JP3155992B2 - 真菌検出のための核酸プローブおよび方法 - Google Patents

真菌検出のための核酸プローブおよび方法

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は真菌生物の検出に関する。特に、本発明は臨
床、食品、環境および他の試料中の酵母菌および糸状菌
の特異的検出のための核酸プローブおよび組成物をその
使用法とともに提供する。
従来の技術 真菌は腐生植物性または寄生性の細胞壁が閉じた真核
生物の種々の集まりであり、形態的には酵母菌、糸状菌
きのこ、または他の名前で記述されるであろう。それら
は至る所に存在する生物でほとんどは無害であるが、と
きどき営利的目的に使用され、場合によっては病原性で
ある。
病原性真菌は医学真菌学（medical mycology）の範囲
に含まれている。この医学分野には表在性、皮膚、皮下
および全身性感染を含む真菌病原体の部門が認められる
（例えば、Rippon,J.W.,Medical Mycology（医学真菌
学）、Saunders Co.,（サウンダース社）、Philadelphi
a（フィラデルフィア州）、1988年発行、を参照された
い）。臨床医が直面する真菌により起こされる最も重篤
な病的状態は全身性感染である。深部組織および全身性
真菌血症は、特に免疫系が弱体化した集団において高い
死亡率を示す。
全身性真菌血症を起こすことができる真菌の中で、い
わゆる“病原性”真菌および“日和見”真菌の間に二叉
分枝（dichotomy）がある。それは人を誤解させるよう
な命名法であり；日和見真菌は殺し屋（killer）であ
り、病原性真菌はしばしば自己制限的（self−limitin
g）である。病原性真菌にはコクシジオイデス イミチ
ス（Coccidiodes imitis）、ヒストプラスマ カプスラ
ーツム（Histoplasma capsulatum）、ブラストミセスデ
ルマチジス（Blastomyces dermatitidis）、パラコクシ
ジオイデス ブラシリエンシス（Paracoccidiodes bras
iliensis）および皮下病原体、スポロスリックス シェ
ンキー（Sporothrix schenkii）が含まれる。重要な日
和見真菌にはカンジダ（Candida）属−−C.アルビカン
ス（albicans）、C.トロピカリス（tropicalis）、C.パ
ラシローシス（prasilosis）およびトルルプシス（Toru
lpsis）〔（カンジダ（Candida））グラブラータ（glab
rata）−−クリプトコッカス ネオホルマンス（Crypto
coccus neoformans）、アスペルギルス（Aspergillus）
属の一員および多少ではあるが事実上、宿主の生理的温
度で生き残れる真菌が含まれる。
全身性真菌血症（Systemic fungemia）の臨床診断お
よび処置は細菌性敗血症（bacterialsepticemia:しばし
ば同じ免疫欠損集団中で起こる）に比較していくつかの
短所を持っている。第１に、抗真菌化学療法は類似の抗
細菌化学療法よりも患者に対しより毒性が強い。その結
果、臨床医は抗真菌剤を処方する前の真菌血症のより信
頼できる証拠を望んでいる。第２に、真菌血症の患者は
感染の初期に診断されないと予後がよくない。第３に、
真菌は大起部分の細菌生物体よりも一般に増殖が遅く、
その結果として試験管内の培養工程を必要とする診断は
時間がかかる。および第４に、真菌のいくつかは（再び
診断に試験管内培養を必要とする）合成培地上一週間で
はコロニーが得られず、あったとしてもわずかである。
これらの因子のすべてに広範囲の系統の真菌が潜在的全
身性病原体であるという事実を加えると、ほとんどすべ
ての真菌が包まれる真菌検出の直接的方法に対する必要
性が指摘される。
真菌を検出できる核酸プローブを検出するのが本発明
の１つの側面（aspect）である。
通常の検定（assay）条件下、プローブに近づかせる
ことができる標的領域にハイブリダイズできる核酸プロ
ーブを提供するのが本発明の別の側面である。
真菌rRNA配列に対する核酸プローブで臨床試料中のこ
れらの生物体の存在を評価する迅速な診断検定の基礎と
して有用なものを提供するのがさらに別の側面である。
Kohneら（バイオフィジカルジャーナル（Biophysical
Journal）8:1104〜1118;1968）はrRNA配列に対するプ
ローブを調製する１つの方法について議論しているが、
真菌検出のプローブを作製するために必要な教えを提供
していない。
PaceおよびCampbell（ジャーナルオブバクテリオロジ
ー（Journal of Bacteriology）107:543〜547,1971）は
種々の細菌種からのリボソームリボ核酸の相同性および
そのような相同性水準を定量化するためのハイブリダイ
ゼーション法について議論している。同様に、Sogin,So
ginおよびWoese（ジャーナルオブモレキュラーエボリュ
ーション（Journal of Molecular Evolution）1:173〜1
84,1972）は系統発生論的関係の評価のため異なったリ
ボソームRNA分子の一次構造特性を使用する理論的およ
び実際的な面について議論している。Fox,Pechmanおよ
びWoese（インターナショナルジャーナルオブシステマ
ティックバクテリオロジー（International Journal of
Systematic Bacteriology）27:44〜57,1977）は原核動
物分類への方法としての16SリボソームRNAの比較カタロ
グ作りについて議論している。しかしながら、これらの
参考文献は真菌に関するKohneの教えの不足分を補なっ
ておらず、および特に真菌血症またはその病因学的因子
（酵母および糸状菌の広範囲のスペクトル）を検出する
ための検定に有用な特異的プローブを提供していない。
Hoganら（国際特許出願、公開番号WO88/03957）は４
つの推定真菌特異的プローブについて記述している。そ
のどれも真菌を広範囲に含んでいるとは思えず、またそ
れらは本発明のプローブとは相関していない。
リボソームは生命の主たる構造および触媒要素である
細胞タンパク質へ遺伝的情報を翻訳する唯一の既知の手
段として働いているのですべての生物体において深い重
要性を持つ。この重要性の明らかな現れは、すべての細
胞がリボソームを持っているという観察である。
細菌リボソームは異ったRNA分子（少なくとも大腸菌
において）を含んでおり、5S,16Sおよび23SrRNAと称さ
れている。真核生物においては一般的に5S,18S,28Sおよ
び5.8Sと称される４つの異なったrRNA種がある。これら
の名前は歴史的にはその沈降速度により決定されたRNA
分子の大きさに関連している。しかしながら実際的には
リボソームRNA分子は生物体間で大きさがかなり変動し
ている。それにもかかわらず真核生物において相同する
RNA分子の遺伝子的名前として5S,18S,28Sおよび5.8SrRN
Aが共通に使用されており、この伝統はここにおいても
引き継がれている。
真菌病原体の18Sリボソームリボ核酸（rRNA）内の独
特の核酸配列と相補的な核酸プローブを提供するのも本
発明の別の側面である。
ここで使用されているように、プローブとは、設計ま
たは選択により、定義され、あらかじめ決められたスト
リンジェンシー下、標的核酸配列へ特異的に（即ち、優
先的に、次節参照）それをハイブリダイズさせることを
可能にする特異的ヌクレオチド配列を含む、合成または
生物的に産生された核酸（DNAまたはRNA）を意味してい
る。そのハイブリダイゼーション特性に加えて、プロー
ブはまた、特定の検定条件下、その性質または最適な機
能発現に関する構成物を含んでいてもよい。例えば、プ
ローブはヌクレアーゼ分解に対するその抵抗性を改良
（例えば末端キャッピング）するため、検出リガンドを
運搬するため（例えばフルオレセイン（fluorescei
n）、32−Ｐビオチン等）または固体支持体へのその捕
捉を容易にするため（例えばポリデオキシアデノシン
“尾”（polydeoxy adenosine“tails"））改変しても
よい。そのような改変はハイブリダイゼーション検定に
おける標的および非標的生物間を有効に識別するための
その能力である基本プローブ機能上の改良である。
ハイブリダイゼーションとは、あらかじめ決められた
条件下、核酸塩基が互いに対をつくることに関する明白
な規則に従って、特異的および安定な水素結合により、
２つの部分的または完全に相補的な核酸鎖が逆平行様式
（１つは５′から３′へ配向し、他は３′から５′へ配
向する）に一緒になって２重鎖核酸を形成される過程と
理解されている。プローブの高い特異性は、その個々の
確率の乗積（multiplicative product）により指図（di
ctate）されるごとく、でたらめに存在する特異配列の
低い統計的確率によっている。これらの概念は当業者に
は良く理解されている。
ハイブリダイゼーション条件の特定の組のストリンジ
ェンシー（stringency）は２つの核酸の間の誤対合（mi
spairing）の水準および幾何構造によると同様にプロー
ブ／標的二連体（prove/targetduplex）の塩基組成によ
り決定される。
ストリンジェンシーはハイブリダイゼーション溶液中
に存在するイオン種の型の濃度、存在する変性剤（dena
turing agent）の型および濃度およびハイブリダイゼー
ション温度のごとき反応パラメータによってもまた支配
されている。一般に、ハイブリダイゼーション条件がよ
りストリンジェントになると、もし安定なハイブリッド
が形成されるならより長いプローブが好適である。当然
の結果として、ハイブリダイゼーションが起きる条件の
ストリンジェンシー（例えば実施される検定の型に基づ
いて）は用いられる好適なプローブのある種の特性を指
図するであろう。そのような関係はよく理解されており
当業者により容易に処理される。
一般的事項としては、（プローブ長に依存するが）ス
トリンジェント条件とは約0.9モルNaClの塩溶液中約35
℃〜65℃を意味すると理解されている。
ここでなされたすべての参照事項は出典指示により完
全に含まれている。
発明の要約 本発明の種々の原理および態様に従うと、特定の条件
下真菌のリボソームRNA分子（rRNA）（特に18SrRNA分
子）またはrRNA遺伝子（rDNA）とハイブリダイズする
が、同じ条件下、試験試料中に存在するであろう細菌ま
たは宿主または環境マトリックスのrRNAまたはrDNAには
ハイブリダイズしないデオキシリボ核酸（DNA）または
リボ核酸（RNA）からなる核酸プローブおよびプローブ
の組が提供される。本発明のプローブは真菌血症または
その病因因子の特異的検出のための有用な核酸ハイブリ
ダイゼーション検定の開発を現在可能にしている。この
検定はヒト患者または獣医学被験体からの血液、尿、脳
脊椎液、皮膚バイオプシー（skin biopsy）、唾液、関
節滑液、痰、気管支洗剤、気管支洗剤液または他の組織
または液体試料などの臨床試料中の酵母菌および糸状菌
の検定に都合よく使用される。
本発明のプローブはまた、食品腐敗に伴う酵母菌およ
び糸状菌を検出できる有用な核酸ハイブリダイゼーショ
ン検定の開発の基礎も提供する。本発明の最も好適なプ
ローブはあらかじめ決められた条件下、肉、乳製品、穀
類、堅果ジュースおよび他の市販の食品母体と交差反応
せずに、真菌の種々の収集物とハイブリダイズできる。
核酸ハイブリダイゼーションに基づく検定（assay）
は、試験試料中の真菌の検出のために現在利用可能なほ
とんどの微生物学的または免疫学的方法よりも高い遂行
能力が与えられていることが見い出されており、一般的
に以下のことが挙げられる。
ａ）高められた感度；即ち、与えられた試料中の酵母菌
または糸状菌をより頻度高く検出する能力； ｂ）安価な試薬の使用および労力の減少による検定費用
の著しい減少の可能性； ｃ）生化学的に異常な標的微生物の株または劇的に異な
った抗原性を持つ単離物の正確な同定； ｄ）酵母菌または糸状菌の存在の直接検定およびその結
果としての病因因子定量の可能性； ｅ）直接試験法は抗真菌養生法（antifungal regime）
の効力のモニタリングを可能にし；および ｆ）感染因子が隠れた体液標本への実験技術者の暴露を
著しく減少させる可能性。
rRNAに対し本発明のプローブを向けることにより招か
れる他の利点には検出されたrRNAは細胞質量のかなりの
成分を構成しているという事実が見い出されている。細
胞リボソーム含量の見積りはバラついているが、活発に
増殖している真菌細胞は細胞当り100,000より以上のリ
ボソームを含んでいてもよく、それ故rRNAの各々の100,
000コピーがある（リボソーム中1:1:1:1の化学量論で存
在する）。反対に、遺伝子またはそのRNA転写体のごと
き他の潜在的細胞標的分子はより少ない量でしか存在し
ない。さらなる予期されなかった利点は、rRNA（および
それらを特定する遺伝子）は同時代の生物体（contempo
rary organisms）間の側方転移（lateral transfer）を
受けにくいようであることである。それ故、rRNA一次構
造は同時代生物体間の側方伝達を受けやすい。例えばプ
ラスミド運搬性遺伝子またはその遺伝子産物の場合のご
とき遺伝子−特異的標的というよりむしろ生物体−特異
的分子標的を提供する。
動物、植物または細菌ゲノムへの交差反応を必然的に
招くことなく、ほとんどすべての真菌生物の検出に関し
て本発明のプローブの異常な包含および排外特性を持つ
プローブが発生できるという発見は予想することができ
ずかつ期待されていなかった。
表の簡単な説明 本発明の原理および態様のさらなる理解は表を参照し
てなされるであろう、ここで： 表1,2および３は臨床および環境を代表する真菌種の
名簿に対する15のプローブのハイブリダイゼーション挙
動を示している。追加の真菌が既知の真菌分類群の幅を
表わすために名簿に加えられている。約80の真菌種が表
わされており、最も有力な病原体は番号株として表わさ
れている。さらに、比較のためにヒト、小麦、正常ヒト
便および２つの至る所に存在する細菌種からのRNAを含
む種々の非真菌生物からの核酸が含まれている。当業者
は、細菌はここに記載されたプローブの型と一般的に交
差反応しないので、進化論的に遠くはなれていることを
理解するであろう。脊椎動物間および高等植物間の配列
変異はかなり限られており、小麦のごとき個々の試料は
高率で予測値を持っていることもさらに認められるであ
ろう。
名簿上のすべての種は100ngの精製変性RNAにより表わ
されている。プローブは32−リンで標識されており、標
準条件下示されている温度で名簿のものとハイブリダイ
ズされ、オートラジオグラフィーにて評価された。
“＋”は３時間暴露後の強いハイブリダイゼーション信
号を表わし、“＋−”は弱い信号であり、“＋−−”は
実質的に不在であり、および“−”は標的へのプローブ
のハイブリダイゼーションが無いことを示している。
“NT"は指定された株に対し特定のプローブが試験され
なかったことを示している。
図の簡単な説明 さらなる理解が、二重プローブ捕捉／検出検定の図解
的表現を示している付随する図を研究することによりな
されるであろう。
発明の詳細な説明および最良の形態 プローブ開発戦略 本発明のプローブの開発にとられた最初の工程は、真
菌特異性核酸プローブのための標的部位として潜在的に
働くことができる18SrRNA領域の同定である。このこと
は： １）真菌rRNA配列間で高度に保存されており（少しのヌ
クレオチド変化、欠損または挿入）、および ２）非真菌（細菌、ヒトまたは植物）rRNA配列と本質的
に異なっている部位の発見を必然的に伴なっている。
この分析のため、入手可能な18SrRNA配列の正確な列
の並びが明らかにされた。多くの18SrRNA配列がこの努
力の一部として決定された。そのようなヌクレオチド配
列は遺伝子特定rRNAのクローニングおよび配列決定また
は逆転写酵素を用いるrRNAそれ自身の直接配列決定によ
る（Laneら,1985,プロシーディングスオブザナショナル
アカデミーオブサイエンスイズ（Proceedings of the N
ational Academy of Sciences）,USA82:6955〜6959）標
準的実験室プロトコール（protocol）により決定され
た。
真菌間で最も高い類似性を示す領域を同定するため18
SrRNA配列の一例に並べた組に実施されるコンピュータ
ー互除法（computer algorithm）が使用された。そのよ
うな領域への核酸プローブは最も広範囲の種々の真菌に
ハイブリダイズするであろう。ヒト、ラット、マウス、
コーン、大豆、米、細菌、原生動物、藻類その他からの
既知の18SrRNA配列とこれらの真菌保存領域を比較する
ことにより更なる情報が得られた。
これらの分析に基づき15のプローブが同定された。非
真菌の特定の型との交差反応が見い出されてもプローブ
を興味のないものとする必要はない。例えば、プローブ
の植物との交差反応は脊椎動物血の真菌血症のスクリー
ニングにおいてはプローブの有用性を減じるわけではな
い。ここに記載した他のプローブも交差反応することが
知られているが、しかし、それらは二重プローブ検定
（図および実施例２参照）において使用されるように設
計されている。
プローブの説明 示したごとく、上記プローブ選択戦略において、試料
中の真菌へのハイブリダイゼーションに有用な15のプロ
ーブが得られた： 前記のプローブの特異的挙動は、それらが使用される
検定型式の有効範囲に依存している。逆にいえば、検定
型式は特定のプローブのある種の至適な様相を指図する
であろう。本発明のプローブの“本質（essence）”は
名付けられたプローブ中のヌクレオチドの特定の一連の
列に限定されると解釈してはならない。例えば、これら
の特定のオリゴヌクレオチドの長さは以下に記載するド
ットブロット検定（およびある種の他の予期される検
定）における使用のために最適化されている。最適プロ
ーブ長は選択されたハイブリダイゼーション条件のスト
リンジェンシーの関数であろうし、およびそれ故本プロ
ーブの長さはそれに応じて変えられるであろうことは当
業者にはよく知られている。また、１つより多くのプロ
ーブからなる組を考慮する場合、すべてのプローブはそ
れらが用いられる特定の型式中で両立できる様式で挙動
することが望まれている。それ故、特定のプローブの正
確な長さは、その特定の意図される使用法をある程度反
映するであろう。
本発明のプローブはオリゴヌクレオチドプローブとし
て有益であり、また、リボ核酸かまたはデオキシリボ核
酸のより長いポリヌクレオチド内へ挿入できる。ここに
記載したプローブへ相補的な配列はrRNA遺伝子へのプロ
ーブとして使用できる。好適なプローブまたはその相補
物はまたポリメラーゼチェーン反応のための鎖伸長開始
剤、配列決定または他の応用に使用できる。
これに関連して有用な２つの追加の好適なプローブ
は： から成る。プローブ／プライマー936は真菌18SrRNAに相
補的な18SrRNA遺伝子鎖にハイブリダイズするように設
計されている。オリゴヌクレオチド935および936は、真
菌および関係物の18SrRNA遺伝子（rDNA）のほとんどす
べてのポリメラーゼチェーン反応法による増幅を用いる
検定における使用に設計され最も好適である。これら２
つのプローブ／プライマーの標的特異性“本質”はこれ
らのオリゴヌクレオチドの括弧内以外のところにある。
括弧内のヌクレオチドはそれらが増幅生成物に対する有
用な制限エンドヌクレアーゼ認識（クローニング）部位
であるので好んで含まれている。
ハイブリダイゼーション間のプローブ挙動 好適なプローブの実験特異性は以下のごとく要約され
るであろう（実施例１および表1,2,および３にさらに情
報が供給されている）： プローブ1417:試験された真菌が100％含まれており、
ヒトRNAに対し60℃では無視できる交差反応。65℃（ハ
イブリダイゼーション温度）では171真菌の２つに対し
信号が減少しているが（他のすべてにはまだ強くハイブ
リダイズ）、ヒト交差反応性が除去されている。小麦rR
NAへの強いハイブリダイゼーションが明白である。
プローブ1418:試験された真菌が100％含まれており、
ヒトRNAへの交差反応性がない。
プローブ1417:1418の亜配列であり、即ち、それは同
じプローブのより短いものである。
プローブ1415:真菌の部分集合に対し包含的、カンジ
ダ（Candida）酵母菌を含まないが、重要な病原体酵母
菌、クリプトコッカス（Cryptococcus）を含んでいる。
プローブ1416:種ヤロウィア（Varrowia）〔カンジダ
（Candida）〕リポリチカ（lipolytica）を除く属カン
ジダ（Candida）〔トルロプシス（Torulopsis）〕の試
験された株のすべてを包含。ハンセヌラ（Hansenul
a）、メツニコウィア（Metschnikowia）およびサッカロ
ミセス（Saccharomyces）−−すべてカンジダ（Candid
a）酵母菌の進化論的近縁種−−のすべてを含んでい
る。この検定型式においてこのプローブで１つのペニシ
リウム（Penicillium）種が弱い信号を与えた。
プローブIG707:ヤロウィア リポリチカ（Yarrowia l
ipolytica）を100％含んでいる。プローブ1416と合わせ
ると、これらの２つで試験されたカンジダ（Candida）
が完全に含まれる。
プローブ1415,1416およびIG707:これは相同的であ
り、即ち、これらはすべて18SrRNAの同じ領域にハイブ
リダイズする。
プローブ1542:すべての試験された真菌にヒトRNAを加
えたものを100％含む。二重プローブ（サンドイッチ
型）ハイブリダイゼーションスキームにおける1417また
は1418の相手のプローブとして設計された。
プローブ1545:すべての試験された真菌にヒトRNAを加
えたものを100％含む。二重プローブ（サンドイッチ
型）ハイブリダイゼーションスキームにおける1417また
は1418の相手のプローブとして設計された。
プローブ1814:広範囲な真菌が、特に50℃以下のハイ
ブリダイゼーション条件で含まれる。
プローブ1816:50℃で広範囲な真菌が含まれる。
プローブ1857:広範囲に含むが、50℃で非真菌にわず
かなハイブリダイゼーション。
プローブ1813:50℃で広範囲のものを含む。
プローブ1860:50℃または60℃でのハイブリダイゼー
ションで広範囲なものを含む。
プローブ1813:プローブ1860の一部の配列である。
プローブ1812:50℃で非常に広範囲のものを含み、ヒ
トまたは小麦麦芽RNAと交差反応しない。
プローブ1858:ズィゴミセテス（Zygomycetes）にハイ
ブリダイズするように設計、それ故プローブ1812のハイ
ブリダイズ挙動を補って完全にする。
プローブ1859:ヤロウィア リポリチカ（Yarrowia li
polytica）にハイブリダイズするように設計、およびそ
れ故プローブ1812のハイブリダイズ挙動を補って完全と
する。
プローブ1812,1858および1859:これらは相同的な組で
ある−−即ち、これらはすべて18SrRNA分子上の同一の
位置へハイブリダイズする。組として、これらはただ２
つの株のみに強くハイブリダイズしない（表２および３
参照）。
プローブ1857および1860のごとき非相同プローブは実
施例２に記載されているごとき二重プローブ検定で一緒
に使用されるように設計されている。
プローブ／プライマー935および936はアスペルギルス
（Aspergillus）カンジダ（Candida）、ペニシリウム
（Penicillium）クリプトコッカス（Cryptococcus）お
よびブラストミセス（Blastomyces）を含む試験された
すべての真菌分類群からの18SrDNAの増幅に使用されて
きた。
実施例 １ プローブハイブリダイゼーション挙動のド
ット−ブロット分析 よく知られている方法に従うドット−ブロット分析に
は、特にこの目的のためのニトロセルロース、ナイロン
または他の誘導化膜のごときフィルター（市販のものが
容易に入手できる）上への核酸または核酸の集団の固定
化が含まれている。DNAまたはRNAの両方が容易にそのよ
うなフィルター上へ固定化され、続いて任意の組合せの
条件下（即ちストリンジェンシー）、問題とするヌクレ
オチド配列またはプローブでハイブリダイゼーションが
証明または試験できる。ストリンジェント条件下、その
ヌクレオチド配列が標的へより大きな相補性を持つプロ
ーブはより少ない相補性を含むプローブよりも高い水準
のハイブリダイゼーションを示すであろう。
本発明のプローブはドット−ブロット様式で試験され
た。フェノール抽出およびセシウムトリフルオロアセテ
ート勾配を通しての遠心分離により精製された標的RNA
100ナノグラムを変性し、ナイロン膜上にスポットし
た。プローブはオリゴヌクレオチドの５′末端への32−
リン部分の添加により同位元素で標識されている。プロ
ーブのハイブリダイゼーションは1.08M塩化ナトリウ
ム、60mMリン酸ナトリウムおよび6mMエチレンジアミン
四酢酸存在下pH7.4にて示された温度で起こした。ハイ
ブリダイズしていないプローブはハイブリダイゼーショ
ン条件の３分の１の塩濃度で洗浄することにより除去さ
れた。フィルターをＸ線フィルムに暴露し、暴露３時間
後にハイブリダイゼーション信号の強度を評価した。
表1,2および３は上記の方法で試験されたプローブの
挙動を要約しており、前に要約された特異性の情報を提
供している。
実施例 ２ 二重プローブハイブリダイゼーション 実際的にはこれらのプローブの多くの応用は第１図に
示したごとき“捕捉”プローブおよび“検出”プローブ
の“サンドイッチ”ハイブリダイゼーションスキームに
おいて同時に一対のプローブが使用されるであろう。捕
捉プローブ12は理想的には高い標的特異性のプローブへ
同種重合体の３′尾を付けることにより製造される二機
能性ポリヌクレオチドであろう。尾は順に、ガラスビー
ズまたはフィルター円盤のごとき固体表面10上の相補的
同種重合体11へハイブリダイズするであろう。捕捉プロ
ーブ12のその標的15（この場合真菌スピロヘータ18SrRN
A）へのハイブリダイゼーションにより標的15の固体支
持体10への複合体形成がおこる。検出プローブ13（都合
が良いのはある程度の特異性をもっているもの）は、完
全ハイブリダイゼーション複合体の存在を報告するであ
ろう放射活性、蛍光、化学発光、色その他（検出部
分14）に依存する好適な検出スキームの一部であろう。
実施例 ３ 血液、痰または脳脊椎液試料からの真菌敗
血症の臨床診断 臨床試験は全核酸含量を遊離するように、超音波処
理、ガラスビーズとの激しい撹拌、SDSのごとき試薬を
用いる界面活性剤溶菌または化学的処理により理想的に
加工される。もしくは、真菌細胞を例えばデュポンアイ
ソレーターシステムにより一部精製され、続いて溶菌す
る。破壊された真菌を含む試料は次に捕捉プローブ、検
出プローブおよび理想的にはオリゴ−チミジンで誘導化
されている（実施例２も参照されたい）磁気粒子ビーズ
の存在下、GillespieらUSSN299,150により記載されてい
るグアニジニウムイソチオシアネートのごときカオトロ
ピック緩衝液（chaotropic buffer）中でインキュベー
トする。
もし酵母菌または糸状菌18SrRNA標的分子が存在する
なら、ビーズ＋捕捉プローブ＋標的＋検出プローブハイ
ブリダイゼーション複合体が形成される。反応管の底部
近くの磁気の外部的存在により磁気粒子−ハイブリダイ
ゼーション複合体−の管内壁への接着が起こされ、それ
により都合よく、試料マトリックス、非結合プローブそ
の他のごとき未反応成分の除去ができる。ビーズ−プロ
ーブ−標的複合体の再水和および変性を繰り返すと著し
くバックグラウンドを減少させることができるであろう
（より詳細には、Collinsら,USSN922,155,EPA87309308
およびUSSN136,920,EPA88312135.2に記載されてい
る）。本実施例においては、最終的検出は膜上へのビー
ズのスポットおよびオートラジオグラフィーによる検出
が用いられた。
そのような検定のためには、下記の捕捉および検出プ
ローブの組合せが好適な対の例である： プローブ1417＋1542,プローブ1417＋1545, プローブ1418＋1542,プローブ1418＋1545, プローブ1416＋1812,プローブ1812＋1860, プローブ1857＋1860。
実施例 ４ 真菌rDNAのポリメラーゼチェーン反応増幅
を用いるヒト試料からの真菌感染の臨床診断 実施例３で提供されたごとき試料加工がDNAを得るた
めに理想的に設計された。ポリメラーゼチェーン反応
（“PCR"）増幅のための調製においては、DNAは更に処
理された一本鎖にされる（例えは融解により）。プロー
ブ／プライマー936およびプローブ／プライマー935が標
準PCR法において臨床試料と連結して理想的に用いられ
た。生じる物質は、ここに記載された任意のプローブと
共に実施例２の“サンドイッチ”ハイブリダイゼーショ
ン法を利用して都合よく検定されるであろう。ポリメラ
ーゼチェーン反応、それ自身もプローブ／プライマー93
6を例えばプローブ1812と連結して用いることにより高
度に特異的にすることができる。プローブ1814を捕捉
に、およびプローブ1415および1416を検出に用いること
により検出が都合よく達成される。
実施例 ５ 細胞学的染色としてのイン・サイチュ（in
situ）でのハイブリダイゼーション 本発明のプローブは細胞学的染色試薬としても都合よ
く使用できる。例えば痰試料を顕微鏡スライドにのせ
る。適当な固定化および溶菌後、本発明のプローブとの
ハイブリダイゼーションがイン・サイチュ（in situ）
で実施される。この方法により、プローブ1416を蛍光標
識し、蛍光顕微鏡を用いてスライドを試験することによ
り標本中の真菌が視覚化できた。
実施例 ６ 培養による真菌血症の確認 バクテック、ロッシェ、セプチーチェックまたはデュ
ポンアイソレーターを利用する標準培養工程の後、コロ
ニーまたは液体培養物に真菌が存在するかどうか、実施
例２に記載されている方法でプローブ1418および1542を
用いて試験した。結構な利点は純粋な培養が必要でない
ことである。
ここに示した方法またはプローブの種々の変更が本発
明の精神または範囲から離れることなくなされることが
当業者には容易に理解されるであろう。特に、ハイブリ
ダイゼーション条件での調節に伴われる１つまたは２つ
の末端ヌクレオチドを欠損させることによるごときプロ
ーブの変更は均等の範囲内にあるものと思われる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、二重プローブの捕捉／検出検定の方法を示し
た模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デール・エイ・ペレティアー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02143，サマーヴィル，ウォルナット・ ストリート 58，アパートメント ナン バー ３ (72)発明者 ミッチェル・エル・ソジン アメリカ合衆国コロラド州80220，デン ヴァー，グレンコー・ストリート 1371 (56)参考文献 Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖ ｏｌ．38［４］（1986）ｐ．419−427 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/11 - 15/62 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の： からなるグループから選択されるプローブの配列と相補
    的であるか、または同一の核酸配列を含む核酸プローブ
    であって、 真菌の18S rRNAまたはrDNAにはハイブリダイズする
    が、ヒト、細菌および小麦のrRNAまたはrDNAには同一の
    ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしな
    い、前記核酸プローブ。
  2. 【請求項２】核酸配列が、プローブ1415、1416、IG70
    7、1859、1858、1857、1812、1813、1814または1816に
    相補的であるか、または同一である、請求項１の核酸プ
    ローブ。
  3. 【請求項３】さらに、末端キャップを含む、請求項１の
    核酸プローブ。
  4. 【請求項４】さらに、検出リガンドを含む、請求項１の
    核酸プローブ。
  5. 【請求項５】さらに、ポリデオキシアデノシンテイルを
    含む、請求項１の核酸プローブ。
  6. 【請求項６】プローブ1418（５′−TGTCTGGACCTGGTGAGT
    TTCCCCGTGTTGAGTCAAATT−３′）の27ないし39ヌクレオ
    チドを含み、そして、 プローブ1417（５′−TGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTG−
    ３′）の少なくとも27ヌクレオチドを含む配列と相補的
    であるか、または同一の核酸配列を含む核酸プローブで
    あって、 真菌の18S rRNAまたはrDNAにはハイブリダイズする
    が、ヒト又は細菌のrRNAまたはrDNAには同一のハイブリ
    ダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、前記核
    酸プローブ。
  7. 【請求項７】プローブ1417の配列と相補的であるか、ま
    たは同一の核酸配列を含む、請求項６の核酸プローブ。
  8. 【請求項８】プローブ1418の配列と相補的であるか、ま
    たは同一の核酸配列を含む、請求項６の核酸プローブ。
  9. 【請求項９】プローブ1860（５′− AAATGCTTTCGCAGTAGTTGGTCTTCGGTAAATCCAAGAATTTCACCTT
    −３′）の25ないし49ヌクレオチドを含み、そして、 プローブ1813（５′−AAATGCTTTCGCAGTAGTTGGTCTT−
    ３′）の少なくとも25ヌクレオチドを含む配列と相補的
    であるか、または同一の核酸配列を含む核酸プローブで
    あって、 真菌の18S rRNAまたはrDNAにはハイブリダイズする
    が、ヒト又は細菌のrRNAまたはrDNAには同一のハイブリ
    ダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、前記核
    酸プローブ。
  10. 【請求項１０】プローブ1813の配列と相補的であるか、
    または同一の核酸配列を含む、請求項９の核酸プロー
    ブ。
  11. 【請求項１１】プローブ1860の配列と相補的であるか、
    または同一の核酸配列を含む、請求項９の核酸プロー
    ブ。
  12. 【請求項１２】少なくとも２種のプローブを含む核酸プ
    ローブのセットであって、プローブの少なくとも１種が
    以下の： ならびにこれらの相補的な配列、からなるグループから
    選択される、上記核酸プローブのセット。
  13. 【請求項１３】以下のプローブ対:1417と1542、1417と1
    545、1418と1542、1418と1545、1416と1812、1812と186
    0、1857と1860、1812と936、1814と1415、および1814と
    1416からなるグループから選択される、請求項12の核酸
    プローブのセット。
  14. 【請求項１４】患者由来の生物学的試料中の真菌生物を
    検出するための方法であって、 ａ）当該試料を、請求項１、６または９のいずれか１項
    の少なくとも１種の核酸プローブと接触させ； ｂ）真菌生物の18S rRNAまたはrDNAがもし当該試料中
    に存在するならば、それらに当該プローブがハイブリダ
    イズするような条件を、当該試料および核酸プローブに
    課し、核酸複合体を形成し；そして ｃ）当該複合体を、当該試料中に真菌生物が存在するこ
    との指標として検出する ことを含む、前記検出方法。
  15. 【請求項１５】接触工程における核酸プローブが、以下
    の： ならびにこれらの相補的な配列からなるプローブのグル
    ープから選択される、請求項14の方法。
  16. 【請求項１６】接触工程における核酸プローブが、プロ
    ーブ／ライマー936（５′−（CCGAATTCGTCGACAAC）CTGG
    TTGATCCTGCCAGT−３′）を含み、そして、 検出工程が、試料を以下の： ならびにこれらの相補的な配列からなるプローブのグル
    ープから選択される第２の核酸プローブと、さらに接触
    させることを含む、請求項14の方法。
  17. 【請求項１７】さらに複製連鎖反応によって真菌生物の
    18S rRNAまたはrDNA配列を増幅する工程を含む、請求
    項14の方法。
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