JP2005065604A - 魚病細菌検出基板、魚病細菌検出方法、および、魚病細菌検出試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、簡便かつ迅速に魚病診断を行うことができる、魚病細菌検出基板、魚病細菌検出方法、および、魚病細菌検出試薬を提供することを課題とする。
【解決手段】 エドワジエラ属、フレキシバクター属、フォトバクテリウム属、ラクトコッカス属、およびストレプトコッカス属などに例示される魚病細菌に由来するポリヌクレオチドが固定された基板を、魚病細菌検出基板とする。また、エドワジエラ属、フレキシバクター属、フォトバクテリウム属、ラクトコッカス属、およびストレプトコッカス属などに例示される魚病細菌に由来するポリヌクレオチドの少なくとも１種を含む試薬を、魚病検出試薬とする。前記ポリヌクレオチドの少なくとも１種を用い、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲなどを行い、魚病細菌の検出を行う。
【選択図】 図１

Description

本発明は、魚病細菌検出基板、魚病細菌検出方法および魚病細菌検出試薬に関し、詳しくは魚病診断、養殖場などの環境モニタリングに好適に用いられる魚病細菌検出基板、魚病細菌検出方法および魚病細菌検出試薬に関する。

魚類病原菌による感染症が養殖場で発生したとき、その原因菌を究明することは魚病の治療にとって重要なことである。魚病の診断は、寒天などを用いて細菌を分離した後、抗血清を用いたスライド凝集反応試験が行われているものが多いが、分離には数日〜数週間かかり手間もかかるため、迅速かつ簡便な検出・同定が望まれている。

また、近年のバイオテクノロジーの急速な発展にともない、バイオテクノロジーを利用し遺伝子診断をもとに病原菌を分析、同定する技術が開発されている。魚病の診断の分野においては、魚類の病原菌を同定するために、特定種に由来する特異的遺伝子を見いだし、これをプローブとして用い、病原菌を特定するという技術が開発されている（例えば、特許文献１など）。

特開平３−２８０８８２号公報

一般に、水中の病原菌の伝搬は早く、また容易に大規模に拡大してしまう場合が多いため、病気の予防および発生した場合の早期発見が極めて重要である。上記のように、魚病診断に関する技術は様々なものが開発されているが、さらに簡便かつ迅速に病原菌の発見を可能とする技術が求められている。上記のような、状況の下、本発明は、簡便かつ迅速に魚病診断を行うことができる、魚病細菌検出基板、魚病細菌検出方法、および、魚病細菌検出試薬を提供することを課題とする。

本発明者らは、鋭意研究を進めたところ、魚病細菌を簡便に特定することができるポリヌクレオチド断片を見いだした。さらに、見いだしたポリヌクレオチド断片を基板に固定して用いることにより、簡便かつ迅速に魚病細菌の特定を行うことができることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は次の通りである。

〔１〕 魚病細菌に由来するポリヌクレオチドが固定された基板である、魚病細菌検出基板。
〔２〕 前記魚病細菌が、エドワジエラ属、フレキシバクター属、フォトバクテリウム属、ラクトコッカス属、およびストレプトコッカス属からなる群より選ばれる属に属する１種または２種以上の細菌である、上記〔１〕に記載の、魚病細菌検出基板。
〔３〕 前記魚病細菌に由来するポリヌクレオチドが、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域の全部または一部を含む、上記〔１〕または〔２〕に記載の魚病細菌検出基板。
〔４〕 下記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドが固定された基板である、魚病細菌検出基板。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
〔５〕 試験サンプル中に存在する核酸を鋳型とし、下記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドを、１対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方のＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲ法により前記核酸の特定部位を増幅し、増幅された核酸を検出し、魚病細菌に由来する核酸を検出する、魚病細菌の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
〔６〕 標識物質を備えた下記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドを、試験サンプルに添加して、前記標識物質を検出して前記ポリヌクレオチドがハイブリダイズする核酸を検出する、魚病細菌の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
〔７〕 下記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有する、魚病細菌検出試薬。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド

（Edwardsiella属、配列番号１）
5'-CTCATGCCATCAGATGAACCCAGATGG-3'
（Flexibacter maritimus、配列番号２）
5'-CCTACTCGTAGGTACGTTTCTTCCTGTA-3'
（Photobacterium damsela、配列番号３）
5'-ACTACCTTCCTCCCTACTGAAAGTGCTTTA-3'
（Lactococcus garvieae、配列番号４）
5'-CCGTCACTTAAGTAATTTTCCACTCTAC-3'
（Streprococcus iniae、配列番号５）
5’-AAGTACATGTGTACTCTAGTGTCATGC-3’

本発明により、魚病の原因菌を簡便かつ迅速に診断することができる。本発明は、養殖などにおける魚病の監視、予防、早期発見、治療に有用である。

以下、本発明の実施形態について、
１．魚病細菌検出基板、
２．魚病細菌検出方法、
３．魚病細菌細菌検出試薬、
４．具体的な適用例、
の順に説明する。なお、本発明を実施するにあたり、遺伝子工学的な処理、例えば、核酸、タンパク質、プラスミド、種々の酵素、形質転換体などの調製、形質転換体の選抜、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法などの諸操作については、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, J. Sambrookら編、1989、COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（1999）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、それらが参照される。

１．魚病細菌検出基板
本発明の魚病細菌検出基板は、基板上に、魚病細菌に由来するポリヌクレオチドが、基板上に固定されている。本発明の魚病細菌検出基板は、例えば、ポリヌクレオチドの固定方法などの製法に限定されるものではない。また、本明細書においては、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップなどの名称による区別はぜず、双方とも含む意味で、ＤＮＡマイクロアレイという。

基板は、ポリヌクレオチドを固定し保持できるものであればよく、ガラス、プラスチック、繊維類などの各種材料を用いることができる。

魚病細菌に由来するポリヌクレオチドは、魚病細菌に特有の塩基配列を備えている部分を用いる。また、魚病細菌の種類ごとに保存性の高い領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドであることが好ましい。このような配列は、実験的に単離、精製し、単離されたポリヌクレオチドの塩基配列を解析し、その配列に基づいて決定してもよいし、また、塩基配列等の各種データベースで既知の塩基配列を検索し、アラインメントを取ることなどによって、In Silicoで決定してもよい。核酸またはアミノ酸などのデータベースは、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）、ＥＭＢＬ（European Molecular Biology Laboratry, EMBL nucleic acid sequence data library）、ＧｅｎＢａｎｋ（Genetic sequence data bank）などのデータベースを利用できる。

魚病細菌の種類に応じた特有の配列を見いだすためには、例えば、細菌に特有の遺伝子を選び、マルチプルアラインメントをとるなどの手段により行うことができる。アラインメントをとるためのアルゴリズムには特に限定はなく、より具体的な解析プログラムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８などのプログラムを利用することができる。アラインメントをとる際のパラメータは、各プログラムのデフォルト状態で実行してもよいが、プログラムの種類などに応じて適宜調整してよい。

魚病細菌には特に限定はなく、試験を行う者が任意に選択してよい。代表的な魚病細菌としては、例えば、エドワジエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属、フレキシバクター（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、および、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属などの属に属する細菌が挙げられる。

基板上に固定されるポリヌクレオチドとして好ましくは、これらの属それぞれにおいて特異的な塩基配列である。魚病細菌を区別して検出するために、細菌の種類によって配列が特異的であり、かつ、細菌が共通して有している遺伝子領域が好ましい。このような領域としては、例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、ＤＮＡ ｇｙｒａｓｅ Ｂなどの遺伝子領域が挙げられる。基板に固定されるポリヌクレオチドには１６Ｓ ｒＲＮＡなどの全領域を用いてもよいが、細菌の検出ができる範囲であればその一部を含む領域であってもよい。

エドワジエラ属、フレキシバクター属、フォトバクテリウム属、ラクトコッカス属、および、ストレプトコッカス属に属する細菌を同定するためのポリヌクレオチド断片としては、より具体的には以下（ａ）から（ｊ）に記載の配列が例示される。これらの配列は、各属の細菌における１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの一部に由来する。これらの配列を用いることにより各属の細菌を安定的に区別できる。なお、本明細書において、配列番号１に記載の塩基配列とは、下記配列表における配列番号１に記載の塩基配列であり、他の配列番号を付したものも同様である。

エドワジエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属に属する細菌を検出；
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド

フレキシバクター マリチムス（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）を検出；
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド

フォトバクテリウム ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａ）を検出；
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド

ラクトコッカス ガルビエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ）を検出；
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド

ストレプロコッカス イニアエ（Ｓｔｒｅｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）；
（ｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド

基板に固定するポリヌクレオチドは、合成してもよいし、ＰＣＲ法などにより特定領域を増幅し、分離・精製して調製してもよい。基板に固定するポリヌクレオチドの長さは、ハイブリダイゼーションなどの条件にもよるが、検出しようとする配列以外の配列とのミスマッチを抑制し、検出目的の配列とハイブリダイズ可能な長さであればよい。ポリヌクレオチドの長さは塩基数にして、好ましくは１０bp〜１０００bp程度、より好ましくは２０bp〜４０bp程度である。

本発明の魚病細菌検出基板は、基板上に、所定のポリヌクレオチドフラグメントを整列させて固定することにより製造される。ポリヌクレオチドフラグメントを固定する方法は特に限定されず、光リソグラフィー技術等を利用して基板上でＤＮＡ合成を行う方法、あるいは、スポッター（アレイヤー）を用いてポリヌクレオチドフラグメントを固定していく方法などが例示される。

ＤＮＡマイクロアレイの一例の概要を図１に示す。図１中（Ｉ）はＤＮＡマイクロアレイの全体像を示し、（ＩＩ）は（Ｉ）の一部を拡大した図であり、（ＩＩＩ）は（ＩＩ）の一部を拡大した図であり、（ＩＶ）は（ＩＩＩ）の一部を拡大した図である。

ＤＮＡマイクロアレイ１は、ガラスプレート１１にＤＮＡフラグメントの固定領域１０としての１００サイトを備えてなる。なお、（ＩＩ）に示されるＤＮＡフラグメントの固定領域１０のウエルは一部のみを表示している。ウエルプレート１０の一部１０Ｘは、１００サイト中の５０サイトを拡大して示したものである。ウエルプレート１０上の個々のウエルには一本鎖ＤＮＡフラグメント２０が固定されている。図１の（ＩＶ）には、ハイブリダイゼーションが形成されたウエルの状況を模式的に示す。固定されたＤＮＡフラグメント２０に、これと相補的な塩基配列を有する標識核酸２１がハイブリダイズしている。標識核酸２１には標識物質３０が結合されている。標識物質は、測定機器または目視などにより検出可能な物質であればよく、例えば、発色物質、蛍光物質、発光物質、放射性同位体、抗原もしくは抗体、酵素などが用いられる。より具体的には、例えばｃｙ３、ｃｙ５などの標識物質が好適である。白丸で表されたウエル１０ａは標識物質が検出されなかった部位、黒丸で表されたウエル１０ｂは標識物質が検出された部位を示す。

魚病細菌を検出可能な複数種のポリペプチドを、本発明の魚病細菌検出基板に固定しておくことにより、複数の魚病細菌について簡便にまた迅速に検査することができる。

２．魚病細菌検出方法
２−１．ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法
本発明では魚病細菌の検出が主たる目的である。ＤＮＡマイクロアレイを用いて魚病細菌を検出するための実施形態の一例について以下説明する。

ＤＮＡマイクロアレイとして、上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドを基板に固定したものを用いる。上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドのうちから、検査対象とする１種または２種以上のポリヌクレオチドを選択する。１つのウエルには１種のポリヌクレオチドを固定する。１種のポリヌクレオチドについて複数のウエルに固定してもよい。複数のサイトに固定して、検出することにより、試験サンプル中の魚病細菌の定量がより正確になり、また、ミスマッチによる精度の低下も抑制できる。

試験の対象としての試験サンプルは、例えば養殖場の海水、養殖場の魚、または、病気を発症している魚などを採取してサンプルとすればよい。試験サンプルから、そこに含まれている微生物の核酸を抽出する。核酸は、二本鎖ポリヌクレオチドとして回収することが好ましい。核酸の抽出方法は、定法によればよく、例えば、濾過、培養、遠心、溶解等を行い、回収できる。なお、本明細書において核酸とは、ポリヌクレオチドのことであり、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。また、ポリヌクレオチドとは、少なくとも２以上のヌクレオチドが結合した高分子をいう。

抽出された核酸の所定部位を増幅する。核酸の増幅は、例えばＰＣＲ法により、容易に行うことができる。ＰＣＲ法による核酸の増幅は、定法に従って行うことができる。

増幅する部位は、ＤＮＡマイクロアレイに固定したＤＮＡフラグメントと同じ核酸領域をコードする部位である。上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドのうちの１種または２種以上を固定している本例においては、増幅する部位は１６Ｓ ｒＲＮＡの領域である。

増幅したＤＮＡ２２は一本鎖とし、ＤＮＡマイクロアレイに固定されたＤＮＡフラグメント２０とハイブリダイゼーションさせる（図２）。ハイブリダイゼーションあるいは洗浄は、ストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。ストリンジェントな条件とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい，あるいは類似配列によってクロスハイブリダイゼーションしたＤＮＡを解離させる条件である。ハイブリダイゼーションあるいは洗浄におけるストリンジェントな条件について具体的に例示する。ハイブリダイズさせる際の温度条件としては、例えば、好ましくは２０〜６５℃である。また、ハイブリダイズさせる際の時間は、約１分〜１５時間である。さらに、洗浄の際の洗浄液は、好ましくは４×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、より好ましくは３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、もしくは５００ｍＭ 塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）が用いられる。また、洗浄時の温度は、好ましくは２０〜９５℃、より好ましくは３５〜６５℃である。また、ハイブリダイゼーション時に用いる緩衝液は、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、もしくは５０ｍＭヒスチジンバッファー、あるいは一般に市販されている緩衝液を用いることができ、核酸のハイブリダイゼーション用の混合液も市販品を入手可能である。

さらに、標識プローブ２３をハイブリダイズさせる（図２）。標識プローブ２３は、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡに共通する配列を有し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡフラグメントの５’末端に、標識物質３０としてｃｙ５もしくはｃｙ３を結合させたものを用いる。標識プローブをハイブリダイゼーションさせる代わりに、核酸の増幅の際のプライマーにあらかじめ標識しておいてもよい。

ハイブリダイゼーションおよび洗浄処理が完了後、蛍光スキャナー（読みとり装置）でスキャンする。蛍光スキャナーの様式は特に限定されない。蛍光スキャナーのレーザーの出力、検出部の感度を調整して行うスキャンを行う。

スキャンの結果に基づく定量方法は、定量ソフトウエアにより行う。定量ソフトウエアに特に限定はない。また、定量にあたっては、ＤＮＡフラグメントのスポット位置、ＤＮＡフラグメントが固定されたスライドガラスの寸法精度などを考慮し、またバックグラウンド（ＢＧ）の調整を行うことが好ましい。

２−２．標識プローブをハイブリダイゼーションさせる方法
上記では、魚病細菌に特有のＤＮＡフラグメントを基板に固定してＤＮＡマイクロアレイとしたが、本発明の魚病細菌検出方法は、魚病細菌に特有のＤＮＡフラグメントを用いて、魚病細菌の核酸にハイブリダイズさせて検出する様々な形態をとることができる。固定する場合も、上記のように基板に限らず、ガラスビーズなどの不溶性の担体などに担持させて用いてもよい。また、基質等に固定する方法に限らず、フラグメントのままプローブとして用いてもよい。

魚病細菌に特有のＤＮＡフラグメントを標識プローブとして用い、ハイブリダイゼーションにより検出する実施形態の一例を以下に説明する。上記２−１．では、上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドを固定して用いたが、本例は、上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドを固定しないでプローブとして用いる。すなわち、標識物質を備えた上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドを、試験サンプルに添加して、前記標識物質を検出して前記ポリヌクレオチドがハイブリダイズする核酸の有無を検出する。

ハイブリダイゼーションを用いた、標的とするポリヌクレオチドの検出、分離、単離の手法としては、例えば、サザンブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法など多数存在し、本発明の方法においては、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを利用した様々な手法をとり得る。コロニーハイブリダイゼーション等を行う場合の、試験サンプルの調製、ハイブリダイゼーション・洗浄の実験条件、標識物質の検出手段等は各々の手法の定法に従って行う。ハイブリダイゼーション，及び洗浄は、ストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。

２−３．ＰＣＲ法で核酸を増幅し分離する検出方法
本発明の魚病細菌検出方法のまた別の実施形態の一例を説明する。本実施形態では、試験サンプル中に存在する核酸を鋳型とし、上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドを、１対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方のＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲ法により前記核酸の特定部位を増幅し、増幅された核酸を検出して、魚病細菌に由来する核酸の有無を判定し、魚病細菌の検出を行う。

増幅する部位としては、魚病細菌を区別して検出するために、細菌の種類によって配列が特異的であり、かつ、細菌が共通して有している遺伝子領域が好ましい。このような領域としては、例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、ＤＮＡ ｇｙｒａｓｅ Ｂなどの遺伝子領域が挙げられる。増幅するポリヌクレオチドには１６Ｓ ｒＲＮＡなどの全領域を用いてもよいが、細菌の検出ができる範囲であればその一部を含む領域であってもよい。

ＰＣＲ法には様々な様式の変法があるが、本発明においては核酸の所定部位を増幅できる限り、特に限定されない。試験サンプルの形態は、ＰＣＲを行うことができる状態に調製されていればよい。例えば、試験サンプル中から核酸を抽出してもよいし、あるいは、Ｉｎ ＳｉｔｕでＰＣＲを行えるように細胞組織の切片を調製してもよい。ＰＣＲの温度操作、ＰＣＲ反応液の組成、試料に添加するＤＮＡ合成酵素などの諸条件は、定法に従って調整することができる。

ＰＣＲに用いられる１対のプライマーのうち、少なくとも一方は、上記（ａ）から（ｊ）からなる群より選ばれる。他方のプライマーは、通常のプライマー設計方法に準じて任意に設計してよい。上記（ａ）から（ｊ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法により増殖される領域は、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域を含む。

増幅された核酸は、核酸分離の定法により分離して検出できる。核酸の分離は定法によればよく、例えば、電気泳動、クロマトグラフィー、遠心分離、沈降法などの方法がとられる。増幅し分離された核酸が、魚病細菌由来の核酸であるか否かを、魚病細菌由来の核酸をコントロールとして比較することにより判定し、試験サンプル中に魚病細菌が存在するか否かを検出することができる。

３．魚病細菌細菌検出試薬
上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドは上記のように、魚病細菌の特定に用いることができる。すなわち、上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドにより、これらの群から選ばれる少なくとも１種を配合した魚病細菌検出試薬が提供される。上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドは、化学合成等の方法により得ることができる。試薬には、試薬基材、緩衝剤など、生物化学的に許容される他の成分を配合してよい。上記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチドは、魚病細菌の特定領域を増幅するためのＰＣＲプライマー、ＤＮＡマイクロアレイに固定するフラグメント、標識物質を結合させて標識プローブなどとして用いることができる。本発明の試薬は、魚病細菌を簡便にかつ迅速に検出するために有用である。

４．具体的な適用例
次に、本発明を適用した実施形態についてより具体的な例を挙げて説明する。
（ＤＮＡマイクロアレイを用いた魚病細菌の診断）
病原菌に感染した魚の内臓よりｔｏｔａｌ ＤＮＡを抽出し、フォワードプライマーとして5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3'（配列番号６）、リバースプライマーとして5'- ATT ACC GCG GCT GCT GG -3'（配列番号７）、を用いてＰＣＲ法により、ＤＮＡの増幅を行う。配列番号６および７で示される塩基配列は、いずれもバクテリア特異的配列なものであり、これらをプライマーとして増幅される領域には１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域の一部が含まれる。増幅させたＤＮＡを一本鎖化させ、本発明のＤＮＡマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーションを行う。温度をかけてミスマッチ配列を除去した後、５’Ｃｙ３標識をしたヌクレオチドを室温でハイブリダイズさせる。蛍光が検出された個所に固定したプローブ配列を１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の一部として持つ菌が、魚病の原因菌であることがわかる。

（電気泳動による魚病細菌の診断）
病気に感染した魚の内臓よりｔｏｔａｌ ＤＮＡを抽出し、配列番号２に示されるフレキシバクター マリチムスに特異的なオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとし、バクテリア特異的配列 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'（配列番号６）をフォワードプライマーとして、酵素、ｄＮＴＰ、バッファーを混合した液を９５度１０分の後、９５度１分、６２度１分、７２度１分のサイクルを２５回繰り返して遺伝子増幅を行う。配列番号２および配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーをプライマーとして増幅される領域には１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域の一部が含まれる。アガロースゲル電気泳動により，約４５０ｂｐの増幅が認められた場合には感染病原菌がフレキシバクター マリチムス菌であることがわかる。

（ハイブリダイゼーションによる魚病細菌の診断）
病気に感染した魚の内臓から寒天培地を用いて細菌を増殖させる。このコロニーをメンブレンに移し取る。このようなメンブレンを５枚準備し、配列番号１から５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれアイソトープ³²Ｐでラベルする。ラベルされたオリゴヌクレオチドをプローブとして、各メンブレン上でハイブリダイズさせる。オートラジオグラフィーによりシグナルが検出されたメンブレンで用いられたプローブの由来細菌が、感染菌であることがわかる。

以下に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（１）配列解析
ＧｅｎＢａｎｋに登録されているフレキシバクター マリチムスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列４種（ＡＢ０７８０５７、Ｄ１２６６７、Ｍ６４６２９、Ｄ１４０２３）について、解析プログラムＣｌｕｓｔａｌＸ１．８を用いてアラインメントを行い、フレキシバクター マリチムスに保存されていて、かつ、特異的な配列を決定した。解析の結果に基づき、配列番号２に示される配列を得た。プログラムを実行する際の各種パラメーターはデフォルトで行った。パラメータの具体的な設定は次の通りとした。

ClustalX1.8パラメーター
Multiple parameters
Gap opening: 15
Gap extention: 6.66
Delay Divergent Sequences: 30 %
DNA transition weight: 0.5
Use negative matrix: Off
DNA weight matrix: IUB

エドワジエラ属の細菌、フレキシバクター マリチムス、フォトバクテリウム ダムセラ、ラクトコッカス ガルビエ、ストレプトコッカス イニアエについてＧｅｎＢａｎｋに登録されている１６Ｓ ｒＲＮＡの配列を検索し、同様の解析手法にて、それぞれについて特異的な配列、配列番号１（エドワジエラ属の細菌）、配列番号２（フレキシバクター マリチムスの細菌）、配列番号３（フォトバクテリウム ダムセラ）、配列番号４（ラクトコッカス ガルビエ）、配列番号５（ストレプトコッカス イニアエ）を得た。

（２）ＤＮＡマイクロアレイの調製
ここでは，株式会社日立ハイテクノロジーズ社製 ナノチップ モレキュラーバイオロジー ワークステーションを用いてアレイの調整を行った。配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドにビオチンラベルしたものを、アレイ基盤にビオチン・アビジン結合により固定し，ＤＮＡマイクロアレイを調製した。ＤＮＡマイクロアレイの作製は、日立ハイテクノロジーズ社のマニュアルに沿って行った。

（３）ＤＮＡの抽出
フォトバクテリウム ダムセラ（ＮＵＦ５１５）、エドワジエラ タルダ（ＮＵＦ８０７）、フレキシバクター マリチムス（ＮＵＦ６８４）の培養株を長崎大学金井助教授より分譲を受け、これらの培養株から、以下のようにしてｔｏｔａｌ ＤＮＡを抽出した。なお、ｔｏｔａｌ ＤＮＡとは、特定部位に限られた部位ではなく、微生物が有するＤＮＡの総体のことをいう。

ＤＮＡの抽出操作には、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）を用いて行った。試薬、Ｂｕｆｆｅｒ等は、特に記載がないものについてはキット添付のものを用いた。

（３−ａ）試薬の調製
（試薬１）；１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ１２．１１ｇ／１００ｍＬ ｄＨ₂Ｏ（メスアップ）。ＨＣｌでｐＨ８．０に調整後オートクレーブ処理。
（試薬２）；０．５ ＥＤＴＡＥＤＴＡＮａ₂・２Ｈ₂Ｏ １８．６１ｇ／１００ｍＬ ｄＨ₂Ｏ（メスアップ）。ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後オートクレーブ処理。
（試薬３）；ＴＥ１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬ ０．５ ＥＤＴＡ ２００μＬ／１００ｍＬ ｄＨ₂Ｏ（メスアップ）。
混合後オートクレーブ処理。

（３−ｂ）操作
上記の菌株をそれぞれ培養した培養液を遠心分離により濃縮した。次いでＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製 ＩＳＯＰＬＡＮＴに附属）を３００μＬ加えて１〜２秒ボルテックスした。その後５０℃で３０分間インキュベートした。これに、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製 ＩＳＯＰＬＡＮＴに附属）を１５０μＬ加えて５〜６秒ボルテックスした後、５０℃で１５分間インキュベートした。これにＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製 ＩＳＯＰＬＡＮＴに附属）を１５０μＬ加えて１〜２秒ボルテックスした後、氷上に１５分間静置した。これを１２０００×ｇ、１５分間、４℃の条件で遠心し、水相を１．５ｍＬマイクロチューブに分取した。これに２〜２．５倍量のエタノールを加え、よく混合し、１２０００×ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心した。これの上清を捨て、沈殿を７５％エタノールでリンス後、試薬３５０μＬに溶解させた。

（４）ＤＮＡの精製
抽出したＤＮＡは、ＤＮＡ精製用カラムＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により行った。試薬の調製、精製方法は、マニュアルに従った。

（５）ＰＣＲ反応
上記（４）で精製した各菌のＤＮＡを、それぞれＰＣＲ法により増幅した。フォワードプライマーとして5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3'（配列番号６）、リバースプライマーとして5'- ATT ACC GCG GCT GCT GG -3'（配列番号７）を用いた。配列番号６および配列番号７に記載の塩基配列は、いずれもバクテリア特異的配列であり、これらをプライマーとして増幅される領域には１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域の一部が含まれる。ＰＣＲ反応に用いたdNTP MIX、Ｂｕｆｆｅｒは、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に添付のものを用いた。

また、ＰＣＲ反応においてチューブには以下の溶液を入れて混合した。
10×PCR Buffer 10μL
dNTP MIX 10μL
primer forward 1μL
primer reverse 1μL
template DNA 10ng
AmpliTaq Gold 0.5μL
滅菌水
総容量 100μL

増幅されたＤＮＡの塩基配列を解析した。フォトバクテリウム ダムセラの増幅されたＤＮＡの塩基配列を配列番号８に、エドワジエラ タルダの増幅されたＤＮＡの塩基配列を配列番号９に、フレキシバクター マリチムスの増幅されたＤＮＡの塩基配列を配列番号１０に、それぞれ示す。

（６）ハイブリダイゼーションおよび検出
上記（５）の操作により増幅させたＤＮＡを一本鎖化させ、それぞれの種類について上記（２）のように調製したＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズさせた。温度をかけてミスマッチ配列を除去した後、５’Ｃｙ５標識をしたポリヌクレオチド 5'-TCC CGT AGG A-3'（配列番号１１、バクテリア特異的配列）を室温でハイブリダイズさせた後、洗浄した。

なお、上記（６）の操作により増幅させたＰＣＲ産物由来一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション、５’Ｃｙ５標識をしたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの条件はそれぞれ次の通りとした。
ＰＣＲ産物由来一本鎖ＤＮＡハイブリダイゼーション条件
緩衝液：５０ｍＭヒスチジンバッファー
温度：室温
時間：５分
５’Ｃｙ５標識ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション条件
緩衝液：５０ｍＭヒスチジンバッファー
温度：室温
時間：５分

また、洗浄の条件は次の通りとした。
洗浄液：５００ｍＭ 塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０） 温度：３８℃

洗浄後レーザー光を当てて検出を行った結果、フレキシバクター マリチムスから抽出したｔｏｔａｌ ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行ったＤＮＡフラグメントをハイブリダイズさせた時のみ蛍光が検出された。結果を図３に示す。すなわち、上記（１）のようにして特定された配列をＤＮＡマイクロアレイに固定して、魚病菌が特定された。試験サンプルの調製から魚病細菌の特定までに要した時間はおよそ６時間であった。

ＤＮＡマイクロアレイの概要を示す図である。 ＤＮＡマイクロアレイを用いて、魚病菌由来のＤＮＡを検出する状態を模式的に示した図である。 ＤＮＡマイクロアレイでハイブリダイゼーション後の蛍光強度を測定した結果を示す図である。

符号の説明

１ ＤＮＡマイクロアレイ
１０ ＤＮＡフラグメントの固定領域
１０Ｘ ＤＮＡフラグメントの固定領域の一部
１０ａ ＤＮＡフラグメントのスポッディング部位（標識物質検出されず）
１０ｂ ＤＮＡフラグメントのスポッディング部位（標識物質検出）
１１ ガラスプレート
２０ 基板に固定されたＤＮＡフラグメント
２１ 標識核酸
２２ ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡフラグメント
２３ 標識プローブ
３０ 標識物質

配列番号６；ＰＣＲプライマー
配列番号７；ＰＣＲプライマー
配列番号９；塩基番号１〜５０７、ＰＣＲで増幅された領域
塩基番号４６９、ａまたはｃまたはｇまたはｔ
配列番号１０；塩基番号１〜４９３、ＰＣＲで増幅された領域
配列番号１１；プローブ

Claims (7)

1. 魚病細菌に由来するポリヌクレオチドが固定された基板である、魚病細菌検出基板。
2. 前記魚病細菌が、エドワジエラ属、フレキシバクター属、フォトバクテリウム属、ラクトコッカス属、およびストレプトコッカス属からなる群より選ばれる属に属する１種または２種以上の細菌である、請求項１に記載の、魚病細菌検出基板。
3. 前記魚病細菌に由来するポリヌクレオチドが、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域の全部または一部を含む、請求項１または２に記載の魚病細菌検出基板。
4. 下記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドが固定された基板である、魚病細菌検出基板。
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｃ）配列番号２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｇ）配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｈ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｊ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
5. 試験サンプル中に存在する核酸を鋳型とし、下記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドを、１対のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方のＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲ法により前記核酸の特定部位を増幅し、増幅された核酸を検出して、魚病細菌に由来する核酸を検出する、魚病細菌の検出方法。
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｃ）配列番号２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｇ）配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｈ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｊ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
6. 標識物質を備えた下記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドを、試験サンプルに添加し、前記標識物質を検出して前記ポリヌクレオチドがハイブリダイズする核酸を検出する、魚病細菌の検出方法。
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｃ）配列番号２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｇ）配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｈ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｊ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
7. 下記（ａ）から（ｊ）に記載のポリヌクレオチド群から選ばれる少なくとも１種のポリヌクレオチドを含有する、魚病細菌検出試薬。
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｃ）配列番号２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｅ）配列番号３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｆ）配列番号３に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｇ）配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｈ）配列番号４に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｉ）配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
   （ｊ）配列番号５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド

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