ES2296623T3 - Hibridacion sustractiva basada en micromatrices. - Google Patents
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Abstract
Un método para analizar una población heterogénea de ácido nucleico, que comprende las etapas de (a) proporcionar moléculas de ácido nucleico de dicha población inmovilizadas sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz; (b) exponer dicha micromatriz en condiciones de hibridación a un conjunto de sondas marcadas generadas a partir de secuencias de ácido nucleico conocidas o de secuencias que se sospecha están presentes en dicha población; (c) detectar una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes en la micromatriz que se hibridan débilmente o que no se hibridan con dicho conjunto de sondas, en el que se considera que dichas moléculas de ácido nucleico no coincidentes se hibridan débilmente con dicho conjunto de sondas si la hibridación produce una señal de hibridación que tiene una relación señal-ruido (S/R) inferior a 0, 5; y determinar la identidad de dicha una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes; (d) secuenciar dicha una o más moléculas de ácido nucleicono coincidentes de la etapa (c); (e) añadir sondas marcadas respectivamente que correspondan a cada una de dichas una o más moléculas de ácido nucleico no coincidentes con dicho conjunto de sondas para generar un conjunto de sondas expandido; y (f) repetir las etapas (a) a (e) una o más veces usando dicho conjunto expandido de sondas en lugar de dicho conjunto de sondas.
Description
Hibridación sustractiva basada en
micromatrices.
La elucidación de los mecanismos que dictan el
funcionamiento normal de las células vivas requiere una comprensión
detallada de la información codificada en todo el genoma completo.
Habitualmente se usan secuencias de ARN mensajero (mRNA) para
mapear y secuenciar los genes contenidos en los genomas de
diferentes organismos. La información de secuencia se usa para
evaluar la modificación genética de una célula u organismo concreto
de interés. Sin embargo, los mARNs se producen a diferentes niveles
en diferentes tipos de células y durante diferentes puntos del
desarrollo. La distribución de tipos de mARN, sus expresiones
reguladas de desarrollo y específicas de tipo de célula, y sus
traducciones en proteína, producen el carácter único de un tipo
celular concreto.
Las poblaciones de moléculas de ácido nucleico,
tales como ARNs mensajeros, se estudian habitualmente usando
librerías de ácidos nucleicos. Las librerías pueden incluir
librerías genómicas, que pueden construirse colocando
aleatoriamente fragmentos de ADN separados de un genoma completo en
un vector de clonación adecuado. Para las librerías obtenidas a
partir de ADN de genomas de mamíferos, la mayoría de clones
genómicos aleatorios contienen ADN no codificador, ADN altamente
repetido, o ambos.
Un segundo tipo de librería se obtiene a partir
de moléculas de ADN complementario (cADN). Dichas librerías se
construyen a partir de ADN que se transcribe inversamente a partir
de mARN aislado de una fuente de interés. Por consiguiente, las
librerías de cADN contienen principalmente ADN que codifica
genes.
Las diferentes especies de mARN no están
igualmente representadas en una célula dada. En vez de eso, las
moléculas de mARN se distribuyen en tres clases de frecuencias: (1)
superprevalente (que consiste en aproximadamente
10-15 mARNs que, juntos, representan el 10-20% de la masa total de mARN); (2) intermedio (que consiste en aproximadamente 1-2.000 mARNs que, juntos, representan el 40-45% de la masa total de mARN), y (3) complejo (que consiste en aproximadamente 15-20.000 mARNs que, juntos, representan el 40-45% de la masa total de mARN). Davidson y Britten, SCIENCE 204: 1052-1059 (1979).
10-15 mARNs que, juntos, representan el 10-20% de la masa total de mARN); (2) intermedio (que consiste en aproximadamente 1-2.000 mARNs que, juntos, representan el 40-45% de la masa total de mARN), y (3) complejo (que consiste en aproximadamente 15-20.000 mARNs que, juntos, representan el 40-45% de la masa total de mARN). Davidson y Britten, SCIENCE 204: 1052-1059 (1979).
La existencia de molécula de ARN de complejidad
supervalente o intermedia dentro de una célula puede ser un
obstáculo significativo para la identificación y el secuenciamiento
de especies de mARN de baja abundancia. En la creación de librerías
de ácidos nucleicos adecuadas para el secuenciamiento, los mARNs
superprevalentes dificultan el aislamiento y el análisis de mARNs
de menor abundancia. Puesto que la mayoría de los clones aislados a
partir de una librería de cADN procederán de mARNs prevalentes
intermedios y superprevalentes, se dedica un tiempo y un esfuerzo
significativos a resecuenciar las especies de mARN prevalentes
conocidas previamente, y deben secuenciarse grandes cantidades de
especies de mARN a fin de aislar y secuenciar especies de mARN de
baja abundancia. Por tanto, el ritmo de descubrimiento de genes a
partir de librerías puede estar limitado por la naturaleza
redundante de los mARNs presentes en una célula dada. La presencia
de mARNs altamente abundantes también dificulta la comparación de
diferencias en genes activos observadas en células diferentes de
tipos de tejido relacionados, en células de diferentes etapas de
desarrollo, el efecto de estímulos, y la expresión génica
diferencial entre células que funcionan normalmente y células
anormales (por ejemplo, células de tejido normal comparadas con
tejidos tumorales).
La presente invención se basa en parte en el
descubrimiento de un método de alta capacidad altamente eficaz para
la identificación y eliminación de redundancia en una población
heterogénea de moléculas de ácido nucleico.
El método incluye proporcionar una muestra
aleatoria de fragmentos de ácido nucleico, inmovilizar la muestra
aleatoria de fragmentos de ácido nucleico en una micromatriz, e
hibridar una o más sondas marcadas correspondientes a fragmentos
previamente secuenciados o dispuestos en matriz. Se detectan los
fragmentos que se hibridan a las sondas marcadas, y se identifica y
secuencia al menos un fragmento no hibridado o hibridado débilmente
a las sondas marcadas.
Los fragmentos de ácido nucleico pueden ser ADN
ó ARN, y opcionalmente pueden ser clonados en un vector. En algunas
realizaciones, los fragmentos de ácido nucleico son miembros de una
librería genómica de cADN. La librería puede estar normalizada o no
normalizada. En otras realizaciones, los fragmentos de ácido
nucleico son fragmentos de PCR. En algunas realizaciones, los
fragmentos de ácido nucleico son amplificados, por ejemplo mediante
PCR.
Los fragmentos de ácido nucleico son
inmovilizados a continuación sobre una superficie sólida, por
ejemplo en una micromatriz. Preferiblemente, la superficie sólida
es vidrio. Las sondas marcadas que corresponden a fragmentos
previamente secuenciados o dispuestos en matriz (es decir, la sonda
de sustracción) se hibridan a los fragmentos de ácido nucleico
inmovilizados. Las marcas de ácido nucleico pueden ser
fluorescentes, luminiscentes o radiactivas, etiquetas biotiniladas,
haptenadas u otras etiquetas químicas que permitan una fácil
detección de las sondas marcadas. Generalmente, las sondas no
hibridadas se eliminan. Los fragmentos de ácido nucleico que no se
hibridan o que se hibridan débilmente a una sonda marcada son
aislados y reunidos a continuación con el conjunto anterior de
sondas para generar un nuevo conjunto mayor de sondas. Los
fragmentos aislados recién formados son secuenciados y sus
secuencias se comparan con las de una base de datos de
secuencias.
Los métodos de la presente invención implican un
protocolo de sustracción que identifica y aísla fragmentos de ácido
nucleico no redundantes a partir de una población de moléculas de
ácido nucleico. Si se desea, se reitera el protocolo, a fin de
crear un conjunto de fragmentos que sea más afín hacia los genes no
caracterizados previamente con cada iteración sucesiva. Por
consiguiente, con cada ronda de sustracción, las sondas
correspondientes a los fragmentos recién aislados se marcan y se
añaden a la sonda de sustracción previa, y esta nueva sonda de
sustracción se hibrida a la siguiente micromatriz que contiene
fragmentos de ácido nucleico seleccionados aleatoriamente. Dicho
procedimiento se repite varias veces, preferiblemente acompañado de
la adición de secuencias recién identificadas a la sonda de
sustracción previa. Por tanto, el método permite la identificación y
el aislamiento de fragmentos de ácido nucleico no redundantes o
mínimamente solapados procedentes de fuentes de interés, y acelera
el ritmo de descubrimiento de nuevos genes. En una realización
preferida, los clones no redundantes que se aíslan usando los
métodos de la invención se identifican, se seleccionan y se
inmovilizan a una nueva micromatriz para producir un conjunto
unigénico.
Se pueden contemplar numerosas aplicaciones para
los métodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el
método puede usarse en cualquier aplicación en la que se desee el
enriquecimiento de las secuencias de interés. De forma alternativa,
el método puede usarse para eliminar fragmentos de ácido nucleico no
deseados de una población de moléculas de ácido nucleico. Un
conjunto no limitante de usos incluye:
- I.
- Un método basado en micromatrices para acelerar el ritmo de descubrimiento de secuencias expresadas de mARN/cADN y para facilitar la construcción de un conjunto de moléculas de ácido nucleico para identificar mensajes presentes en pequeñas cantidades de moléculas de ácido nucleico. Dicho método permite aumentar el descubrimiento de cADNs expresados y facilitar la construcción de conjuntos de cADNs de excepción.
- II.
- Un método basado en micromatrices para acelerar el ritmo de descubrimiento de secuencias genómicas y para facilitar el aislamiento de fragmentos de ADN correspondientes al genoma completo o a subregiones de interés. En esta solicitud, el método proporciona un descubrimiento acelerado de clones genómicos, una construcción mejorada de un conjunto de clones genómicos no redundantes o mínimamente solapados. También se proporciona un descubrimiento acelerado de clones que mapean una región de interés, una construcción mejorada de un conjunto de clones genómicos en una región de interés del genoma, y un llenado mejorado de los huecos de los mapas genómicos. Esto puede ser útil, por ejemplo, para facilitar el mapeado génico de enfermedades y para la identificación génica de enfermedades.
- III.
- Un método basado en micromatrices para enriquecer y/o aislar secuencias de ADN que son únicas en una población en comparación con otra población. La invención también permite la identificación de secuencias únicas o nuevas en un organismo frente a otro, incluyendo moléculas de ácido nucleico de diferentes cepas, por ejemplo, patogénicas frente a no patogénicas, y de diferentes especies. Las secuencias pueden ser, por ejemplo, mARN/cADN, genómicas, extracromosomales, plásmidos o ácidos nucleicos virales.
- IV.
- Un método basado en micromatrices para acelerar el descubrimiento de secuencias de ADN relacionadas. A la inversa, el método permite la identificación de secuencias relacionadas entre organismos íntima o distantemente relacionados. Las secuencias pueden ser, por ejemplo, mARN/cADN, genómicas, extracromosomales, plásmidos y ácidos nucleicos virales.
- V.
- Un método basado en micromatrices para acelerar la eliminación de secuencias no deseadas de una población de moléculas de ácido nucleico. En otra realización, la invención proporciona la eliminación de secuencias de ADN no deseadas, que incluyen secuencias de ADN contaminantes y secuencias íntimamente relacionadas con las identificadas previamente.
- VI.
- Un método basado en micromatrices para identificar cambios en el número de copias de una o más secuencias de ADN en dos poblaciones diferentes de ácidos nucleicos.
A menos que se definan de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el
mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista
habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se
pueden usar métodos y materiales similares a los descritos en el
presente documento en la práctica o en la evaluación de la presente
invención, los métodos y materiales adecuados se describen a
continuación. En caso de conflicto prevalecerá la presente
especificación, incluyendo las definiciones. Además, los
materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no
pretenden ser limitantes.
Beltz y col. (1983), Methods in Enzymology, 100
266-85 describe el aislamiento de familias
multigénicas y la determinación de homologías mediante métodos de
hibridación de filtrado.
Heller y col. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, vol. 94, páginas 2150-2155 presenta el uso de
micromatrices de cADN en el descubrimiento y análisis de genes
relacionados con enfermedades inflamatorias.
\newpage
Schena y col. Octubre de 1996, Proc. Natl. Acad.
Sci. vol 93 (20), páginas 10614-10619 presenta la
monitorización de expresión de 1000 genes basada en
micromatrices.
Nguyen y col. (1995), Genomics, US, Academic
Press, San Diego, vol. 29, páginas 207-216 describe
el uso de hibridación cuantitativa de clones de cADN dispuestos en
matriz para evaluar la expresión génica diferencial en el timo de
murina.
La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra
una visión global de la estrategia de descubrimiento de genes.
La Figura 2 es una representación de una
micromatriz usada para la identificación de nuevos genes.
La Figura 3 es un diagrama de flujo que muestra
la construcción de un chip unigénico de calvaria de ratón.
La Figura 4 es un gráfico de línea que muestra
la eliminación de genes mitocondriales contaminantes de una
librería.
Para mayor comodidad, se muestra a continuación
el significado pretendido para determinados términos y expresiones
utilizados en el presente documento.
"Genes conocidos" o "secuencias
conocidas" son aquellos cuyas secuencias pueden encontrarse en
una base de datos de secuencias pública o privada.
"Nuevos genes" o "nuevas secuencias"
son moléculas de ácido nucleico cuyas secuencias no se encuentran
disponibles públicamente, por ejemplo, no se encuentran en ninguna
base de datos de secuencias pública o privada.
"Heterogéneo" significa un conjunto de
moléculas de ácido nucleico en el que el conjunto incluye al menos
dos moléculas de ácido nucleico que difieren en la secuencia. Los
ácidos nucleicos heterogéneos incluyen, por ejemplo, poblaciones de
ARN aisladas de células, tejidos y/u organismos.
Hibridación "débil", tal como se define en
el presente documento, se refiere a una señal de hibridación que
tiene una relación señal-ruido (S/R) inferior a 0,5,
identificada usando el sistema de análisis de datos del software de
ArrayVision. La S/R es una medida de la intensidad restada de fondo
de la señal del punto dividida por la desviación estándar de la
intensidad de fondo.
"Ácido nucleico no redundante" es un ácido
nucleico que no ha sido identificado previamente en una población
de moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, una población
heterogénea de moléculas de ácido nucleico. En algunas
realizaciones, el ácido nucleico no redundante es una secuencia
presente en un bajo número de copias en una población de moléculas
de ácido nucleico.
"Conjunto único de genes" es un conjunto de
genes en los que cada miembro del conjunto corresponde a una
secuencia representada en un número bajo de copias en una población
de células. Por ejemplo, un conjunto único de genes corresponde a
secuencias presentes en unas pocas copias por célula.
Alternativamente, un conjunto único de genes puede denominarse
conjunto de genes de abundancia reducida. En algunas realizaciones,
el conjunto único de genes incluye miembros presentes en 100, 50,
25, 15, 10, 5, 2 copias, o incluso en 1 copia por célula. Por
tanto, un conjunto único de genes de un tipo celular particular o de
una población concreta, en algunas realizaciones, contiene una
copia de cada gen expresado en dicho tipo de célula.
"Sonda compleja" es aquella que contiene
muchas moléculas de ADN o de ARN diferentes. Tal como se usa en el
presente documento, la sonda compleja contiene secuencias de ácido
nucleico que son complementarias a secuencias conocidas.
La presente invención proporciona un método
altamente eficaz y de elevada capacidad para la identificación y la
eliminación de redundancia en una población de moléculas de ácido
nucleico usando una selección reiterativa que implica hibridación
sustractiva con un conjunto de sondas complejas y con tecnología de
micromatrices. Los fragmentos de ácido nucleico elegidos
aleatoriamente de una librería de clonación se disponen en
micromatrices y se exponen, en condiciones de hibridación, a una
sonda compleja marcada generada a partir de secuencias conocidas
(por ejemplo, secuencias obtenidas de una base de datos pública tal
como Genbank, pubEST). Sólo se secuencian los clones que se
hibridan débilmente, o que no se hibridan, con dicho primer conjunto
de sondas; los clones que se hibridan con dicho primer conjunto de
sondas no se secuencian. Las secuencias obtenidas en esta etapa se
comparan con bases de datos públicas de moléculas de ácido nucleico
identificadas previamente (por ejemplo, BLAST, pubEST, Genbank NR).
Estas secuencias se añaden al conjunto de sondas inicial para
generar un segundo conjunto de sondas sustractivas. Dicho conjunto
de sondas sustractivas se hibrida con un segundo grupo de clones
seleccionados aleatoriamente de la librería. La sonda se hibrida con
ácidos nucleicos complementarios a los ácidos nucleicos de las
secuencias iniciales conocidas públicamente, así como con ácidos
nucleicos identificados en la primera ronda de hibridación. Se
repite el procedimiento de expansión del conjunto de sondas tras
sucesivas rondas de hibridación hasta que esencialmente todos los
clones elegidos aleatoriamente se hibridan con una sonda marcada,
lo cual indica que todos los clones no caracterizados previamente
han sido secuenciados. Por consiguiente, los métodos de la presente
invención eliminan la necesidad
de re-secuenciar clones conocidos, problema que reduce la eficacia de otros métodos conocidos en la técnica.
de re-secuenciar clones conocidos, problema que reduce la eficacia de otros métodos conocidos en la técnica.
La primera etapa implica el aislamiento de una
población heterogénea de moléculas de ácido nucleico. Las moléculas
de ácido nucleico pueden ser fragmentos de moléculas de ARN o de ADN
de longitud completa. En algunas realizaciones, la población
heterogénea de moléculas de ácido nucleico puede incluir fragmentos
de ácido nucleico elegidos aleatoriamente de una población de
moléculas de ácido nucleico. Dichos fragmentos pueden ser ADN o ARN,
y opcionalmente pueden estar clonados en vectores. En una
realización preferida, las moléculas de ácido nucleico incluyen
cADN de una librería de ácido nucleico de secuencias conocidas. En
una realización, la librería es una librería genómica. En otra
realización, la librería es una librería de cADN. En cualquier
realización, la librería puede ser una librería normalizada o una
librería no normalizada. Alternativamente, la población de
fragmentos de ácido nucleico puede no ser parte de una librería, por
ejemplo, fragmentos de PCR.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos
se amplifican usando PCR u otros métodos de amplificación. A
continuación, el ADN se inmoviliza en una micromatriz sobre una
superficie, preferiblemente vidrio. En algunas realizaciones, el
ADN dispuesto en matriz incluye oligonucleótidos sintetizados sobre
el vidrio. En una realización preferida, los fragmentos de PCR son
dispuestos en matriz usando un observador de micromatrices.
A continuación se deja que las moléculas de ADN
inmovilizadas entren en contacto con un conjunto de sondas marcadas
que contiene moléculas de ácido nucleico de secuencias conocidas o
definidas en condiciones que permitan la hibridación. Los
protocolos estándar de marcado para ácidos nucleicos se describen,
por ejemplo, en Sambrook y col.; Kambara y col., BIOTECHNOLOGY 6:
816-821 (1988); Smith y col., NUC. ACIDS RES. 13:
2399-2412 (1985). Las marcas de ácido nucleico
pueden ser fluorescentes, luminiscentes o radiactivas, etiquetas
biotiniladas, haptenadas u otras etiquetas químicas que permitan
una fácil detección de las sondas marcadas. Las marcas
fluorescentes son ventajosas para los métodos descritos en el
presente documento, ya que se usan de forma rutinaria con
instrumentación automatizada para el análisis simultáneo de alta
capacidad de muestras múltiples. Metzker y Gibbs han descrito
recientemente una familia de nucleótidos marcados fluorescentemente
basados en los fluoróforos Cy con características espectrales
mejoradas. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.728.529,
incorporada a la presente memoria a modo de referencia. Los
conjuntos alternativos de fluoróforos incluyen fluoróforos basados
en rodamina, TARAM, ROX, JOE y FAM; los fluoróforos BigDye® (Applied
Biosystems, Inc.), el grupo dansilo, la fluoresceína y los
derivados sustituidos de la fluoresceína, los derivados de la
acridina, los derivados de la coumarina, las ftalocianinas, la
tetrametilrodamina, el Texas Red®, los
9-(carboxietil)-3-hidroxi-6-oxo-6H-xantenos,
los fluoróforos DABCYL® y BODIPY® (Molecular Probes, Eugene,
OR).
Después de la etapa de hibridación, se detecta
la cantidad de marca en cada posición de la micromatriz, por
ejemplo de la micromatriz de ADN. Véase Brown y Botstein, Nat.
Genet. 21: 33-37 (1999). Las micromatrices son una
matriz ordenada de moléculas de ADN de cadena doble o monocatenarias
colocadas en un material de soporte en una organización
espacialmente separada. En contraste con las "macromatrices" en
filtro, que son habitualmente grandes láminas de nitrocelulosa, las
micromatrices colocan el ADN en una organización empaquetada de
manera más densa, de tal forma que pueden meterse hasta 10.000
moléculas de ADN en una región típicamente de 1-4
centímetros cuadrados. Las micromatrices habitualmente usan vidrio
recubierto como soporte sólido, en contraposición al material
basado en nitrocelulosa de las matrices de filtro. Teniendo una
matriz ordenada de muestras de ADN, la posición de cada muestra
puede seguirse y relacionarse con la muestra original a partir de la
cual se generó el ADN de la matriz. Se han descrito métodos y
aparatos para preparar una micromatriz. Véase, por ejemplo, las
Patentes de EE.UU. 5.445.934 y 5.800.992.
El proceso de creación de una micromatriz
implica una serie de etapas en las que se procesa un conjunto de
colonias bacterianas que contienen una librería de cADN para obtener
un fragmento amplificado de ADN purificado derivado del injerto del
vector mantenido en una cualquiera de las colonias de bacterias. La
serie de etapas puede llevarse a cabo manualmente o mediante el uso
de estaciones de trabajo robotizadas, tales como máquinas de PCR y
robots de manejo de líquidos. En el método preferido, las etapas se
llevan a cabo usando placas multipocillo de hasta 96 pocillos, 384
pocillos o 1536 pocillos. Sin embargo, otras configuraciones son
posibles. La micromatriz se construye usando un observador robótico
tal como el instrumento desarrollado por Molecular Dynamics, o en
el laboratorio de Patrick Brown, Universidad de Stanford (ver
anterior). Otra característica del proceso de micromatriz es que el
análisis de datos se lleva a cabo automáticamente usando software de
análisis de datos, tal como ArrayVision. El proceso completo desde
el seguimiento del clon, la construcción de la micromatriz, hasta
los resultados, está completamente integrado de tal modo
que las colonias bacterianas que van a ser procesadas para secuenciamiento pueden ser identificadas fácilmente.
que las colonias bacterianas que van a ser procesadas para secuenciamiento pueden ser identificadas fácilmente.
En diversas realizaciones, una micromatriz de
acuerdo con la invención incluye 100; 1.000; 10.000, o incluso
100.000 ó más muestras de ADN.
Las muestras de ADN de la micromatriz se
hibridan con sondas de ARN o ADN que se han marcado, por ejemplo
con fluorescencia, para identificar si la muestra con la sonda
contiene una molécula que es similar o idéntica a la muestra de ADN
de la micromatriz. En realizaciones preferidas, se puede hibrida una
sonda compleja con la micromatriz. Una sonda compleja es aquella
que contiene muchas moléculas de ADN o de ARN diferentes.
Las moléculas sonda se hibridan con una molécula
de ADN en la micromatriz en condiciones que permitan la formación
de híbridos entre moléculas sonda y una molécula, o varias, de ADN
idéntica o casi idéntica de la micromatriz. La presencia de
moléculas híbridas ADN-sonda se detecta, por
ejemplo, mediante un instrumento de detección de fluorescencia. Si
la señal de hibridación es débil o no existente en una posición de
ADN concreta, entonces la correspondiente molécula de ADN o de ARN
está ausente en la sonda. En diversas realizaciones se usan
simultáneamente 1, 2, 3, 4 ó mas moléculas sonda.
En algunas realizaciones, el proceso se lleva a
cabo mediante rondas iterativas de construcción de micromatriz,
hibridación y análisis. El método reduce la cantidad de
secuenciamiento necesario para obtener un conjunto único de genes
de un tamaño dado. En diversas realizaciones, se puede usar para
eliminar muestras repetidas, por ejemplo cADNs duplicados, muestras
con ADN bacteriano o mitocondrial, y muestras sin ningún injerto de
cADN.
Existe una serie de ventajas en la sustracción
basada en micromatrices frente a los métodos de matriz de filtro.
Por ejemplo, los presentes métodos administran la necesidad de
propagar clones en bacterias antes del secuenciamiento. Por
ejemplo, los métodos en filtro generalmente presentan en la matriz
colonias bacterianas en las que está contenido el cADN clonado. Las
colonias deben cultivarse durante varios días, someterse a lisis
para liberar el ADN y fijar el ADN sobre el filtro. La hibridación
con las matrices de filtro de colonias puede verse afectada por los
residuos bacterianos y la baja cantidad de ADN liberado de la
colonia.
Una segunda ventaja de los presentes métodos es
que las iteraciones se pueden llevar a cabo más rápidamente con
micromatrices que con ensayos de filtro usando colonias bacterianas.
La propagación y el análisis de clones en bacterias pueden requerir
hasta varios días. Por el contrario, el tratamiento con la sonda de
una micromatriz subsiguiente puede comenzar menos de 24 h después
de completar el análisis de una matriz.
Otra ventaja de las micromatrices es la
capacidad de usar sondas marcadas con fluorescencia. Esto
proporciona un método no radiactivo para la detección de la
hibridación. Por el contrario, la hibridación de filtro generalmente
usa sondas marcadas con fósforo o azufre radiactivos. Las
micromatrices pueden hibridarse con múltiples sondas
simultáneamente. Por el contrario, las matrices de filtro sólo
pueden hibridarse con una sonda cada vez.
Otra ventaja adicional de las micromatrices es
la reproducibilidad y la sensibilidad de las señales de hibridación.
Habitualmente, las señales de hibridación son más elevadas y la
sensibilidad es mayor en las micromatrices en comparación con las
matrices de filtro. Esto permite que la complejidad de la sonda sea
mayor y que aún así se consiga una señal de hibridación positiva en
la micromatriz. Además, las matrices de filtro muestran a menudo
señales de fondo falsas que no están relacionadas con la hibridación
productiva entre la sonda y el ADN del filtro.
Además existe una serie de ventajas en la
construcción de un conjunto único de genes mediante sustracción
basada en micromatrices frente a otros métodos. Por ejemplo, los
métodos que usan hibridación selectiva en disolución, como los
usados en los procedimientos de normalización o de sustracción de
cADN, habitualmente dan como resultado la pérdida de determinados
clones de baja abundancia. Por el contrario, usando la estrategia
iterativa basada en micromatrices, todos los clones de la librería
son capaces de ser identificados. Se descubrirá un clon de cADN de
baja abundancia después de múltiples rondas iterativas de
hibridación. Otra ventaja de la estrategia basada en micromatrices
para la preparación de conjuntos únicos de cADNs es que es más
probable que los clones de cADN resultantes estén cerca de tener
una longitud completa. Por el contrario, otros métodos de
sustracción y normalización a menudo dan lugar a cADNs cortos e
incompletos.
Generalmente, una señal débil o la ausencia de
señal en una posición concreta de la matriz, corresponde a la
presencia de ADN que no se ha hibridado o que se ha hibridado
débilmente con las secuencias representadas en el conjunto de
sondas. Los clones con una señal débil o sin señal son secuenciados.
El secuenciamiento se puede realizar usando métodos de
secuenciamiento de ADN bien conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, Maxam y Gilbert, PROC NATL ACAD SCI USA 74:
560-564 (1977); Sanger y col., PROC NATL ACAD SCI
USA 74: 5463-5467 (1977); y la Patente de Estados
Unidos Nº 5.821.058.
El análisis automatizado de los fragmentos en
geles o en capilares ha reducido significativamente el trabajo
relativo a la recolección y el procesamiento de la información de
secuencia. Véase, por ejemplo, Prober y col., SCIENCE 238:
336-341 (1987); Smith y col., NATURE 321:
674-679 (1986); Luckey y col., NUCLEIC ACIDS RES
18: 4417-4421(1990); Dovichi, ELECTROPHORESIS
18: 2393-2399 (1997). Los fragmentos de ácido
nucleico aislados y secuenciados en esta etapa se añaden al
conjunto de sondas inicial. A menudo dichos fragmentos son
secuenciados primero para determinar la presencia de moléculas de
ácido nucleico no redundantes en la micromatriz. A continuación se
comparan sus secuencias con bases de datos públicas de moléculas de
ácido nucleico identificadas previamente (por ejemplo, mediante
comparación de las secuencias en bases de datos disponibles
públicamente).
El segundo conjunto de sondas sustractivas se
usa en la siguiente ronda de hibridación que implica una segunda
micromatriz generada a partir de un grupo diferente de clones
elegidos aleatoriamente de la librería. Añadiendo los fragmentos de
ácido nucleico recién identificados al conjunto de sondas
sustractivas, las subsiguientes micromatrices de clones elegidos
aleatoriamente de la librería son expuestas a un mayor número de
sondas marcadas. Por consiguiente, los métodos de la presente
invención eliminan el resecuenciamiento de clones conocidos.
\newpage
Según va aumentando el número de sondas marcadas
con las sucesivas iteraciones, el número de clones "conocidos"
marcados aumentará y quedarán menos clones sin marcar. Finalmente,
con suficientes iteraciones, se marcarán todos los clones de las
micromatrices de clones elegidos aleatoriamente de una librería
dada, ya que todos los clones habrán sido secuenciados.
En un aspecto de la presente descripción, se
genera una librería de clonación enriquecida en mARNs de baja
abundancia. En una extensión de este método, las secuencias de baja
abundancia se usan en la construcción de un chip que contiene
ácidos nucleicos correspondientes a ARNs de baja abundancia. Dichos
chips pueden usarse en una experimentación posterior (por ejemplo,
en experimentos de visualización diferencial). En la Figura 1 se
muestra una visión global de la estrategia para el descubrimiento de
nuevos genes. En una realización adicional de la presente
invención, los ácidos nucleicos contaminantes son eliminados de la
librería de clonación.
En otro aspecto, la descripción proporciona un
método para reducir la redundancia en una muestra de moléculas de
ácido nucleico. El método incluye proporcionar una muestra
heterogénea de moléculas de ácido nucleico e inmovilizar la muestra
de moléculas de ácido nucleico sobre una micromatriz. A continuación
se hibridan una o más sondas marcadas correspondientes a moléculas
de ácido nucleico previamente secuenciadas o dispuestas en
micromatriz con las moléculas de ácido nucleico de la muestras
inmovilizada. Preferiblemente, las sondas incluyen secuencias que
se sabe están presentes en la muestra de moléculas de ácido
nucleico. El método también incluye identificar al menos una
molécula inmovilizada que se hibrida con las sondas marcadas, y
proporcionar una segunda molécula de ácido nucleico que reconoce
específicamente el ácido o ácidos nucleicos inmovilizados que se
hibridan con la muestra. Si se desea, la segunda molécula de ácido
nucleico puede ser marcada y usada como molécula sonda, y la
muestra puede rehibridarse con una o varias moléculas sonda que
incluyan la molécula sonda recién añadida. El proceso se puede
repetir, si se desea, para eliminar progresivamente moléculas de
ácido nucleico que ya han sido identificadas en la población de
moléculas de ácido nucleico.
También se incluye en la memoria un método para
identificar una pluralidad de secuencias no redundantes en una
población de ácidos nucleicos proporcionando una muestra heterogénea
de moléculas de ácido nucleico, inmovilizando la muestra de
moléculas de ácido nucleico sobre una micromatriz, e hibridando una
o más sondas marcadas con la muestra. Las sondas marcadas
corresponden a una o más moléculas de ácido nucleico previamente
identificadas en la muestra. Se identifica al menos una molécula de
ácido nucleico de la muestra inmovilizada que se hibrida débilmente
o que no se hibrida con las sondas marcadas. Se repite el proceso,
si se desea, hasta que se ha identificado una pluralidad de
secuencias no redundantes. La descripción también incluye las
secuencias identificadas de acuerdo con dicho método, así como una
micromatriz que incluye la pluralidad de secuencias.
La descripción puede adaptarse a cualquier
propósito en el que el especialista desee enriquecer secuencias de
interés o eliminar secuencias que no sean de interés. Los ejemplos
de usos incluyen los siguientes, aunque sin estar limitados a los
mismos:
En un aspecto, la descripción proporciona un
aumento del descubrimiento de nuevos genes y una construcción
mejorada de un conjunto de cADNs expresados. Esto puede llevarse a
cabo mediante:
- (a)
- amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico;
- (b)
- inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
- (c)
- hibridar sondas marcadas procedentes de una fuente de ADN con los fragmentos de ADN inmovilizados dispuestos en micromatriz;
- (d)
- detectar fragmentos de ADN hibridados con una sonda marcada e identificar al menos un fragmento que no se hibrida o que se hibrida débilmente (es decir, sustracción);
- (e)
- determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas; y
- (f)
- reiterar las etapas (b) o (c) hasta (e) con secuencias previamente identificadas en el conjunto de sondas a fin de identificar otras secuencias adicionales y aumentar el conjunto único de genes.
En el caso de secuencias genómicas, puede ser
deseable construir un conjunto de clones "mínimamente
solapados", es decir, clones con la menor cantidad posible de
secuencias solapadas. Por tanto, la invención permite aumentar el
descubrimiento de clones genómicos, mejorar la construcción de un
conjunto de clones genómicos no redundantes o mínimamente solapados
y acelerar el descubrimiento de clones que mapean un gen de interés.
El método también permite la construcción mejorada de un conjunto
de clones genómicos en una región de interés del genoma. La
capacidad de mapear fácilmente clones a una región de interés del
genoma permite además al especialista rellenar fácilmente huecos en
el mapa genómico, lo que facilita el mapeado de genes de
enfermedades y la identificación de genes de enfermedades.
El método incluye:
- (a)
- amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico genómico;
- (b)
- inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
- (c)
- hibridar sondas marcadas (aisladas o agrupadas) procedentes de una fuente de ADN con fragmentos de ADN inmovilizados dispuesto en micromatriz (las sondas pueden ser secuencias de cADN/mARN o genómicas);
- (d)
- detectar fragmentos de ADN que se hibridan con una sonda marcada;
- (e)
- determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas; y
- (f)
- reiterar las etapas (b) o (c) hasta (e) con secuencias previamente identificadas en el conjunto de sondas a fin de identificar otras secuencias adicionales y aumentar el conjunto único de genes.
En particular, las regiones finales de
secuencias previamente identificadas pueden usarse como sondas para
"pasear" e identificar clones flanqueantes.
Otro uso de la invención es para la
identificación de secuencias (de cADN expresado o genómicas) únicas
o nuevas en un organismo frente a otro. Esto incluye la
identificación de ácidos nucleicos únicos en una cepa frente a otra
(es decir, patogénica frente a no patogénica), así como la
comparación de conjuntos únicos de genes a partir de especies
íntimamente relacionadas y especies más distantes.
Puesto que se usan moléculas de ácido nucleico
de más de un organismo fuente en esta aplicación, las etapas
específicas del método son algo diferentes e incluyen:
- (a)
- amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico;
- (b)
- inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
- (c)
- hibridar sondas marcadas procedentes de una primera y de una segunda fuentes con los fragmentos de ADN inmovilizados dispuesto en micromatriz (las sondas pueden ser secuencias de cADN/mARN o genómicas);
- (d)
- detectar fragmentos de ADN que se hibridan con una sonda marcada de una primera fuente pero no con una segunda fuente, o viceversa; y
- (e)
- determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas.
Lo contrario del anterior método permite el
descubrimiento de secuencias relacionadas (en lugar de diferentes)
en varias especies, incluyendo cepas bacterianas diferentes y
organismos relacionados distantemente. El método incluye:
- (a)
- amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico;
- (b)
- inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
- (c)
- hibridar sondas marcadas (aisladas o agrupadas) con los fragmentos de ADN inmovilizados dispuesto en micromatriz, particularmente con menores restricciones de hibridación (las sondas pueden ser secuencias de cADN/mARN o genómicas);
- (d)
- detectar fragmentos de ADN que se hibridan con una sonda marcada (a menudo con una señal débil);
- (e)
- determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas; y
- (f)
- comparar secuencias de ADN obtenidas de otras secuencias de ADN disponibles para detectar secuencias que muestran homología pero que no son idénticas a otras secuencias conocidas.
La descripción también proporciona la
eliminación de secuencias de ADN no deseadas (cADN o genómicas)
procedentes de cualquier población de ADN dispuesto en matriz. Este
puede incluir ADN contaminante, así como cualquier ADN que no sea
de interés, por ejemplo, secuencias íntimamente relacionadas con las
ya identificadas. Este método incluye:
- (a)
- amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico;
- (b)
- inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
- (c)
- hibridar sondas marcadas, que son secuencias destinadas a eliminación, con fragmentos de ADN inmovilizados dispuestos en micromatriz;
- (d)
- detectar fragmentos de ADN hibridados con una sonda marcada e identificar al menos un fragmento que no se hibrida o que se hibrida débilmente (es decir, sustracción);
- (e)
- determinar la identidad del fragmento de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas; y
- (f)
- repetir las etapas (a), (b) o (c) hasta (e) con las secuencias previamente identificadas en el conjunto de sondas, si se considera necesario, a fin de eliminar secuencias no deseadas de la población de fragmentos.
La presente descripción también proporciona un
método basado en micromatrices para identificar cambios en el
número de copias (por debajo o por encima) de secuencias de ADN
(genómicas, extracromosomales, plásmidos y todas las demás) entre
diferentes fuentes de ácidos nucleicos. El método incluye:
- (a)
- amplificar (mediante PCR o procedimientos de aislamiento de ácido nucleico) y proporcionar una muestra aleatoria de fragmentos de ácido nucleico procedentes de una fuente dada;
- (b)
- inmovilizar los ácidos nucleicos aleatorios sobre una superficie sólida en un formato de micromatriz;
- (c)
- hibridar sondas marcadas (aisladas o agrupadas; con cualquier tipo de ácido nucleico -mARN/cADN, genómico, extracromosomal, plásmido y todos los demás- que generalmente corresponden al tipo de ácido nucleico dispuesto en micromatriz) de otra fuente con los fragmentos de ADN inmovilizados dispuestos en micromatriz;
- (d)
- detectar fragmentos de ADN que muestran ausencia de hibridación con una sonda marcada, o una hibridación significativamente menor o significativamente mayor. Dichas alteraciones en la intensidad de la señal reflejarán cambios en la abundancia; y
- (e)
- determinar la identidad de el(los) fragmento(s) de ADN mediante secuenciamiento de ADN, hibridación y otras estrategias analíticas;
Ejemplo
1
Se generó una librería de cADN mediante técnicas
bien conocidas en la técnica. Se aislaron injertos de cADN
procedentes de clones bacterianos usando Reacción de Polimerasa en
Cadena (PCR). Se añadieron veinticinco \mul de mezcla de PCR a
cada pocillo de una placa de microtitulación de 384 pocillos a
partir de una mezcla maestra de PCR que contenía 1.000 \mul de
10X tampón PCR, 800 \mul de dNTPs 2,5 mM, 400 \mul de cebador
T3 (5 pmoles/\mul), 400 \mul de cebador T7 (5 pmoles/\mul) y
10 \mul de polimerasa Taq recombinante. La placa de PCR se
inoculó de la placa de cultivo de una noche usando una herramienta
de 384 puntas para transferir aproximadamente 1 \mul. Las placas
fueron selladas con MicrosealA y colocadas en unidades alfa de
máquinas de PCR MJ Research tetrad. Las reacciones se precalentaron
a 95ºC durante 4 minutos, seguido de 35 ciclos de amplificación: 45
segundos a 95ºC, 1 minuto a 55ºC y 2,5 minutos a 72ºC.
La amplificación de los injertos de cADN se
verificó mediante electroforesis de gel de agarosa en la que se
cargaron 2 \mul de cada reacción PCR en un gel con un 1% de
agarosa que contenía 500 ng/\mul de bromuro de etidio. Se
añadieron 500 ng de patrón de peso molecular (extensión de 1 Kb,
Promega) a cada gel para determinar el tamaño y cuantificar la
amplificación. Las muestras fueron sometidas a electroforesis en 1X
TAE (Tris Acetato, EDTA) a 150 miliamperios durante 30 minutos.
Los injertos de cADN amplificados fueron
purificados de nucleótidos no incorporados y cebadores en placas
filtrantes de fibra de vidrio de 384 pocillos tal como se indica a
continuación: se añadieron 70 \mul de isotiocianato de guanidinio
5M (Sigma) a cada placa usando un transportador de líquidos Cyclone
de 96 puntas; se transfirieron 25 \mul de reacción PCR desde la
placa de microtitulación de PCR hasta la placa filtrante de fibra
de vidrio y se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente.
La placa filtrante se colocó en un colector de vacío y se secó. Se
lavó la placa filtrante 2 veces con 70 \mul de isopropanol al 80%
y se secó en un colector de vacío durante dos minutos. El productor
de PCR purificado se eluyó de la placa filtrante de fibra de vidrio
a una placa de recolección de 384 pocillos mediante adición de 50
\mul de agua, incubación durante 5 minutos a temperatura ambiente
y centrifugación a 3.000 rpm durante 5 minutos. Los productos de
PCR purificados fueron liofilizados hasta sequedad en un
speed-vac en posición alta durante de 45 minutos a
1 hora. Los productos purificados fueron resuspendidos en 30 \mul
de DMSO/agua al 50%.
Se observó un máximo de 4.608 fragmentos de PCR
diferentes en portaobjetos de vidrio por duplicado usando un
observador de micromatriz Generation III (Gen III) de
Amersham/Molecular Dynamics. Se colocaron doce placas de
microtitulación de fondo en U de 384 pocillos en el hotel del
observador Gen III. Se colocaron hasta 36 portaobjetos de vidrio en
el observador, y se observaron con ADN manteniendo la humedad de la
cámara de observación en el 55%. Se observaron seis portaobjetos
por acceso de placa fuente. Antes de acceder al siguiente conjunto
de plantillas de PCR, se lavó la casete de 12 puntas como se indica
a continuación: 1 segundo en KOH 0,2 M, 1 segundo en etanol al 95%
y 2 segundos en agua destilada. Después de la observación, los
portaobjetos fueron secados al aire durante 1 hora a temperatura
ambiente. Los fragmentos PCR fueron ligados al vidrio mediante
reticulación con UV en un Stratalinker (Stratagene) a 5.000
julios.
Ejemplo
2
Los injertos de cADN para clones verificados en
secuencia fueron amplificados en placas PCR de 96 pocillos tal como
se ha descrito previamente para las placas de 384 pocillos, con la
excepción de que el volumen de reacción PCR fue de 50 \mul. La
amplificación se verificó mediante electroforesis de gel de agarosa
tal como se ha descrito previamente. Los fragmentos de PCR fueron
purificados usando placas filtrantes de fibra de carbono de 96
pocillos y una resina de unión de ADN tal como se indica a
continuación: se añadieron 100 \mul de resina de purificación de
PCR Wizard (Promega) a cada pocillo de una placa filtrante de 96
pocillos usando un pipeteador de 12 canales; se añadieron los 50
\mul de reacción PCR a la resina, y se incubaron a temperatura
ambiente durante 1 minuto; a continuación se colocó la placa en un
colector de vacío durante 1 minuto, hasta sequedad. Se lavó
brevemente cada placa con 200 \mul de isopropanol al 80% antes de
eliminar la disolución en el colector de vacío, y la flaca
filtrante se secó bien mediante vacío. El producto de PCR
purificado fue eluido mediante la adición de 50 \mul de agua
destilada esterilizada seguida de centrifugación a 3.000 rpm
durante 5 minutos en una placa de microtitulación de 96 pocillos.
Las reacciones PCR purificadas fueron reunidas y se purificaron 100
\mug de la reacción de PCR reunida en columnas de purificación PCR
Qiagen. El conjunto de PCR repurificado se verificó mediante
electroforesis de gel como se ha descrito previamente. Se determinó
la concentración de PCR reunido espectrofotométricamente y se ajustó
la concentración a 100 ng/\mul usando agua destilada
esterilizada.
El conjunto de fragmentos PCR purificados se usó
como plantilla para la síntesis de ARN en una reacción de
transcripción in vitro. La reacción PCR purificada (500 ng)
se añadió a una reacción de 20 \mul que contenía 1X tampón de
transcripción, 0,5 mM de cada rNTP, DTT 37 mM y 10 unidades de
polimerasa de ARN T7 ó T3. La reacción se incubó a 37ºC durante 90
minutos. La plantilla de ADN se eliminó mediante la adición de 1
unidad de ADNasa RQ1 e incubación a 37ºC durante 30 minutos. Los
nucleótidos no incorporados fueron eliminados mediante purificación
en una Columna RNA Easy (Qiagen).
Se sintetizó una sonda fluorescente a partir de
la plantilla de ARN sintetizada in vitro en una primera
reacción de marcado de cadena tal como se indica a continuación: se
incubaron 100 ng de plantilla de ARN con 0,5 \mug de hexámeros
aleatorios en un volumen final de 10 \mul durante 10 minutos a
70ºC. Se enfrió la reacción en hielo durante 5 minutos, seguido de
la adición de una mezcla de reacción que contenía 1X tampón de
transcripción inversa (Tris 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5
mM), DTT 10 mM, dGTP, dTTP, dATP 100 \muM, dCTP 50 \muM, Cye3
dCTP ó cye5 dCTP 50 \muM, y 200 unidades de transcriptasa inversa
Superscript II (Gibco BRL, #18089-011). Se incubó
la reacción a 42ºC durante 90 minutos. Se hidrolizó la plantilla de
ARN mediante la adición de 1 \mul de NaOH 5 M e incubación a 37ºC
durante 10 minutos. Se neutralizó el NaOH añadiendo 10 \mul de
MOPS 2M (ácido libre). Los nucleótidos no incorporados y los
cebadores fueron eliminados mediante purificación en columnas GFX
(Pharmacia). Las sondas fueron liofilizadas y resuspendidas en 30
\mul de tampón de hibridación que contenía un 50% de formamida,
5X SSC, SDS al 0,2%, 1X Denhardt's, 100 \mug/ml de ADN de esperma
de salmón y 1 \mug de oligo-dA(80).
Ejemplo
3
El procedimiento para identificar nuevos genes
se muestra en la Figura 2.
Las sondas se desnaturalizaron a 100ºC durante
10 minutos y se añadieron al portaobjetos de la micromatriz. Los
portaobjetos fueron cubiertos con cubreobjetos de vidrio (Coming) e
incubados durante de 18 a 24 horas a 42ºC en una cámara
humidificada. Los portaobjetos hibridados se lavaron dos veces con
2X SSC que contenía un 0,1% de SDS durante 10 minutos a temperatura
ambiente, seguido de 2 lavados en 0,1 X SSC que contenía un 0,1% de
SDS a 42ºC durante 10 minutos. Los portaobjetos fueron sumergidos
varias veces en agua destilada y se secaron en aire filtrado a alta
presión. La hibridación de sondas fluorescentes se detectó mediante
el escaneo de los portaobjetos en un escáner confocal Generation
III (Gen III) (Amersham/Molecular Dynamics).
Las imágenes del portaobjetos se analizaron con
el software de análisis de imágenes ArrayVision (Imaging
Research) para el análisis de detección de manchas, la determinación del fondo localizado, la distribución de las intensidades de señal en una mancha, y las relaciones de señal-ruidos. Los datos fueron exportados en forma de fichero delimitado por tabulador y se exportaron a una base de datos Oracle. La normalización y la determinación de la calidad estadística se llevaron a cabo con herramientas de análisis de conjuntos de datos basadas en Web con herramientas de navegador Web desarrolladas en el Centro Hoechst-Ariad Genomics Center. Los datos fueron clasificados en base a la relación señal-ruido, y los ADNs que presentaron una señal por encima del ruido de fondo pero por debajo de la relación señal-ruido media fueron caracterizadas en mayor profundidad mediante secuenciamiento EST.
Research) para el análisis de detección de manchas, la determinación del fondo localizado, la distribución de las intensidades de señal en una mancha, y las relaciones de señal-ruidos. Los datos fueron exportados en forma de fichero delimitado por tabulador y se exportaron a una base de datos Oracle. La normalización y la determinación de la calidad estadística se llevaron a cabo con herramientas de análisis de conjuntos de datos basadas en Web con herramientas de navegador Web desarrolladas en el Centro Hoechst-Ariad Genomics Center. Los datos fueron clasificados en base a la relación señal-ruido, y los ADNs que presentaron una señal por encima del ruido de fondo pero por debajo de la relación señal-ruido media fueron caracterizadas en mayor profundidad mediante secuenciamiento EST.
Los clones que no se hibridaron en la etapa 3.1
fueron fijados como objetivo para el secuenciamiento EST (etiqueta
de secuencia expresada, del inglés "expressed sequence tag"),
usando técnicas bien conocidas en la técnica. Adams y col., Science
252: 1651-1656 (1991). Se escrutaron las secuencias
frente a las bases de datos de dbEST público, EST de ratón y
Lifeseq (Incyte). Todos los clones recién caracterizados o
identificados como secuencias previamente conocidas fueron añadidos
al conjunto de sondas (sustracción) para evitar la identificación
múltiple del mismo gen durante posteriores hibridaciones.
La siguiente micromatriz que contiene clones
tomados aleatoriamente se hibridó con una nueva sonda que incluía
todos los clones previos, y además contenía cualesquier clones
nuevos identificados mediante el secuenciamiento EST. Los clones
identificados con esta metodología se usaron para construir
conjuntos únicos de genes (Ermolaeva y col., Nat. Genet. 20:
19-23 (1998)) que contienen clones identificados
previamente a partir de otras fuentes (por ejemplo, bases de datos
públicas), así como nuevos clones que no habían sido descritos
previamente.
Ejemplo
4
Se usó un protocolo de sustracción basado en
repeticiones en el que se construyeron micromatrices que contenían
1.500 cADNs diferentes tomados aleatoriamente de una librería de
cADN. La primera micromatriz se hibridó con una sonda de
sustracción que contenía cADNs que codifican 64 genes domésticos y
ribosomales. Los clones no hibridados fueron analizados mediante
secuenciamiento EST. Cualquier clon que no estuviera presente en la
sonda de sustracción previa se añadió a la sonda de sustracción
existente y se hibridó con la siguiente micromatriz que contenía
clones de cADN tomados aleatoriamente. Este procedimiento se repitió
17 veces, de tal modo que se dispusieron en la micromatriz 26.112
cADNs. En base a los datos de hibridación, únicamente se eligieron
7.700 clones mediante secuenciamiento EST. Después de la dispersión,
se identificaron 4.400 clones de cADN diferentes. Este grupo de
clones estaba altamente enriquecido en tránscritos de baja
abundancia. Adicionalmente, eliminando los ARNs mensajeros de alta
abundancia redundantes, la sustracción basada en micromatriz
disminuyó el esfuerzo de secuenciamiento EST en un 70%.
\newpage
Ejemplo
5
Se construyó un chip para identificar ARN
mensajero presente en un bajo número de copias en calvaria de ratón
según el procedimiento descrito en la Figura 3. Se generaron
matrices de 27.648 clones a partir de librerías de calvaria de
ratón normalizadas. Todos los 27.648 clones fueron amplificados
mediante PCR y dispuestos en 18 micromatrices. Como resultado de la
hibridación sustractiva (como se ha descrito anteriormente), se
secuenciaron 7.790 cADNs después de 18 rondas de hibridación.
Mediante comparación de dichas secuencias con bases de datos que
contienen secuencias conocidas, se eligieron 4.608 clones para
amplificación y disposición en una micromatriz. Este chip se usó a
continuación en un experimento de expresión génica diferencial para
identificar genes modulados por BMP2 (proteína morfogénica 2 de
hueso).
Ejemplo
6
El protocolo de hibridación sustractivo descrito
en la presente invención fue demostrado en la eliminación de la
contaminación de genes altamente abundantes de una librería de
clonación. Tal como se muestra en la Figura 4, la librería inicial
estaba contaminada con un 35% de genes mitocondriales. Después de
nueve rondas de hibridación sustractiva, dicha cantidad se redujo
al 2-3%. Esto demuestra la utilidad de la invención
en la eliminación de secuencias altamente abundantes de una
población inicial de ácidos nucleicos.
Claims (11)
1. Un método para analizar una población
heterogénea de ácido nucleico, que comprende las etapas de
(a) proporcionar moléculas de ácido nucleico de
dicha población inmovilizadas sobre una superficie sólida en un
formato de micromatriz;
(b) exponer dicha micromatriz en condiciones de
hibridación a un conjunto de sondas marcadas generadas a partir de
secuencias de ácido nucleico conocidas o de secuencias que se
sospecha están presentes en dicha población;
(c) detectar una o más moléculas de ácido
nucleico no coincidentes en la micromatriz que se hibridan
débilmente o que no se hibridan con dicho conjunto de sondas, en el
que se considera que dichas moléculas de ácido nucleico no
coincidentes se hibridan débilmente con dicho conjunto de sondas si
la hibridación produce una señal de hibridación que tiene una
relación señal-ruido (S/R) inferior a 0,5; y
determinar la identidad de dicha una o más moléculas de ácido
nucleico no coincidentes;
(d) secuenciar dicha una o más moléculas de
ácido nucleico no coincidentes de la etapa (c);
(e) añadir sondas marcadas respectivamente que
correspondan a cada una de dichas una o más moléculas de ácido
nucleico no coincidentes con dicho conjunto de sondas para generar
un conjunto de sondas expandido; y
(f) repetir las etapas (a) a (e) una o más veces
usando dicho conjunto expandido de sondas en lugar de dicho
conjunto de sondas.
2. Un método como el reivindicado en la
reivindicación precedente, en el que dichas una o más moléculas de
ácido nucleico no coincidentes se identifican, se seleccionan y se
inmovilizan en formato de micromatriz para producir un conjunto
unigénico.
3. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dichas moléculas de ácido
nucleico comprenden ADN.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
el ADN es cADN o ADN genómico.
5. El método de la reivindicación 4, en el que
el ADN es un clon procedente de una librería.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, en el que dichas moléculas de
ácido nucleico comprenden ARN.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dichas moléculas de ácido
nucleico son amplificadas.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
dichas moléculas de ácido nucleico son amplificadas usando
amplificación de PCR.
9. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la marca se selecciona del
grupo que consiste en una marca fluorescente, una marca
luminiscente y una marca radioactiva.
10. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho conjunto de sondas
marcadas contiene una o más moléculas de ácido nucleico que
presentan secuencias derivadas de una base de datos pública.
11. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicha superficie sólida es
una superficie de vidrio.
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