DE69034219T2 - Nukleinsäure-Sonden und Verfahren zum Nachweis von Fungi - Google Patents

Nukleinsäure-Sonden und Verfahren zum Nachweis von Fungi Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft den Nachweis pilzlicher Organismen. Insbesondere bietet sie Nukleinsäuresonden und -zusammensetzungen zusammen mit Verfahren zu deren Verwendung für den spezifischen Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen in Klinik-, Nahrungsmittel-, Umwelt- und anderen Proben.
  • Fungi sind eine vielfältige Sammlung von in der Zellwand eingeschlossenen Eukaryoten, entweder saprophytisch oder parasitisch, und können morphologisch als Hefen, Schimmelpilze, Pilze oder mittels anderer Namen beschrieben werden. Es handelt sich bei ihnen um ubiquitäre Organismen; meist sind sie harmlos, und sie werden zuweilen für kommerzielle Zwecke eingesetzt, gelegentlich sind sie jedoch pathogen.
  • Die pathogenen Fungi sind in die Domäne medizinischer Mykologie eingeschlossen. Dieses medizinische Gebiet erkennt Kategorien pilzlicher Pathogene (siehe zum Beispiel Rippon, J. W., Medical Mycology, Saunders Co., Philadelphia, 1988) einschließlich oberflächlicher, kutaner, subkutaner und systemischer Infektion. Die mit Abstand seriöseste Pathologie verursacht durch die Fungi mit dem es Kliniker zu tun haben, sind systemische Infektionen. Tiefgewebe- und systemische Fungämie verursachen hohe Sterblichkeitsraten, insbesondere bei Populationen mit geschwächtem Immunsystem.
  • Unter den Fungi, welche in der Lage sind, systemische Fungämie zu verursachen, gibt es eine Zweiteilung zwischen den sogenannten „pathogenen" Fungi und den „opportunistischen" Fungi. Diese Namensgebung ist irreführend; die Opportunisten sind die Killer und die pathogenen Fungi sind oft selbsteinschränkend. Zu pathogenen Fungi zählen Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidiodes brasiliensis und das subkutane Pathogen Sporothrix schenkii. Zu den wichtigen opportunistischen Fungi zählen Candidas – insbesondere C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis und Torulpsis (Candida) glabrata – Cryptococcus neoformans, Mitglieder der Gattung Aspergillus, und in einem geringerem Umfang besonders jeder Fungus, welcher bei physiologischen Temperaturen des Wirtes überleben kann.
  • Die klinische Diagnose und Behandlung systemischer Fungämie weisen im Vergleich zu bakterieller Septikämie (welche häufig bei der gleichen Population mit geschwächtem Immunsystem auftritt) mehrere Nachteile auf. Erstens ist die antifungale Chemotherapie toxischer für den Patienten als die analoge antibakterielle Chemotherapie. Demzufolge erhoffen sich Kliniker eine zuverlässigere Demonstration von Fungämie vor der Verschreibung antifungaler Wirkstoffe. Zweitens haben an Fungämie leidende Patienten eine schlechte Prognose, es sei denn, die Diagnose wird in einem frühen Infektionsstadium gestellt. Drittens wachsen Fungi im Allgemeinen langsamer als die meisten Bakterienorganismen und dementsprechend ist eine Diagnose, welche einen in vitro Kultivierungsschritt erfordert, zeitaufwändig. Und Viertens erzeugen einige der Fungi (wieder bei Diagnosen, welche einen Kultivierungsschritt erfordern) wochenlang keine Kolonien auf synthetischen Medien, wenn überhaupt. All diese Faktoren sowie die Tatsache, dass eine große Zahl an Fungi potentielle systemische Pathogene sind, weisen auf den Bedarf für ein direktes Verfahren zum Nachweis von Fungi hin, welches praktisch alle Fungi einschließt.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Nukleinsäuresonden, welche zum Nachweis von Fungi in der Lage sind.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Nukleinsäuresonden, welche mit Zielregionen hybridisieren können, welche unter normalen Untersuchungsbedingungen für Sonden zugänglich gemacht werden können.
  • Ein noch weiterer Aspekt ist die Bereitstellung von Nukleinsäuresonden für pilzliche rRNA-Sequenzen geeignet als Grundlage für schnelle diagnostische Untersuchungen zur Bewertung der Gegenwart dieser Organismen in einer klinischen Probe.
  • EP-A-0335633 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA-Sonde zum Nachweis eines Zielorganismus, welcher zu einem Stamm pilzlicher Mikroorganismen gehört. Diese Sonden werden in der vorliegenden Erfindung nicht beschrieben.
  • Während Kohne et al. (Biophysical Journal 8:1104-1118, 1968) ein Verfahren zur Herstellung von Sonden für rRNA-Sequenzen diskutieren, liefern sie keine Lehre, welche für die Herstellung von Sonden zum Nachweis von Fungi notwendig ist.
  • Pace and Campbell (Journal of Bacteriology 107:543-547, 1971) diskutieren die Homologie ribosomaler Ribonukleinsäuren aus unterschiedlichen Bakterienspezies und ein Hybridisierungsverfahren zum Quantifizieren solcher Homologiegrade. Ähnlich diskutieren Sogin, Sogin and Woese (Journal of Molecular Evolution 1:173-184, 1972) die theoretischen und praktischen Aspekte der Verwendung der primären Strukturcharakterisierung unterschiedlicher ribosomaler RNA-Moleküle zur Bewertung phylogenetischer Beziehungen.
  • Fox, Pechman and Woese (International Journal of Systematic Bacteriology 27:44-57, 1977) diskutieren die komparative Katalogisierung von ribosomalen 16S RNAs als einen Ansatz für prokaryotische Systematiken. Diese Referenzen beheben allerdings nicht den Mangel von Kohne's Lehre in Bezug auf Fungi und insbesondere bieten sie keine spezifischen Sonden, die für Untersuchungen zum Nachweis von Fungämie oder ihren äthiologischen Wirkstoffen, einem breiten Spektrum an Hefe und Schimmelpilzen geeignet sind.
  • Hogan et al. (Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer WO 88/03957) beschreiben vier mutmaßliche Fungus-spezifische Sonden. Keine von ihnen scheint Fungi breitgefächert einzuschließen, und sie stehen nicht in Beziehung zu den Sonden der vorliegenden Erfindung.
  • Ribosomen haben eine tiefgreifende Bedeutung für alle Organismen, da sie als das einzige bekannte Mittel zum Übersetzen genetischer Informationen in Zellproteine dienen, den strukturellen und katalytischen Hauptelementen des Lebens. Eine klare Manifestation dieser Bedeutung ist die Beobachtung, dass sämtliche Zellen Ribosomen aufweisen.
  • Bakterienribosomen enthalten drei bestimmte RNA-Moleküle, welche, zumindest bei Escherichia coli, als 5S, 16S und 23S rRNAs bezeichnet werden. Bei eukaryotischen Organismen gibt es vier bestimmte rRNA-Spezies, welche im Allgemeinen als 5S, 185, 28S und 5.85 bezeichnet werden. Diese Namen stehen historisch in Bezug zur Größe der RNA-Moleküle, die durch ihre Sedimentationsrate bestimmt wird. In der Realität variieren ribosomale RNA-Moleküle jedoch erheblich in der Größe zwischen unterschiedlichen Organismen.
  • Trotzdem werden 5S, 18S, 28S und 5.8S rRNA üblicherweise als generische Bezeichnungen für die homologen RNA-Moleküle in allen Eukaryoten verwendet, und diese Konvention wird hierin beibehalten.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Nukleinsäuresonden, die zu einmaligen Nukleinsäuresequenzen innerhalb der ribosomalen 18S-Ribonukleinsäure (rRNA) pilzlicher Pathogene komplementär sind.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich Sonde(n) auf synthetisch oder biologisch hergestellte Nukleinsäuren (DNA oder RNA), welche, durch Design oder Auswahl, spezifische Nukleotidsequenzen enthalten, welche es ihnen ermöglichen, unter definierter vorbestimmter Stringenz zu hybridisieren, spezifisch (d.h. bevorzugt, siehe nächster Absatz) zu Zielnukleinsäuresequenzen. Zusätzlich zu ihren Hybridisierungseigenschaften können Sonden auch bestimmte Konstituenten enthalten, welche ihr ordnungsgemäßes oder optimales Funktionieren unter bestimmten Untersuchungsbedingungen aufrecht erhalten. Zum Beispiel können Sonden modifiziert sein, um ihre Resistenz gegen Nukleaseabbau (z.B. durch Endkappung) zu verbessern, um Nachweisliganden zu tragen (z.B. Fluorescein, 32-P, Biotin, etc.) oder ihr Anhaften an einem festen Träger zu vereinfachen (z.B. Polydeoxyadenosin-„Schwänze"). Solche Modifikationen sind Weiterentwicklungen der Grundsondenfunktion, welche ihre Fähigkeit darstellt, bei einer Hybridisierungsuntersuchung zwischen Ziel- und Nicht-Ziel-Organismen unterscheiden zu können.
  • Hybridisierung wird traditionell als das Verfahren verstanden, durch welches, unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen, zwei teilweise oder komplett komplementäre Nukleinsäurestränge auf eine antiparallele Art und Weise zusammengebracht werden (einer in Richtung 5' zu 3', der andere 3' zu 5'), um eine doppelsträngige Nukleinsäure mit spezifischen und stabilen Wasserstoffbindungen zu bilden, wobei explizite Regeln befolgt werden, welche Nukleinsäurebasen miteinander gepaart werden können. Die hohe Spezifität der Sonden ist auf die geringe statistische Wahrscheinlichkeit angewiesen, dass einmalige Sequenzen zufällig auftreten, wie durch das multiplikative Produkt ihrer individuellen Wahrscheinlichkeiten diktiert. Diese Konzepte sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Die Stringenzität eines bestimmten Satzes an Hybridisierungsbedingungen wird durch die Basenzusammensetzung des Sonden/Ziel-Duplexes sowie durch den Grad und die Geometrie der Fehlpaarung zwischen den beiden Nukleinsäuren bestimmt.
  • Die Stringenzität kann auch durch solche Reaktionsparameter wie die Konzentration und die Ionenart, welche in der Hybridisierungslösung vorliegt, bestimmt werden, sowie durch die Arten und Konzentrationen der vorliegenden Denaturierungsmittel und der Hybridisierungstemperatur. Im Allgemeinen werden, wenn die Hybridisierungsbedingungen stringenter werden, längere Sonden bevorzugt, wenn stabile Hybriden gebildet werden sollen. Als eine logische Folge diktiert die Stringensität der Bedingungen, unter welchen eine Hybridisierumg stattfinden soll (z.B. basierend auf der Art der durchzuführenden Untersuchung) bestimmte Eigenschaften der bevorzugten einzusetzenden Sonden. Solche Beziehungen sind gut bekannt und sie können durch den Fachmann leicht manipuliert werden.
  • Im Allgemeinen versteht der Fachmann, abhängig von der Sondenlänge, unter stringenten Bedingungen etwa 35°C – 65°C in einer Salzlösung von etwa 0,9 Mol NaCl.
  • Gemäß den verschiedenen Prinzipien und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäure-Sondensätze bereitgestellt, welche Deoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) -Sequenzen enthalten, welche unter spezifischen Bedingungen mit den ribosomalen RNA-Molekülen (rRNA), spezifisch 18S rRNA-Moleküle, oder rRNA-Genen (rDNA) von Fungi hybridisieren, welche jedoch unter den gleichen Bedingungen nicht mit rRNA oder rDNA von Bakterien oder dem Wirt oder der umgebenden Matrix, welche in den Testproben vorhanden sein kann, hybridisieren. Die Sonden der vorliegenden Erfindung lassen nun die Entwicklung einer nützlichen Nukleinsäure-Hybridisierungsuntersuchung für den spezifischen Nachweis von Fungämie oder ihren äthiologischen Wirkstoffen zu. Diese Untersuchung kann vorteilhaft für den Test auf Hefen und Schimmelpilze in klinischen Proben von Blut, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Hautbiopsie, Speichel, Gelenkflüssigkeit, Sputum, Bronchialspülung, Bronchiallavage oder anderen Gewebe- oder Fluidproben von humanen oder tierischen Patienten eingesetzt werden.
  • Die Sonden der vorliegenden Erfindung bietet außerdem die Grundlage für die Entwicklung nützlicher Nukleinsäure-Hybridisierungsuntersuchungen, welche in der Lage sind, Hefen und Schimmelpilze in Zusammenhang mit Lebensmittelverderb nachzuweisen. Die am meisten bevorzugten Sonden der vorliegenden Erfindung können zu einer diversen Sammlung an Fungi hybridisieren, während sie, bei vorbestimmten Bedingungen, nicht mit Fleisch, Milchprodukten, Getreide, Nüssen, Säften und anderen kommerziellen Nahrungsmittelmatrizen reagieren.
  • Es ist entdeckt worden, dass auf Nukleinsäurehybridisierung basierende Untersuchungen eine nachweislich verbesserte Leistungsfähigkeit im Vergleich zu den meisten derzeit zur Verfügung stehenden mikrobiologischen oder immunologischen Verfahren zum Nachweis von Fungi in Testproben ermöglichen, welche im Allgemeinen Folgendes einschließen:
    • a) erhöhte Empfindlichkeit, d.h. die Fähigkeit, Hefe oder Schimmelpilz in einer gegebenen Probe häufiger nachzuweisen;
    • b) potentiell signifikante Verringerungen der Untersuchungskosten aufgrund der Verwendung kostengünstiger Reagenzien und weniger Arbeit;
    • c) genaue Identifikation selbst von biochemisch ungewöhnlichen Stämmen des Ziel-Organismus oder Isolaten mit extrem unterschiedlichen antigenen Eigenschaften;
    • d) direkte Untersuchung auf die Gegenwart der Hefe oder des Schimmelpilzes und dementsprechend Potential zum Quantifizieren der äthiologischen Wirkstoffe;
    • e) direkte Tests ermöglichen die Überwachung der Wirksamkeit eines antifungalen Regimes; und
    • f) Labortechniker werden potentiell signifikant weniger Körperflüssigkeitsproben ausgesetzt, welche infektiöse Wirkstoffe tragen.
  • Es wurde entdeckt, dass zu weiteren Vorteilen, welche sich dadurch ergaben, dass die Sonden der vorliegenden Erfindung gegen rRNA gerichtet wurden, die Tatsache zählt, dass die entdeckten rRNAs eine signifikante Komponente der Zellmasse darstellen. Obwohl Schätzungen des Zellribosomengehaltes variieren, können aktiv wachsende Pilzzellen über 100.000 Ribosomen pro Zellen enthalten und somit 100.000 Kopien jeder der rRNAs (vorliegend in einer 1:1:1:1 Stöchiometrie in Ribosomen). Im Gegensatz dazu sind andere potentielle zelluläre Zielmoleküle wie Gene oder RNA-Transkripte davon weniger ideal, da sie in einer viel geringeren Häufigkeit vorliegen. Ein weiterer unerwarteter Vorteil ist, dass die rRNAs (und die Gene, durch welche sie spezifiziert werden) keinem lateralen Transfer zwischen gleichzeitig auftretenden Organismen ausgesetzt zu sein scheinen. Somit bietet die rRNA-Primärstruktur ein Organismus-spezifisches Molekularziel anstelle eines Gen-spezifischen Ziels, wie dies zum Beispiel bei einem Plasmid-getragenen Gen oder Produkt davon, welche lateraler Übertragung zwischen gleichzeitig auftretenden Organismen ausgesetzt sein können, sehr wahrscheinlich der Fall wäre.
  • Die Entdeckung, dass Sonden mit den außergewöhnlichen Inklusivitäts- und Exklusivitätseigenschaften jener der vorliegenden Erfindung in Bezug auf den Nachweis praktisch aller pilzlicher Organismen erzeugt werden können, ohne notwendigerweise eine Kreuzreaktivität mit Tier-, Pflanzen- oder Bakteriengenomen zu verursachen, war unvorhersehbar und unerwartet.
  • Ein weiteres Verständnis der Prinzipien und Aspekte der vorliegenden Erfindung kann durch Verweis auf die Tabellen erreicht werden, wobei:
    Tabelle 1, 2 und 3 das Hybridisierungsverhalten von fünfzehn Sonden gegenüber einer Palette klinisch und umweltbezogen repräsentativer Pilzspezies zeigt. Der Palette wurden weitere Fungi hinzugefügt, um die Breite bekannter Pilztaxa darzustellen. Etwa achtzig Pilzspezies sind dargestellt, und die Pathogenen mit der höchsten Prävalenz sind durch mehrere Stämme dargestellt. Außerdem sind Nukleinsäuren aus einer Vielzahl nichtpilzlicher Organismen zum Vergleich eingeschlossen, einschließlich rRNAs von Mensch, Weizen, normalem humanem Stuhl und zwei ubiquitäre Bakterienspezies. Der Fachmann wird verstehen, dass Bakterien evolutionär so weit entfernt sind, dass sie normalerweise nicht mit den Arten der hierin beschriebenen Sonden kreuz-reagieren. Ferner dürfte erkannt werden, dass die Sequenzvariation unter Wirbeltieren und unter höheren Pflanzen ausreichend nah ist, dass eine individuelle Probe wie Weizen einen hohen Prädiktivwert hat.
  • Sämtliche Spezies der Palette sind mit 100 ng gereinigter denaturierter RNA dargestellt. Die Sonden wurden mit 32-Phosphor markiert, unter Standardbedingungen, bei den angegebenen Temperaturen mit den Paletten hybridisiert und autoradiographisch bewertet. „+" stellt ein starkes Hybridisierungssignal nach drei Stunden Einwirkung dar, „+–" ist ein schwaches Signal, „+–" ist praktisch nicht vorhanden, und „–" zeigt an, dass keine Hybridisierung der Sonde mit dem Ziel stattfand. „NT" zeigt an, dass eine bestimmte Sonde nicht gegen den angegebenen Stamm getestet wurde.
  • Weiteres Verständnis kann durch Heranziehen der beiliegenden Figur erreicht werden, welche eine schematische Darstellung einer dualen Sonden-Einfang/Nachweis-Untersuchung zeigt.
  • Sondenentwicklungsstrategie
  • Der erste Schritt bei der Entwicklung der Sonden der vorliegenden Erfindung beinhaltete die Identifikation von Regionen der 18S rRNA, welche potentiell als Zielstellen für Fungusspezifische Nukleinsäuresonden dienen können. Dies beinhaltete das Auffinden von Stellen, welche:
    • 1) unter den pilzlichen rRNA-Sequenzen hoch konserviert sind (wenige Nukleotid-Änderungen, -Deletionen oder -Insertionen), und
    • 2) sich in nicht-pilzlichen (Bakterien, Mensch oder Pflanze) rRNA-Sequenzen wesentlich unterscheiden.
  • Für diese Analyse wurden exakte Ausrichtungen verfügbarer 18S rRNA-Sequenzen entwickelt. Eine Reihe von 18S rRNA-Sequenzen wurde als Teil dieser Aufgabe bestimmt. Solche Nukleotidsequenzen wurden durch Standardlaborprotokolle entweder durch Klonen und Sequenzierung von Genen, welche rRNA spezifizieren, oder durch direkte Sequenzierung der rRNAs selbst mittels Umgekehrtranskriptase (Lane et al., 1985, Proceedings of the Nationale Academy of Sciences, USA 82:6955-6959) bestimmt.
  • Ein Computeralgorithmus, welcher mit dem ausgerichtentem-Satz der 18S rRNA-Sequenzen arbeitet, wurde verwendet, um die Regionen mit der größten Ähnlichkeit unter den Fungi zu identifizieren. Nukleinsäuresonden zu solchen Regionen werden am verbreitetsten unter verschiedenen Fungi hybridisieren. Zusätzliche Informationen erhielt man durch den Vergleich dieser erhaltenen pilzlichen Regionen mit bekannten 18S rRNA-Sequenzen von Mensch, Ratte, Maus, Mais, Soja, Reis, Bakterien, Protozoonlgen usw.
  • Basierend auf diesen Analysen wurden fünfzehn Sonden identifiziert. Die Entdeckung eines spezifischen Typs nicht-pilzlicher Kreuzreaktivität macht eine Sonde nicht notwendigerweise uninteressant. Zum Beispiel beeinträchtigt die Kreuzreaktion einer Sonde mit dem Pflanzereich nicht die Nützlichkeit der Sonde beim Screening von Wirbeltierblut auf Fungämie. Von weiteren hierin beschriebenen Sonden ist bekannt, dass sie eine Kreuzreaktion eingehen; sie wurden jedoch für den Einsatz in Dualsonden-Untersuchungen ausgelegt (siehe Figur und Beispiel 2).
  • Sonden können durch jedes geeignete chemische oder biologische Verfahren synthetisiert werden. Insbesondere können DNA-Sonden durch automatisierte Phosphamidchemie unter Verwendung von Cyanoethylphosphamiden (Beaucage and Camithers Tetrahedron Letters 24, 245 (1981)) synthetisiert werden. RNA-Sonden können durch Transkription der entsprechenden DNA-Sequenzen hergestellt werden.
  • Beschreibung der Sonden
  • Wie angegeben ergab die obengenannte Sondenselektionsstrategie fünfzehn Sonden, die für die Hybridisierung zu Fungi in Proben geeignet sind, welche Folgende umfassen:
    Sonde 1417: 5'-TGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTG-3'(SEQ ID1)
    Sonde 1418: 5'-TGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATT-3'(SEQ ID2)
    Sonde 1415: 5'-TCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTTCCAATT-3'(SEQ ID3)
    Sonde 1416: 5'-TCCTCGTTAAGGTATTTACATTGTACTCATTCCAAT-3'(SEQ ID4)
    Sonde IG707: 5'-TCCTCGTTAAGGTGTTTAAATTGTACTCATTCCAATT-3'(SEQ ID5)
    Sonde 1542: 5'-AACTAAGAACGGCCATGCACCACCAT-3'(SEQ ID6)
    Sonde 1545: 5'-TGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCG-3'(SEQ ID7)
    Sonde 1814: 5'-TCGCTGGCGCAAGGCCATGCGATTCGAGAGGTTATATTATGAATCATCAG-3'(SEQ ID8)
    Sonde 1816: 5'-CAAGCTGATGACTTGTGCTTACTAGGGATT-3'(SEQ ID9)
    Sonde 1857: 5' -TCGGCATAGTTTGTGGTTAAGACTACGACGGTATCTT-3'(SEQ ID10)
    Sonde 1813: 5'-AAATGCTTTCGCAGTAGTTGGTCTT-3'(SEQ ID11)
    Sonde 1860: 5'-AAATGCTTTCGCAGTAGTTGGTCCTTCGGTAAATCCAAGAATTTCACCTT-3'(SEQ ID12)
    Sonde 1812: 5'-ACGTCCTATTTTATATTCCATGCTAAT-3'(SEQ ID13)
    Sonde 1858: 5'-AAGTCATATTTCATTATTCCATGCTAACT-3'(SEQ ID14)
    Sonde 1859: 5'-TCGTCGAGTTATGTTATTCCATGCAAAT-3'(SEQ ID15)
  • Die spezifischen Verhaltensweisen der zuvor genannten Sonden sind in erheblichem Maße abhängig vom Untersuchungsformat, in welchem sie eingesetzt werden. Umgekehrt diktiert das Untersuchungsformat einige der optimalen Merkmale bestimmter Sonden. Die „Essenz" der Sonden der Erfindung ist nicht als auf den spezifischen Nukleotidstrang in den genannten Sonden beschränkt zu sehen. Zum Beispiel wurde die Länge dieser bestimmten Oligonukleotide für die Verwendung bei der unten beschriebenen Dot-Blot-Untersuchung (und einigen anderen erwähnten Untersuchungen) optimiert. Dem Fachmann ist gut bekannt, dass die optimale Sondenlänge eine Funktion der Stringenzität der ausgewählten Hybridisierungsbedingungen ist, und daher kann die Länge der jeweiligen Sonden entsprechend geändert werden. Außerdem ist es, unter der Annahme, dass die Sätze aus mehr als einer Sonde bestanden, wünschenswert, dass sich alle Sonden in jedem einzelnen Format, in dem sie eingesetzt werden, in einer kompatiblen Art und Weise verhalten. Somit reflektiert die genaue Länge einer bestimmten Sonde in einem bestimmten Maß ihre spezifische beabsichtigte Verwendung.
  • Die Sonden der vorliegenden Erfindung sind geeignet als Oligonukleotidsonden und können auch in größere Polynukleotide von entweder Ribonukleinsäure oder Deoxyribonukleinsäure eingebaut werden. Zu den hierin beschriebenen Sonden komplementäre Sequenzen können als Sonden zu rRNA-Genen verwendet werden. Die bevorzugten Sonden oder ihre Komplemente können auch als Kettenverlängerungsinitiatoren für die Polymerasekettenreaktion, Sequenzierung oder andere Anwendungen eingesetzt werden.
  • Zwei weitere bevorzugte Sonden geeignet in dieser Hinsicht umfassen:
    Sonde/Primer 936: 5'-(CCGAATTCGTCGACAAC)CTGGTTGATCCTGCCAGT-3' (SEQ ID 16)
    Sonde/Primer 935: 5'-(CCCGGGATCCAAGCT)TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3' (SEQ ID 17)
  • Sonde/Primer 936 ist so ausgelegt, dass sie/er mit dem 18S rDNA-Genstrang komplementär zur pilzlichen 18S rRNA hybridisiert. Die Oligonukleotide 935 und 936 sind ausgelegt für und am bevorzugtesten für die Verwendung bei Untersuchungen, bei denen Amplifikation durch das Polymerasekettenreaktionsverfahren von nahezu dem gesamten 18S rRNA-Gen (rDNA) von Fungi und Verwandten angewandt wird. Die Ziel-spezifische „Essenz" dieser beiden Sonden/Primer liegt in den Abschnitten dieser Oligonukleotide, welche nicht in den Klammern eingeschlossen sind. Die Nukleotide innerhalb der Klammern werden bevorzugt eingefügt, da sie nützliche Restriktionsendonukleaseerkennungs- (Kloning-) Stellen zu den amplifizierten Produkten hinzufügen.
  • Sondenverhalten während der Hybridisierung
  • Die experimentelle Spezifität der bevorzugten Sonden, wie weiter in Beispiel 1 und Tabelle 1, 2 und 3 dokumentiert, kann wie Folgt zusammengefasst werden:
    Sonde 1417: 100 % inklusiv für die getesteten Fungi, mit vernachlässigbarer Kreuzreaktivität zu humaner RNA bei 60°C. Bei 65°C (Hybridisierungstemperatur) ist das Signal für 2 der 171 Fungi verringert, alle anderen hybridisieren noch stark, und die humane Kreuzreaktivität ist entfernt. Starke Hybridisierung zu Weizen-rRNA ist deutlich.
    Sonde 1418: 100 % inklusiv für alle getesteten Fungi, ohne Kreuzreaktivität zu humaner RNA.
    Sonde 1417: Ist eine Untersequenz von 1418, d.h. sie ist eine kürzere Version der gleichen Sonde.
    Sonde 1415: Inklusiv für eine Teilmenge der Fungi, ausschließlich jeglicher Candida-Hefen, jedoch einschließlich der wichtigen pathogenen Hefe Cryptococcus.
    Sonde 1416: Inklusiv für alle getesteten Stämme aus der Gattung Candida (Torulopsis) außer der Spezies Yarrowia (Candida) lipolytica. Auch inklusiv für Hansenula, Metschnikowia und Saccharomyces – alle nahe evolutionäre Verwandte der Candida-Hefen. Eine Penicillium-Spezies erzeugte ein schwaches Signal mit dieser Sonde in diesem Untersuchungsformat.
    Sonde IG707: 100 % inklusiv für Yarrowia lipolytica. Kombiniert mit Sonde 1416 sind diese beiden komplett inklusiv für die getesteten Candidas.
    Sonden 1415, 1416 und IG707: sind homolog, d.h. sie hybridisieren alle zur gleichen Region der 18S rRNA.
    Sonde 1542: 100 % inklusiv für alle getesteten Fungi plus humane RNA. Ausgelegt als eine Begleitsonde für 1417 oder 1418 in einem dualen Sonden- (Sandwich-Typ) Hybridisierungsschema.
    Sonde 1545: 100 % inklusiv für alle getesteten Fungi plus humane RNA. Ausgelegt als Begleitsonde für 1417 oder 1418 in einem dualen Sonden- (Sandwich-Typ) Hybridisierungsschema.
    Sonde 1814: weitgehend pilzlich inklusiv, insbesondere bei Hybridisierungsbedingungen unter 50°C.
    Sonde 1816: weitgehend pilzlich inklusiv bei 50°C.
    Sonde 1857: weitgehend inklusiv mit leichter Hybridisierung zu Nicht-Fungi bei 50°C.
    Sonde: 1813: weitgehend inklusiv bei 50°C.
    Sonde 1860: weitgehend inklusiv bei Hybridisierung bei 50°C oder 60°C.
    Sonde 1813: ist eine Untersequenz der Sonde 1860.
    Sonde 1812: sehr weitgehend inklusiv bei 50°C, ohne Kreuzreaktivität zu humaner oder Weizenkeim-RNA.
    Sonde 1858: ausgelegt für die Hybridisierung zu Zygomycetes und somit Komplementierung des Hybridisierungsverhaltens von Sonde 1812.
    Sonde 1859: ausgelegt für die Hybridisierung zu Yarrowia lipolytica und somit Komplementierung des Hybridisierungsverhaltens von Sonde 1812.
    Sonden 1812, 1858 und 1859: sind ein homologer Satz – d.h. sie hybridisieren alle mit einer identischen Stelle auf dem 18S rRNA-Molekül. Als ein Satz hybridisieren sie nicht stark zu nur zwei Stämmen (siehe Tabelle 2 und 3.)
  • Nichthomologe Sonden wie Sonden 1857 und 1860 sind für die gemeinsame Verwendung in dualen Sondenuntersuchungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgelegt.
  • Sonde/Primer 935 und 936 wurden verwendet, um 18S rDNA aus allen getesteten Pilztaxa zu amplifizieren, einschließlich Aspergillus, Candida, Penicillium, Cryptococcus und Blastomyces.
  • Beispiel 1 Dot-Blot-Analyse des Sondenhybridisierungsverhaltens
  • Die Dot-Blot-Analyse beinhaltet gemäß bekannter Verfahren die Immobilisierung einer Nukleinsäure oder einer Population von Nukleinsäuren auf einem Filter wie Nitrocellulose, Nylon oder anderen, für diesen Zweck spezifisch derivatisierte Membranen, welche leicht im Handel erhältlich sind. Entweder DNA oder RNA kann auf einem solchen Filter leicht immobilisiert werden und anschließend wird sie unter jeder einer Vielzahl von Bedingungen (d.h. verschiedenen Stringenzitäten) mit Nukleotidsequenzen oder Sonden von Interesse auf Hybridisierung geprüft oder getestet. Unter stringenten Bedingungen zeigen Sonden deren Nukleotidsequenzen eine größere Komplementarität zum Ziel aufweisen einen höheren Hybridisierungsgrad als Sonden, welche weniger Komplementarität aufweisen.
  • Sonden der vorliegenden Erfindung wurden in einem Dot-Blot-Format getestet. Einhundert Nanogramm Ziel-RNA, gereinigt durch Phenolextraktion und Zentrifugierung durch Cäsiumtrifluoracetat-Gradienten, wurde denaturiert und auf eine Nylonmembran getupft. Die Sonden wurden durch Zugabe einer 32-Phosphor-Anteil zum 5'-Ende des Oligonukleotides isotopisch markiert. Es fand eine Hybridisierung der Sonden statt, bei den jeweils angegebenen Temperaturen, in Gegenwart von 1,08 M Natriumchlorid, 60 mM Natriumphosphat und 6 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 7,4. Nicht hybridisierte Sonde wurde durch Waschung mit einer Salzkonzentration von einem Drittel der Hybridisierungsbedingung entfernt. Die Filter wurden einem Röntgenfilm ausgesetzt und die Intensität der Hybridisierungssignale wurde nach drei Stunden Einwirkung bewertet.
  • Tabelle 1, 2 und 3 fassen das Verhalten der Sonden, wie durch die zuvor genannten Verfahren getestet, zusammen und dokumentieren die zuvor zusammengefasste Spezifität.
  • Beispiel 2 Duale Sondenhybridisierung
  • In der Praxis würden viele Anwendungen dieser Sonden den gleichzeitigen Einsatz eines Sondenpaares in einem „Sandwich"-Hybridisierungsschema von „Einfang"-Sonde und „Detektor"-Sonde, wie in der Figur gezeigt, beinhalten. Die Einfang-Sonde12 wäre idealerweise ein durch Zugabe eines homopolymerischen 3'-Schwanzes zu einer Sonde mit hoher Zielspezifität hergestelltes bifurilctionales Polynukleotid. Der Schwanz würde wiederum mit dem komplementären Homopolymer11 auf einer festen Oberfläche10 wie einem Glaskügelchen oder einer Filterscheibe hybridisieren. Die Hybridisierung der Einfang-Sonde12 zu ihrem Ziel15, in diesem Fall pilzliche Spirochete 18S rRNA, würde einen Komplex des Ziels15 und des festen Trägers10 ergeben. Die Detektor-Sondel3, vorteilhaft auch mit einem gewissen Grad an Spezifität, wäre Teil eines bevorzugten Nachweisschemas auf Grundlage von Radioaktivität, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Farbe usw. (Nachweiseinheitl4), welches die Gegenwart des gesamten Hybridisierungskomplexes anzeigen würde.
  • Beispiel 3 Klinische Diagnose pilzlicher Sepsis aus einer Blut-, Sputum- oder Zerebrospinalflüssigkeitsprobe
  • Die klinische Probe wird idealerweise so verarbeitet, dass der gesamte Nukleinsäuregehalt freigesetzt wird, zum Beispiel durch Beschallung, Vortexring mit Glaskügelchen, Detergenzien mit Hilfe eines Mittels wie SDS oder durch chemische Behandlung. Alternativ dazu können Pilzzellen teilweise gereinigt werden, z.B. durch das DuPont-Isolatorsystem, gefolgt von Zelllyse. Die Probe, welche die zerissenen Fungi enthält, wird dann in Gegenwart der Einfang-Sonde, Detektor-Sonde und idealerweise magnetischen Partikelkügelchen inkubiert, welche mit Oligo-Thymidin (siehe auch Beispiel 2) in einem chaotropen Puffer wie Guanidinium-Isothiocyanat, wie von Gillespie et al. USSN 299,150 beschrieben, derivatisiert wurden.
  • Wenn Hefe oder Schimmelpilz 18S rRNA-Zielmoleküle vorliegen, wird ein Hybridisierungskomplex aus Kügelchen + Einfang-Sonde + Ziel + Detektor-Sonde gebildet. Die Gegenwart eines außenseitigen Magneten nahe dem Boden des Reaktionsröhrchens sorgt dafür, dass sich der magnetische Partikel-Hybridisierungskomplex an der Innenseite des Röhrchens anlagert, wodurch vorteilhafterweise nicht reagierte Komponenten wie Probenmatrix, ungebundene Sonde usw. entfernt werden können. Wiederholte Rehydrierung und Denaturierung des Kügelchen-Sonden-Ziel-Komplexes würde eine erhebliche Hintergrundreduktion ermöglichen (wie in Collins et al., USSN 922,155, EPA 87309308.2 und USSN 136,920, EPA 88312135.2 ausführlicher beschrieben). In diesem Beispiel könnte der Endnachweis das Auftupfen von Kügelchen auf Membran und die Untersuchung durch Autoradiographie umfassen.
  • Für solche Untersuchungen sind die folgenden Einfang- und Detektor-Sonden-Kombinationen Beispiele der bevorzugten Paare:
    Sonden 1417+1542, Sonden 1417+1545, Sonden 1418+1542, Sonden 1418+1545, Sonden 1416+1812, Sonden 1812+1860, Sonden 1857+1869.
  • Beispiel 4 Klinische Diagnose von Pilzinfektion in humaner Probe unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion-Amplifizierung pilzlicher rDNA
  • Die Probenverarbeitung wie in Beispiel 3 bereitgestellt ist idealerweise so ausgelegt, dass DNA entsteht. Die DNA wird weiters so behandelt, dass als Vorbereitung auf die Polymerasekettenreaktions- („PCR") Amplifizierung ein Einzelstrang entsteht (z.B. durch Schmelzen). Idealerweise werden Sonde/Primer 936 und Sonde/Primer 935 in Verbindung mit der klinischen Probe in den Standard-PCR-Verfahren eingesetzt. Entstehendes Material kann dann geeigneterweise mit Hilfe des „Sandwich"-Hybridisierungsverfahrens von Beispiel 2 mit jeder der hierin beschriebenen Sonden untersucht werden. Die Polymerasekettenreaktion selbst kann hoch-spezifisch gemacht werden, indem Sonde/Primer 936 in Verbindung mit zum Beispiel Sonde 1812 eingesetzt wird. Der Nachweis wird vorteilhaft mit Hilfe der Sonde 1814 für den Einfang-Schritt und Sonden 1415 und 1416 für den Nachweisschritt erreicht.
  • Beispiel 5 In situ-Hybridisierung als eine zytologische Färbung
  • Die Sonden der vorliegenden Erfindung können auch vorteilhaft als zytologische Färbereagenzien eingesetzt werden. Zum Beispiel wird eine Sputum-Probe auf einen Objektträger aufgebracht. Nach entsprechender Fixierung und Lyse wird eine Hybridisierung mit den Sonden der vorliegenden Erfindung in situ durchgeführt. Auf diese An und Weise können Fungi in einer Probe durch fluoreszierende Markierung der Sonde 1416 und Untersuchung des Objektträgers mittels eines Fluoreszenzmikroskops visualisiert werden.
  • Beispiel 6 Bestätigung von Fungämie nach der Kultivierung
  • Nach einem Standardkultivierungsschritt unter Verwendung von Bactec, Roche Septi-Chek oder des DuPont-Isolators, wurde eine Kolonie oder Flüssigkultur unter Verwendung der Sonden 1418 und 1542 in den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens auf die Gegenwart von Fungi getestet. Es war sehr von Vorteil, dass keine reine Kultur notwendig ist.
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Claims (12)

  1. Satz isolierter Nukleinsäurefragmente zum Ermitteln der Gegenwart pilzlicher Nukleinsäure in einer Gewebe- oder Fluidprobe von einem Menschen oder einem anderen Wirbeltier, wobei der Satz ein isoliertes Nukleinsäurefragment aufweist, welches unter vorbestimmten Hybridisierungsbedingungen zu der Sequenz aus einer der Sonden 1417[SEQ. ID NR.: 1], 1418 [SEQ. ID NR.: 2], 1814 [SEQ. ID NR.: 8], 1816 [SEQ. ID NR.: 9], 1813 [SEQ. ID NR.: 11], 1860 [SEQ. ID NR.: 12], 1812 [SEQ. ID NR.: 13], 1857 [SEQ. ID NR.: 10] oder ihren Komplementärsequenzen hybridisiert, wobei das isolierte Nukleinsäurefragment unter den genannten Hybridisierungsbedingungen und mit zumindest einem weiteren isolierten Nukleinsäurefragment spezifisch an rRNA oder rDNA von Pilzen hybridisiert, jedoch nicht an humaner oder bakterieller rRNA oder rDNA.
  2. Satz isolierter Nukleinsäurefragmente nach Anspruch 1, wobei der Satz die Sonden 1417[SEQ. ID NR.: 1] und 1542 [SEQ. ID NR.: 6]; 1417 [SEQ. ID NR.: 1] und 1545 [SEQ. ID NR.: 7]; 1418 [SEQ. ID NR.: 2] und 1542 [SEQ. ID NR.: 6]; 1418 [SEQ. ID NR.: 2] und 1545 [SEQ. ID NR.: 7]; 1416 [SEQ. ID NR.: 4] und 1812 [SEQ. ID NR.: 13); 1812 [SEQ. ID NR.: 13] und 1860 [SEQ. ID NR.: 12]; 1857 [SEQ. ID NR.: 10] und 1860 [SEQ. ID NR.: 12]; 1812 [SEQ. ID NR.: 13], 1858 [SEQ. 1D NR.: 14] und 1859 [SEQ. ID NR.: 15] oder 1814 [SEQ. ID NR.: 8]; 1415 [SEQ. ID NR.: 3] und 1416 [SEQ. ID NR.: 4] umfasst.
  3. Satz isolierter Nukleinsäurefragmente nach Anspruch 1, wobei der Satz die Sonde 935[SEQ. ID NR.: 17] und Sonde 936[SEQ. ID NR.: 16) umfasst.
  4. Satz isolierter Nukleinsäurefragmente nach Anspruch 2 zur Verwendung beim Ermitteln pilzlicher Organismen in Proben von Blut, Urin, Hirn-Rückenmarksflüssigkeit, Hautbiopsie, Speichel, Synovialflüssigkeit, Sputum, Bronchialspülung oder Bronchuswaschung.
  5. Verfahren zum Ermitteln pilzlicher Organismen in einer humanen oder anderen Wirbeltier-Probe, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: (a) Kontaktieren der Probe mit einem isolierten Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 unter Hybridisierungsbedingungen, welche zulassen, dass das isolierte Nukleinsäurefragment an rRNA oder rDNA pilzlicher Organismen hybridisiert, falls in der Probe vorhanden, um Nukleinsäurekomplexe zu bilden, jedoch nicht Komplexe mit humaner oder bakterieller rRNA oder rDNA zu bilden; und (b) Ermitteln der Nukleinsäurekomplexe als eine Indikation der Gegenwart der pilzlichen Organismen.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, welches ferner den Schritt des Amplifizierens von 18S rRNA-Sequenzen des pilzlichen Organismus durch die Polymerase-Kettenreaktion umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Sonden 936[SEQ. ID NR.: 16] und 935 [SEQ. ID NR.: 17] für die Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden.
  8. Verfahren zum Ermitteln pilzlicher Organismen in einer Probe, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: (a) Kontaktieren der Probe mit der isolierten Nukleinsäuresonde 936[SEQ. ID NR.: 16] unter Hybridisierungsbedingungen, welche zulassen, dass das isolierte Nukleinsäurefragment an rRNA oder rDNA pilzlicher Organismen hybridisiert, falls in der Probe vorhanden, um Nukleinsäurekomplexe zu bilden, jedoch nicht Komplexe mit humaner oder bakterieller rRNA oder rDNA zu bilden; und (b) Ermitteln der Nukleinsäurekomplexe durch weiteres Kontaktieren der Probe mit einer isolierten Nukleinsäure nach Anspruch 1 als eine Indikation der Gegenwart der pilzlichen Organismen.
  9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Probe Blut, Urin, Hirn-Rückenmarksflüssigkeit, Biopsie, Speichel, Sputum, Bronchialspülung oder Bronchuswaschung von Menschen umfasst.
  10. Verfahren zum Ermitteln eines pilzlichen Organismus in einer Nahrungsmittelprobe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fleisch, Milchprodukten und Säften, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: (a) Kontaktieren bringen der Probe mit einem isolierten Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 unter Hybridisierungsbedingungen, welche zulassen, dass das isolierte Nukleinsäurefragment an rRNA oder rDNA pilzlicher Organismen hybridisiert, falls in der Probe vorhanden, um Nukleinsäurekomplexe zu bilden, jedoch nicht Komplexe mit humaner oder bakterieller rRNA oder rDNA zu bilden; und (b) Ermitteln der Nukleinsäurekomplexe als eine Indikation der Gegenwart der pilzlichen Organismen.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, welches ferner den Schritt des Amplifizierens von 18S rRNA-Sequenzen der pilzlichen Organismen durch die Polymerase-Kettenreaktion umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Sonden 936[SEQ. ID NR.: 16] und 935 [SEQ. ID NR.: 17] für die Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden.
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