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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren und insbesondere die Verfahren
zur Identifikation und zur Isolierung nicht-redundanter mRNAs und
neuartiger genomischer Sequenzen.
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ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
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Die
Aufklärung
von den Mechanismen, welche das normale Funktionieren der lebenden
Zellen bestimmen, setzt ein detailliertes Verständnis der Information voraus,
die insgesamt in dem vollständigen Genom
codiert ist. Die Sequenzen der Messenger-RNA (mRNA) werden üblicherweise
verwendet, um die Gene, welche innerhalb der Genome von den unterschiedlichen
Organismen enthalten sind, zu kartieren und zu sequenzieren. Die
Sequenzinformation wird verwendet, um den genetischen Aufbau von einer
bestimmten Zelle oder Organismus von Interesse zu untersuchen. Die
mRNAs werden jedoch in der Entwicklung mit unterschiedlichen Konzentrationen innerhalb
unterschiedlicher Zelltypen und während unterschiedlicher Zeitpunkte
hergestellt. Die Verteilung der MRNA-Typen, ihre entwicklungs- und
zelltypspezifische regulierte Expression und ihre Translation in
die Proteine produzieren den einzigartigen Charakter von einem bestimmten
Zelltyp.
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Die
Populationen der Nukleinsäuremoleküle, wie
beispielsweise Messenger-RNAs, werden üblicherweise unter Verwendung
von klonierten Nukleinsäurebibliotheken
studiert. Diese Bibliotheken können
genomische Bibliotheken einschließen, welche durch Einsetzen
von willkürlich
gespaltenen DNA-Fragmenten aus einem gesamten Genom in einen geeigneten
Klonierungsvektor konstruiert werden können. Bei den Bibliotheken,
die aus der DNA von den Säugergenomen
hergestellt werden, enthalten die meisten zufälligen genomischen Klone nicht-codierende DNA,
hochrepetitive DNA oder beiderlei DNA.
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Ein
zweiter Bibliothekentyp wird aus komplementären DNA-(cDNA-)Molekülen hergestellt.
Diese Bibliotheken werden aus DNA konstruiert, die revers von der
aus einer interessierenden Quelle isolierten mRNA umgeschrieben
wird. Dementsprechend enthalten cDNA-Bibliotheken hauptsächlich DNA,
die für Gene
codiert.
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Unterschiedliche
Spezies der mRNA sind in einer vorgegebenen Zelle nicht in gleichem
Maße vorhanden.
Stattdessen sind die mRNA-Moleküle
auf drei Häufigkeitsklassen
verteilt: (1) sehr häufig
vorkommend (bestehend aus ungefähr
10–15
mRNAs, die zusammen 10–20%
von der gesamten mRNA-Masse repräsentieren);
(2) intermediär
(bestehend aus annähernd
1–2.000
mRNA, welche zusammen 40–45%
der gesamten mRNA-Masse repräsentieren)
und (3) zusammengesetzt (bestehend aus annähernd 15–20.000 mRNAs, welche zusammen 40–45% der
gesamten mRNA-Masse repräsentieren).
Davidson und Britten, SCIENCE 204: 1052–1059 (1979).
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Die
Existenz von RNA-Molekülen
mit sehr häufig
vorkommender und intermediärer
Komplexität innerhalb
einer Zelle kann ein signifikantes Hindernis für die Identifikation und Sequenzierung
von mRNA-Spezies mit geringer Häufigkeit
darstellen. Bei der Herstellung von Nukleinsäurebibliotheken, die für das Sequenzieren
geeignet sind, erschweren die sehr häufig vorkommenden mRNAs die
Isolierung und Analyse der mit geringer Häufigkeit vorkommenden mRNAs.
Weil die überwiegende
Mehrheit der aus einer cDNA-Bibliothek isolierten Klone von sehr
häufig
und intermediär
vorkommenden mRNAs abstammen wird, muss ein erheblicher Teil an
Zeit und Arbeit für
die Resequenzierung von bekannten häufigen mRNA-Spezies aufgebracht
werden und es müssen
große
Mengen an mRNA-Spezies sequenziert werden, um die mit geringer Häufigkeit
vorkommenden mRNA-Spezies zu isolieren und zu sequenzieren. Demzufolge
kann die Ge schwindigkeit der Entdeckung von Genen in Bibliotheken
durch die redundante Beschaffenheit der in einer vorgegebenen Zelle
vorhandenen mRNAs eingeschränkt
werden. Das Vorhandensein der in hohem Maße vorkommenden mRNAs behindert
ebenfalls den Vergleich von Unterschieden in aktiven Genen, der
in unterschiedlichen Zellen von verwandten Gewebetypen, bei Zellen
in verschiedenen Stadien der Entwicklung, bei der Wirkung von Stimulantien
und der unterschiedlichen Genexpression zwischen normal funktionierenden
und abnormen Zellen beobachtet wird (z. B. beim Vergleich von Zellen
aus normalem Gewebe und aus Tumorgeweben).
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KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung von einem
außerordentlich
wirksamen Hochdurchsatzverfahren zur Identifizierung und Eliminierung
der Redundanz in einer heterogenen Population von Nukleinsäuremolekülen.
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Das
Verfahren schließt
die Bereitstellung einer zufälligen
Auswahl von Nukleinsäurefragmenten ein,
die Immobilisierung der zufälligen
Auswahl der Nukleinsäurefragmente
an einem Microarray und die Hybridisierung einer oder mehrerer markierter
Proben, nachfolgend Sonden genannt, die den vorher auf dem Microarray
angeordneten oder sequenzierten Fragmenten entsprechen. Die Fragmente,
die mit den markierten Sonden hybridisieren, werden nachgewiesen
und mindestens ein Fragment, das mit den markierten Sonden nicht
hybridisiert oder nur schwach hybridisiert, wird identifiziert und
sequenziert
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Die
Nukleinsäurefragmente
können
aus RNA oder DNA sein und wahlweise in einen Vektor kloniert sein.
In einigen Ausführungsformen
sind die Nukleinsäurefragmente
Bestandteile von einer cDNA- oder einer genomischen Bibliothek.
Die Bibliothek kann dabei normalisiert oder nicht-normalisiert sein.
In anderen Ausführungsformen
bestehen die Nukleinsäurefragmente
aus PCR-Fragmenten. In einigen Ausführungsformen sind die Nukleinsäurefragmente
amplifiziert, beispielsweise durch PCR.
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Die
Nukleinsäurefragmente
werden anschließend
auf einer festen Oberfläche
immobilisiert, beispielsweise in einem Microarray. Die feste Oberfläche ist
vorzugsweise Glas. Die markierten Sonden, welche den vorher in einem
Microarray angeordneten oder sequenzierten Fragmenten entsprechen (d.
h. die Subtraktionssonde), werden mit den immobilisierten Nukleinsäurefragmenten
hybridisiert. Die Nukleinsäuremarkierungen
können
fluoreszierende, lumineszierende oder radioaktive Marker, biotinylierte,
mit Hapten versehene oder andere chemische Kennzeichnungen sein,
die einen leichten Nachweis der markierten Sonden ermöglichen.
Im Allgemeinen werden die nicht-hybridisierten Sonden entfernt.
Die Nukleinsäurefragmente,
die nicht hybridisiert sind oder nur schwach an eine markierte Sonde
hybridisiert sind, werden isoliert und danach mit den vorherigen
Sets der Sonden vereinigt, um dadurch ein neues, größeres Set
an Sonden zu erzeugen. Die neu isolierten Fragmente werden sequenziert
und anschließend
ihre Sequenzen mit denjenigen verglichen, welche in einer Sequenz-Datenbank
gefunden wurden.
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Die
vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren
beinhalten ein Subtraktions-Protokoll, das die nicht-redundanten
Nukleinsäurefragmente
aus einer Population von Nukleinsäuremolekülen identifiziert und isoliert.
Das Protokoll ist, falls gewünscht,
reiteriert, um ein Set an Fragmenten zu erzeugen, das einseitig
in Richtung auf vorher uncharakterisierte Gene mit jeder sukzessiven
Iteration verschoben wird. Dementsprechend werden mit jeder Subtraktionsrunde
die Sonden, welche zu den neu isolierten Fragmenten korrespondieren,
markiert und zu den vorangehenden Subtraktionssonden hinzugefügt und diese
neue Subtraktionssonde wird mit dem nächsten Microarray hybridisiert,
der zufällig
ausgewählte Nukleinsäurefragmente
enthält.
Diese Prozedur wird mehrmals wiederholt, vorzugsweise einhergehend mit
dem Hinzufügen
der neu identifizierten Sequenzen zu der vorherigen Subtraktionssonde.
Somit ermöglicht
dieses Verfahren die Identifizierung und Isolierung von nicht-redundanten oder
nur minimal überlappenden
Nukleinsäurefragmenten
aus den interessierenden Quellen und erhöht so die Geschwindigkeit der
Entdeckung neuartiger Gene. In einer bevorzugten Ausführungsform
werden die nicht-redundanten Klone, die während der Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
isoliert werden, identifiziert, ausgewählt und an einen neuen Microarray
immobilisiert, um ein Unigene-Set herzustellen.
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Zahlreiche
Anwendungen können
für die hierin
beschriebenen Verfahren vergegenwärtigt werden. Zum Beispiel
kann das Verfahren in irgendeiner Anwendung verwendet werden, in
der die Anreicherung der Sequenzen von Interesse gewünscht wird. Wahlweise
kann das Verfahren dazu verwendet werden, um unerwünschte Nukleinsäurefragmente
aus einer Population von Nukleinsäuremolekülen zu entfernen. Eine nicht-einschränkende Zusammenstellung
an Verwendungen beinhaltet:
- I. Ein Microarray-basiertes
Verfahren zur Erhöhung
der Rate der Auffindung von exprimierten mRNA/cDNA-Sequenzen und
zum Erleichtern der Konstruktion eines Sets aus Nukleinsäuremolekülen zur
Identifizierung von Nachrichten, welche in geringen Mengen in einer
Population von Nukleinsäuremolekülen vorhanden
ist. Dieses Verfahren ermöglicht
die vermehrte Entdeckung von exprimierten cDNAs und die beschleunigte Konstruktion
von Sets mit einmaligen cDNAs.
- II. Ein Microarray-basiertes Verfahren zur Erhöhung der
Auffindungsrate von genomischen Sequenzen und zur Unterstützung der
Isolation von den DNA-Fragmenten, welche zu einem ganzen Genom oder
den interessierenden Subbereichen davon gehören. In dieser Anwendung stellt
das Verfahren eine gesteigerte Auffindung von genomischen Klonen
bereit, sowie die beschleunigte Konstruktion von einem Set aus nicht-redundanten
oder nur minimal überlappenden
genomischen Klonen. Ebenfalls wird eine gesteigerte Auffindung von
Klonen, welche die interessierende Region entschlüsseln, eine
beschleunigte Konstruktion eines Sets aus genomischen Klonen in einem
interessierenden Bereich von dem Genom sowie ein beschleunigtes
Auffüllen
von Lücken
in genomischen Kartierungen bereitgestellt. Dies kann beispielsweise
bei der Förderung
der Kartierung von Krankheiten und der Identifizierung von Krankheitsgenen
nützlich
sein.
- III. Ein Microarray-basiertes Verfahren zur Anreicherung und/oder
zur Isolation von DNA-Sequenzen, die für eine Population einzigartig
sind, verglichen mit einer anderen Population. Die Erfindung ermöglicht ebenfalls
die Identifizierung von Sequenzen, die einzigartig oder neuartig
für einen Organismus
gegenüber
einem anderen Organismus sind, einschließlich der Nukleinsäuremoleküle aus verschiedenen
Stämmen,
beispielsweise von pathogenen gegenüber nicht-pathogenen Mechanismen
und unterschiedlicher Spezies. Die Sequenzen können zum Beispiel mRNA/cDNA, genomische,
extrachromosomale, in Plasmiden enthaltene oder virale Nukleinsäuren sein.
- IV. Ein Microarray-basiertes Verfahren zur Erhöhung der
Auffindung von verwandten DNA-Sequenzen. Umgekehrt gestattet das
Verfahren die Identifizierung von in Beziehung stehenden Sequenzen
zwischen eng oder weit miteinander verwandten Organismen. Die Sequenzen
können zum
Beispiel mRNA/cDNA, genomische, extrachromosomale, in Plasmiden
enthaltene oder virale Nukleinsäuren
sein.
- V. Ein Microarray-basiertes Verfahren zur Steigerung der Rate
der Entfernung von unerwünschten Sequenzen
aus einer Population von Nukleinsäuremolekülen. In einer weiteren Ausführungsform gewährleistet
die Erfindung das Entfernen von unerwünschten DNA-Sequenzen, einschließlich kontaminierender
DNA-Sequenzen und der Sequenzen, welche eng mit den vorher identifizierten
Sequenzen verbunden sind.
- VI. Ein Microarray-basiertes Verfahren zur Identifizierung von Änderungen
der Kopienanzahl von einer oder mehrerer DNA-Sequenzen in zwei unterschiedlichen
Nukleinsäurepopulationen.
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Wenn
nichts anderes festgelegt ist, besitzen alle technischen und wissenschaftlichen
Bezeichnungen, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung,
wie sie durch einen Durchschnittsfachmann verstanden wird, dem diese
Erfindung gehört.
Wenngleich Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleichwertig zu
den hierin beschriebenen sind, in der Anwendung oder der Überprüfung der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Verfahren
und Materialien nachfolgend beschrieben. Im Konfliktfall sind die
vorliegenden Spezifikationen, einschließlich der Definitionen, bestimmend.
Darüber
hinaus sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend
und nicht als einschränkend
zu verstehen.
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Beltz
et al. (1983), Methods in Enzymology, 100, 266–285, offenbaren die Isolation
von Multigenfamilien und die Bestimmung von Homologien durch Filter-Hybridisierungsverfahren.
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Heller
et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 94, Seite 2150–2155, berichten über die Verwendung
von cDNA-Microarrays bei der Entdeckung und Analyse von mit entzündlichen
Krankheiten zusammenhängenden
Genen.
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Schena
et al., Oktober 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., Band 93 (20), Seite
10.614–10.619,
berichten über
das auf Microarrays basierende Expressionsmonitoring von 1.000 Genen.
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Nguyen
et al. (1995), Genomics, US, Academic Press, San Diego, Band 29.
Seite 207–216,
beschreiben die Verwendung der quantitativen Hybridisierung von
auf Arrays angeordneten cDNA-Klonen zur Untersuchung der differentiellen
Genexpression in dem Thymus von Nagern.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 stellt
ein Flussdiagramm dar, das eine Übersicht über die
Strategie zur Entdeckung neuer Gene anschaulich beschreibt.
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2 ist
eine Darstellung von einem Microarray, der bei der Identifikation
von neuartigen Genen verwendet wird.
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3 stellt
ein Flussdiagramm dar, das die Konstruktion von einem UniGene-Chip
des Mäuseschädeldachs
anschaulich beschreibt.
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4 ist
ein Liniendiagramm, das die Entfernung von kontaminierenden mitochondrialen
Genen aus einer Bibliothek anschaulich beschreibt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Der
Einfachheit halber wird die beabsichtigte Bedeutung von bestimmten
Begriffen und Ausdrücken,
welche hierin verwendet werden, nachfolgend bereitgestellt.
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„Bekannte
Gene" oder „bekannte
Sequenzen" sind
diejenigen, deren Sequenzen in einer öffentlich zugänglichen
oder einer privaten Sequenz-Datenbank gefunden werden können.
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„Neuartige
Gene" oder „neuartige
Sequenzen" sind
Nukleinsäuremoleküle, deren
Sequenzen nicht öffentlich
zur Verfügung
stehen, z. B. werden sie weder in irgendeiner öffentlich zugänglichen
oder privaten Sequenz-Datenbank gefunden.
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Ein „heterogenes" Set von Nukleinsäuren bedeutet
ein Set, welches mindestens zwei Nukleinsäuremoleküle enthält, die sich in ihrer Sequenz
unterscheiden. Heterogene Nukleinsäuren beinhalten beispielsweise
RNA-Populationen,
die aus Zellen, Geweben und/oder Organismen isoliert wurden.
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„Schwach" hybridisierend,
wie hierin festgelegt, bezieht sich auf ein Hybridisierungssignal,
welches ein Signal-Rausch-Verhältnis
(S/N-) von weniger als 0,5 aufweist, wie unter Verwendung des Datenanalysesystems
der ArrayVision-Software nachgewiesen. S/N ist ein Maß für die abgezogene
Hintergrundintensität
von dem Spotsignal dividiert durch die Standardabweichung von der
Hintergrundintensität.
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Eine „nicht-redundante
Nukleinsäure" ist eine Nukleinsäure, welche
nicht vorher in einer Population von Nukleinsäuremolekülen, beispielsweise einer heterogenen
Population von Nukleinsäuremolekülen, identifiziert
worden ist. In einigen Ausführungsformen
ist die nicht-redundante
Nukleinsäure eine
Sequenz, welche in einer niedrigen Kopienanzahl in einer Population
von Nukleinsäuremolekülen vorhanden
ist.
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Ein „einzigartiges
Genset" ist ein
Set von Genen, worin jedes Element von dem Set einer Sequenz entspricht,
die in einer niedrigen Kopienanzahl in einer Population von Zellen
repräsentiert
ist. Ein einzigartiges Genset entspricht zum Beispiel Sequenzen,
welche mit wenigen Kopien pro Zelle vorhanden sind. Ein einzigartiges
Genset kann wahlweise auch als ein reduziertes Set häufiger Gene
bezeichnet werden. In einigen Ausführungsformen schließt das einzigartige
Genset Sequenzen ein, die in 100, 50, 25, 15, 10, 5, 2 Kopien oder
sogar mit 1 Kopie pro Zelle vorhanden sind. Dementsprechend wird
ein einzigartiges Genset aus einem bestimmten Zelltyp oder einer
Zellpopulation in einigen Ausführungsformen
eine Kopie von jedem Gen enthalten, das in diesem Zelltyp exprimiert
wird.
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Eine „komplexe
Sonde" ist eine
Sonde, die viele unterschiedliche DNA- oder RNA-Moleküle enthält. Wie
hierin verwendet, enthält
eine komplexe Sonde Nukleinsäuresequenzen,
welche komplementär
zu bekannten Sequenzen sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein hochwirksames Hochdurchsatzverfahren
für die
Identifizierung und Eliminierung der Redundanz in einer Population
von Nukleinsäuremolekülen bereit,
wobei eine reiterative Selektion verwendet wird, die eine subtraktive
Hybridisierung mit einem komplexen Sondenpool und Microarray-Technologie beinhaltet. Die
willkürlich
aus einer Klonierungsbibliothek ausgewählten Nukleinsäurefragmente
werden mittels Microarray untersucht und unter hybridisierenden
Bedingungen einer komplex markierten Sonde ausgesetzt, die aus bekannten
Sequenzen erzeugt wurde (z. B. Sequenzen, die aus einer öffentlich
zugänglichen
Datenbank wie beispielsweise Genbank, pubEST erhalten wurden). Nur
Klone, welche mit diesem ersten Sondenpool schwach hybridisieren,
oder überhaupt nicht
hybridisieren, werden sequenziert; dagegen werden Klone, die mit
dem ersten Sondenpool hybridisieren, nicht sequenziert. Die in diesem
Schritt erhaltenen Sequenzen werden mit den öffentlich zugänglichen
Datenbanken von vorher identifizierten Nukleinsäuremolekülen verglichen (z. B. BLAST,
pubEST, Genbank NR). Diese Sequenzen werden zu dem anfänglichen
Sondenpool hinzugefügt,
um einen zweiten, subtraktiven Sondenpool zu erzeugen. Dieser subtraktive
Sondenpool wird mit einer zweiten Gruppe von willkürlich aus
der Bibliothek ausgewählten
Klonen hybridisiert. Die Sonde hybridisiert mit den Nukleinsäuren, welche
komplementär
zu den Nukleinsäuren
von den anfänglichen, öffentlich
bekannten Sequenzen sind, sowie mit den Nukleinsäuren, die in der ersten Runde
der Hybridisierung identifiziert wurden. Die Prozedur des Expandierens
von dem Sondenpool nach aufeinanderfolgenden Runden der Hybridisierung
wird wiederholt, bis im Wesentlichen alle willkürlich gewählten Klone mit einer markierten
Sonde hybridisieren, was darauf hinweist, dass alle der vorher uncharakterisierten
Klone sequenziert worden sind. Dementsprechend eliminieren die Verfahren
der vorliegenden Erfindung die Notwendigkeit der Resequenzierung
von bekannten Klonen – ein
Problem, das die Effizienz von anderen auf dem Fachgebiet bekannten
Verfahren verringert.
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Der
erste Schritt beinhaltet die Isolierung einer heterogenen Population
von Nukleinsäuremolekülen. Die
Nukleinsäuremoleküle können Fragmente aus
der Gesamtsequenz von RNA- oder DNA-Molekülen sein. In einigen Ausführungsformen
kann die heterogene Population der Nukleinsäuremoleküle willkürlich ausgewählte Nukleinsäurefragmente
aus einer Population von Nukleinsäuremolekülen enthalten. Diese Fragmente
können
DNA oder RNA sein und sie können
wahlweise in Vektoren kloniert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
beinhalten die Nukleinsäuremoleküle cDNA
aus einer Nukleinsäurebibliothek
mit unbekannten Sequenzen. In einer Ausführungsform ist die Bibliothek
eine genomische Bibliothek. In einer weiteren Ausführungsform
ist die Bibliothek eine cDNA-Bibliothek. In jeder Ausführungsform
kann die Bibliothek entweder eine normalisierte Bibliothek oder
eine nicht-normalisierte Bibliothek sein. Wahlweise dazu kann die
Population der Nukleinsäurefragmente
nicht ein Teil einer Bibliothek sein, z. B. PCR-Fragmente.
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In
einigen Ausführungsformen
sind die Nukleinsäuren
unter Verwendung von PCR oder anderen Amplifikationsverfahren vervielfältigt. Die
DNA wird anschließend
in einem Microarray auf einer Oberfläche, vorzugsweise Glas, immobilisiert.
In einigen Ausführungsformen schließt die im
Microarray angeordnete DNA Oligonukleotide ein, die auf Glas synthetisiert
wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die PCR-Fragmente
unter Verwendung von einem Microarray-Spotter in einem Microarray angeordnet.
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Den
immobilisierten DNA-Molekülen
wird anschließend
unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben, der Kontakt
mit einem markierten Sondenpool ermöglicht, der Nukleinsäuremoleküle bekannter
oder definierter Sequenzen enthält.
Standard-Markierungsprotokolle für
Nukleinsäuren
sind beispielsweise in Sambrook et al.; Kambara et al., BIOTECHNOLOGY
6: 816–821
(1988); Smith et al., NUCL. ACIDS RES. 13: 2399–2412 (1985) beschrieben. Die
Nukleinsäuremarkierungen
können
fluoreszierende, lumineszierende oder radioaktive Marker, biotinylierte,
mit Hapten versehene oder andere chemische Kennzeichnungen sein,
die einen leichten Nachweis der markierten Sonden ermöglichen.
Fluoreszierende Markierungen sind für die hierin beschriebenen
Verfahren vorteilhaft, da diese routinemäßig mit einer automatisierten
Geräteausstattung für die gleichzeitige
Hochdurchsatzanalyse von multiplen Proben verwendet werden. Metzker
und Gibbs haben kürzlich
eine Familie von fluoreszierend markierten Nukleotiden offenbart,
auf der Grundlage von den Cy-Fluorophoren mit verbesserten spektralen
Eigenschaften. Siehe beispielsweise die
US-Patentschrift Nr. 5,728,529 , die
hierin mittels Verweis eingebunden ist. Alternative Sets von Fluorophoren
schließen
Fluorophore auf Rhodaminbasis, TARAM, ROX, JOE und FAM, die BigDye
® Fluorophore
(Applied Biosystems, Inc.), die Dansylgruppe, Fluorescein und substituierte
Fluorescein-Derivate, Acridin-Derivate, Coumarin-Derivate, Pthalocyanine,
Tetramethylrhodamin, Texas Red
®, 9-(Carboxyethyl)-3-hydroxy-6-oxo-6H-Xanthene, DABCYL
® und
BODIPY
® Fluorophore
(Molecular Probes, Eugene, OR) ein.
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Im
Anschluss an den Hybridisierungsschritt wird die Konzentration des
Markers an jeder Position von dem Microarray, z. B. einem DNA-Microarray, nachgewiesen.
Siehe Brown und Kotstein, NAT. GENET. 21: 33–37 (1999). Microarrays stellen
eine geordnete Anordnung von doppelsträngigen oder einzelsträngigen DNA-Molekülen dar,
die auf einem Trägermaterial
in einer räumlich
getrennten Ordnung positioniert sind. Im Gegensatz zu den Filter-„Makroarrays", welche typischerweise
aus großen
Bogen von Nitrocellulose bestehen, positionieren die Microarrays
die DNA in einer dichteren gepackten Ordnung derart, dass bis zu
10.000 DNA-Moleküle
in einen Bereich passen, der typischerweise 1–4 Quadratzentimeter beträgt. In Microarrays
wird normalerweise beschichtetes Glas als das Trägermaterial verwendet, im Gegensatz
zu den auf der Grundlage von Nitrocellulosematerial bestehenden
Filterarrays. Durch die geordneten Reihen der DNA-Proben kann die
Position von jeder Probe nachverfolgt werden und mit der Originalprobe,
aus der die DNA auf dem Array generiert wurde, verknüpft werden.
Verfahren und Geräte
zur Herstellung von einem Microarray sind beschrieben worden. Siehe
beispielsweise die
US-Patentschriften
Nr. 5,445,934 und
5,800,992 .
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Das
Verfahren zur Herstellung eines Microarrays beinhaltet eine Reihe
von Schritten, in welchen ein Set von Bakterienkolonien, welche
eine cDNA-Bibliothek enthalten, verarbeitet wird, um ein vervielfältigtes
Fragment aus gereinigter DNA, welche aus dem Insert von dem Vektor,
der in jeder einzelnen Bakterienkolonie enthalten ist, zu erhalten.
Die Reihe der Schritte kann entweder manuell oder unter Verwendung
von Roboter-Arbeitsplätzen, wie
beispielsweise PCR-Maschinen, und Robotern zur Handhabung von Flüssigkeiten
durchgeführt
werden. In dem bevorzugten Verfahren werden die Schritte unter Verwendung
von Multiwell-Platten durchgeführt,
die 96, 384 oder 1.536 Vertiefungen (Wells) enthalten. Es sind jedoch
auch andere Konfigurationen möglich.
Der Microarray wird unter Verwendung eines automatischen Spotters,
wie zum Beispiel dem durch Molecular Dynamics in dem Labor von Patrick Brown,
Stanford Universität
(ibidem), entwickelten Instrument, durchgeführt. Ein weiteres Merkmal von dem
Microarray-Verfahren
ist, dass die Datenanalyse automatisch unter Verwendung von Datenanalysen-Software,
wie beispielsweise ArrayVision, durchgeführt wird. Das gesamte Verfahren
von der Zuordnung der Klone, der Microarray-Konstruktion bis zu den Ergebnissen
ist vollständig
integriert, sodass Bakterienkolonien, welche für die Sequenzierung prozessiert
werden sollen, mühelos
identifiziert werden können.
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In
verschiedenen Ausführungsformen
beinhaltet ein erfindungsgemäßer Microarray
100, 1.000, 10.000 oder sogar 100.000 oder mehr DNA-Proben.
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Die
DNA-Proben auf dem Microarray werden mit RNA- oder DNA-Sonden hybridisiert,
die markiert worden sind, beispielsweise fluoreszierend markiert, um
zu ermitteln, ob die Sondenauswahl ein Molekül enthält, welches ähnlich oder
identisch zu der DNA-Probe auf dem Microarray ist. In bevorzugten Ausführungsformen
kann eine komplexe Sonde an den Microarray hybridisiert werden.
Eine komplexe Sonde ist eine Sonde, die viele unterschiedliche DNA-
oder RNA-Moleküle
enthält.
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Die
Sondenmoleküle
werden mit einem DNA-Molekül
unter Bedingungen hybridisiert, welche die Bildung von Hybriden
zwischen den Sondenmolekülen
und identischen oder einem nahezu identischen DNA-Molekül/DNA-Molekülen auf
dem Microarray gestatten. Das Vorhandensein von DNA-Sonden-Hybridmolekülen wird
beispielsweise durch ein Fluoreszenz-Detektionsgerät nachgewiesen.
Falls ein Hybridisierungssignal an einem bestimmten DNA-Spot schwach
oder nicht existent ist, so ist das korrespondierende DNA- oder
RNA-Molekül
in der Sonde abwesend. In verschiedenen Ausführungsformen werden 1, 2, 3
oder 4 oder mehr Sondenmoleküle
gleichzeitig verwendet.
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In
einigen Ausführungsformen
bewerkstelligen iterative Runden der Microarray-Konstruktion, Hybridisierung
und Analyse diesen Prozess. Das Verfahren verringert den Umfang
der Sequenzierung für
ein einzigartiges Genset mit einer vorgegebenen Größe. Es kann
in verschiedenen Ausführungsformen
zum Entfernen von sich wiederholenden Proben, z. B. cDNA-Duplikaten,
mit bakterieller oder mitochondrialer DNA und für Proben ohne irgendein cDNA-Insert verwendet
werden.
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Bei
der auf dem Microarray basierenden Subtraktion existiert gegenüber den
Filterarray-Verfahren eine Anzahl an Vorteilen. Zum Beispiel entbehren
die vorliegenden Verfahren der Notwendigkeit, die Klone vor der
Sequenzierung in Bakterien zu vermehren. Beispielsweise untersuchen
Filterarray-Verfahren im Allgemeinen Bakterienkolonien, in welchen
die klonierte cDNA enthalten ist. Die Kolonien müssen über mehrere Tage herangezogen,
zur Freisetzung der DNA lysiert und die DNA an dem Filter fixiert
werden. Die Hybridisierung an Filterarrays mit Kolonien kann aufgrund
von bakteriellen Trümmern
und niedrigen DNA-Mengen, die aus den Kolonien freigesetzt wurden,
beeinträchtigt
werden.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Verfahren ist, dass die Iteration
mit Microarrays schneller durchgeführt werden kann als mit Filterarrays
unter Verwendung von Bakterienkolonien. Das Vermehren und Analysieren
von Klonen in Bakterien kann bis zu mehreren Tagen dauern. Im Gegensatz
dazu kann die Untersuchung eines anschließenden Microarrays mittels
der Sonden weniger als 24 Stunden nach der Beendigung der Analyse
von einem Array gestartet werden.
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Ein
weiterer Vorteil von Microarrays ist die Möglichkeit der Verwendung von
fluoreszierend markierten Sonden. Dies stellt ein nicht-radioaktives
Verfahren des Hybridisierungsnachweises bereit. Im Gegensatz dazu verwenden
die Filterhybridisierungen im Allgemeinen Sonden, die mit radioaktivem
Phosphor oder Schwefel markiert sind. Microarrays können mit
multiplen Sonden gleichzeitig hybridisiert werden. Im Gegensatz
dazu können
Filterarrays jeweils nur mit einer Sonde hybridisiert werden.
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Ein
weiterer Vorteil von Microarrays liegt in ihrer Reproduzierbarkeit
und der Sensitivität
der Hybridisierungssignale. Typischerweise sind bei Microarrays
gegenüber
den Filterarrays die Hybridisierungssignale höher und die Empfindlichkeit
größer. Dies
ermöglicht
eine größere Komplexität der Sonde und
dennoch das Erhalten von einem positiven Hybridisierungssignal auf
dem Microarray. Darüber
hinaus weisen Filterarrays häufig
störende
Hintergrundsignale auf, die nicht mit einer produktiven Hybridisierung
zwischen der Sonde und der DNA auf dem Filter in Beziehung stehen.
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Es
existiert zusätzlich
eine Anzahl an Vorteilen bei der Konstruktion von einem einzigartigen Genset
durch die Microarray-basierende Subtraktion gegenüber anderen
Verfahren. Beispielsweise resultieren Verfahren, die eine selektive
Hybridisierung in Lösung
verwenden, wie sie in cDNA-Normalisierungs- oder Subtraktionsverfahren
verwendet wird, in dem Verlust bestimmter in niedrigen Mengen vorkommender
Klone. Im Gegensatz dazu ist man unter Verwendung des iterativen,
auf dem Microarraybasierenden Subtraktionsansatzes in der Lage,
alle Klone in der Bibliothek zu identifizieren. Ein in niedriger
Menge vorkommender cDNA-Klon (low-abundant cDNA) wird nach multiplen
iterativen Hybridisierungsrunden entdeckt werden. Ein weiterer Vorteil von
dem auf dem Microarray basierenden Ansatz bei der Herstellung von
Unique-cDNA-Sets ist, dass die sich ergebenden cDNA-Klone eher mit
voller Länge erhalten
werden. Im Gegensatz dazu reichern andere Verfahren zur Subtraktion
und Normalisierung häufig
kurze, unvollständige
cDNAs an.
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Ein
schwaches Signal oder überhaupt
kein Signal an einer bestimmten Position von dem Array stimmt im
Allgemeinen mit dem Vorhandensein von einer DNA überein, die nicht oder nur
schwach mit den Sequenzen, welche in dem Sondenpool repräsentiert
sind, hybridisiert hat. Klone mit einem schwachen Signal oder überhaupt
keinem Signal werden sequenziert. Die Sequenzierung kann unter Verwendung
von DNA-Sequenzierungsverfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt
sind, durchgeführt
werden. Siehe beispielsweise Maxam und Gilbert, PROC. NATL. ACAD.
SCI. USA 74: 560–564
(1977); Sanger et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 74: 5463–5467 (1977)
und
US-Patentschrift Nr. 5,821,058 .
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Die
automatische Analyse von Fragmenten in Gelen oder in Kapillaren
hat beträchtlich
den Arbeitsaufwand verringert, der mit dem Sammeln und Prozessieren
von Sequenzinformationen verbunden war. Siehe beispielsweise Prober
et al., SCIENCE 238: 336–341
(1987); Smith et al., NATURE 321: 674–679 (1986); Luckey et al.,
NUCLEIC ACIDS RES 18: 4417–4421
(1990); Dovichi, ELECTROPHORESIS 18: 2393–2399 (1997). Die in diesem Schritt
isolierten und sequenzierten Nukleinsäurefragmente werden zu dem
anfänglichen
Sondenpool hinzugefügt.
Häufig
werden diese Fragmente zuerst sequenziert, um das Vorhandensein
von nicht-redundanten Nukleinsäuremolekülen in dem
Microarray zu bestimmen. Ihre Sequenzen werden anschließend mit
den öffentlich
zugänglichen
Datenbanken der vorher identifizierten Nukleinsäuremoleküle verglichen (z. B. durch
Vergleich der Sequenzen in den öffentlich
zugänglichen
Datenbanken).
-
Der
zweite subtraktive Sondenpool wird in der nächsten Runde der Hybridisierung
verwendet, die einen zweiten Microarray einbezieht, der aus einer
unterschiedlichen Gruppe von willkürlich ausgewählten Klonen
der Bibliothek generiert wurde. Durch Hinzufügen von den neu identifizierten
Nukleinsäurefragmenten
zu dem subtraktiven Sondenpool werden die anschließenden Microarrays
mit den willkürlich aus
der Bibliothek ausgewählten
Klonen einer größeren Anzahl
an markierten Sonden ausgesetzt. Dementsprechend eliminieren die
vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren
das Resequenzieren von bekannten Klonen.
-
Da
die Anzahl der markierten Sonden mit den aufeinanderfolgenden Iterationen
anwächst,
wird auch die Anzahl von den markierten „bekannten" Klonen anwachsen und weniger Klone
unmarkiert bleiben. Letztendlich werden, bei ausreichenden Iterationen,
alle Klone in den Microarrays der willkürlich aus einer vorgegebenen
Bibliothek ausgewählten
Klone markiert sein, weil alle Klone sequenziert worden sind.
-
In
einem Aspekt der vorliegenden Offenlegung wird eine Klonierungsbibliothek
aus gering vorkommenden mRNAs (low-abundance mRNAs) generiert. In
einer Erweiterung von diesem Verfahren werden die low-abundance
Sequenzen bei der Konstruktion von einem Chip verwendet, der Nukleinsäuren enthält, die
low-abundance-RNAs entsprechen. Diese Chips können in den nachfolgenden Experimenten
(z. B. Differential Display Experiments) verwendet werden. Ein Überblick über die
Strategie für
das Entdecken von neuartigen Genen ist in 1 bildlich dargestellt.
In einer zusätzlichen
Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung werden kontaminierende Nukleinsäuren aus
einer Klonierungsbibliothek entfernt.
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Verringerung der Redundanz in einer Probe aus Nukleinsäuremolekülen bereit.
Das Verfahren schließt
das Bereitstellen einer heterogenen Probe aus Nukleinsäuremolekülen und das
Immobilisieren der Probe der Nukleinsäuremoleküle auf einem Microarray ein.
Eine oder mehrere markierte Sonden, welche den vorher mit einem
Array überprüften oder
sequenzierten Nukleinsäuremolekülen entsprechen,
werden dann mit den Nukleinsäuremolekülen in der
immobilisierten Probe hybridisiert. Vorzugsweise schließen die
Sonden Sequenzen ein, von denen bekannt ist, dass sie in der Probe der
Nukleinsäuremoleküle vorhanden
sind. Das Verfahren beinhaltet ebenfalls das Identifizieren von mindestens
einem immobilisierten Molekül,
das mit den markierten Sonden hybridisiert und das Bereitstellen
eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, welches spezifisch
die immobilisierte Nukleinsäure
oder die Nukleinsäuren
erkennt, die mit der Probe hybridisieren. Falls gewünscht, kann
das zweite Nukleinsäuremolekül markiert
sein, und als ein Sondenmolekül verwendet
werden und die Probe kann mit einem Sondenmolekül oder Sondenmolekülen rehybridisiert werden,
die das neu hinzugefügte
Sondenmolekül einschließen. Dieser
Prozess kann wie gewünscht wiederholt
werden, um fortschreitend die Nukleinsäuremoleküle zu eliminieren, welche schon
in der Population der Nukleinsäuremoleküle identifiziert
worden sind.
-
Ebenfalls
in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist ein Verfahren zur
Identifizierung mehrerer nicht-redundanter
Sequenzen in einer Population von Nukleinsäuren durch Bereitstellen einer heterogenen
Probe von Nukleinsäuremolekülen, das Immobilisieren
der Probe der Nukleinsäuremoleküle auf einem
Microarray und das Hybridisieren mit einer oder mehrerer markierter
Sonden mit der Probe. Die markierten Sonden entsprechen einem oder
mehreren vorher identifizierten Nukleinsäuremolekülen in der Probe. Mindestens
ein immobilisiertes Nukleinsäuremolekül in der
immobilisierten Probe, das mit den markierten Sonden schwach oder
nicht hybridisiert, wird identifiziert. Der Prozess wird, falls
gewünscht,
wiederholt, bis mehrere nicht-redundante Sequenzen identifiziert
worden sind. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenfalls die
Sequenzen, welche gemäß diesem
Verfahren identifiziert worden sind, sowie einen Microarray, der
mehrere Sequenzen enthält.
-
Die
vorliegende Erfindung kann an jeden Verwendungszweck angepasst werden,
in dem der Anwender die Anreicherung von interessierenden Sequenzen
oder die Entfernung von nicht interessierenden Sequenzen wünscht. Beispielhafte
Anwendungen beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, nachfolgende
Beispiele:
-
I. MICROARRAY-BASIERTES VERFAHREN ZUR ERHÖHUNG DER
ENTDECKUNGSRATE VON EXPRIMIERTEN mRNA/cDNA-SEQUENZEN UND UNTERSTÜTZUNG DER
KONSTRUKTION VON EINEM SEQUENZSET; WELCHE EINZIGARTIGEN ODER GERING
VORKOMMENDEN TRANSKRIPTEN ENTSPRECHEN
-
In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine neuartige verbesserte
Genentdeckung und eine beschleunigte Konstruktion von einem Set aus
exprimierten cDNAs bereit. Dies kann zustande gebracht werden durch:
- (a) Amplifizieren (durch PCR oder Nukleinsäure-Isolationsverfahren)
und Bereitstellen einer zufälligen
Probe mit Nukleinsäurefragmenten;
- (b) Immobilisieren der zufälligen
Nukleinsäuren auf
einer festen Oberfläche
in einem Microarray-Format;
- (c) Hybridisieren der markierten Sonden aus einer DNA-Quelle mit den immobilisierten,
auf dem Microarray angeordneten DNA-Fragmenten;
- (d) Nachweisen der DNA-Fragmente, die mit einer markierten Sonde
hybridisiert sind und Identifizieren von mindestens einem Fragment,
das nicht hybridisiert oder nur schwach hybridisiert (d. h. Subtraktion);
- (e) Bestimmen der Identität
von dem DNA-Fragment durch DNA-Sequenzierung, Hybridisierung oder
andere analytische Ansätze;
und
- (f) Wiederholen der Schritte (b) oder (c) bis (e) mit den vorher
identifizierten Sequenzen in dem Sondenset, um zusätzliche
Sequenzen zu identifizieren und das Unique-Genset zu vergrößern.
-
II. EIN MICROARRAY-BASIERTES VERFAHREN ZUR
ERHÖHUNG
DER ENTDECKUNGSRATE VON GENOMISCHEN SEQUENZEN UND UNTERSTÜTZUNG DER
ISOLATION VON DNA-FRAGMENTEN, WELCHE ZU EINEM GANZEN GENOM ODER
DEN INTERESSIERENDEN SUBBEREICHEN DAVON GEHÖREN
-
Im
Falle von genomischen Sequenzen kann es erwünscht sein, ein Set von „minimal überlappenden" Klonen zu konstruieren,
d. h., Klone mit dem geringstmöglichen
Anteil an überlappenden
Sequenzen. Demzufolge ermöglicht
die Erfindung eine verbesserte Entdeckung von genomischen Klonen,
eine beschleunigte Konstruktion von einem Set mit nicht-redundanten
oder nur minimal überlappenden genomischen
Klonen und eine verstärkte
Entdeckung von Klonen, die den interessierenden Genen zugeordnet
werden können.
Das Verfahren gestattet ebenfalls eine beschleunigte Konstruktion
von einem Set mit genomischen Klonen in einem interessierenden Abschnitt
von dem Genom. Das Vermögen,
Klone mühelos
einem interessierenden Abschnitt in dem Genom zuzuordnen, ermöglicht es
dem Fachmann weiterhin, die Lücken
in einer Genomkarte leicht zu füllen
und gibt Unterstützung
bei der Kartierung von Krankheitsgenen und bei der Identifizierung
von Krankheitsgenen.
-
Das
Verfahren umfasst:
- (a) Amplifizieren (durch
PCR oder Nukleinsäure-Isolationsverfahren)
und Bereitstellen einer zufälligen
Probe mit genomischen Nukleinsäurefragmenten;
- (b) Immobilisieren der zufälligen
Nukleinsäuren auf
einer festen Oberfläche
in einem Microarray-Format;
- (c) Hybridisieren der markierten Sonden (zusammen gefasst oder
einzeln) aus einer DNA-Quelle mit den immobilisierten, auf dem Microarray
angeordneten DNA-Fragmenten
(die Sonden können cDNA/mRNA-
oder genomische Sequenzen sein);
- (d) Nachweisen von DNA-Fragmenten, die mit einer markierten
Sonde hybridisieren:
- (e) Bestimmen der Identität
von dem DNA-Fragment durch DNA-Sequenzierung, Hybridisierung oder
andere analytische Ansätze;
und
- (f) Wiederholen der Schritte (b) oder (c) bis (e) mit den vorher
identifizierten Sequenzen in dem Sondenset, um zusätzliche
Sequenzen zu identifizieren und das Unique-Genset zu vergrößern.
-
Insbesondere
können
die Endbereiche von vorher identifizierten Sequenzen als Sonden
verwendet werden, um die flankierenden Klone „abzuwandern" und zu identifizieren.
-
III. MICROARRAY-BASIERTES VERFAHREN ZUR ANREICHERUNG
UND/ODER ISOLIERUNG VON DNA-SEQUENZEN (mRNA/cDNA, GENOMISCHE; EXTRACHROMOSOMALE;
PLASMID- UND ALLE ANDEREN); DIE FÜR EINE POPULATION, VERGLICHEN
MIT EINER ANDEREN POPULATION, EINZIGARTIG SIND.
-
Eine
weitere Anwendung von der Erfindung ist bei der Identifizierung
von Sequenzen (exprimierte cDNA oder genomisch), welche für einen
Organismus einzigartig oder neuartig gegenüber einem anderen Organismus
sind. Diese Anwendung schließt die
Identifizierung von Nukleinsäuren
ein, die einzigartig für
einen Stamm gegenüber
einem anderen Stamm sind (d. h. pathogen versus nicht-pathogen), sowie
den Vergleich von den einzigartigen Gensets aus nahe verwandten
Spezies und entfernter verwandten Spezies.
-
Weil
Nukleinsäuremoleküle aus mehr
als einem Ursprungsorganismus in dieser Anwendung verwendet werden,
sind die spezifischen Schritte von dem Verfahren ein wenig unterschiedlich
und beinhalten:
- (a) Amplifizieren (durch PCR
oder Nukleinsäure-Isolationsverfahren)
und Bereitstellen einer zufälligen
Probe mit Nukleinsäurefragmenten;
- (b) Immobilisieren der zufälligen
Nukleinsäuren auf
einer festen Oberfläche
in einem Microarray-Format;
- (c) Hybridisieren der markierten Sonden aus einer ersten Quelle
und einer zweiten Quelle an die immobilisierten, auf dem Microarray
angeordneten DNA-Fragmente (die Sonden können cDNA/mRNA- oder genomische
Sequenzen sein);
- (d) Nachweisen der DNA-Fragmente, welche mit einer markierten
Sonde aus einer ersten Herkunft, aber nicht mit einer aus der zweiten
Quelle oder umgekehrt hybridisieren; und
- (e) Bestimmen der Identität
von dem DNA-Fragment durch DNA-Sequenzierung, Hybridisierung oder
andere analytische Ansätze.
-
IV. MICROARRAY-BASIERTES VERFAHREN ZUR STEIGERUNG
DER ENTDECKUNG VON VERWANDTEN (ODER KONSERVIERTEN) DNA-SEQUENZEN (mRNA/cDNA,
GENOMISCHE; EXTRACHROMOSOMALE; PLASMID- UND ALLE ANDEREN)
-
Die
Umkehrung von dem obigen Verfahren ermöglicht die Entdeckung von verwandten
Sequenzen (anstatt der Unterschiede) in verschiedenen Spezies, einschließlich unterschiedlicher
Bakterienstämme
und entfernt verwandter Organismen. Das Verfahren umfasst:
- (a) Amplifizieren (durch PCR oder Nukleinsäure-Isolati onsverfahren)
und Bereitstellen einer zufälligen
Probe mit Nukleinsäurefragmenten;
- (b) Immobilisieren der zufälligen
Nukleinsäuren auf
einer festen Oberfläche
in einem Microarray-Format;
- (c) Hybridisieren der markierten Sonden (einzeln oder zusammengefasst)
mit den immobilisierten, auf dem Microarray angeordneten DNA-Fragmenten
(die Sonden können
cDNA/mRNA- oder genomische Sequenzen sein);
- (d) Nachweisen von DNA-Fragmenten, die mit einer markierten
Sonde hybridisieren (häufig
mit einem schwächeren
Signal);
- (e) Bestimmen der Identität
von dem DNA-Fragment durch DNA-Sequenzierung, Hybridisierung oder
andere analytische Ansätze;
und
- (f) Vergleichen der erhaltenen DNA-Sequenzen mit anderen verfügbaren DNA-Sequenzen,
um Sequenzen nachzuweisen, die Homologie aufweisen, aber nicht zu
anderen bekannten Sequenzen identisch sind.
-
V. MICROARRAY-BASIERTES VERFAHREN ZUR STEIGERUNG
DER GESCHWINDIGKEIT DES ENTFERNENS UNERWÜNSCHTER SEQUENZEN
-
Die
vorliegende Erfindung sieht ebenfalls ein Entfernen unerwünschter
DNA-Sequenzen (cDNA oder genomisch) aus jeder Population von geordneter
DNA vor. Dies kann kontaminierende DNA sowie jede DNA einschließen, die
nicht von Interesse ist, z. B. Sequenzen, die nahe mit den bereits
identifizierten verwandt sind. Dieses Verfahren umfasst:
- (a) Amplifizieren (durch PCR oder Nukleinsäure-Isolationsverfahren)
und Bereitstellen einer zufälligen
Probe mit Nukleinsäurefragmenten;
- (b) Immobilisieren der zufälligen
Nukleinsäuren auf
einer festen Oberfläche
in einem Microarray-Format;
- (c) Hybridisieren der markierten Sonden, welche als zu entfernende
Sequenzen in Betracht kommen, an die immobilisierten, auf dem Microarray angeordneten
DNA-Fragmente;
- (d) Nachweisen der DNA-Fragmente, die mit einer markierten Sonde
hybridisiert sind und Identifizieren von mindestens einem Fragment,
das nicht hybridisiert oder nur schwach hybridisiert (d. h. Subtraktion);
- (e) Bestimmen der Identität
von dem DNA-Fragment durch DNA-Sequenzierung, Hybridisierung oder
andere analytische Ansätze;
und
- (f) Wiederholen der Schritte (a), (b) oder (c) bis (e) mit den
vorher identifizierten Sequenzen in dem Sondenset, die als notwendig
erachtet werden, um die unerwünschten
Sequenzen aus der Population der Fragmente zu eliminieren.
-
VI. MICROARRAY-BASIERTES VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG
VON ÄNDERUNGEN
IN DER KOPIENANZAHL (UNTER- ODER ÜBERREPRÄSENTIERT) VON DNA-SEQUENZEN
(GENOMISCH; EXTRACHROMOSOMAL; PLASMID UND ALLE ANDEREN) ZWISCHEN
UNTERSCHIEDLICHEN QUELLEN DER NUKLEINSÄUREN.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Microarray-basiertes
Verfahren zur Identifizierung von Änderungen in der Kopienanzahl
(unter- oder überrepräsentiert)
von DNA-Sequenzen (genomisch, extrachromosomal, Plasmid und alle
anderen) zwischen unterschiedlichen Quellen der Nukleinsäuren bereit.
Das Verfahren umfasst:
- (a) Amplifizieren (durch
PCR oder Nukleinsäure-Isolationsverfahren)
und Bereitstellen einer zufälligen
Probe mit Nukleinsäurefragmenten
aus einer vorgegebenen Quelle;
- (b) Immobilisieren der zufälligen
Nukleinsäuren auf
einer festen Oberfläche
in einem Microarray-Format;
- (c) Hybridisieren von markierten Sonden (einzeln oder zusammengefasst;
jeder Typ Nukleinsäure – mRNA/cDNA,
genomisch, extrachromosomal, Plasmid und alle anderen – allgemein
zu dem mittels Array zu untersuchenden Nukleinsäuretyp korrespondierend) aus
einer anderen Quelle mit den immobilisierten, auf dem Microarray
angeordneten DNA-Fragmenten;
- (d) Nachweisen von DNA-Fragmenten, welche eine fehlende, eine
wesentliche geringere oder wesentlich größere Hybridisierung zu einer
markierten Sonde aufweisen. Solche Veränderungen in der Signalintensität reflektieren Änderungen
in der Häufigkeit;
und
- (e) Bestimmen der Identität
von dem/den DNA-Fragment(en) durch DNA-Sequenzierung, Hybridisierung
oder andere analytische Ansätze.
-
Beispiel 1 cDNA-Microarray Konstruktion
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1.1 cDNA-Vervielfältigung (Amplifikation)
-
Es
wurde eine cDNA-Bibliothek durch Techniken generiert, die auf dem
Fachgebiet gut bekannt sind. Die cDNA-Inserts wurden aus bakteriellen
Klonen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) isoliert.
Fünfundzwanzig μl PCR-Mischung wurden
zu jeder Vertiefung von einer 384-well Mikrotiterplatte aus einer
PCR-Hauptmischung hinzugefügt,
die 1.000 μl
10X PCR Puffer, 800 μl
2,5 mM dNTPs, 400 μl
T3-Primer (5 pmol/μl),
400 μl T7-Primer
(5 pmol/μl)
und 10 μl
rekombinante Taq-Polymerase enthält.
Die PCR-Platte wurde aus einer Übernacht-Wachstumsplatte
unter Verwendung eines 384-Nadelinstrumentes zum Übertragen
von annähernd
1 μl inokuliert.
Die Platten wurden mit Microseal A verschlossen und in Alpha-Einheiten
von MJ Research Tetraden PCR-Maschinen platziert. Die Reaktionsansätze wurden
bei 95°C
für 4 Min
vorgewärmt, gefolgt
von 35 Vervielfältigungszyklen:
45 sec bei 95°C,
1 Min bei 55°C
und 2,5 Min bei 72°C.
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Die
Vervielfältigung
von den cDNA-Inserts wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese nachgeprüft, wobei
2 μl von
jedem PCR-Reaktionsansatz auf ein 1%-Agarosegel geladen wurden,
das 500 ng/μl Ethidiumbromid
enthält.
500 ng Molekulargewichtsstandard (1 Kb Leiter, Promega) wurde zu
jedem Gel zur Größenbestimmung
und Quantifizierung der Vervielfältigung
hinzugefügt.
Die Proben wurden in 1X TAE (Tris Acetat, EDTA) bei 150 Milliampere
für 30 Min
elektrophoretisch getrennt.
-
Die
vervielfältigten
cDNA-Inserts wurden von nicht eingebauten Nukleotiden und Primern
in 384-Well Glasfaserfilterplatten wie folgt gereinigt: 70 μl 5 M Guanidinisothiocyanat
(Sigma) wurden zu jeder Platte unter Verwendung eines 96-Nadel Cyclone Liquid
Handler 25 μl
des PCR-Reaktionsansatzes aus der PCR-Mikrotiterplatte zu der Glasfaserfilterplatte
transferiert und für
2 Min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Filterplatte wurde auf einen
Vakuumaufsatz gesetzt und getrocknet. Die Filterplatte wurde 2-mal
mit 70 μl
80% Isopropanol gewaschen und auf einem Vakuumaufsatz für zwei Minuten
getrocknet. Das gereinigte PCR-Produkt wurde aus der Glasfaserfilterplatte
in eine 384-Well Sammelplatte durch Zugabe von 50 μl Wasser,
5 Min Inkubation bei Raumtemperatur und Zentrifugation bei 3.000
U/min für
5 Min eluiert. Die gereinigten PCR-Produkte wurden auf einem hoch eingestellten
Speed-Vac für
45 min bis 1 Stunde zur Trockne lyophilisiert. Die gereinigten Produkte
wurden in 30 μl
50% DMSO/Wasser resuspendiert.
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1.2 Immobilisierung der Probe
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Ein
Maximum von 4.608 unterschiedlichen PCR-Fragmenten wurde auf Glasobjektträger in zweifacher
Ausfertigung unter Verwendung eines Generation III (Gen III) Microarray-Spotters
von Amersham/MolecularDynamics punktförmig aufgetragen. Zwölf 384-Well
Mikrotiterplatten mit U-förmigem
Boden wurden in den Druckraum von dem Gen III-Spotter platziert.
Bis zu 36 Glasobjektträger
wurden in den Spotter platziert und mit DNA punktförmig beladen,
während
die Luftfeuchtigkeit zum Spotten in der Spotterkammer bei 55% gehalten
wurde. Sechs Objektträger
wurden pro Zugriff auf die Quellenplatte punktförmig mit DNA beladen. Vor dem
Zugriff auf das nächste
Set der PCR-Templates wurde die 12-Stift-Kassette wie folgt gewaschen:
1 sec in 0,2 M KOH, 1 sec in 95% Ethanol und 2 sec in destilliertem Wasser.
Nach dem punktförmigen
Auftragen wurden die Objektträger
für 1 Stunde
bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Die PCR-Fragmente wurden mit dem Glas mittels
UV-Vernetzung in einem Stratalinker (Stratagene) bei 5.000 Joule
verbunden.
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Beispiel 2 Sondensynthese
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Die
cDNA-Inserts für
die sequenzverifizierten Klone wurden in 96-Well PCR-Platten, wie
vorher für
die 384-Well-Platten
beschrieben, vervielfältigt, mit
der Ausnahme, dass das PCR-Reaktionsvolumen 50 μl betrug. Die Vervielfältigung
wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese wie vorher beschrieben überprüft. Die
PCR-Fragmente wurden unter Verwendung von 96-Well Carbonfaserfilterplatten
und einem DNA-bindenden Harzmaterial wie folgt gereinigt: 100 μl Wizard
PCR-Reinigungs-Harz (Promega) wurden zu jeder Vertiefung von einer
96-Well Filterplatte unter Verwendung eines 12-Kanal-Pipettors hinzugefügt, die
50 μl PCR-Reaktionsansatz
zu dem Harz hinzugefügt
und bei Raumtemperatur für
1 Min inkubiert, die Platte wurde dann für 1 Min auf einen Vakuumaufsatz
platziert, bis sie trocken war. Jede Platte wurde kurz mit 200 μl 80% Isopropanol
gewaschen, bevor die Lösung
mittels des Vakuumaufsatzes entfernt wurde und die Filterplatte
wurde gut über Vakuum
getrocknet. Das gereinigte PCR-Produkt wurde durch Zugabe von 50 μl sterilem,
destilliertem Wasser, gefolgt durch Zentrifugation bei 3.000 U/min für 5 Min
in eine 96-Well Mikrotiterplatte eluiert. Die gereinigten PCR-Produkte
wurden vereinigt und 100 μg
von der vereinigten PCR-Reaktion wurden über Qiagen PCR-Reinigungssäulen gereinigt.
Der neu gereinigte PCR-Pool wurde mittels Gelelektrophorese wie
voranstehend beschrieben überprüft. Die
Konzentration von dem vereinigten PCR-Produkt wurde spektrofotometrisch
bestimmt und die Konzentration auf 100 ng/μl unter Verwendung von sterilem,
destilliertem Wasser angepasst.
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Der
gereinigte PCR-Fragmentpool wurde als Template für die RNA-Synthese in einer
in vitro Transkriptionsreaktion verwendet. Der gereinigte PCR-Reaktionsansatz
(500 ng) wurde zu 20 μl
einer Reaktionslösung
hinzugefügt,
die jeweils 0,5 mM von jedem rNTP, 37 mM DTT und 10 Einheiten von
T7- oder T3-RNA-polymerase enthielt. Der Reaktionsansatz wurde bei
37°C für 90 Min
inkubiert. Das DNA-Template wurde durch Zugabe von 1 Einheit RQ1-DNAse
und Inkubation bei 37°C
für 30
Minuten entfernt. Die nicht eingebauten Nukleotide wurden mittels
Reinigung über
eine RNA-Easy Säule
(Qiagen) entfernt.
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Eine
fluoreszierende Sonde wurde wie folgt aus dem in vitro synthetisierten
RNA-Template in einer Erststrang-Markierungsreaktion
synthetisiert: 100 ng von dem RNA-Template wurden zusammen mit 0,5 μg Zufallshexameren
in einem Endvolumen von 10 μl
für 10
Min bei 70°C
inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde für 5 Minuten auf Eis abgekühlt, gefolgt
von der Zugabe von einer Reaktionsmischung, die 1X Reverse Transkriptionspuffer
(20 mM Tris pH 8,4, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2),
10 mM DTT, 100 μM dGTP,
dTTP, dATP, 50 μM
dCTP, 50 μM
Cye3 dCTP oder Cye5 dCTP und 200 Einheiten Supercript II Reverse
Transkriptase (Gibco BRL, #18089-011) enthält. Der Reaktionsansatz wurde
für 90
Minuten bei 42°C
inkubiert. Das RNA-Template wurde durch die Zugabe von 1 μl 5 M NaOH
und Inkubation für
10 Minuten bi 37°C
hydrolysiert. Die NaOH wurde durch Hinzufügen von 10 μl 2 M MOPS (freie Säure) neutralisiert.
Nicht eingebaute Nukleotide und Primer wurden durch Reinigung über GFX-Säulen (Pharmacia) entfernt.
Die Sonden wurden mittels Lyophilisation konzentriert und in 30 μl Hybridisierungspuffer
resuspendiert, der 50% Formamid, 5X SSC, 0,2% SDS, 1X Denhardt's, 100 μg/ml Lachsspermien-DNA
und 1 μg Oligo-dA
(80) enthielt.
-
Beispiel 3 Identifizierung neuartiger
Gene
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Das
Verfahren zur Identifizierung von neuartigen Genen ist bildlich
in 2 dargestellt.
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3.1 Hybridisierung
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Die
Sonden wurden bei 100°C
für 10
Min denaturiert und auf den Microarray-Objektträger aufgetragen. Die Objektträger wurden
mit Glasdeckgläsern (Corning)
abgedeckt und für
18 bis 24 Stunden bei 42°C
in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Die hybridisierten Objektträger wurden
zweimal mit 2X SSC, das 0,1% SDS enthält, für 10 Minuten bei Raumtemperatur
gewaschen, gefolgt von zwei Waschgängen in 0,1X SSC mit 0,1% SDS
bei 42°C für 10 Minuten.
Die Objektträger
wurden mehrfach in destilliertes Wasser getaucht und unter gefilterter Druckluft
getrocknet. Die Hybridisierung der fluoreszierenden Sonden wurde
durch Scannen der Objektträger
in einem Generation III (Gen III) Konfokalscanner (Amersham/Molecular
Dynamics) nachgewiesen.
-
3.2 Datenerfassung
-
Die
Abbildungen der Objektträger
wurden mit der Bildanalysesoftware ArrayVision (Imaging Research)
hinsichtlich der Spotauffindungs-Analyse, der örtlich beschränkten Hintergrundbestimmung, der
Verteilung der Signalintensitäten
in einem Spot und des Signal-Rausch-Verhältnisses
ausgewertet. Die Daten wurden als tablimitierte Datei ausgeführt und
in eine Oracle-Datenbank exportiert. Die Normalisierung und die
statistische Qualitätsbeurteilung wurden
mit einem Web-basierten Set von Datenanalysewerkzeugen durchgeführt und
die Daten wurden mit Netzwerkbrowser-Programmen analysiert, die
in dem Hoechst-Ariad Genomics Center entwickelt wurden. Die Daten
wurden aufgrund des Signal-Rausch-Verhältnisses
sortiert und die DNAs, welche ein Signal oberhalb des Hintergrundes,
aber unterhalb eines Schwellenwertes des Signal-Rausch-Verhältnisses
aufwiesen, wurden durch EST-Sequenzierung weiter charakterisiert.
-
3.3 Sequenzierung und Vergleich zu bekannten
Bibliotheken
-
Diejenigen
Klone, die in Schritt 3.1 nicht hybridisierten, wurden zielorientiert
für die
EST-(Expressed Sequence Tag) Sequenzierung unter Verwendung der
auf dem Fachgebiet bekannten Techniken ausgewählt. Adams et al., SCIENCE
252: 1651–1656
(1991). Die Sequenzen wurden gegen die öffentlich zugänglichen
dbEST-, Maus-EST-
und Lifeseq-(Incyte) Datenbanken abgeglichen. Alle Klone, die neu
charakterisiert wurden oder als vorher bekannte Sequenzen identifiziert
wurden, wurden zu dem Sonden-(Subtraktions-)Pool hinzugefügt, um eine
mehrfache Identifikation von demselben Gen während der nachfolgenden Hybridisierungen
zu vermeiden.
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3.4 Reiterative subtraktive Hybridisierung
-
Der
nächste
Microarray, welcher willkürlich ausgewählte Klone
enthält,
wurde mit einer neuen Sonde hybridi siert, die alle vorherigen Klone
einschloss, und zusätzlich
jegliche neuen Klone enthielt, die durch EST-Sequenzierung identifiziert worden waren.
Die mittels dieser Methodologie identifizierten Klone wurden zur
Erstellung von einzigartigen Gensets (Unique-Gensets) verwendet
(Ermolaeva et al., NAT. GENET. 20: 19–23 (1998)), welche Klone enthalten,
die vorher aus anderen Quellen (z. B. öffentlich zugänglichen
Datenbanken) identifiziert wurden sowie neuartige Klone, die nicht
vorher beschrieben worden waren.
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Beispiel 4 Selektion von low-abundance
mRNAs
-
Ein
auf der Grundlage der Reiteration basierendes Subtraktionsprotokoll
wurde verwendet, wo Microarrays konstruiert wurden, die 1.500 unterschiedliche
cDNAs enthielten, die willkürlich
aus einer cDNA-Bibliothek ausgewählt
wurden. Der erste Microarray wurde mit einer Subtraktionssonde hybridisiert,
welche cDNAs enthielt, die 64 Housekeeping- und ribosomale Gene
codieren. Die nicht hybridisierenden Klone wurden mittels EST-Sequenzierung analysiert.
Jegliche Klone, die nicht in der vorherigen Subtraktionssonde vorhanden
waren, wurden zu der existierenden Subtraktionssonde hinzugefügt und mit dem
nächsten
Microarray hybridisiert, der willkürlich ausgewählte cDNA-Klone
enthielt. Dieses Verfahren wurde 17-mal wiederholt, sodass insgesamt
26.112 cDNAs über
die Microarrays untersucht wurden. Basierend auf den Hybridisierungsdaten
wurden nur 7.700 Klone für
die EST-Sequenzierung ausgewählt. Nach
der Clusterbildung wurden 4.400 unterschiedliche cDNA-Klone identifiziert.
Diese Gruppe der Klone war äußerst angereichert
mit low-abundance Iranskripten. Darüber hinaus erniedrigte die
Microarray-basierte Subtraktion durch das Entfernen der redundanten
hoch vorkommenden Messenger-RNAs (highabundance mRNAs) den Aufwand
der EST-Sequenzierung um 70%.
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Beispiel 5 Konstruktion von einem Chip
zur Identifizierung von einzigartigen oder low-abundance Transkripten
und Verwendung im Differential Display
-
Ein
Chip zur Identifizierung von Messenger-RNA, welche in einer geringen
Kopienanzahl in dem Schädeldach
der Maus vorhanden ist, wurde gemäß dem in 3 umrissenen
Verfahren konstruiert. Die Arrays wurden aus 27.648 Klonen aus den
normalisierten Bibliotheken von der Mausschädeldecke generiert. Alle 27.648
Klone waren mittels PCR vervielfältigt
und in 18 Microarrays angeordnet. Als ein Ergebnis der subtraktiven
Hybridisierung (wie oben beschrieben) wurden 7.790 cDNAs mittels
18 Hybridisierungsrunden sequenziert. Nach Vergleich von diesen
Sequenzen mit den Datenbanken, die bekannte Sequenzen enthalten,
wurden 4.608 Klone zur Amplifikation und zur Platzierung auf einem
Microarray ausgewählt.
Dieser Chip wurde anschließend in
einem differentiellen Genexpressionsexperiment verwendet, um Gene
zu identifizieren, welche durch BMP2 (Bone Morphogenetic Protein
2) moduliert werden.
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Beispiel 6 Entfernen von Kontaminationen
aus einer Bibliothek
-
Das
Protokoll der subtraktiven Hybridisierung, wie es in der vorliegenden
Erfindung beschrieben wurde, wurde an der Entfernung von Kontaminationen
mit hoch vorkommenden Genen aus einer Klonierungsbibliothek veranschaulicht.
Wie in 4 dargestellt, war die anfängliche Bibliothek zu 35% mit mitochondrialen
Genen kontaminiert. Nach neun Runden der subtraktiven Hybridisierung
wurde diese Menge auf 2–3%
verringert. Dies demonstriert die Anwendbarkeit der Erfindung bei
der Entfernung von hoch vorkommenden Sequenzen aus einer Anfangspopulation
von Nukleinsäuren.
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Schlüssel
zu den Figuren
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1
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- EN: Overview of Gene Discovery Strategy
DE: Übersicht über Genentdeckungs-Strategie
EN:
Sequencing/Bioinformatics
DE: Sequenzierung/Bioinformatik
EN:
Gene Expression/cDNA library construction
DE: Genexpression/Konstruktion
cDNA-Bibliothek
EN: Gene Expression/Bioinformatics
DE:
Genexpression/Bioinformatik
EN: Construction of normalized
mouse calvaria libraries
DE: Konstruktion normalisierter Schädeldach-Bibliotheken
der Maus
EN: Sequence new clones
DE: Sequenzieren
neuer KLone
EN: Subtractive hybridization
DE: Subtraktive
Hybridisierung
EN: Develop LIMS Tools
DE: LIMS-Hilfsprogramme
entwickeln
EN: Clustering
DE: Clusterbildung
EN:
Evaluation of gene discovery
DE: Evaluation der Genentdeckung
EN:
Develop gene expression querie tools
DE: Abfrageprogramme für Genexpression
entwickeln
EN: Determine cDNAs for microarray construction
DE:
cDNAs für
Microarray-Konstruktion bestimmen
EN: Assess size of unigene
set
DE: Größe des Unigen-Sets
festlegen
EN: Construct microarray
DE: Microarray
konstruieren
EN: Hybridize with RNA grobes
DE: Mit
RNA-Sonden hybridisieren
EN: Analyze gene expression data
DE:
Genexpressionsdaten analysieren
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2
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- EN: Identification of Novel Clones by Subtractive Hybridization
DE:
Identifizierung neuartiger Klone durch Subtraktive Hybridisierung
EN:
HYBRIDIZE CHIP
DE: CHIP HYBRIDISIEREN
EN: ANALYZE
SIGNAL INTENSITIES
DE: SIGNALINTENSITÄTEN ANALYSIEREN
EN:
IDENTIFY « WERK » HYBRIDIZATION
SIGNALS
DE: « SCHWACHE » HYBRIDISIERUNGSSIGNALE IDENTIFIZIEREN
EN:
REARRAY CLONES
DE: KLONE ERNEUT MITTELS ARRAY ÜBERPRÜFEN
EN:
SEQUENCE CLONES
DE: KLONE SEQUENZIEREN
EN: ELEMENTAL
DISPLAY
DE: ELEMENTARE ANZEIGE
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3
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- EN: Construction of HAGC Mouse Calvaria Unigene Chip
DE:
Konstruktion HAGC Unigene-Chip von Schädeldach der Maus
EN:
Sequencing Bioinformatics
DE: Sequezierung/Bioinformatik
EN:
Gene Expression/cDNA Library Construction
DE: Genexpression/Konstruktion
cDNA-Bibliothek
EN: Arrayed and glycerol stocked 27,648
clones from normalized mouse calvaria libraries
DE: Mittels
Array analysierte und in Glycerol aufbewahrte 27,648 Klone aus normalisierter
Bibliothek des Schädeldaches
der Maus
EN: Amplified and gel verified 27,648 cDNA inserts
DE:
Vervierfältigte
und mittels Gelelektrophorese verifizierte 27,648 cDNA-Inserts
EN:
Constructed 18 microarrays
DE: 18 konstruierte Microarrays
EN:
7,790 cDNAs Sequenced
DE: 7.790 sequenzierte cDNAs
EN:
Subtractive Hybridization of 26,112 cDNAs
DE: Subtraktive Hybridisierung
von 26.112 cDNAs
EN: Blast sequences: pubEST, genbank
NR, Incyte
DE: Blast-Sequenzen: pubEST, Genbank NR, Incyte
EN:
Evaluation of Gene Discovery
DE: Evaluation der Genentdeckung
EN:
Determine cDNAs for microarray construction
DE: cDNAs für Microarray-Konstruktion
bestimmen
EN: Rearray 4,608 cDNAs from 82 96-well plates
DE:
4.608 cDNAs aus 82 96-Well-Platten erneut mittels Array überprüfen
EN:
Amplify/gel verify 4,608 cDNA Inserts
DE: 4.608 cDNA-Inserts
vervielfältigen/über Gelelektrophorese
verifizieren
EN: Purify 4,608 cDNA Inserts and construct
microarray
DE: 4.608 cDNA-Inserts reinigen und Microarray konstruieren
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4
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- EN: Removal of High Abundant Nucleic Acids from Libraries
DE:
Entfernung von hoch vorkommenden Nukleinsäuren aus Bibliotheken
EN:
Percent Mitochondrial Contamination
DE: Prozent mitochondriale
Kontamination
EN: Number of Sequences
DE: Sequenzanzahl