCR-Multiplex-Reaktion, so dass bei der nachfolgenden Hybridisierung eine wesentlich größere Anzahl verschiedener Sequenzen mit immobilisierten Oligonukleotiden nachgewiesen werden könne
Hybridisierungsschritte lassen sich erfindungsgemäß nach je¬ dem PCR-Zyklus durchführen, sobald erste Hybridisierungse- reignisse markierter Amplikons erwartet werden können. So er¬ hält man eine Aussage über das dynamische Hybridisierungs- verhalten, indem man Detektionssignale aufeinanderfolgender PCR-Zyklen miteinander vergleicht. Dadurch hat man Kontrolle darüber, ob sich die Amplifikation in einem frühen Amplifika- tionsbereich oder in der Sättigung befindet und erreicht eine wesentlich bessere Quantifizierung der Messergebnisse. Außerdem erhält man dadurch ein Abbruchkriterium für den gesamten Prozess. Einem Hybridisierungsschritt kann dann ggf. nachfol¬ gend wieder ein Amplifikationsschritt angeschlossen werden.
Weiterhin lässt die Erfindung durch den hohen Anteil nichtmarkierter Oligonukleotiden und die im Vergleich geringere erforderliche Konzentration markierter Oligonukleotiden in der Reaktionslösung den Einsatz großer Markergruppen, wie z.B. magnetischer Beads in kleinen Reaktionskammern zu.
Die Erfindung macht es auch möglich, der Reaktionslösung während des Prozesses (I) bis (III) keine zusätzlichen Reagen¬ zien zuzuführen. Alle zur Reaktion benötigten Reagenzien kön- nen somit entweder vorgemischt oder in der Reaktionskammer trocken gelagert vorliegen.
Das Auslesen sollte im Sinne der Erfindung oberflächennah geschehen, da so durch das Entfallen von Waschschritten der Vorteil der einfachen Fluidik voll zur Geltung kommt.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können die in der Be¬ schreibungseinleitung beschriebenen Mikroarrays bzw. das dort beschriebene Verfahren eingesetzt werden, unter der Voraus¬ setzung, dass das Verfahren weiter die Merkmale der vorliegenden Erfindung aufweist.
In der Ausführungsform der Erfindung, wonach diese zur Expressionsanalyse bestimmter Gene eingesetzt wird, können im Wesentlichen zwei Verfahren eingesetzt werden.
(1) Durch Vorlagerung des Schrittes der reversen Transkrip- tion vor die Amplifikation (z.B. durch RT-PCR) kann das erfindungsgemäße Verfahren wie oben ausgeführt übernommen wer¬ den .
(2) Auf den Amplifikationsschritt kann ganz verzichtet wer- den, wenn eine ausreichende Menge an mRNA in der Probe vor¬ liegt, dann wird der Schritt der Amplifikation durch eine re- verse Transkription, die die mRNA in cDNA unter gleichzeitiger Markierung übersetzt.
Gegenstand der Erfindung ist somit weiterhin die Gegenwart von markierten Oligo (T) -Nukleotiden und der Einsatz von Reverser Transkriptase . Die Fänger-Oligonukleotide müssen dabei u. U. entsprechend verlängert gewählt werden, um die er¬ wünschte Hybridisierung zu erzielen und werden so typischer- weise aus 20 bis 100, bevorzugt aus 20 bis 50 Nukleobasen be¬ stehen .
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf allen Gebieten, auf denen Nukleinsäureanalysen betrieben werden, angewandt werden wie z. B. in der medizinischen, forensischen, Lebensmittel- und Umweltanalytik, im Pflanzenschutz, der Tiermedizin oder allgemein in der Life Science Forschung.
Da die PCR einleitend überwiegend mit unmarkierten Oligo- nukleotiden stattfindet, entstehen so unmarkierte Amplikons (Figur 1) . Da im Laufe der PCR-Zyklen die Konzentration nicht-markierter Oligonukleotide abnimmt, kommt es in zuneh¬ mendem Maße zu Annealing- (Figur 3), Elongations- (Figur 4) und Denaturierungsvorgängen (Figur 5) unter Beteiligung von markierten Oligonukleotiden und von Fänger-Oligonukleotiden .
Hybridisierungen zwischen von markierten Oligonukleotiden und von Fänger-Oligonukleotiden gebildeten elongierten Oligonukleotiden werden erfindungsgemäß eingeleitet, indem nach Abschluss der Denaturierung eines PCR-Zykluss auf einer Tem¬ peratur oberhalb der Denaturierungstemperatur Hybridisie- rungstemperatur verharrt wird (Figur 6) . Dadurch kommt es nicht zu einer festen Anbindung von noch freien Oligonukleotiden an die jeweils komplementären Stellen der Amplikons . Im Unterschied hybridisieren jetzt die an der Reaktionskammerwand oder anderweitig immobilisierten aus der PCR gebildeten Fänger-Amplikons mit ihren komplementären, markierten Ampli- kons aus der Reaktionslösung. Da ihre Sequenz wesentlich länger ist als die der markierten und nicht-markierten Oligo- nukleotide (z.B. um den Faktor 2 bis 100, vorzugsweise 10 bis 50), bleibt die Hybridisierung auch unter der herrschenden, gegenüber der Annealingtemperatur erhöhten Temperatur stabil. Die herrschende Temperatur sollte also oberhalb der Schmelz¬ temperatur der relativ kurzen Primer und unterhalb der Schmelztemperatur der relativ langen Amplikons liegen.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figurenbeschrei- bung beispielhaft dargestellt.
Die Figuren 1 bis 6 stellen den schematischen Verlauf des Verfahrens dar. Die Zielsequenz (SO) ist durch die Sequenzen Sl and S2 begrenzt, wobei im Allgemeinen Sl oder S2 auch noch Teil der Zielsequenz sein können. Die jeweils komplementären Sequenzen sind durch "S0-Überstrich" , "Sl-Überstrich" oder "S2-Überstrich" gekennzeichnet. Im folgenden Text werden diese als SO*, Sl* und S2* bezeichnet.
Die Figur 1 stellt den Beginn der PCR-Reaktion dar, wobei die immobilisierten (mit der Sequenz Sl*) und markierten Oligo- nukleotide (mit der Sequenz S2) erfindungsgemäß in weitaus geringerer Konzentration vorliegen können als die nicht-mar- kierten Oligonukleotide (Sl* und S2) . Sie werden deshalb zu¬ erst mit der Zielsequenz (SO) oder (SO*) bzw. (S1+S0+S2) oder (Sl*+S0*+S2*) eine Amplifikation eingehen.
Figur 2 stellt den Verlauf einer PCR-Reaktion dar, die bis dahin hauptsächlich nur Amplikons generierte, die die in Überzahl vorhandenen nicht-markierten Oligonukleotide (Sl* und S2) beanspruchten.
Figur 3 stellt den weiteren Verlauf des erfindungsgemäßen
Verfahrens dar, wobei jetzt die zuvor nach Figur 2 generierten Amplikons als Template für die markierten (S2) und die Fänger-Oligonukleotide (Sl*) dienen.
Figur 4 zeigt die vollständig verlängerten Amplikons aus Fi¬ gur 3.
Figur 5 zeigt die durch z.B. Temperaturerhöhung ausgelöste Teilung der in Figur 4 generierten Doppelstränge in seine beiden Einzelstränge (Amplikons) .
Figur 6 zeigt schließlich die erfindungsgemäße Hybridisierung zwischen den erhaltenen markierten und Fänger-Amplikons aus Figur 5. Zwar treten die unmarkierten, in höherer Konzentra- tion gelösten Oligonukleotide in Konkurrenz zu den markierten, jedoch sollte dies eine ausreichende Hybridisierung markierter Oligonukleotide nicht behindern, da die Dichte der dort gebildeten Fänger-Amplikons so hoch ist, dass es in un¬ mittelbarer Nähe des Spots zu einer Konzentrationsabnahme von Amplikons kommt und daher eine Sättigung der Fänger des Spots nicht den begrenzenden Faktor bei der Hybridisierung mit markierten Amplikons darstellt .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis zumindest einer Ziel-
Nukleotidsequenz umfassend die nachfolgenden Schritte (a) Bereitstellen von mit zumindest einer Ziel- Nukleotidsequenz hybridisierbaren
- nicht markierten, freien Oligonukleotiden, im Folgenden nicht-markierte Oligonukleotide genannt,
- markierten, freien, hybridisierbaren Oligonukleotiden, im Folgenden markierte Oligonukleotide genannt und
- nicht markierten und immobilisierten Oligonukleotiden, im Folgenden Fänger-Oligonukleotide genannt;
(b) Bereitstellen der Probensubstanz in die Reaktionskammer, wobei die Probensubstanz die Ziel-Nukleotidsequenz (en) (b.l) umfasst oder die Ziel-Nukleotidsequenz (en) aus der Probensubstanz durch reverse Transkription herstellbar ist (sind) (b.2), wobei in diesem Fall
(c) eine reverse Transkription einer RNA zur Herstellung von markierten und/oder nicht-markierten Ziel-
Nukleotidsequenzen (b.2) in der Reaktionskammer durchgeführt wird;
(d) Amplifikation (d.l) umfassend die Ziel- Nukleotidsequenz (en) gemäß (b.l), die nicht-markierten Oligonukleotide, die markierten Oligonukleotide und die Fänger-Oligonukleotide zur Herstellung von markierten Amplikons, nicht-markierten Amplikons sowie Fänger- Amplikons, oder Verzicht (d.2) auf die Amplifikation soweit die Ziel- Nukleotidsequenzen nach (b.2) durch reverse Transkription mittels der markierten Oligonnukleotide in ausreichender Zahl gewonnen wurden und für diesen Fall die Fänger- Oligonukleotide aus Schritt (a) zur Herstellung von mar¬ kierten Nukleotidsequenzen bereitstehen; (e) Hybridisierung der nach (d.l) hergestellten markierten
Amplikons mit den immobilisierten Fänger-Amplikons (e.l), wobei die Dichte der gebildeten Fänger-Amplikons so hoch ist, dass es in unmittelbarer Nähe derselben zu einer Konzentrationsabnahme von freien markierten und nicht¬ markierten Amplikons kommt und daher eine Sättigung der Fänger-Amplikons nicht den begrenzenden Faktor bei der Hybridisierung mit markierten Amplikons darstellt oder
Hybridisierung der nach (d.2) hergestellten markierten Nukleotidsequenzen mit den Fänger-Oligonukleotiden (e.2);
(f) Detektion der Fänger-Amplikons oder der Fänger- Oligonukleotide aus (e.l) bzw. (e.2), wobei nach Schritt (b) alle zur Durchführung des Verfahrens benötigten Reagenzien in einer Reaktionskammer vorhanden sind und während der weiteren Durchführung des Verfahrens nichts zugegeben wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, , dadurch gekennzeichnet dass
(g) nach Schritt (f) eine erneute Amplifizierung nach Schritt
(d.l) durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (a) bis (g) in ein und derselben Reaktionskammer ausgeführt werden.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Schritte (a) bis (d) und (e) bis
(f) in jeweils einer Reaktionskammer ausgeführt werden.
5. Verfahren gemäß zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fänger- Oligonukleotide an der Reaktionskammer immobilisiert sind.
6. Verfahren gemäß zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mar- kierten Oligonukleotide an Beads gekoppelt sind.
7. Verfahren gemäß zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ampli- fikation eine PCR aufweisend eine Anzahl von Denaturie- rungs-, Annealing- und Elongationszyklen unter Einwirkung eines Temperaturzykluses umfasst.
8. Verfahren gemäß zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu un¬ tersuchenden Sequenzen bevorzugt aus DNA bestehen und die Oligonukleotide aus 5 bis 1000, bevorzugt aus 10 bis 100 und besonders bevorzugt aus 15 bis 30 Nukleobasen bestehen.
9. Verfahren gemäß zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker optisch, elektrochemisch, enzymatisch, magnetisch, gra- vimetrisch, radioaktiv oder durch Hap- ten/Antikörperwechselwirkungen bestimmt werden oder Ladungsträger aufweisen oder solche erzeugen.
10. Verfahren gemäß zumindest einem der vorhergehenden An- Sprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfah¬ ren die Schritte (f) und (g) in mehrfacher Folge um¬ fasst .
11. Verfahren gemäß zumindest einem der vorhergehenden An- Sprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker oberflächennah, ggf. durch die Lösung hindurch, detek- tiert werden.
12. Verfahren gemäß zumindest einem der vorhergehenden An- Sprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht¬ markierten Oligonukleotide in höherer Konzentration als die Summe der markierten Oligonukleotide und der Fänger- Oligonukleotide vorliegen.
13. Verfahren gemäß zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest 2, vorzugsweise zumindest 5, unterschiedliche nicht¬ markierte Oligonukleotide und zumindest 2, vorzugsweise zumindest 5, unterschiedliche markierte Oligonukleotide mit jeweils zumindest 2, vorzugsweise zumindest 5, ver¬ schiedenen in der Probensubstanz enthaltenden Zielsequenzen hybridisieren in einem Verfahren des Mehrkanal- Multiplexings .
14. Verwendung des Verfahrens gemäß zumindest einem der vor¬ hergehenden Ansprüche für das Genotyping oder die SNP- Analyse umfassend die Amplifikation nach (d.l) .
15. Verwendung des Verfahrens gemäß zumindest einem der An¬ sprüche 1 bis 5 und 8 bis 13 zur Genexpressionsanalyse ggf. umfassend zusätzlich eine Amplifikation nach (d.l) .
16. Verwendung gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Sequenzen bevorzugt aus RNA bestehen und die Oligonukleotide aus 5 bis 1000, be¬ vorzugt aus 10 bis 100 und besonders bevorzugt aus 15 bis 30 Nukleobasen bestehen.
17. Testbesteck aufweisend nur eine Reaktionskammer umfassend
- nicht markierte, freie Oligonukleotide, im Folgen den nicht-markierte Oligonukleotide genannt, - markierte, freie Oligonukleotide, im Folgenden mar kierte Oligonukleotide genannt und
- nicht markierte und immobilisierte Oligonukleotide, im Folgenden Fänger-Oligonukleotide genannt,
- Trägermaterial für die Fänger-Oligonukleotide vor liegend als Bestandteil der Reaktionskammer oder in der Reaktionskammer befindlich, wobei die Fänger- Oligonukleotide in hoher Dichte am Trägermaterial immobilisiert sind, und
- Reagenzien umfassend zumindest Reaktionslösung, En zyme, freie Desoxyribonukleotide, Puffer und Addi tive .
18. Testbesteck gemäß Anspruch 17 aufweisend als Additive zumindest eine der nachfolgenden Substanzen: DMSO, GIy- cerin, und Mg-Ionen.
19. Testbesteck gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-markierten Oligonukleotide in höherer Stückzahl als die Summe der markierten Oligonukleotide und der Fänger-Oligonukleotide zugesetzt sind.
20. Testbesteck gemäß den Ansprüchen 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest 2, vorzugsweise zu¬ mindest 5, unterschiedliche nicht-markierte Oligonukleo¬ tide und zumindest 2, vorzugsweise zumindest 5, unter- schiedliche markierte Oligonukleotide mit jeweils zumin¬ dest 2, vorzugsweise zumindest 5, verschiedenen in der Probensubstanz enthaltenden Zielsequenzen hybridisieren in einem Verfahren des Mehrkanal-Multiplexings .
21. Verfahren gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 13 unter Verwendung des Testbestecks gemäß Ansprüchen 17 bis 20.
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