ES2296623T3 - Hibridacion sustractiva basada en micromatrices. - Google Patents

Hibridacion sustractiva basada en micromatrices. Download PDF

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Katherine Call
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Abstract

Un método para analizar una población heterogénea de ácido nucleico, que comprende las etapas de (a) proporcionar moléculas de ácido nucleico de dicha población inmovilizadas sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz; (b) exponer dicha micromatriz en condiciones de hibridación a un conjunto de sondas marcadas generadas a partir de secuencias de ácido nucleico conocidas o de secuencias que se sospecha están presentes en dicha población; (c) detectar una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes en la micromatriz que se hibridan débilmente o que no se hibridan con dicho conjunto de sondas, en el que se considera que dichas moléculas de ácido nucleico no coincidentes se hibridan débilmente con dicho conjunto de sondas si la hibridación produce una señal de hibridación que tiene una relación señal-ruido (S/R) inferior a 0, 5; y determinar la identidad de dicha una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes; (d) secuenciar dicha una o más moléculas de ácido nucleicono coincidentes de la etapa (c); (e) añadir sondas marcadas respectivamente que correspondan a cada una de dichas una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes con dicho conjunto de sondas para generar un conjunto de sondas expandido; y (f) repetir las etapas (a) a (e) una o más veces usando dicho conjunto expandido de sondas en lugar de dicho conjunto de sondas.

Description

Hibridación sustractiva basada en micromatrices.
Antecedentes de la invención
La elucidación de los mecanismos que dictan el funcionamiento normal de las células vivas requiere una comprensión detallada de la información codificada en todo el genoma completo. Habitualmente se usan secuencias de ARN mensajero (mRNA) para mapear y secuenciar los genes contenidos en los genomas de diferentes organismos. La información de secuencia se usa para evaluar la modificación genética de una célula u organismo concreto de interés. Sin embargo, los mARNs se producen a diferentes niveles en diferentes tipos de células y durante diferentes puntos del desarrollo. La distribución de tipos de mARN, sus expresiones reguladas de desarrollo y específicas de tipo de célula, y sus traducciones en proteína, producen el carácter único de un tipo celular concreto.
Las poblaciones de moléculas de ácido nucleico, tales como ARNs mensajeros, se estudian habitualmente usando librerías de ácidos nucleicos. Las librerías pueden incluir librerías genómicas, que pueden construirse colocando aleatoriamente fragmentos de ADN separados de un genoma completo en un vector de clonación adecuado. Para las librerías obtenidas a partir de ADN de genomas de mamíferos, la mayoría de clones genómicos aleatorios contienen ADN no codificador, ADN altamente repetido, o ambos.
Un segundo tipo de librería se obtiene a partir de moléculas de ADN complementario (cADN). Dichas librerías se construyen a partir de ADN que se transcribe inversamente a partir de mARN aislado de una fuente de interés. Por consiguiente, las librerías de cADN contienen principalmente ADN que codifica genes.
Las diferentes especies de mARN no están igualmente representadas en una célula dada. En vez de eso, las moléculas de mARN se distribuyen en tres clases de frecuencias: (1) superprevalente (que consiste en aproximadamente
10-15 mARNs que, juntos, representan el 10-20% de la masa total de mARN); (2) intermedio (que consiste en aproximadamente 1-2.000 mARNs que, juntos, representan el 40-45% de la masa total de mARN), y (3) complejo (que consiste en aproximadamente 15-20.000 mARNs que, juntos, representan el 40-45% de la masa total de mARN). Davidson y Britten, SCIENCE 204: 1052-1059 (1979).
La existencia de molécula de ARN de complejidad supervalente o intermedia dentro de una célula puede ser un obstáculo significativo para la identificación y el secuenciamiento de especies de mARN de baja abundancia. En la creación de librerías de ácidos nucleicos adecuadas para el secuenciamiento, los mARNs superprevalentes dificultan el aislamiento y el análisis de mARNs de menor abundancia. Puesto que la mayoría de los clones aislados a partir de una librería de cADN procederán de mARNs prevalentes intermedios y superprevalentes, se dedica un tiempo y un esfuerzo significativos a resecuenciar las especies de mARN prevalentes conocidas previamente, y deben secuenciarse grandes cantidades de especies de mARN a fin de aislar y secuenciar especies de mARN de baja abundancia. Por tanto, el ritmo de descubrimiento de genes a partir de librerías puede estar limitado por la naturaleza redundante de los mARNs presentes en una célula dada. La presencia de mARNs altamente abundantes también dificulta la comparación de diferencias en genes activos observadas en células diferentes de tipos de tejido relacionados, en células de diferentes etapas de desarrollo, el efecto de estímulos, y la expresión génica diferencial entre células que funcionan normalmente y células anormales (por ejemplo, células de tejido normal comparadas con tejidos tumorales).
Resumen de la invención
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de un método de alta capacidad altamente eficaz para la identificación y eliminación de redundancia en una población heterogénea de moléculas de ácido nucleico.
El método incluye proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico, inmovilizar la muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico en una micromatriz, e hibridar una o más sondas marcadas correspondientes a fragmentos previamente secuenciados o dispuestos en matriz. Se detectan los fragmentos que se hibridan a las sondas marcadas, y se identifica y secuencia al menos un fragmento no hibridado o hibridado débilmente a las sondas marcadas.
Los fragmentos de ácido nucleico pueden ser ADN ó ARN, y opcionalmente pueden ser clonados en un vector. En algunas realizaciones, los fragmentos de ácido nucleico son miembros de una librería genómica de cADN. La librería puede estar normalizada o no normalizada. En otras realizaciones, los fragmentos de ácido nucleico son fragmentos de PCR. En algunas realizaciones, los fragmentos de ácido nucleico son amplificados, por ejemplo mediante PCR.
Los fragmentos de ácido nucleico son inmovilizados a continuación sobre una superficie sólida, por ejemplo en una micromatriz. Preferiblemente, la superficie sólida es vidrio. Las sondas marcadas que corresponden a fragmentos previamente secuenciados o dispuestos en matriz (es decir, la sonda de sustracción) se hibridan a los fragmentos de ácido nucleico inmovilizados. Las marcas de ácido nucleico pueden ser fluorescentes, luminiscentes o radiactivas, etiquetas biotiniladas, haptenadas u otras etiquetas químicas que permitan una fácil detección de las sondas marcadas. Generalmente, las sondas no hibridadas se eliminan. Los fragmentos de ácido nucleico que no se hibridan o que se hibridan débilmente a una sonda marcada son aislados y reunidos a continuación con el conjunto anterior de sondas para generar un nuevo conjunto mayor de sondas. Los fragmentos aislados recién formados son secuenciados y sus secuencias se comparan con las de una base de datos de secuencias.
Los métodos de la presente invención implican un protocolo de sustracción que identifica y aísla fragmentos de ácido nucleico no redundantes a partir de una población de moléculas de ácido nucleico. Si se desea, se reitera el protocolo, a fin de crear un conjunto de fragmentos que sea más afín hacia los genes no caracterizados previamente con cada iteración sucesiva. Por consiguiente, con cada ronda de sustracción, las sondas correspondientes a los fragmentos recién aislados se marcan y se añaden a la sonda de sustracción previa, y esta nueva sonda de sustracción se hibrida a la siguiente micromatriz que contiene fragmentos de ácido nucleico seleccionados aleatoriamente. Dicho procedimiento se repite varias veces, preferiblemente acompañado de la adición de secuencias recién identificadas a la sonda de sustracción previa. Por tanto, el método permite la identificación y el aislamiento de fragmentos de ácido nucleico no redundantes o mínimamente solapados procedentes de fuentes de interés, y acelera el ritmo de descubrimiento de nuevos genes. En una realización preferida, los clones no redundantes que se aíslan usando los métodos de la invención se identifican, se seleccionan y se inmovilizan a una nueva micromatriz para producir un conjunto unigénico.
Se pueden contemplar numerosas aplicaciones para los métodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el método puede usarse en cualquier aplicación en la que se desee el enriquecimiento de las secuencias de interés. De forma alternativa, el método puede usarse para eliminar fragmentos de ácido nucleico no deseados de una población de moléculas de ácido nucleico. Un conjunto no limitante de usos incluye:
I.
Un método basado en micromatrices para acelerar el ritmo de descubrimiento de secuencias expresadas de mARN/cADN y para facilitar la construcción de un conjunto de moléculas de ácido nucleico para identificar mensajes presentes en pequeñas cantidades de moléculas de ácido nucleico. Dicho método permite aumentar el descubrimiento de cADNs expresados y facilitar la construcción de conjuntos de cADNs de excepción.
II.
Un método basado en micromatrices para acelerar el ritmo de descubrimiento de secuencias genómicas y para facilitar el aislamiento de fragmentos de ADN correspondientes al genoma completo o a subregiones de interés. En esta solicitud, el método proporciona un descubrimiento acelerado de clones genómicos, una construcción mejorada de un conjunto de clones genómicos no redundantes o mínimamente solapados. También se proporciona un descubrimiento acelerado de clones que mapean una región de interés, una construcción mejorada de un conjunto de clones genómicos en una región de interés del genoma, y un llenado mejorado de los huecos de los mapas genómicos. Esto puede ser útil, por ejemplo, para facilitar el mapeado génico de enfermedades y para la identificación génica de enfermedades.
III.
Un método basado en micromatrices para enriquecer y/o aislar secuencias de ADN que son únicas en una población en comparación con otra población. La invención también permite la identificación de secuencias únicas o nuevas en un organismo frente a otro, incluyendo moléculas de ácido nucleico de diferentes cepas, por ejemplo, patogénicas frente a no patogénicas, y de diferentes especies. Las secuencias pueden ser, por ejemplo, mARN/cADN, genómicas, extracromosomales, plásmidos o ácidos nucleicos virales.
IV.
Un método basado en micromatrices para acelerar el descubrimiento de secuencias de ADN relacionadas. A la inversa, el método permite la identificación de secuencias relacionadas entre organismos íntima o distantemente relacionados. Las secuencias pueden ser, por ejemplo, mARN/cADN, genómicas, extracromosomales, plásmidos y ácidos nucleicos virales.
V.
Un método basado en micromatrices para acelerar la eliminación de secuencias no deseadas de una población de moléculas de ácido nucleico. En otra realización, la invención proporciona la eliminación de secuencias de ADN no deseadas, que incluyen secuencias de ADN contaminantes y secuencias íntimamente relacionadas con las identificadas previamente.
VI.
Un método basado en micromatrices para identificar cambios en el número de copias de una o más secuencias de ADN en dos poblaciones diferentes de ácidos nucleicos.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares a los descritos en el presente documento en la práctica o en la evaluación de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. En caso de conflicto prevalecerá la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Beltz y col. (1983), Methods in Enzymology, 100 266-85 describe el aislamiento de familias multigénicas y la determinación de homologías mediante métodos de hibridación de filtrado.
Heller y col. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, páginas 2150-2155 presenta el uso de micromatrices de cADN en el descubrimiento y análisis de genes relacionados con enfermedades inflamatorias.
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Schena y col. Octubre de 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. vol 93 (20), páginas 10614-10619 presenta la monitorización de expresión de 1000 genes basada en micromatrices.
Nguyen y col. (1995), Genomics, US, Academic Press, San Diego, vol. 29, páginas 207-216 describe el uso de hibridación cuantitativa de clones de cADN dispuestos en matriz para evaluar la expresión génica diferencial en el timo de murina.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra una visión global de la estrategia de descubrimiento de genes.
La Figura 2 es una representación de una micromatriz usada para la identificación de nuevos genes.
La Figura 3 es un diagrama de flujo que muestra la construcción de un chip unigénico de calvaria de ratón.
La Figura 4 es un gráfico de línea que muestra la eliminación de genes mitocondriales contaminantes de una librería.
Descripción detallada de la invención
Para mayor comodidad, se muestra a continuación el significado pretendido para determinados términos y expresiones utilizados en el presente documento.
"Genes conocidos" o "secuencias conocidas" son aquellos cuyas secuencias pueden encontrarse en una base de datos de secuencias pública o privada.
"Nuevos genes" o "nuevas secuencias" son moléculas de ácido nucleico cuyas secuencias no se encuentran disponibles públicamente, por ejemplo, no se encuentran en ninguna base de datos de secuencias pública o privada.
"Heterogéneo" significa un conjunto de moléculas de ácido nucleico en el que el conjunto incluye al menos dos moléculas de ácido nucleico que difieren en la secuencia. Los ácidos nucleicos heterogéneos incluyen, por ejemplo, poblaciones de ARN aisladas de células, tejidos y/u organismos.
Hibridación "débil", tal como se define en el presente documento, se refiere a una señal de hibridación que tiene una relación señal-ruido (S/R) inferior a 0,5, identificada usando el sistema de análisis de datos del software de ArrayVision. La S/R es una medida de la intensidad restada de fondo de la señal del punto dividida por la desviación estándar de la intensidad de fondo.
"Ácido nucleico no redundante" es un ácido nucleico que no ha sido identificado previamente en una población de moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, una población heterogénea de moléculas de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico no redundante es una secuencia presente en un bajo número de copias en una población de moléculas de ácido nucleico.
"Conjunto único de genes" es un conjunto de genes en los que cada miembro del conjunto corresponde a una secuencia representada en un número bajo de copias en una población de células. Por ejemplo, un conjunto único de genes corresponde a secuencias presentes en unas pocas copias por célula. Alternativamente, un conjunto único de genes puede denominarse conjunto de genes de abundancia reducida. En algunas realizaciones, el conjunto único de genes incluye miembros presentes en 100, 50, 25, 15, 10, 5, 2 copias, o incluso en 1 copia por célula. Por tanto, un conjunto único de genes de un tipo celular particular o de una población concreta, en algunas realizaciones, contiene una copia de cada gen expresado en dicho tipo de célula.
"Sonda compleja" es aquella que contiene muchas moléculas de ADN o de ARN diferentes. Tal como se usa en el presente documento, la sonda compleja contiene secuencias de ácido nucleico que son complementarias a secuencias conocidas.
La presente invención proporciona un método altamente eficaz y de elevada capacidad para la identificación y la eliminación de redundancia en una población de moléculas de ácido nucleico usando una selección reiterativa que implica hibridación sustractiva con un conjunto de sondas complejas y con tecnología de micromatrices. Los fragmentos de ácido nucleico elegidos aleatoriamente de una librería de clonación se disponen en micromatrices y se exponen, en condiciones de hibridación, a una sonda compleja marcada generada a partir de secuencias conocidas (por ejemplo, secuencias obtenidas de una base de datos pública tal como Genbank, pubEST). Sólo se secuencian los clones que se hibridan débilmente, o que no se hibridan, con dicho primer conjunto de sondas; los clones que se hibridan con dicho primer conjunto de sondas no se secuencian. Las secuencias obtenidas en esta etapa se comparan con bases de datos públicas de moléculas de ácido nucleico identificadas previamente (por ejemplo, BLAST, pubEST, Genbank NR). Estas secuencias se añaden al conjunto de sondas inicial para generar un segundo conjunto de sondas sustractivas. Dicho conjunto de sondas sustractivas se hibrida con un segundo grupo de clones seleccionados aleatoriamente de la librería. La sonda se hibrida con ácidos nucleicos complementarios a los ácidos nucleicos de las secuencias iniciales conocidas públicamente, así como con ácidos nucleicos identificados en la primera ronda de hibridación. Se repite el procedimiento de expansión del conjunto de sondas tras sucesivas rondas de hibridación hasta que esencialmente todos los clones elegidos aleatoriamente se hibridan con una sonda marcada, lo cual indica que todos los clones no caracterizados previamente han sido secuenciados. Por consiguiente, los métodos de la presente invención eliminan la necesidad
de re-secuenciar clones conocidos, problema que reduce la eficacia de otros métodos conocidos en la técnica.
La primera etapa implica el aislamiento de una población heterogénea de moléculas de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser fragmentos de moléculas de ARN o de ADN de longitud completa. En algunas realizaciones, la población heterogénea de moléculas de ácido nucleico puede incluir fragmentos de ácido nucleico elegidos aleatoriamente de una población de moléculas de ácido nucleico. Dichos fragmentos pueden ser ADN o ARN, y opcionalmente pueden estar clonados en vectores. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico incluyen cADN de una librería de ácido nucleico de secuencias conocidas. En una realización, la librería es una librería genómica. En otra realización, la librería es una librería de cADN. En cualquier realización, la librería puede ser una librería normalizada o una librería no normalizada. Alternativamente, la población de fragmentos de ácido nucleico puede no ser parte de una librería, por ejemplo, fragmentos de PCR.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se amplifican usando PCR u otros métodos de amplificación. A continuación, el ADN se inmoviliza en una micromatriz sobre una superficie, preferiblemente vidrio. En algunas realizaciones, el ADN dispuesto en matriz incluye oligonucleótidos sintetizados sobre el vidrio. En una realización preferida, los fragmentos de PCR son dispuestos en matriz usando un observador de micromatrices.
A continuación se deja que las moléculas de ADN inmovilizadas entren en contacto con un conjunto de sondas marcadas que contiene moléculas de ácido nucleico de secuencias conocidas o definidas en condiciones que permitan la hibridación. Los protocolos estándar de marcado para ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en Sambrook y col.; Kambara y col., BIOTECHNOLOGY 6: 816-821 (1988); Smith y col., NUC. ACIDS RES. 13: 2399-2412 (1985). Las marcas de ácido nucleico pueden ser fluorescentes, luminiscentes o radiactivas, etiquetas biotiniladas, haptenadas u otras etiquetas químicas que permitan una fácil detección de las sondas marcadas. Las marcas fluorescentes son ventajosas para los métodos descritos en el presente documento, ya que se usan de forma rutinaria con instrumentación automatizada para el análisis simultáneo de alta capacidad de muestras múltiples. Metzker y Gibbs han descrito recientemente una familia de nucleótidos marcados fluorescentemente basados en los fluoróforos Cy con características espectrales mejoradas. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.728.529, incorporada a la presente memoria a modo de referencia. Los conjuntos alternativos de fluoróforos incluyen fluoróforos basados en rodamina, TARAM, ROX, JOE y FAM; los fluoróforos BigDye® (Applied Biosystems, Inc.), el grupo dansilo, la fluoresceína y los derivados sustituidos de la fluoresceína, los derivados de la acridina, los derivados de la coumarina, las ftalocianinas, la tetrametilrodamina, el Texas Red®, los 9-(carboxietil)-3-hidroxi-6-oxo-6H-xantenos, los fluoróforos DABCYL® y BODIPY® (Molecular Probes, Eugene, OR).
Después de la etapa de hibridación, se detecta la cantidad de marca en cada posición de la micromatriz, por ejemplo de la micromatriz de ADN. Véase Brown y Botstein, Nat. Genet. 21: 33-37 (1999). Las micromatrices son una matriz ordenada de moléculas de ADN de cadena doble o monocatenarias colocadas en un material de soporte en una organización espacialmente separada. En contraste con las "macromatrices" en filtro, que son habitualmente grandes láminas de nitrocelulosa, las micromatrices colocan el ADN en una organización empaquetada de manera más densa, de tal forma que pueden meterse hasta 10.000 moléculas de ADN en una región típicamente de 1-4 centímetros cuadrados. Las micromatrices habitualmente usan vidrio recubierto como soporte sólido, en contraposición al material basado en nitrocelulosa de las matrices de filtro. Teniendo una matriz ordenada de muestras de ADN, la posición de cada muestra puede seguirse y relacionarse con la muestra original a partir de la cual se generó el ADN de la matriz. Se han descrito métodos y aparatos para preparar una micromatriz. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 5.445.934 y 5.800.992.
El proceso de creación de una micromatriz implica una serie de etapas en las que se procesa un conjunto de colonias bacterianas que contienen una librería de cADN para obtener un fragmento amplificado de ADN purificado derivado del injerto del vector mantenido en una cualquiera de las colonias de bacterias. La serie de etapas puede llevarse a cabo manualmente o mediante el uso de estaciones de trabajo robotizadas, tales como máquinas de PCR y robots de manejo de líquidos. En el método preferido, las etapas se llevan a cabo usando placas multipocillo de hasta 96 pocillos, 384 pocillos o 1536 pocillos. Sin embargo, otras configuraciones son posibles. La micromatriz se construye usando un observador robótico tal como el instrumento desarrollado por Molecular Dynamics, o en el laboratorio de Patrick Brown, Universidad de Stanford (ver anterior). Otra característica del proceso de micromatriz es que el análisis de datos se lleva a cabo automáticamente usando software de análisis de datos, tal como ArrayVision. El proceso completo desde el seguimiento del clon, la construcción de la micromatriz, hasta los resultados, está completamente integrado de tal modo
que las colonias bacterianas que van a ser procesadas para secuenciamiento pueden ser identificadas fácilmente.
En diversas realizaciones, una micromatriz de acuerdo con la invención incluye 100; 1.000; 10.000, o incluso 100.000 ó más muestras de ADN.
Las muestras de ADN de la micromatriz se hibridan con sondas de ARN o ADN que se han marcado, por ejemplo con fluorescencia, para identificar si la muestra con la sonda contiene una molécula que es similar o idéntica a la muestra de ADN de la micromatriz. En realizaciones preferidas, se puede hibrida una sonda compleja con la micromatriz. Una sonda compleja es aquella que contiene muchas moléculas de ADN o de ARN diferentes.
Las moléculas sonda se hibridan con una molécula de ADN en la micromatriz en condiciones que permitan la formación de híbridos entre moléculas sonda y una molécula, o varias, de ADN idéntica o casi idéntica de la micromatriz. La presencia de moléculas híbridas ADN-sonda se detecta, por ejemplo, mediante un instrumento de detección de fluorescencia. Si la señal de hibridación es débil o no existente en una posición de ADN concreta, entonces la correspondiente molécula de ADN o de ARN está ausente en la sonda. En diversas realizaciones se usan simultáneamente 1, 2, 3, 4 ó mas moléculas sonda.
En algunas realizaciones, el proceso se lleva a cabo mediante rondas iterativas de construcción de micromatriz, hibridación y análisis. El método reduce la cantidad de secuenciamiento necesario para obtener un conjunto único de genes de un tamaño dado. En diversas realizaciones, se puede usar para eliminar muestras repetidas, por ejemplo cADNs duplicados, muestras con ADN bacteriano o mitocondrial, y muestras sin ningún injerto de cADN.
Existe una serie de ventajas en la sustracción basada en micromatrices frente a los métodos de matriz de filtro. Por ejemplo, los presentes métodos administran la necesidad de propagar clones en bacterias antes del secuenciamiento. Por ejemplo, los métodos en filtro generalmente presentan en la matriz colonias bacterianas en las que está contenido el cADN clonado. Las colonias deben cultivarse durante varios días, someterse a lisis para liberar el ADN y fijar el ADN sobre el filtro. La hibridación con las matrices de filtro de colonias puede verse afectada por los residuos bacterianos y la baja cantidad de ADN liberado de la colonia.
Una segunda ventaja de los presentes métodos es que las iteraciones se pueden llevar a cabo más rápidamente con micromatrices que con ensayos de filtro usando colonias bacterianas. La propagación y el análisis de clones en bacterias pueden requerir hasta varios días. Por el contrario, el tratamiento con la sonda de una micromatriz subsiguiente puede comenzar menos de 24 h después de completar el análisis de una matriz.
Otra ventaja de las micromatrices es la capacidad de usar sondas marcadas con fluorescencia. Esto proporciona un método no radiactivo para la detección de la hibridación. Por el contrario, la hibridación de filtro generalmente usa sondas marcadas con fósforo o azufre radiactivos. Las micromatrices pueden hibridarse con múltiples sondas simultáneamente. Por el contrario, las matrices de filtro sólo pueden hibridarse con una sonda cada vez.
Otra ventaja adicional de las micromatrices es la reproducibilidad y la sensibilidad de las señales de hibridación. Habitualmente, las señales de hibridación son más elevadas y la sensibilidad es mayor en las micromatrices en comparación con las matrices de filtro. Esto permite que la complejidad de la sonda sea mayor y que aún así se consiga una señal de hibridación positiva en la micromatriz. Además, las matrices de filtro muestran a menudo señales de fondo falsas que no están relacionadas con la hibridación productiva entre la sonda y el ADN del filtro.
Además existe una serie de ventajas en la construcción de un conjunto único de genes mediante sustracción basada en micromatrices frente a otros métodos. Por ejemplo, los métodos que usan hibridación selectiva en disolución, como los usados en los procedimientos de normalización o de sustracción de cADN, habitualmente dan como resultado la pérdida de determinados clones de baja abundancia. Por el contrario, usando la estrategia iterativa basada en micromatrices, todos los clones de la librería son capaces de ser identificados. Se descubrirá un clon de cADN de baja abundancia después de múltiples rondas iterativas de hibridación. Otra ventaja de la estrategia basada en micromatrices para la preparación de conjuntos únicos de cADNs es que es más probable que los clones de cADN resultantes estén cerca de tener una longitud completa. Por el contrario, otros métodos de sustracción y normalización a menudo dan lugar a cADNs cortos e incompletos.
Generalmente, una señal débil o la ausencia de señal en una posición concreta de la matriz, corresponde a la presencia de ADN que no se ha hibridado o que se ha hibridado débilmente con las secuencias representadas en el conjunto de sondas. Los clones con una señal débil o sin señal son secuenciados. El secuenciamiento se puede realizar usando métodos de secuenciamiento de ADN bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Maxam y Gilbert, PROC NATL ACAD SCI USA 74: 560-564 (1977); Sanger y col., PROC NATL ACAD SCI USA 74: 5463-5467 (1977); y la Patente de Estados Unidos Nº 5.821.058.
El análisis automatizado de los fragmentos en geles o en capilares ha reducido significativamente el trabajo relativo a la recolección y el procesamiento de la información de secuencia. Véase, por ejemplo, Prober y col., SCIENCE 238: 336-341 (1987); Smith y col., NATURE 321: 674-679 (1986); Luckey y col., NUCLEIC ACIDS RES 18: 4417-4421(1990); Dovichi, ELECTROPHORESIS 18: 2393-2399 (1997). Los fragmentos de ácido nucleico aislados y secuenciados en esta etapa se añaden al conjunto de sondas inicial. A menudo dichos fragmentos son secuenciados primero para determinar la presencia de moléculas de ácido nucleico no redundantes en la micromatriz. A continuación se comparan sus secuencias con bases de datos públicas de moléculas de ácido nucleico identificadas previamente (por ejemplo, mediante comparación de las secuencias en bases de datos disponibles públicamente).
El segundo conjunto de sondas sustractivas se usa en la siguiente ronda de hibridación que implica una segunda micromatriz generada a partir de un grupo diferente de clones elegidos aleatoriamente de la librería. Añadiendo los fragmentos de ácido nucleico recién identificados al conjunto de sondas sustractivas, las subsiguientes micromatrices de clones elegidos aleatoriamente de la librería son expuestas a un mayor número de sondas marcadas. Por consiguiente, los métodos de la presente invención eliminan el resecuenciamiento de clones conocidos.
\newpage
Según va aumentando el número de sondas marcadas con las sucesivas iteraciones, el número de clones "conocidos" marcados aumentará y quedarán menos clones sin marcar. Finalmente, con suficientes iteraciones, se marcarán todos los clones de las micromatrices de clones elegidos aleatoriamente de una librería dada, ya que todos los clones habrán sido secuenciados.
En un aspecto de la presente descripción, se genera una librería de clonación enriquecida en mARNs de baja abundancia. En una extensión de este método, las secuencias de baja abundancia se usan en la construcción de un chip que contiene ácidos nucleicos correspondientes a ARNs de baja abundancia. Dichos chips pueden usarse en una experimentación posterior (por ejemplo, en experimentos de visualización diferencial). En la Figura 1 se muestra una visión global de la estrategia para el descubrimiento de nuevos genes. En una realización adicional de la presente invención, los ácidos nucleicos contaminantes son eliminados de la librería de clonación.
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para reducir la redundancia en una muestra de moléculas de ácido nucleico. El método incluye proporcionar una muestra heterogénea de moléculas de ácido nucleico e inmovilizar la muestra de moléculas de ácido nucleico sobre una micromatriz. A continuación se hibridan una o más sondas marcadas correspondientes a moléculas de ácido nucleico previamente secuenciadas o dispuestas en micromatriz con las moléculas de ácido nucleico de la muestras inmovilizada. Preferiblemente, las sondas incluyen secuencias que se sabe están presentes en la muestra de moléculas de ácido nucleico. El método también incluye identificar al menos una molécula inmovilizada que se hibrida con las sondas marcadas, y proporcionar una segunda molécula de ácido nucleico que reconoce específicamente el ácido o ácidos nucleicos inmovilizados que se hibridan con la muestra. Si se desea, la segunda molécula de ácido nucleico puede ser marcada y usada como molécula sonda, y la muestra puede rehibridarse con una o varias moléculas sonda que incluyan la molécula sonda recién añadida. El proceso se puede repetir, si se desea, para eliminar progresivamente moléculas de ácido nucleico que ya han sido identificadas en la población de moléculas de ácido nucleico.
También se incluye en la memoria un método para identificar una pluralidad de secuencias no redundantes en una población de ácidos nucleicos proporcionando una muestra heterogénea de moléculas de ácido nucleico, inmovilizando la muestra de moléculas de ácido nucleico sobre una micromatriz, e hibridando una o más sondas marcadas con la muestra. Las sondas marcadas corresponden a una o más moléculas de ácido nucleico previamente identificadas en la muestra. Se identifica al menos una molécula de ácido nucleico de la muestra inmovilizada que se hibrida débilmente o que no se hibrida con las sondas marcadas. Se repite el proceso, si se desea, hasta que se ha identificado una pluralidad de secuencias no redundantes. La descripción también incluye las secuencias identificadas de acuerdo con dicho método, así como una micromatriz que incluye la pluralidad de secuencias.
La descripción puede adaptarse a cualquier propósito en el que el especialista desee enriquecer secuencias de interés o eliminar secuencias que no sean de interés. Los ejemplos de usos incluyen los siguientes, aunque sin estar limitados a los mismos:
I. Un método basado en micromatrices para acelerar el ritmo de descubrimiento de secuencias de mARN/cADN expresadas y para facilitar la construcción de un conjunto de secuencias correspondiente a transcritos únicos o de baja abundancia
En un aspecto, la descripción proporciona un aumento del descubrimiento de nuevos genes y una construcción mejorada de un conjunto de cADNs expresados. Esto puede llevarse a cabo mediante:
(a)
amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico;
(b)
inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
(c)
hibridar sondas marcadas procedentes de una fuente de ADN con los fragmentos de ADN inmovilizados dispuestos en micromatriz;
(d)
detectar fragmentos de ADN hibridados con una sonda marcada e identificar al menos un fragmento que no se hibrida o que se hibrida débilmente (es decir, sustracción);
(e)
determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas; y
(f)
reiterar las etapas (b) o (c) hasta (e) con secuencias previamente identificadas en el conjunto de sondas a fin de identificar otras secuencias adicionales y aumentar el conjunto único de genes.
II. Un método basado en micromatrices para acelerar la tasa de descubrimiento de secuencias genómicas y para facilitar el aislamiento de fragmentos de ADN correspondientes a un genoma completo o a subregiones de interés
En el caso de secuencias genómicas, puede ser deseable construir un conjunto de clones "mínimamente solapados", es decir, clones con la menor cantidad posible de secuencias solapadas. Por tanto, la invención permite aumentar el descubrimiento de clones genómicos, mejorar la construcción de un conjunto de clones genómicos no redundantes o mínimamente solapados y acelerar el descubrimiento de clones que mapean un gen de interés. El método también permite la construcción mejorada de un conjunto de clones genómicos en una región de interés del genoma. La capacidad de mapear fácilmente clones a una región de interés del genoma permite además al especialista rellenar fácilmente huecos en el mapa genómico, lo que facilita el mapeado de genes de enfermedades y la identificación de genes de enfermedades.
El método incluye:
(a)
amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico genómico;
(b)
inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
(c)
hibridar sondas marcadas (aisladas o agrupadas) procedentes de una fuente de ADN con fragmentos de ADN inmovilizados dispuesto en micromatriz (las sondas pueden ser secuencias de cADN/mARN o genómicas);
(d)
detectar fragmentos de ADN que se hibridan con una sonda marcada;
(e)
determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas; y
(f)
reiterar las etapas (b) o (c) hasta (e) con secuencias previamente identificadas en el conjunto de sondas a fin de identificar otras secuencias adicionales y aumentar el conjunto único de genes.
En particular, las regiones finales de secuencias previamente identificadas pueden usarse como sondas para "pasear" e identificar clones flanqueantes.
III. Un método basado en micromatrices para enriquecer y/o aislar secuencias de ADN (mARN/cADN, genómico, extracromosomal, plásmido y todos los demás) que son únicas en una población en comparación con otra población
Otro uso de la invención es para la identificación de secuencias (de cADN expresado o genómicas) únicas o nuevas en un organismo frente a otro. Esto incluye la identificación de ácidos nucleicos únicos en una cepa frente a otra (es decir, patogénica frente a no patogénica), así como la comparación de conjuntos únicos de genes a partir de especies íntimamente relacionadas y especies más distantes.
Puesto que se usan moléculas de ácido nucleico de más de un organismo fuente en esta aplicación, las etapas específicas del método son algo diferentes e incluyen:
(a)
amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico;
(b)
inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
(c)
hibridar sondas marcadas procedentes de una primera y de una segunda fuentes con los fragmentos de ADN inmovilizados dispuesto en micromatriz (las sondas pueden ser secuencias de cADN/mARN o genómicas);
(d)
detectar fragmentos de ADN que se hibridan con una sonda marcada de una primera fuente pero no con una segunda fuente, o viceversa; y
(e)
determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas.
IV. Un método basado en micromatrices para aumentar el descubrimiento de secuencias de ADN relacionadas (o conservadas) (mARN/cADN, genómico, extracromosomal, plásmido y todas las demás)
Lo contrario del anterior método permite el descubrimiento de secuencias relacionadas (en lugar de diferentes) en varias especies, incluyendo cepas bacterianas diferentes y organismos relacionados distantemente. El método incluye:
(a)
amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico;
(b)
inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
(c)
hibridar sondas marcadas (aisladas o agrupadas) con los fragmentos de ADN inmovilizados dispuesto en micromatriz, particularmente con menores restricciones de hibridación (las sondas pueden ser secuencias de cADN/mARN o genómicas);
(d)
detectar fragmentos de ADN que se hibridan con una sonda marcada (a menudo con una señal débil);
(e)
determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas; y
(f)
comparar secuencias de ADN obtenidas de otras secuencias de ADN disponibles para detectar secuencias que muestran homología pero que no son idénticas a otras secuencias conocidas.
V. Un método basado en micromatrices para acelerar el ritmo de eliminación de secuencias no deseadas
La descripción también proporciona la eliminación de secuencias de ADN no deseadas (cADN o genómicas) procedentes de cualquier población de ADN dispuesto en matriz. Este puede incluir ADN contaminante, así como cualquier ADN que no sea de interés, por ejemplo, secuencias íntimamente relacionadas con las ya identificadas. Este método incluye:
(a)
amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico;
(b)
inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
(c)
hibridar sondas marcadas, que son secuencias destinadas a eliminación, con fragmentos de ADN inmovilizados dispuestos en micromatriz;
(d)
detectar fragmentos de ADN hibridados con una sonda marcada e identificar al menos un fragmento que no se hibrida o que se hibrida débilmente (es decir, sustracción);
(e)
determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas; y
(f)
repetir las etapas (a), (b) o (c) hasta (e) con las secuencias previamente identificadas en el conjunto de sondas, si se considera necesario, a fin de eliminar secuencias no deseadas de la población de fragmentos.
VI. Un método basado en micromatrices para identificar cambios en el número de copias (por debajo o por encima) de secuencias de ADN (genómicas, extracromosomales, plásmidos y todas las demás) entre diferentes fuentes de ácidos nucleicos
La presente descripción también proporciona un método basado en micromatrices para identificar cambios en el número de copias (por debajo o por encima) de secuencias de ADN (genómicas, extracromosomales, plásmidos y todas las demás) entre diferentes fuentes de ácidos nucleicos. El método incluye:
(a)
amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico procedentes de una fuente dada;
(b)
inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
(c)
hibridar sondas marcadas (aisladas o agrupadas; con cualquier tipo de ácido nucleico -mARN/cADN, genómico, extracromosomal, plásmido y todos los demás- que generalmente corresponden al tipo de ácido nucleico dispuesto en micromatriz) de otra fuente con los fragmentos de ADN inmovilizados dispuestos en micromatriz;
(d)
detectar fragmentos de ADN que muestran ausencia de hibridación con una sonda marcada, o una hibridación significativamente menor o significativamente mayor. Dichas alteraciones en la intensidad de la señal reflejarán cambios en la abundancia; y
(e)
determinar la identidad de el(los) fragmento(s) de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas;
Ejemplo 1
Construcción de Micromatriz de cADN 1.1 Amplificación de cADN
Se generó una librería de cADN mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Se aislaron injertos de cADN procedentes de clones bacterianos usando Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR). Se añadieron veinticinco \mul de mezcla de PCR a cada pocillo de una placa de microtitulación de 384 pocillos a partir de una mezcla maestra de PCR que contenía 1.000 \mul de 10X tampón PCR, 800 \mul de dNTPs 2,5 mM, 400 \mul de cebador T3 (5 pmoles/\mul), 400 \mul de cebador T7 (5 pmoles/\mul) y 10 \mul de polimerasa Taq recombinante. La placa de PCR se inoculó de la placa de cultivo de una noche usando una herramienta de 384 puntas para transferir aproximadamente 1 \mul. Las placas fueron selladas con MicrosealA y colocadas en unidades alfa de máquinas de PCR MJ Research tetrad. Las reacciones se precalentaron a 95ºC durante 4 minutos, seguido de 35 ciclos de amplificación: 45 segundos a 95ºC, 1 minuto a 55ºC y 2,5 minutos a 72ºC.
La amplificación de los injertos de cADN se verificó mediante electroforesis de gel de agarosa en la que se cargaron 2 \mul de cada reacción PCR en un gel con un 1% de agarosa que contenía 500 ng/\mul de bromuro de etidio. Se añadieron 500 ng de patrón de peso molecular (extensión de 1 Kb, Promega) a cada gel para determinar el tamaño y cuantificar la amplificación. Las muestras fueron sometidas a electroforesis en 1X TAE (Tris Acetato, EDTA) a 150 miliamperios durante 30 minutos.
Los injertos de cADN amplificados fueron purificados de nucleótidos no incorporados y cebadores en placas filtrantes de fibra de vidrio de 384 pocillos tal como se indica a continuación: se añadieron 70 \mul de isotiocianato de guanidinio 5M (Sigma) a cada placa usando un transportador de líquidos Cyclone de 96 puntas; se transfirieron 25 \mul de reacción PCR desde la placa de microtitulación de PCR hasta la placa filtrante de fibra de vidrio y se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente. La placa filtrante se colocó en un colector de vacío y se secó. Se lavó la placa filtrante 2 veces con 70 \mul de isopropanol al 80% y se secó en un colector de vacío durante dos minutos. El productor de PCR purificado se eluyó de la placa filtrante de fibra de vidrio a una placa de recolección de 384 pocillos mediante adición de 50 \mul de agua, incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugación a 3.000 rpm durante 5 minutos. Los productos de PCR purificados fueron liofilizados hasta sequedad en un speed-vac en posición alta durante de 45 minutos a 1 hora. Los productos purificados fueron resuspendidos en 30 \mul de DMSO/agua al 50%.
1.2 Inmovilización de la Muestra
Se observó un máximo de 4.608 fragmentos de PCR diferentes en portaobjetos de vidrio por duplicado usando un observador de micromatriz Generation III (Gen III) de Amersham/Molecular Dynamics. Se colocaron doce placas de microtitulación de fondo en U de 384 pocillos en el hotel del observador Gen III. Se colocaron hasta 36 portaobjetos de vidrio en el observador, y se observaron con ADN manteniendo la humedad de la cámara de observación en el 55%. Se observaron seis portaobjetos por acceso de placa fuente. Antes de acceder al siguiente conjunto de plantillas de PCR, se lavó la casete de 12 puntas como se indica a continuación: 1 segundo en KOH 0,2 M, 1 segundo en etanol al 95% y 2 segundos en agua destilada. Después de la observación, los portaobjetos fueron secados al aire durante 1 hora a temperatura ambiente. Los fragmentos PCR fueron ligados al vidrio mediante reticulación con UV en un Stratalinker (Stratagene) a 5.000 julios.
Ejemplo 2
Síntesis de Sondas
Los injertos de cADN para clones verificados en secuencia fueron amplificados en placas PCR de 96 pocillos tal como se ha descrito previamente para las placas de 384 pocillos, con la excepción de que el volumen de reacción PCR fue de 50 \mul. La amplificación se verificó mediante electroforesis de gel de agarosa tal como se ha descrito previamente. Los fragmentos de PCR fueron purificados usando placas filtrantes de fibra de carbono de 96 pocillos y una resina de unión de ADN tal como se indica a continuación: se añadieron 100 \mul de resina de purificación de PCR Wizard (Promega) a cada pocillo de una placa filtrante de 96 pocillos usando un pipeteador de 12 canales; se añadieron los 50 \mul de reacción PCR a la resina, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 minuto; a continuación se colocó la placa en un colector de vacío durante 1 minuto, hasta sequedad. Se lavó brevemente cada placa con 200 \mul de isopropanol al 80% antes de eliminar la disolución en el colector de vacío, y la flaca filtrante se secó bien mediante vacío. El producto de PCR purificado fue eluido mediante la adición de 50 \mul de agua destilada esterilizada seguida de centrifugación a 3.000 rpm durante 5 minutos en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Las reacciones PCR purificadas fueron reunidas y se purificaron 100 \mug de la reacción de PCR reunida en columnas de purificación PCR Qiagen. El conjunto de PCR repurificado se verificó mediante electroforesis de gel como se ha descrito previamente. Se determinó la concentración de PCR reunido espectrofotométricamente y se ajustó la concentración a 100 ng/\mul usando agua destilada esterilizada.
El conjunto de fragmentos PCR purificados se usó como plantilla para la síntesis de ARN en una reacción de transcripción in vitro. La reacción PCR purificada (500 ng) se añadió a una reacción de 20 \mul que contenía 1X tampón de transcripción, 0,5 mM de cada rNTP, DTT 37 mM y 10 unidades de polimerasa de ARN T7 ó T3. La reacción se incubó a 37ºC durante 90 minutos. La plantilla de ADN se eliminó mediante la adición de 1 unidad de ADNasa RQ1 e incubación a 37ºC durante 30 minutos. Los nucleótidos no incorporados fueron eliminados mediante purificación en una Columna RNA Easy (Qiagen).
Se sintetizó una sonda fluorescente a partir de la plantilla de ARN sintetizada in vitro en una primera reacción de marcado de cadena tal como se indica a continuación: se incubaron 100 ng de plantilla de ARN con 0,5 \mug de hexámeros aleatorios en un volumen final de 10 \mul durante 10 minutos a 70ºC. Se enfrió la reacción en hielo durante 5 minutos, seguido de la adición de una mezcla de reacción que contenía 1X tampón de transcripción inversa (Tris 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM), DTT 10 mM, dGTP, dTTP, dATP 100 \muM, dCTP 50 \muM, Cye3 dCTP ó cye5 dCTP 50 \muM, y 200 unidades de transcriptasa inversa Superscript II (Gibco BRL, #18089-011). Se incubó la reacción a 42ºC durante 90 minutos. Se hidrolizó la plantilla de ARN mediante la adición de 1 \mul de NaOH 5 M e incubación a 37ºC durante 10 minutos. Se neutralizó el NaOH añadiendo 10 \mul de MOPS 2M (ácido libre). Los nucleótidos no incorporados y los cebadores fueron eliminados mediante purificación en columnas GFX (Pharmacia). Las sondas fueron liofilizadas y resuspendidas en 30 \mul de tampón de hibridación que contenía un 50% de formamida, 5X SSC, SDS al 0,2%, 1X Denhardt's, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón y 1 \mug de oligo-dA(80).
Ejemplo 3
Identificación de Nuevos Genes
El procedimiento para identificar nuevos genes se muestra en la Figura 2.
3.1 Hibridación
Las sondas se desnaturalizaron a 100ºC durante 10 minutos y se añadieron al portaobjetos de la micromatriz. Los portaobjetos fueron cubiertos con cubreobjetos de vidrio (Coming) e incubados durante de 18 a 24 horas a 42ºC en una cámara humidificada. Los portaobjetos hibridados se lavaron dos veces con 2X SSC que contenía un 0,1% de SDS durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de 2 lavados en 0,1 X SSC que contenía un 0,1% de SDS a 42ºC durante 10 minutos. Los portaobjetos fueron sumergidos varias veces en agua destilada y se secaron en aire filtrado a alta presión. La hibridación de sondas fluorescentes se detectó mediante el escaneo de los portaobjetos en un escáner confocal Generation III (Gen III) (Amersham/Molecular Dynamics).
3.2 Adquisición de Datos
Las imágenes del portaobjetos se analizaron con el software de análisis de imágenes ArrayVision (Imaging
Research) para el análisis de detección de manchas, la determinación del fondo localizado, la distribución de las intensidades de señal en una mancha, y las relaciones de señal-ruidos. Los datos fueron exportados en forma de fichero delimitado por tabulador y se exportaron a una base de datos Oracle. La normalización y la determinación de la calidad estadística se llevaron a cabo con herramientas de análisis de conjuntos de datos basadas en Web con herramientas de navegador Web desarrolladas en el Centro Hoechst-Ariad Genomics Center. Los datos fueron clasificados en base a la relación señal-ruido, y los ADNs que presentaron una señal por encima del ruido de fondo pero por debajo de la relación señal-ruido media fueron caracterizadas en mayor profundidad mediante secuenciamiento EST.
3.3 Secuenciamiento y Comparación con Librerías Conocidas
Los clones que no se hibridaron en la etapa 3.1 fueron fijados como objetivo para el secuenciamiento EST (etiqueta de secuencia expresada, del inglés "expressed sequence tag"), usando técnicas bien conocidas en la técnica. Adams y col., Science 252: 1651-1656 (1991). Se escrutaron las secuencias frente a las bases de datos de dbEST público, EST de ratón y Lifeseq (Incyte). Todos los clones recién caracterizados o identificados como secuencias previamente conocidas fueron añadidos al conjunto de sondas (sustracción) para evitar la identificación múltiple del mismo gen durante posteriores hibridaciones.
3.4 Hibridación Sustractiva Reiterativa
La siguiente micromatriz que contiene clones tomados aleatoriamente se hibridó con una nueva sonda que incluía todos los clones previos, y además contenía cualesquier clones nuevos identificados mediante el secuenciamiento EST. Los clones identificados con esta metodología se usaron para construir conjuntos únicos de genes (Ermolaeva y col., Nat. Genet. 20: 19-23 (1998)) que contienen clones identificados previamente a partir de otras fuentes (por ejemplo, bases de datos públicas), así como nuevos clones que no habían sido descritos previamente.
Ejemplo 4
Selección de mARNs de Baja Abundancia
Se usó un protocolo de sustracción basado en repeticiones en el que se construyeron micromatrices que contenían 1.500 cADNs diferentes tomados aleatoriamente de una librería de cADN. La primera micromatriz se hibridó con una sonda de sustracción que contenía cADNs que codifican 64 genes domésticos y ribosomales. Los clones no hibridados fueron analizados mediante secuenciamiento EST. Cualquier clon que no estuviera presente en la sonda de sustracción previa se añadió a la sonda de sustracción existente y se hibridó con la siguiente micromatriz que contenía clones de cADN tomados aleatoriamente. Este procedimiento se repitió 17 veces, de tal modo que se dispusieron en la micromatriz 26.112 cADNs. En base a los datos de hibridación, únicamente se eligieron 7.700 clones mediante secuenciamiento EST. Después de la dispersión, se identificaron 4.400 clones de cADN diferentes. Este grupo de clones estaba altamente enriquecido en tránscritos de baja abundancia. Adicionalmente, eliminando los ARNs mensajeros de alta abundancia redundantes, la sustracción basada en micromatriz disminuyó el esfuerzo de secuenciamiento EST en un 70%.
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Ejemplo 5
Construcción de un Chip para Identificar Mensajes Únicos o de Baja Abundancia, uso en Visualización Diferencial
Se construyó un chip para identificar ARN mensajero presente en un bajo número de copias en calvaria de ratón según el procedimiento descrito en la Figura 3. Se generaron matrices de 27.648 clones a partir de librerías de calvaria de ratón normalizadas. Todos los 27.648 clones fueron amplificados mediante PCR y dispuestos en 18 micromatrices. Como resultado de la hibridación sustractiva (como se ha descrito anteriormente), se secuenciaron 7.790 cADNs después de 18 rondas de hibridación. Mediante comparación de dichas secuencias con bases de datos que contienen secuencias conocidas, se eligieron 4.608 clones para amplificación y disposición en una micromatriz. Este chip se usó a continuación en un experimento de expresión génica diferencial para identificar genes modulados por BMP2 (proteína morfogénica 2 de hueso).
Ejemplo 6
Eliminación de Contaminación de la Librería
El protocolo de hibridación sustractivo descrito en la presente invención fue demostrado en la eliminación de la contaminación de genes altamente abundantes de una librería de clonación. Tal como se muestra en la Figura 4, la librería inicial estaba contaminada con un 35% de genes mitocondriales. Después de nueve rondas de hibridación sustractiva, dicha cantidad se redujo al 2-3%. Esto demuestra la utilidad de la invención en la eliminación de secuencias altamente abundantes de una población inicial de ácidos nucleicos.

Claims (11)

1. Un método para analizar una población heterogénea de ácido nucleico, que comprende las etapas de
(a) proporcionar moléculas de ácido nucleico de dicha población inmovilizadas sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
(b) exponer dicha micromatriz en condiciones de hibridación a un conjunto de sondas marcadas generadas a partir de secuencias de ácido nucleico conocidas o de secuencias que se sospecha están presentes en dicha población;
(c) detectar una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes en la micromatriz que se hibridan débilmente o que no se hibridan con dicho conjunto de sondas, en el que se considera que dichas moléculas de ácido nucleico no coincidentes se hibridan débilmente con dicho conjunto de sondas si la hibridación produce una señal de hibridación que tiene una relación señal-ruido (S/R) inferior a 0,5; y determinar la identidad de dicha una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes;
(d) secuenciar dicha una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes de la etapa (c);
(e) añadir sondas marcadas respectivamente que correspondan a cada una de dichas una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes con dicho conjunto de sondas para generar un conjunto de sondas expandido; y
(f) repetir las etapas (a) a (e) una o más veces usando dicho conjunto expandido de sondas en lugar de dicho conjunto de sondas.
2. Un método como el reivindicado en la reivindicación precedente, en el que dichas una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes se identifican, se seleccionan y se inmovilizan en formato de micromatriz para producir un conjunto unigénico.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas moléculas de ácido nucleico comprenden ADN.
4. El método de la reivindicación 3, en el que el ADN es cADN o ADN genómico.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el ADN es un clon procedente de una librería.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dichas moléculas de ácido nucleico comprenden ARN.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas moléculas de ácido nucleico son amplificadas.
8. El método de la reivindicación 7, en el que dichas moléculas de ácido nucleico son amplificadas usando amplificación de PCR.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la marca se selecciona del grupo que consiste en una marca fluorescente, una marca luminiscente y una marca radioactiva.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho conjunto de sondas marcadas contiene una o más moléculas de ácido nucleico que presentan secuencias derivadas de una base de datos pública.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha superficie sólida es una superficie de vidrio.
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