DE69434255T2

DE69434255T2 - Nukleinsäuresonde zum nachweis von lactobacillus

Info

Publication number: DE69434255T2
Application number: DE69434255T
Authority: DE
Inventors: Raymond M. Nietupski; Benjamin B. Stone; William G. Weisburg
Original assignee: Vysis Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 1993-09-10
Filing date: 1994-09-09
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2014-09-10
Also published as: US5484909A; EP0674650B1; EP0674650A1; DE69434255D1; EP0674650A4; JP3749540B2; JPH08503620A; WO1995007289A1; US5705339A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäuresonden, Sondensätze und auf Verfahren für die Detektion von Organismen, einschließlich Pediococcus sp. und Lactobacillus sp., die in den Verderb von Bier in der Brauumgebung verwickelt sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Verhinderung von Bierverderb durch kontaminierende Mikroorganismen ist eine Hauptsorge kommerzieller Brauereien. Die vorherrschenden Organismen, von denen gezeigt worden ist, dass sie Bier verderben, oder die mit Bierverderb in Zusammenhang gebracht worden sind, sind Mitglieder der Gattungen Lactobacillus und Pediococcus (siehe The Prokaryotes, Bd. II, 2. Auflage, Balows et al, Hrsg. 1991). Diese Bakterien können in sehr geringer Anzahl anwesend sein und ihr Nachweis kann drei bis fünf Tage oder mehr durch traditionelle Kulturverfahren benötigen.
Mitglieder der Gattung Pediococcus sind grampositive Kokken, die häufig Tetraden bilden. Sie haben komplexe Anforderungen an die Ernährung und sind in der Lage, eine Reihe von Zuckern zu fermentieren. Sie sind fakultative Anaerobier, die in einer Reihe von Lebensräumen gefunden werden, am häufigsten sind sie mit fermentierender Vegetation verbunden. In dieser Gattung gibt es acht Arten; P. damnosus ist das Hauptmitglied der Gattung, von der bekannt ist, dass sie Bierverderben verursacht.
Die Gattung Lactobacillus enthält grampositive, nicht sporenbildende Stäbe, die einen streng fermentativen Metabolismus nutzen und komplexe Anforderungen an die Ernährung haben. Sie werden in einer Reihe von Lebensräumen gefunden, einschließlich Wasser, Molkerei-, Fleisch- und Fischprodukten, Vegetation und fermentierende Vegetation und in dem Mund und Darmtrakt von Säugetieren.
Etliche Studien identifizierten bakterielle Stämme, die in der Lage sind, Bier zu verderben, und die relativen Zahlen der Stämme innerhalb der so einbezogenen Arten waren mit abnehmender Reihenfolge der Wichtigkeit: Lactobacillus brevis, P. damnosus, L. casei, L. lindneri, L. coryniformis, L. buchneri, L. plantarum und L. curvatus.
Die üblichen Verfahren der Detektion bierverderbender Organismen beruhen auf der klassischen Mikrobiologie und einer allgemeinen Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Kontamination durch Bakterien. Diese Verfahren schließen ein: (a) Kultur, (b) direkter Fluoreszenzantikörpernachweis (DFA) und (c) Nukleinsäuresonden für die Kulturbestätigung. Die tatsächliche Identifikation von Verderbnisorganismen erfordert klassische biochemische Tests und die Erfüllung der Koch'schen Postulate, d. h. die „Reinfektion" von frischem Bier und zeigen, dass es verdorben wird.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf Nukleinsäuren, die zu einzelnen Nukleinsäuresequenzen innerhalb der ribosomalen RNS (rRNS) und DNS (rDNS) von Organismen, die Bierverderb verursachen, komplementär sind, die jedoch in unverdorbenem Bier nicht anwesend sind. Sie bezieht sich weiter auf Nukleinsäuresonden, die mit Zielregionen hybridisieren können, welche für Sonden unter normalen Testbedingungen zugänglich gehalten werden können. Es ist ein Aspekt der Erfindung, für Sonden zu sorgen, die sowohl Pediococcus als auch Lactobacillus-Arten erkennen. Solche Sonden (1) unterscheiden entweder spezifisch zwischen der Gruppe aus P. damnosus und L. brevis und anderen Arten; (2) unterscheiden spezifisch zwischen der Mehrheit an Pediococcus- und Lactobacillus-Arten, die Bierverderb verursachen, und anderen Arten; oder (3) unterscheiden spezifisch zwischen der Mehrheit an Pediococcus und Lactobacillus (und verwandten Arten) und anderen Arten.
Bakterielle Ribosomen enthalten drei verschiedene RNS-Moleküle, auf die, wenigstens in Escherichia coli, Bezug genommen wird als 5S-, 16S- und 23S-rRNS. In eukaryotischen Organismen gib es vier unterschiedliche rRNS Arten, auf die allgemein Bezug genommen wird als 5S, 185, 28S und 5,85. Diese Namen stehen in historischer Beziehung mit der Größe der RNS-Moleküle, wie bestimmt durch ihre Sedimentationsgeschwindigkeit. In Wirklichkeit variieren rRNS-Moleküle jedoch wesentlich in der Größe zwischen Organismen. Dies nicht außer Acht lassend sind 5S-, 165-, 23S-rRNS im Fachgebiet anerkannte Namen, die sich auf rRNS-Moleküle in allen Bakterien beziehen, und diese Übereinkunft wird hierin verwendet werden.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Diagramm eines Sandwichassays.
Definitionen
Wie durch die Anmeldung und Ansprüche hindurch verwendet, wird sich der Begriff „Sonde" auf synthetisch oder biologisch hergestellte Nukleinsäuren mit einer Länge von 10 bis 250 Basen beziehen, die durch Design oder Selektion spezifische Nukleotidsequenzen enthalten, welche eine spezifische und bevorzugte Hybridisierung unter vorbestimmten Bedingungen ermöglichen, um Nukleinsäuresequenzen zum Ziel zu nehmen, und die wahlweise eine Einheit für die Detektion oder die Verstärkung des Erscheinungsbildes des Tests enthalten. Ein Minimum an zehn Nukleotiden ist allgemein notwendig, um statistisch Spezifität zu erhalten und stabile Hybridisierungsprodukte zu bilden, und ein Maximum aus 250 Nukleotiden repräsentiert allgemein eine obere Grenze an Nukleotiden, bei der Reaktionsparameter angepasst werden können, um fehlgepaarte Sequenzen und bevorzugte Hybridisierung zu bestimmen. Deswegen wird im Allgemeinen eine bevorzugte Länge einer Sonde zwischen 10 und 250 Nukleotiden sein. Sonden können ebenfalls wahlweise gewisse Bestandteile enthalten, die zu ihrem genauen oder optimalen Funktionieren unter gewissen Testbedingungen beitragen. Zum Beispiel können Sonden modifiziert sein, um ihre Resistenz gegen Nukleaseabbau zu verbessern (wie zum Beispiel durch End-capping), um De tektionsliganden (wie zum Beispiel Fluorescein, ³²P, Biotin etc.) zu tragen oder um ihr Einfangen auf einem festen Träger (z. B. Polydesoxyadenosin-„Schwänze") zu erleichtern.
„Bevorzugte Hybridisierung" oder „bevorzugt hybridisierend" ist in einer relativen Weise zu verwenden; d. h. ein Hybridisierungsreaktionsprodukt ist stabiler als ein anderes unter identischen Bedingungen. Unter gewissen Bedingungen kann ein Hybridisierungsreaktionsprodukt hinsichtlich eines Ziels gebildet werden, aber nicht hinsichtlich eines anderen möglichen Bindungspartners. Es liegt gut innerhalb des Könnens eines Durchschnittsfachmanns, die Stabilität von Hybridisierungsreaktionsprodukten zu vergleichen und zu beurteilen, welches stabiler ist, d. h. zu bestimmen, welches „bevorzugt" gebunden hat.
Wie hierin verwendet, sind die Begriffe „Homologie" und „homolog" so gemeint, dass sie sich auf den Grad an Ähnlichkeit zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen beziehen und sind nicht so gemeint, dass sie irgendeine taxonomische Verwandtheit zwischen Organismen implizieren. Der Ähnlichkeitsgrad wird als ein Prozentsatz ausgedrückt, d. h. 90% Homologie zwischen zwei Sequenzen wird bedeuten, dass 90% der Basen der ersten Sequenz identisch zu den Basen der zweiten Sequenz passen.
Ein „Cluster an Lactobacillus-Arten" bedeutet eine Gruppe aus Lactobacillus-Arten, die aus der Gruppe, bestehend aus L. fructivorans, L. casei, L. curvatus, L. brevis und L. buchneri ausgewählt sind.
„Spezifisch" bedeutet, das eine Nukleotidsequenz mit einer definierten Zielsequenz hybridisieren wird und im Wesentlichen nicht mit einer Nichtzielsequenz hybridisieren wird, oder dass die Hybridisierung mit einer Nichtzielsequenz minimal sein wird.
„Hybridisierung" ist ein Vorgang, durch welchen es, unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen, zwei teilweise oder vollständig komplementären Nukleinsäuresträngen ermöglicht wird, in einer antiparallelen Weise zusammen zu kommen, um eine doppelsträngige Nukleinsäure mit spezifischen und stabilen Wasserstoffbindungen zu bilden, wobei ausdrückli chen Regeln gefolgt wird, die sich darauf beziehen, welche Nukleinsäurebasen miteinander paaren können.
„Wesentliche Hybridisierung" bedeutet, dass die Menge an Hybridisierung in einem Ausmaß erfolgen wird, dass einer, der die Ergebnisse beobachtet, das Ergebnis in einer klinischen Einstellung für positiv erachten würde. Daten, die für „Hintergrundrauschen" erachtet werden, bedeuten keine wesentliche Hybridisierung.
„Stringente Hybridisierungsbedingungen" bedeutet annähernd 35°C bis 65°C in einer Salzlösung von annähernd 0,9 molar NaCl. Stringenz kann ebenfalls durch solche Reaktionsparameter wie die Konzentration und Art von in der Hybridisierungslösung anwesenden Ionenarten, den Arten und Konzentrationen anwesender denaturierender Mittel und der Hybridisierungstemperatur gesteuert werden. Allgemein werden, indem die Hybridisierungsbedingungen stringenter werden, längere Sonden bevorzugt, falls stabile Hybride gebildet werden sollen. Als eine Regel gilt, dass die Stringenz der Bedingungen, unter welchen eine Hybridisierung stattfinden soll, gewisse Eigenschaften der zu verwendenden bevorzugten Sonden bestimmen. Solche Beziehungen sind wohl verstanden und können leicht durch Fachleute manipuliert werden.
„Lactobacillus sp." bezieht sich auf irgendein Mitglied der Gattung Lactobacillus, ungeachtet der Art.
„Pediococcus sp." bezieht sich auf irgendein Mitglied der Gattung Pediococccus, ungeachtet der Art.
„Mehrheit von", wenn auf Stämme bezogen, bedeutet mehr als die Hälfte der bekannten Stämme oder mehr als die Hälfte der untersuchten Stämme, wenn man repräsentative Stichproben von wenigstens 25 Stämmen untersucht. Wenn auf Arten bezogen, bedeutet es mehr als die Hälfte der bekannten Arten oder mehr als eine Hälfte der untersuchten Arten, wenn man eine repräsentative Zahl an Arten untersucht.
In Übereinstimmung mit dieser Erfindung werden Nukleinsäuresonden bereitgestellt, die aus

(a) einer Nukleotidsequenz bestehen, die identisch ist oder vollständig komplementär ist mit dem allen oder wenigstens einem Teil von zehn aufeinander folgenden Nukleotiden von irgendeiner der folgenden Sonden 2904 (SEQ ID NO: 13), 2896 (SEQ ID NO: 14); 2873 (SEQ ID NO: 15), 2881 (SEQ ID NO: 16), 2887 (SEQ ID NO: 17), 2875 (SEQ ID NO: 18), 2901 (SEQ ID NO: 19), 2854 (SEQ ID NO: 20), 2879 (SEQ ID NO: 21) oder 2902 (SEQ ID NO: 22); und
(b) wahlweise einem Detektions- oder einem Fangliganden.

Wie unten diskutiert werden wird, schließen die in Übereinstimmung mit der Erfindung bereitgestellten Sonden welche ein, die (1) bevorzugt mit der Gruppe aus P. damnosus und L. brevis im Vergleich mit anderen Arten hybridisieren; (2) bevorzugt mit der Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Arten, die Bierverderb verursachen, im Vergleich mit anderen Arten hybridisieren; und (3) die spezifisch zwischen der Mehrheit an Pediococcus und Lactobacillus (und verwandten Arten) und anderen Arten unterscheiden. Unter jenen selben Hybridisierungsbedingungen hybridisieren die Nukleinsäuresonden dieser Erfindung nicht wesentlich mit der rRNS oder rDNS von Nicht-Zielorganismen oder dem Wirt oder der Umgebungsmatrix, die in Testproben anwesend sein können.
Die Nukleinsäuresonden dieser Erfindung sind nützlich für das Detektieren der Anwesenheit eines Organismus, welcher Verderb in Bier verursachen würde, und gewisse Ausführungsbeispiele sind homolog oder hybridisieren mit den Regionen der 16S-rRNS oder -rDNS bierverderbender Mikroorganismen. Die Regionen der 16S-rRNS von besonderem Interesse stehen in Beziehung mit der Nummerierung der homologen Regionen von E. coli, einem Standard, der Fachleuten wohl bekannt ist, und schließen ein:
P. damnosus: 16S-rRNS-Positionen 285 bis 320, 450 bis 485 und 1435 bis 1470;
L. brevis: 16S-rRNS-Positionen 75 bis 105 und 450 bis 485;
P. damnosus oder L. brevis: 16S-rRNS-Positionen 805 bis 840;
Pediococcus und Lactobacillus: 16S-rRNS-Positionen 120 bis 150, 210 bis 245, 280 bis 315, 485 bis 515 und 750 bis 785.
Andere Ausführungen hybridisieren mit Regionen der 23S-rRNS oder -rDNS bierverderbender Organismen. Die Regionen der 23S-rRNS von besonderem Interesse beziehen sich auf die Nummerierung der homologen Regionen in E. coli, einem Standard, der Durchschnittsfachleuten wohl bekannt ist, und schließen ein:
P. damnosus: 23S-rRNS-Positionen 700 bis 740, 870 bis 910, 925 bis 960, 1130 bis 1165 und 1205 bis 1245;
L. brevi:. 23S-rRNS-Positionen 280 bis 320, 325 bis 363, 1130 bis 1165, 1265 bis 1300 und 1480 bis 1512;
P. damnosus und L. brevis: 23S-rRNS-Positionen 600 bis 635.
Eine weitere Ausführung dieser Erfindung schließt einen Satz an Nukleinsäuresonden ein, der wenigstens zwei wie oben definierte Nukleinsäuresonden umfasst. Bevorzugte Sätze bestehen aus irgendeinem der folgenden Sondensätze: 2904 (SEQ ID NO: 13), 2868 (SEQ ID NO: 6) und 2861 (SEQ ID NO: 2); 2896 (SEQ ID NO: 14), 2880 (SEQ ID NO: 8) und 2876 (SEQ ID NO: 4); 2881 (SEQ ID NO: 16), 2873 (SEQ ID NO: 15) und 2887 (SEQ ID NO: 17); 2875 (SEQ ID NO: 18), 2901 (SEQ ID NO: 19) und 2899 (SEQ ID NO: 12); 2854 (SEQ ID NO: 20) und 2879 (SEQ ID NO: 21); oder 2902 (SEQ ID NO: 22), 2875 (SEQ ID NO: 18) und 2901 (SEQ ID NO: 19).
Solche Nukleinsäuresätze sind besonders für das Detektieren bierverderbender Mikroorganismen in einem Sandwich-Assay mit zwei Sonden geeignet. Sondensätze können mit Reagenzien, Zusammensetzungen, Instruktionen, wegwerfbarer Hardware und geeigneter Verpackung verwendet werden, um das Vermarkten in einer geeigneten Anordnung zu ermöglichen.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung schließt Verfahren für die Detektion der Anwesenheit bierverderbender Mikroorganismen ein. Folglich stellt die Erfindung weiter ein Verfahren zum Detektieren von Lactobacillus- oder Pediococcus-Bakterien in einer Bierprobe bereit, wobei das Verfahren die Schritte des Kontaktierens einer Probe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer wie oben definierten Nukleinsäuresonde einschließt, um einen detektierbaren Komplex mit 16S- oder 23S-rRNS oder -rDNS von Lactobacillus oder Pediococcus in der Probe, falls vorhanden, unter den stringenten Hybridisierungsbedingungen zu bilden, worin die Probe nicht einen detektierbaren Komplex mit rRNS oder rDNS von Nicht-Lactobacillus- oder Nicht-Pediococcus-Bakterien unter den stringenten Hybridisierungsbedingungen bildet; und des Detektierens der Komplexe als ein Anzeichen von Lactobacillus- oder Pediococcus-Bakterien in der Probe.
Die Sonden der vorliegenden Erfindung stellen die Basis für die Entwicklung eines Nukleinsäurehybridisierungstests für die spezifische Detektion bierverderbender Organismen in Bier- oder Umgebungsproben bereit. Die Sonden der vorliegenden Erfindung bilden ebenfalls die Basis für die Bestätigung der Anwesenheit von Mikroorganismen, von denen gezeigt worden ist, dass sie Bier verderben.
Der bei der Entwicklung der Sonden der vorliegenden Erfindung erste vorgenommene Schritt schloss die Identifikation der Regionen der 165- oder 23S-rRNS ein, welche möglicherweise als Zielstellen für spezifische Nukleinsäuresonden mit der gewünschten Empfindlichkeit dienen könnten. Dies schloss das Entdecken ein, welche Sondenzielstellen einzigartig waren für: 1) P. damnosus; 2) die Mehrheit der Bierverderb bewirkenden Pediococcus-Stämme; 3) L. brevis; 4) eine Untergruppe von Lactobacillus sp.; 5) die Gruppe aus P. damnosus und L. brevis; 6) der Gruppe der Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Arten von denen gezeigt worden ist, dass sie Bier verderben; und 7) der Gruppe der Mehrheit an Pediococcus und Lactobacillus und verwandten Arten. Dies brachte das Auffinden von Stellen mit sich, die wie folgt sind:

1. unterschiedlich zwischen P. damnosus und anderen Pediococcus- und Nicht-Pediococcus-Arten;
2. unterschiedlich zwischen der Mehrheit der untersuchten Pediococcus-Stämme und anderen Arten;
3. unterschiedlich zwischen L. brevis und anderen Lactobacillus- und Nicht-Lactobacillus-Arten;
4. unterschiedlich zwischen einem Cluster von Lactobacillus-Arten (L. fructivorans, L. casei, L. curvatus, L. brevis und L. buchneri) und anderen Arten;
5. unterschiedlich zwischen der Gruppe aus P. damnosus und L. brevis und anderen Arten;
6. ähnlich für alle Organismen, von denen gezeigt worden ist, dass sie Bierverderb verursachen, wie gezeigt durch eine repräsentative Stichprobennahme von 25 Stämmen, jedoch unterschiedlich zwischen den evolutionär engsten Nachbarsequenzen; und
7. zwischen der Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus- und verwandten Arten, jedoch unterschiedlich von anderen Arten, mit der Ausnahme von L. minutus, L. lacti, Mitgliedern der Gattung Micrococcus und Mitgliedern der Gattung Pectinatus.

Um die obige Analyse zu bewerkstelligen, wurden präzise Anordnungen von 165- und 23S-rRNS-Sequenzen von P. damnosus und L. brevis entwickelt. Die im Wesentlichen vollständigen 16S- und 23S-rRNS-Sequenzen sowohl von P. damnosus als auch von L. brevis wurden unter Verwendung von Standardlaborprotokollen bestimmt. Die so gewonnene rDNS wurde in Plasmidvektoren aus durch enzymatische Amplifikation hergestellten Produkten kloniert (wie zum Beispiel jene, die in Weisburg, 1991, J. Bacteriol. 173: 697–703 beschrieben sind, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen). Die Sequenzen von P. damnosus und L. brevis wurden mit homologen Sequenzen anderer Lactobacillus-Arten, grampositiver Organismen und anderen eubakteriellen rRNS-Sequenzen, einschließlich E. coli (die weithin als Standardreferenzsequenz von Fachleuten verwendet werden) angeordnet.
Basierend auf den festgestellten 16S- und 23S-rRNS-Sequenzen von P. damnosus und L. brevis wurden zweiundzwanzig Sonden gestaltet, synthetisiert und untersucht. Das spezifische Verhalten der Sonden ist zu einem signifikanten Ausmaß von dem Testformat abhängig, in welchem sie genutzt werden. Umgekehrt wird das Testformat gewisse der optimalen Eigenschaften der bestimmten Sonden diktieren.
Die Entdeckung, dass Sonden mit den außergewöhnlichen Einschluss- und Ausschlusseigenschaften der vorliegenden Erfindung bezüglich P. damnosus und L. brevis erzeugt werden konnten, ohne das unerwünschte Ausmaß an Kreuz-Reaktionen auf sich zu nehmen, war unvorhersagbar und unerwartet.
Die erste Gruppe identifizierter Sonden sind in der Lage, zwischen P. damnosus und anderen Arten zu unterscheiden.
Für P. damnosus spezifische 16S-rRNS-Sonden:
Eine zweite Gruppe identifizierter Sonden ist in der Lage, die Mehrheit bierverderbender Pediococcus-Stämme zu detektieren.
Mehrheit an 23S-rRNS-Sonden der Gattung Pediococcus:
Eine dritte Gruppe identifizierter Sonden ist spezifisch für L. brevis.
Für L. brevis spezifische 16S-rRNS-Sonden:
Für L. brevis spezifische 23S-rRNS-Sonden:
Eine vierte identifizierte Sondengruppe ist spezifisch für einen Cluster von Lactobacillus-Arten. Eine wird unten wiedergegeben.
23S-rRNS-Sonde für einen Cluster an Lactobacillus sp.:
Eine fünfte Sondengruppe kann sowohl P. damnosus als auch L. brevis detektieren. Bevorzugte werden unten wiedergegeben.
16S-rRNS-Sonden für P. damnosus und L. brevis:
23S-rRNS-Sonden für P. damnosus und L. brevis:
Eine sechste Gruppe an Sonden hybridisiert mit der Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Arten und allen bierverderbenden Organismen. Bevorzugte werden unten wiedergegeben.
16S-rRNS-Sonden bierverderbender Organismen:
23S-rRNS-Sonden bierverderbender Organismen:
Eine siebte Sondengruppe wird mit der Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Arten hybridisieren. Bevorzugte werden unten wiedergegeben.
16S-rRNS-Sonden für die Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Arten:
23S-rRNS-Sonden für die Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Arten:
Die Sonden der vorliegenden Erfindung können in einem „Sandwich"-Assay verwendet werden. Wie in 1 gezeigt, schließt der „Sandwich"-Assay die gleichzeitige Verwendung eines Sondenpaares ein. Eine Sonde, als die „Fang"-Sonde 12 bezeichnet, ist ein bifunktionelles Nukleotid, das durch Hinzufügen eines homopolymeren 3'-Schwanzes zu einer Sonde mit einer vorzugsweise hohen Zielspezifität gemacht worden ist. Der Schwanz wird mit dem komplementären Homopolymer 11 auf einem festen Träger 10, wie eine Glasperle oder eine Filterscheibe, hybridisieren. Hybridisierung der Fangsonde 12 mit ihrem Ziel 15, in diesem Fall Pediococcus/Lactobacillus-rRNS, würde das Ziel 15 mit dem festen Träger 10 komplexieren. Die Detektorsonde 13, vorzugsweise mit einem gewissen Spezifitätsgrad, würde ein Teil eines Detektionsschemas sein, das im Grunde genommen jede Art an Detektionseinheit 14 verwenden kann, einschließlich Radioaktivität, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Farbe oder einer anderen Detektoreinheit. Die Detektorsonde kann als eine RNS-Sequenz in eine amplifizierbare Q-beta-Midivariante, wie beschrieben durch Kramer und Lizardi, 1989, Nature, 339, eingebaut werden.
Eine Probe, wie ein Abstrich oder eine flüssige Aliquote, wird verarbeitet, um den Gesamtnukleinsäuregehalt freizusetzen. Die Probe, die vermutlich zerstörte Bierverderborganismen enthält, wird in der Anwesenheit einer Fangsonde, Detektorsonde und von Magnetpartikelperlen, die mit Oligo-Desoxy-Thymidin in einem chaotropen Puffer wie Guanidinisothiocyanat derivatisiert worden sind, inkubiert.
Falls Zielmoleküle (Bierverderbmikroorganismen der Gattung Pediococcus oder Lactobacillus) anwesend sind, wird ein Perle-Fangsonde-Ziel-Detektorsonde-Hybridisierungskomplex gebildet, wie in 1. Die Anwesenheit eines Magneten in der Nähe des Bodens des Reaktionsröhrchens wird den magnetischen Partikelhybridisierungskomplex dazu bringen, an der Röhrchenwand anzuhaften, was das Entfernen von Probenmatrix, ungebundener Sonde und anderen nicht hybridisierten Bestandteilen ermöglicht. Die wiederholte Rehydrierung und Denaturierung des Perle-Fangsonde-Ziel-Detektorsonde-Komplexes würde eine signifikante Hintergrundreduktion ermöglichen. Die endgültige Detektion kann das Auftüpfeln der Perlen auf eine Membrane und das Testen durch ein geeignetes Verfahren wie Autoradiographie einschließen, falls die Detektorsonde mit einem Radioisotop markiert worden war. Alternativ kann die Detektorsonde eine amplifizierbare Midivariante-Sonde sein.
Die folgenden nichtbegrenzenden Beispiele werden dargebracht, um die Erfindung besser zu erläutern.
Es wird festgestellt, dass die vorliegende Erfindung auf die folgenden Sonden gerichtet ist: 2904 (SEQ ID NO: 13), 2896 (SEQ ID NO: 14), 2873 (SEQ ID NO: 15), 2881 (SEQ ID NO: 16), 2887 (SEQ ID NO: 17), 2875 (SEQ ID NO: 18), 2901 (SEQ ID NO: 19), 2854 (SEQ ID NO: 20), 2879 (SEQ ID NO: 21), oder 2902 (SEQ ID NO: 22) und ebenfalls auf die folgenden Sondensätze:
2904 (SEQ ID NO: 13), 2868 (SEQ ID NO: 6) und 2861 (SEQ ID NO: 2),
2896 (SEQ ID NO: 14), 2880 (SEQ ID NO: 8) und 2876 (SEQ ID NO: 4),
2881 (SEQ ID NO: 16), 2873 (SEQ ID NO: 15) und 2887 (SEQ ID NO: 17),
2875 (SEQ ID NO: 18), 2901 (SEQ ID NO: 19) und 2899 (SEQ ID NO: 12),
2854 (SEQ ID NO: 20) und 2879 (SEQ ID NO: 21) oder
2902 (SEQ ID NO: 22), 2875 (SEQ ID NO: 18) und 2901 (SEQ ID NO: 19).
Die folgenden Daten beziehen sich auf eine Anzahl von Sonden, es wird jedoch geschätzt werden, dass die Erfindung auf jene Sonden und Sondensätze gerichtet ist, die oben aufgelistet sind. Im Verhältnis zu Beispiel 4 wird dies als eine Erläuterung bereitgestellt, wie die Sonden der Erfindung verwendet werden können.
BEISPIEL 1
Dot-Blot-Analyse des Sondenhybridisierungsverhaltens
Dot-Blot-Analyse in Übereinstimmung mit wohlbekannten Vorgehensweisen, schließt das Immobilisieren einer Nukleinsäure oder einer Population an Nukleinsäuren auf einem Filter wie Nitrozellulose, Nylon oder anderen derivatisierten Membranen ein, die leicht im Handel erhalten werden können. Jede DNS oder RNS kann so immobilisiert werden und nachfolgend für die Hybridisierung unter einer Reihe von Bedingungen (Stringenzen) mit Nukleotidsequenzen oder Sonden von Interesse getestet werden. Unter stringenten Bedingungen werden Sonden mit Nukleotidsequenzen mit einer großen Komplementarität zu dem Ziel einen höheren Hybridisierungsgrad zeigen als Sonden, deren Sequenzen eine geringere Homologie haben.
Sonden der vorliegenden Erfindung werden in einem Dot-Blot untersucht. Einhundert Nanogramm RNS werden durch Phenolextraktion und Zentrifugation durch Cäsiumtrifluoracetatgradienten gereinigt, denaturiert und auf eine Nylonmembran aufgetüpfelt. Sonden werden isotopisch durch die Zugabe einer ³²P-Phosphoreinheit zu dem 5'-Ende des Oligonukleotids durch die etablierte Polynukleotidkinasereaktion markiert. Hybridisierung der Sonden wird bei einer Temperatur von 60°C in der Anwesenheit von 1,08 M NaCl, 60 mM Natriumphosphat und 6 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7,4, durchgeführt. Unhybridisierte Sonde wird durch Waschen bei einer Salzkonzentration, die einem Drittel der Hybridisierungsbedingung entspricht, entfernt. Die Filter werden einem Röntgenfilm ausgesetzt und die Intensität der Hybridisierungssignale wird nach drei Stunden Autoradiographieaussetzen beurteilt.

Die folgende Tabelle 1 ist eine Zusammenfassung der Ergebnisse. P. damnosus-Sonden, die 16S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2858:	Alle P. damnosus-Stämme
Sonde 2861:	Alle P. damnosus-Stämme; ein Isolat von Lactobacillus
Sonde 2867:	Alle P. damnosus-Stämme

L. brevis-Sonden, die die 16S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2868:	Spezifisch für L. brevis. Diese Sonde verfehlte gewisse als L. brevis identifizierte Isolate; dies wird jedoch für eine ungenaue Identifikation gewisser Umgebungsisolate gehalten.
Sonde 2869:	Spezifisch für L. brevis.

Gruppe an P. damnosus- und L. brevis-Sonden die 16S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2904:

P. damnosus und L. brevis. Detektiert ebenfalls L. buchneri und andere verwandte Lactobacillus-Arten.

Alle Bierverderborganismen, die 16S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2873:	Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Stämme; alle bis auf ein Verderbisolat.
Sonde 2881:	Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Stämme. Detektiert ebenfalls viele grampositive Eubakterien.
Sonde 2887:	Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Stämme; alle Verderbisolate.

Gruppe der Mehrheit der Sonden für Pediococcus- und Lactobacillus-Arten, nehmen 165-rRNS zum Ziel

Sonde 2854:	Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Stämme, ebenfalls zwei Bacillus-Arten
Sonde 2879:	Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Stämme. Detektiert ebenfalls gewisse grampositive Bakterien.

Gruppe der Mehrheit der Pediococcus-Bierverderb-Organismen, Sonden, die die 23S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2876:	Die meisten Pediococcus-Stämme. Detektiert ebenfalls gewisse Lactobacillus-Isolate
Sonde 2877:	Die meisten Pediococcus-Stämme. Detektiert ebenfalls gewisse Lactobacillus-Isolate

L. brevis-Sonden, die die 23S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2880:	Spezifisch für L. brevis. Verfehlte einige als L. brevis identifizierte Isolate, dies kann jedoch an der ungenauen Identifizierung gewisser Umgebungsisolate liegen.
Sonde 2891:	Spezifisch für L. brevis.
Sonde 2892:	Spezifisch für L. brevis.
Sonde 2895:	Spezifisch für L. brevis.

Untergruppe an Sonden für die Gattung Lactobacillus, die 23S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2899:

Die meisten Lactobacillus-Arten. Möglicherweise etliche Pediococcus-Stämme.

Gruppe an P. damnosus- und L. brevis-Sonden, die 23S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2896:

P. damnosus und L. brevis. Detektiert auch wenige andere Lactobacillus-Arten.

Alle Bierverderborganismen, die 23S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2875:	Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Stämme, verfehlt einige Verderbisolate.
Sonde 2901:	Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Stämme, verfehlt einige Verderbisolate.

Gruppe der Mehrheit der Pediococcus-Stämme und Lactobacillus-Arten, die 23S-rRNS zum Ziel nehmen

Sonde 2902:

Mehrheit der Pediococcus- und Lactobacillus-Stämme. Ebenfalls etliche grampositive Eubakterien.

Die Ergebnisse des Dot-Blot-Assays werden unten als Tabelle 2 präsentiert. In dieser Tabelle gibt ++++ die stärksten beobachteten Signale an; +++ gibt ein starkes beobachtetes Signal an; ++ gibt ein etwas schwächeres aber eindeutig positives beobachtetes Hybridisierungssignal an; + gibt ein schwaches Signal an; +– gibt ein sehr schwaches, kaum detektierbares Signal an; – gibt an, dass kein Signal beobachtet worden ist. ND gibt an, dass dieser Test nicht durchgeführt worden ist. Falls eine Sonde stark an wenigstens ein Ziel bindet (entweder ++++ oder +++), jedoch eine schwache Hybridisierung (+ oder +–) mit einem zweiten Ziel zeigt, wird die Probe als im Wesentlichen nur mit den Zielen hybridisiert angesehen, welche die ++++- oder +++-Ergebnisse ergaben.
Tabelle 2 Dot-Blot-Hybridisierungsergebnisse von Pediococcus und Lactobacillus
Tabelle 2 (fortgesetzt) Dot-Blot-Hybridisierungsergebnisse von Pediococcus und Lactobacillus
Tabelle 2 (fortgesetzt) Dot-Blot-Hybridisierungsergebnisse von Pediococcus und Lactobacillus
Tabelle 2 (fortgesetzt) Dot-Blot-Hybridisierungsergebnisse von Pediococcus und Lactobacillus
Tabelle 2 (fortgesetzt) Dot-Blot-Hybridisierungsergebnisse von Pediococcus und Lactobacillus
Tabelle 2 (fortgesetzt) Dot-Blot-Hybridisierungsergebnisse von Pediococcus und Lactobacillus
Tabelle 2 (fortgesetzt) Dot-Blot-Hybridisierungsergebnisse von Pediococcus und Lactobacillus
Tabelle 2 (fortgesetzt) Dot-Blot-Hybridisierungsergebnisse von Pediococcus und Lactobacillus
BEISPIEL 2
Zweisondenhybridisierung
Für das Testen während des Brauvorgangs könnte die Detektion spezifischer Verderbnisorganismen unter der großen Breite normaler Brauereimikroflora am geeignetsten sein. Für diesen Typ an Sandwichassay sind die folgenden Fang- und Detektorsondensätze Beispiele bevorzugter Paare oder Sätze.
16S-rRNs von P. damnosus und L. brevis: Sonde 2904 + Sonden 2868 + 2861
Gruppe aller Verderb-l6S-rRNS: Sonde 2881 + Sonden 2873 + 2887
Gruppe der Mehrheit an Pediococcus- und Lactobacillus-165-rRNS: Sonde 2854 + Sonde 2879
23S-rRNS von P. damnosus und L. brevis: Sonde 2896 + Sonden 2880 + 2876
Gruppe aller Verderb-23S-rRNS: Sonde 2875 + Sonden 2901 + 2899
Gruppe der Mehrheit der Pedicoccus- und Lactobacillus-23S-rRNS: Sonde 2902+ Sonden 2875 + 2901.
BEISPIEL 3
Brauerei- und Endproduktdetektion von Bierverderborganismen
Eine Probe wie ein Abstrich oder eine flüssige Aliquote aus einer Flasche, Dose, einem Fass oder anderem Behälter wird bearbeitet, um DNS zu liefern. Eine Sonde dieser Erfindung wird in Verbindung mit dem antiparallelen Komplement einer zweiten Sonde dieser Erfindung verwendet, um enzymatisch ein Segment eines Zielorganismusgens, das Lactobacillus-rRNS kodiert, in einer Polymerasekettenreaktion zu amplifizieren. Resultierendes Material wird dann in einem Sandwichtest untersucht. Die Polymerasekettenreaktion selber kann entweder durch Nutzen der hierin beschriebenen Sonde/Primer hochspezifisch gemacht werden, oder die Reaktion kann unter Verwendung von Sonden, wie jene, die in der ebenfalls anhängigen US 5,401,631 (WO 90/15157) beschrieben sind, allgemeiner gemacht werden, und dann kann das Amplifikationsprodukt als ein Zielorganismus unter Verwendung eines Sandwichassays identifiziert werden.
Für das Endprodukttesten könnten allgemeiner gerichtete Sonden geeignet sein, da die meiste normale Brauereimikroflora entfernt worden sein sollte oder inaktiviert sein sollte. Für diesen besonderen Test sind die folgenden Fangdetektor- und Detektorsonden Beispiele bevorzugter Paare:
16S-rRNS von P. damnosus und L. brevis: Sonde 2904 + Sonden 2868 + 2861
Gruppe aller Verderb-l6S-rRNS: Sonde 2881 + Sonden 2873 + 2887
Gruppe der Mehrheit an Pediococcus- und Lactobacillus-l6S-rRNS: Sonde 2854 + Sonde 2879
23S-rRNS von P. damnosus und L. brevis: Sonde 2896 + Sonden 2880 + 2876
Gruppe aller Verderb-23S-rRNS: Sonde 2875 + Sonden 2901 + 2899
Gruppe der Mehrheit der Pedicoccus- und Lactobacillus-23S-rRNS: Sonde 2902+ Sonden 2875 + 2901.
BEISPIEL 4
In-situ-Hybridisierung als eine zytologische Färbung
Die Sonden dieser Erfindung können als ein zytologisches Färbungsreagens verwendet werden. Eine flüssige Probe wird auf einen Mikroskopobjektträger aufgetragen. Nach Fixierung und Lyse wird die Hybridisierung der Sonden in situ durchgeführt. Zum Beispiel wird die Sonde 2858 mit einer Fluoreszenzmarkierung markiert und verwendet, um das Muster anzufärben. Falls P. damnosus in der Probe vorhanden ist, werden kleine fluoreszierende Körper unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar sein.
BEISPIEL 5
Bestätigung der Anwesenheit eines Bierverderborganismus nach der Kultur
Nach einem Standardkultivierungsschritt für Pediococcus/Lactobacillus/Bierverderborganismen, wie auf modifizierten MRS-Agarplatten (Lawrence et al, 1979, J. Instit. for Brewing 85: 119) oder in einer Flüssigkulturanreicherung, wird eine Probe auf die Anwesenheit von Pediococcus/Lactobacillus/Bierverderborganismen untersucht. Ein Verfahren ist die Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Sandwichassays. Eine Reinkultur ist nicht notwendig.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleinsäuresonde, bestehend aus: (a) einer Nukleotidsequenz, die identisch oder vollständig komplementär ist zu mindestens einem Teil von zehn aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer beliebigen der Sonden 2904 (SEQ ID Nr. 13), 2896 (SEQ ID Nr. 14), 2873 (SEQ ID Nr. 15), 2881 (SEQ ID Nr. 16), 2887 (SEQ ID Nr. 17), 2875 (SEQ ID Nr. 18), 2901 (SEQ ID Nr. 19), 2854 (SEQ ID Nr. 20), 2879 (SEQ ID Nr. 21) oder 2902 (SEQ ID Nr. 22), und (b) wahlweise einem Detektions- oder Einfangliganden.
Nukleinsäuresonde nach Anspruch 1, worin der Detektions- oder Einfangligand Fluorescein, 32-P, Biotin oder ein Poly-Desoxyadenosin-Schwanz ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2904 (SEQ ID Nr. 13) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2896 (SEQ ID Nr. 14) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2873 (SEQ ID Nr. 15) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2881 (SEQ ID Nr. 16) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2887 (SEQ ID Nr. 17) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2875 (SEQ ID Nr. 18) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2901 (SEQ ID Nr. 19) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2854 (SEQ ID Nr. 20) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2879 (SEQ ID Nr. 21) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nukleotidsequenz der Sonde 2902 (SEQ ID Nr. 22) identisch oder zu dieser vollständig komplementär ist.
Satz an Nukleinsäuresonden, umfassend mindestens zwei Nukleinsäuresonden, von denen jede Sonde aus einer anderen der Sonden von Anspruch 1 oder 2 besteht.
Satz an Nukleinsäuresonden, umfassend mindestens zwei Nukleinsäuresonden, von denen jede aus einer anderen der Sonden nach einem der Ansprüche 3 bis 12 besteht.
Satz an Nukleinsäuresonden nach Anspruch 13, worin der Satz aus einem der Sondensätze besteht: 2904 (SEQ ID Nr. 13), 2868 (SEQ ID NR. 6) und 2861 (SEQ ID Nr. 2), 2896 (SEQ ID Nr. 14), 2880 (SEQ ID Nr. 8) und 2876 (SEQ ID Nr. 4), 2881 (SEQ ID Nr. 16), 2873 (SEQ ID Nr. 15) und 2887 (SEQ ID Nr. 17), 2875 (SEQ ID Nr. 18), 2901 (SEQ ID Nr. 19) und 2899 (SEQ ID Nr. 12), 2854 (SEQ ID Nr. 20) und 2879 (SEQ ID Nr. 21) oder 2902 (SEQ ID Nr. 22), 2875 (SEQ ID Nr. 18) und 2901 (SEQ ID Nr. 19).
Verfahren zum Detektieren von Lactobacillus oder Pediococcus als Bakterien in einer Bierprobe, das Verfahren umfassend die Schritte: In-Kontakt-Bringen einer Probe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Bildung eines detektierbaren Komplexes mit 165- oder 23S-rRNS oder -rDNS von Lactobacillus oder Pediococcus in der Probe, falls vorhanden, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, worin die Sonde keinen detektierbaren Komplex mit rRNS oder rDNS von nicht-Lactobacillus- oder nicht-Pediococcus-Bakterien unter den stringenten Hybridisierungsbedingungen bildet, und Detektieren des Komplexes als Anzeichen für Lactobacillus- oder Pediococcus-Bakterien in der Probe.