JP2002017356A

JP2002017356A - ペクチネータス属菌検出のための核酸プローブ、およびその細菌に由来する核酸の検出方法

Info

Publication number: JP2002017356A
Application number: JP2000201258A
Authority: JP
Inventors: Yasuaki Motoyama; 靖朗本山; Takaomi Yasuhara; 貴臣安原; Kyoko Takahashi; 恭子高橋
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2000-07-03
Publication date: 2002-01-22

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ペクチネータス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）属菌
の検出、又は該細菌の同定、又は該細菌の定量方法の提
供。【解決手段】ビール混濁の原因となる微生物のrRNAもし
くはrDNAに優先的に結合する核酸配列が開示される。近
年最も注目されているビール混濁微生物は、ペクチネー
タス属細菌である。本発明において開示される核酸はペ
クチネータス属菌の存在の検出、又は同定、又は定量す
るためのアッセイにおいて用いることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビール混濁菌であるペ
クチネータス（Pectinatus）属菌の検出、または該細菌
の同定、または該細菌の定量に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年のビールの生（なま）化への流れ
は、ビール鮮度という新たな価値観をもたらした。こう
した背景から、ビール製造会社にとっては、製品製造か
ら出荷までの時間が劇的に短縮するとともに、ビール混
濁菌の汚染を迅速に正確に判定する必要性が高まってい
る。偏性嫌気性菌である、ペクチネータス（Pectinatu
s）属菌は、ビール醸造技術の進展に伴う製品ビールの
嫌気度が高まるにつれ検出頻度が高まり、1990年代に入
り発生した幾つかの製品事故の原因菌として同定されて
いる。

【０００３】従って、食品業界特にビール業界において
使用できる、ペクチネータス属菌の迅速かつ選択的な検
出を可能とするのに十分特異的で感度の高い細菌診断試
験法を開発することは重要である。古典的なビール混濁
細菌の同定は、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試
験などの多くの性状ならびに生化学的試験を行い、最終
的に新鮮なビールに単離した細菌を再接種し、その増殖
能の観察を行うことにより決定した。これらの一連の操
作は、多くの時間と労力を要すると同時に正確な判定も
困難な場合が多かった。また、最近では、ペクチネータ
ス属菌のより迅速な検出・同定法についてはいくつか検
討されており、例えば抗原抗体反応を利用したペクチネ
ータス属菌の検出法（J. Am. Soc. Brew. Chem.: 51(4)
158-163, 1993）やペクチネータス属菌からDNAを抽出
して特定のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR
（Polymerase Chain Reaction）を行い、標的配列を増
幅させた後、ペクチネータス属菌特有の核酸の有無を判
定する方法（特表平09-820071）がある。

【０００４】しかし、これらの方法は抗原、または標的
核酸が存在すれば陽性に判定させるものであり、既にビ
ール生育性がないか、もしくは活性の著しく弱い細菌と
ビール生育能を依然として保持している細菌とを区別で
きない。また、PCR法で再現よく、十分な感度を得るに
は、必要最小量の細菌核酸を獲得するための適当な培養
と核酸抽出ならびに遺伝子増幅という予備工程を必要と
する。なぜならば、細菌の核酸量は極めて微量であり、
非常に低濃度の核酸は効率よく抽出できないこと、また
は標的核酸は１細菌ゲノムあたり数コピーでしか存在し
ないからである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本願出願人は
ペクチネータス属菌の特異的な配列を利用し、この核酸
配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、ペクチネ
ータス属菌のみを特異的に検出・同定する方法を特願平
11-329428にて開示した。しかしながら、上記の方法で
利用している16S rRNAもしくは16S rDNAの核酸配列は、
細菌間で保存性が高い領域であることが知られている。
従って、この領域から選択された核酸配列に相補的なオ
リゴヌクレオチドを用いた場合、検出したい特定の微生
物以外の微生物も誤って検出してしまうという可能性は
否定できない。

【０００６】一方、分類学的かつ系統学的観点から23S
rRNAもしくは23S rDNAは、16S rRNAもしくは16S rDNAと
比較してより多くの種に関する情報を含んだ領域である
(System. Appl. Microbiol. : 15, 487-501, 1992)。
従って、この領域から設計された核酸配列に相補的なオ
リゴヌクレオチドは、ペクチネータス属菌に極めて特異
的な核酸配列である。しかしながら、ペクチネータス属
菌の23S rRNA遺伝子の塩基配列は、ペクチネータスフ
リシンゲンシス（P. frisingensis）のみ公開されてお
り (System.Appl.Microbiol. : 15, 487-501, 1992)、
ペクチネータスセルビシフィラス（P. cerevisiiphilu
s）の23S rRNAの塩基配列は公開されていなかった。従
って、ペクチネータスフリシンゲンシスのみに存在す
る特異的な塩基配列を検討する場合、ペクチネータス
フリシンゲンシスに進化近縁的に最も近い種ペクチネー
タスセルビシフィラスの同領域との相同比較を行なわ
なければ、各々の種に特異的な塩基配列の設計は不可能
であった。

【０００７】従って、本発明の目的は、ペクチネータス
セルビシフィラスの23S rRNAの塩基配列を提供するこ
とである。本発明の別の目的は、上記で挙げた欠点を、
特異性、感度および速度を併有する核酸ハイブリダイゼ
ーション下においてアクセス可能とされ得る標的領域に
ハイブリダイズすることができる核酸オリゴヌクレオチ
ドを提供することである。本発明の別の目的は更に、適
当なトレーサーで標識したこれらのオリゴヌクレオチド
をプローブとして機能させて、ハイブリダイゼーション
を行い、当該細菌を選択的に検出同定ならびに定量する
方法を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、配列
番号１に示される塩基配列の一部または全部を含むペク
チネータスセルビシフィラスの23S rRNAをコードする
遺伝子の遺伝子配列である。これにより、ペクチネータ
スセルビシフィラスの23S rRNA遺伝子とペクチネータ
スフリシンゲンシスの同遺伝子との相同比較において
各々種に特異的な核酸配列を見いだした。すなわち本発
明はまた、ペクチネータスセルビシフィラスとペクチ
ネータスフリシンゲンシス各々種特異的な核酸配列に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列表の配列番号２〜13
および14〜25）である。

【０００９】さらに本発明は、ペクチネータス属菌の23
S rDNAならびに23S rRNAを標的とする配列であって、該
オリゴヌクレオチドが配列表の配列番号26〜34の少なく
とも１つを有するか、または対応する相補鎖を有するこ
とを特徴とする一本鎖オリゴヌクレオチドである。本発
明において、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴヌ
クレオチド断片」は天然の（または所望により修飾され
た）核酸の情報配列によって特徴づけられ、かつ天然の
核酸と同様に、予め定めた条件下で、相補的または実質
的に相補的なヌクレオチド断片とハイブリダイズ可能で
あるヌクレオチド単位の鎖を示す二つの同義用語であ
る。その鎖は天然の核酸とは異なる構造のヌクレオチド
単位を含みうる。例えば、オリゴヌクレオチドの構成単
位である核酸が天然に存在する核酸に見られるホスホジ
エステルでなく、他のエステル結合、またはアミド結合
（一般にＰＮＡと呼ばれる）で結合したものであって、
標的領域にハイブリダイズできるものであるばよい。オ
リゴヌクレオチド（または、ヌクレオチド断片）は、例
えば、100までのヌクレオチド単位を含みうる。一般に
は、少なくとも10個のヌクレオチド単位を含み、天然の
核酸分子から、または遺伝子組換えによって、または化
学合成によって得ることができる。

【００１０】「ハイブリダイゼーション」は、適切な条
件下で、十分に相補的な配列を有するヌクレオチド断片
同士が、安定かつ特異的な水素結合によって結合して二
本鎖を形成することと理解される。ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は、「ストリンジェンシー」すなわち反応条
件の厳しさによって決定される。ハイブリダイゼーショ
ンを行うときのストリンジェンシーが高いほど、特異性
は高い。つまり、適切なハイブリダイゼーション条件と
は、特にプローブ／標的二本鎖の塩基組成、ならびに２
個の核酸の間の不一致度から決定され、ハイブリダイゼ
ーション溶液に存在するイオン種の濃度および種類、変
性剤の性質および濃度、またはハイブリダイゼーション
温度などのハイブリダイゼーション反応パラメーターの
関数として表現される。ハイブリダイゼーション反応を
行うときの条件のストリンジェンシーは、特に、使用す
るプローブに依存する。これら全てのデータは周知であ
り、適切な条件は、通常の技術者の能力の範囲内におい
て、ルーチン実験により各ケースで決定され得る。

【００１１】また、「相同である」とは、２個またはそ
れ以上の核酸配列間の類似の度合いを表すことを意味
し、生物間の分類学的な類似度合いを意味するものでは
ない。類似の度合いはパーセンテージで表し、例えば２
個の配列間が90％相同であるとは、第１の配列の塩基の
90％が第２の配列の塩基と同一にマッチすることを意味
する。

【００１２】「プローブ」は、決められた条件下でハイ
ブリダイゼーション特異性を有して、本発明の場合は、
リボソームＲＮＡ、またはリボソームＤＮＡ（ｒＤＮ
Ａ）に含まれるヌクレオチド配列を有する標的核酸とハ
イブリダイゼーション複合体を形成する、例えば、10〜
100 個のヌクレオチド単位、特に12〜35個のヌクレオチ
ド単位を含むヌクレオチド断片である。プローブは、検
出、同定、定量目的に使用することができる。例えば、
放射性同位体、酵素、特に、色素原性、蛍光性または発
光性基質に作用し得る酵素（特に、ペルオキシダーゼま
たはアルカリホスファターゼ）、色素産生化学化合物、
色素原性、蛍光性もしくは発光性化合物、ヌクレオチド
塩基の類似体およびビオチンなどのリガンドから選択さ
れるマーカーによって標識できる。

【００１３】「プライマー」は、例えば10〜100 ヌクレ
オチド単位を含み、かつ例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連
鎖反応）などの増幅法、配列決定プロセス、逆転写法な
どにおける酵素的重合の開始のための決められた条件下
でハイブリダイゼーション特異性を有するオリゴヌクレ
オチドである。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、サ
ンプル中の標的核酸の有無の試験において、公知の全て
のハイブリダイゼーション技術、特に「ドット−ブロッ
ト」と呼ばれるフィルター上での点付着の技術（MANIAT
IS ら、Molecular Cloning，ColdSpring Harbor，198
2)、「サザンブロット」と呼ばれるＤＮＡ移動の技術
（SOUTHERN E.M.，Mol．Biol.，98，503(1975)）、「ノ
ーザンブロット」と呼ばれるＲＮＡ移動の技術に従って
使用することができる。

【００１４】本発明によれば、（１）他の種と比較し
て、ペクチネータス・セルビシフィラス（P.cerevisiip
hilus）と優先的にハイブリダイズする；（２）他の種
と比較して、ペクチネータス・フリシンゲンシス（P.fr
isingensis）と優先的にハイブリダイズする；（３）他
の属と比較して、ペクチネータス属菌（P.frisingensi
s、P.cerevisiiphilus）に優先的にハイブリダイズす
る、約10〜100のヌクレオチド断片が提供される。本発
明のヌクレオチド断片は、ビールの混濁の原因となる生
物の存在を検出するために有用である。上記ヌクレオチ
ドの少なくとも10個の連続した核酸に対して相補的であ
るか、またはそれと少なくとも90％相同であるプローブ
もまた、本発明事項に含む。本発明の１つは、ビール混
濁菌の23SｒRNAまたはｒDNAの領域に対して相補的であ
るか、またはそれにハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドおよびプローブについてである。詳しくは、その核
酸は配列番号１〜34に示すプローブ群により定義される
配列の群から選択される配列中のいずれか10個の連続し
たオリゴヌクレオチドを含む配列の少なくとも90％に対
して相同的であるかまたはそれと相同である。具体的に
は、（１）の核酸は、配列番号２〜13のいずれかの、
（２）の核酸は配列番号14〜25のいずれかの、（３）の
核酸は配列番号26〜34のいずれかの、オリゴヌクレオチ
ドである。

【００１５】本発明のもう一つは、ビール混濁細菌の存
在を検出する方法である。この方法は、標的細菌を含ん
でいる疑いのあるサンプルを少なくとも１種類の核酸と
接触させる工程を含む。この核酸は、（１）ペクチネー
タス・セルビシフィラスの；（２）ペクチネータス・フ
リシンゲンシスの；３）ペクチネータス属菌（P.frisin
gensis、P.cerevisiiphilus）の；rRNAまたはｒDNAと優
先的にハイブリダイズする約10〜100ヌクレオチドを有
する。この方法は、核酸プローブが標的ｒRNAまたはｒD
NAと優先的に結合して核酸複合体を形成するようにハイ
ブリダイゼーション条件を試料に付与し、そして標的生
物（１または２以上）の存在を指示するものとして複合
体を検出する工程を含む。好ましくは、本核酸プローブ
は配列番号１〜34に示すプローブ群により定義される配
列の群から選択される配列中のいずれか10個の連続した
オリゴヌクレオチドを含む配列の少なくとも90％に対し
て相同的であるかまたはそれと相同である。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明のプローブは、ビール及び
ビール製造途中の半製品または、ビール醸造場や下水な
どの環境下から採取された試料中のビール混濁生物の特
異的検出のための核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
開発の基礎を提供する。本発明プローブはまた、ビール
混濁菌の存在を確認するための基礎を提供する。本発明
のプローブの開発に際して最初にとられたステップは特
異的核酸プローブに対して、標的とするビール混濁菌の
23S rRNA内の特有な領域を同定することであった。これ
は、23S rRNA内のどの標的領域が、（１）ビール混濁の
原因となるペクチネータス・セルビシフィラスの；
（２）ペクチネータス・フリシンゲンシスの；３）ペク
チネータス属菌（P.frisingensis、P.cerevisiiphilu
s）の；に対して特異的であるかを見いだすことであっ
た。そこで、これらの実現のためペクチネータス・フリ
シンゲンシスならびにペクチネータス・セルビシフィラ
スの23SｒDNAの配列を公知の実験プロトコールにより決
定し、ビール混濁菌として知られるラクトバシルス（La
ctobacillus）属菌、または大腸菌（E.coli）を含む他
の細菌23S rDNAの配列と比較した。なお、ペクチネータ
ス・セルビシフィラスの23SｒRNAの配列は本発明者らが
初めて明らかにした。その配列を配列表の配列番号１に
示す。この結果を基に、（１）ビール混濁の原因となる
ペクチネータス・セルビシフィラスの；（２）ペクチネ
ータス・フリシンゲンシスの；３）ペクチネータス属菌
（P.frisingensis、P.cerevisiiphilus）の；に対して
特異的なプローブを配列番号２〜34のごとく設計した。
具体的には、（１）の核酸は、配列番号２〜13のいずれ
かの、（２）の核酸は配列番号14〜25のいずれかの、
（３）の核酸は配列番号26〜34のいずれかの、オリゴヌ
クレオチドである。

【００１７】本発明のプローブはfluorescence in situ
hybridization（以下FISHと略す）に用いることができ
る。ビール及びビール製造途中の半製品または、ビール
醸造場や下水などの環境下から採取された試料を、遠心
分離またはビール混濁細菌を捕捉可能なメンブレンフィ
ルター処理し、試料中に存在するかもしれない標的ビー
ル混濁菌と検出プローブとを適切なハイブリダイゼーシ
ョン条件下で接触させる。検出プローブは標的細菌内の
細胞質内に侵入し、そこに存在する23S rRNA内の標的部
位に適切なハイブリダイゼーション条件下でアクセス
し、ハイブリダイズする。この際に、検出プローブを、
³²Ｐなどの放射性同位元素、FITC（Fluorescein isothi
ocyanate）、TRITC (Tetramethylrhodamin isothiocyan
ate)、CyDye（登録商標）などの蛍光物質、ビオチン、D
IG (Digoxigenin) などの化学発光物質等のトレーサー
標識をすることで特異的なハイブリダイゼーションの現
象を適当な手法によってモニタリングすることができ
る。たとえば、検出プローブが放射性同位元素で標識さ
れている場合にはオートラジオグラフィー等の方法によ
ってアッセイを実施し、蛍光物質で標識されている場合
には蛍光顕微鏡等でアッセイを実施し、化学発光物質で
標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やCC
Dカメラを用いたデジタル解析を実施し、標的生物の存
在の有無を判定することができる。上記で定義したオリ
ゴヌクレオチドはまた、公知の方法で耐熱性ポリメラー
ゼの存在下、ペクチネータス属菌、ペクチネータス属菌
の少なくとも１種の23S rDNAもしくは23S rRNAを増幅合
成するための特異的プライマーとして使用することがで
きる（ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲなど）。使用するプライマ
ーの組み合わせと適切な反応プラグラムの設定により、
目的とする核酸が増幅されるかどうかの結果から標的細
菌の存在の有無もまた判定可能である。

【００１８】

【実施例】本発明を下記実施例により説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。実施例１：FISH法によるビール混濁細菌の検出・同定ビール及びビール製造途中の半製品または、ビール醸造
場や下水などの環境下から採取された試料からの細菌の
捕集は以下の２つの手法を用いて行った。（１）遠心分離法による捕集供試サンプル50mlを遠心チューブに入れ、遠心分離（1
0,000×g、10分間、４℃）を行い、上清液を捨て細菌ペ
レットを回収後、さらに30mlのPBS溶液で同条件で遠心
分離し洗浄を行った。洗浄後、細菌ペレットを１ｍlの
固定液（４％w/vのパラホルムアルデヒドを含むPBS）に
再けん濁し、４℃で５時間固定した。細菌を固定後、さ
らに遠心分離により細菌細胞を２回洗浄処理後、適当量
の50％のエタノールを含むPBSに再けん濁し、FISHに供
する細菌液を得た。これらの細菌液をゼラチンでコーテ
ィングしたスライドガラス上に１滴のせ風乾後、70%エ
タノール液、続いて99%エタノール液中にそれぞれ２分
間静置し、脱水処理を行い、FISHに供する試験標本とし
た。FISHに用いるプローブは、5’端をFITC（Fluoresce
in isothiocyanate）標識した蛍光プローブを使用し
た。FISHは、50 pmolの蛍光プローブを含むハイブリダ
イゼーション液（0.9M NaCl, 0.05% SDS, 20mM Tris, 5
mM EDTA, 10％ホルムアミド, pH 7.6）20μlを上述した
試験標本に接触させ、高湿度を保ったチャンバー内で40
℃、２時間行った。洗浄は、以下の通り行った。42℃の
上述したハイブリダイゼーション液中に20分間、試験標
本を静置後、常温の滅菌蒸留水ですすぎ、余分な蛍光プ
ローブを除去した。このハイブリダイゼーションと洗浄
を終えた試験標本を風乾後、10μg/mlのDAPIを含む褪色
防止剤（Slow Fade（登録商標）；Molecular Probe社）
を用いて、全細胞を染色し、蛍光顕微鏡で観察した。

【００１９】（２）メンブレンフィルターによる捕集供試サンプル150mlをポリカーボネート製のメンブレラ
ンフィルター（直径47mm、孔径0.4μm）で吸引濾過した
後、50mlのPBSで２回洗浄した。続いて10 mlのハイブイ
ダイゼーションバッファー（0.9M NaCl, 0.05% SDS, 20
mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.6）で洗浄
し、FISHに供試した。 FISHは、50 pmolの蛍光プローブ
を含むハイブリダイゼーション液（0.9M NaCl, 0.05% S
DS, 20mMTris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.6）2
00μlをプラスチックシャーレに滴下し、この上に菌体
の捕捉されている面が上になるようにフィルターを接触
させ、高湿度を保ったチャンバー内で40℃、２時間行っ
た。洗浄は、以下の通り行った。ハイブリダイゼーショ
ンの終わったフィルターを吸引濾過装置にセットし、42
℃のハイブリダイゼーションバッファー100ml、続いて
常温のフィルター濾過した滅菌水50mlを用いて吸引洗浄
した。ハイブリダイゼーションと洗浄を終えたメンブラ
ンフィルターを無菌的に風乾後、無蛍光スライドグラス
上に細菌捕捉面を上にしてのせ、さらにこの面に直接10
μg/mlのDAPIを含む褪色防止剤（SlowFade（登録商
標）；Molecular Probe社）をのせ、全細胞を染色し、
カバーグラスでフィルターを覆い蛍光顕微鏡で観察し
た。観察画像を図１に示す。

【００２０】FITC標識した特異的プローブを用いてFISH
解析を行い、蛍光顕微鏡下で観察するとターゲットとな
る菌全体が蛍光を発しているのが見える。例えば、FITC
標識した配列番号14の相補鎖プローブを用いてin situ
ハイブリダイゼーションを行うと、図に示すようにPect
inatus frisingensisは蛍光標識されて検出されるが、
Pectinatus cerevisiiphilusは検出されない。上述した
２つの手法は完全に一致し、その結果、FISH法でのプロ
ーブの特異性は表１〜３の通りであった。ビールに混入
する可能性のある細菌と本発明に示すプローブとのFISH
による反応性は、 ○：反応性あり、×：反応性無しを
示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】

【表２】

【００２３】

【表３】

【００２４】また、複数のプローブを同時に用いる手法
もある。例えば、プローブ１とプローブ２を同時にFISH
解析に供試すると、プローブ１とプローブ２はそれぞれ
23SrRNA内の標的領域が異なるため、加算的にシグナル
の増強ができた。このように、本発明によって得たプロ
ーブを検出したい標的目標に応じて、組み合わせて用い
ることは有用であった。

【００２５】実施例２：FISH法によるペクチネータス属
菌の定量試料中のペクチネータス属菌の定量は下記の通り行っ
た。実施例１のごとく試料中の細菌を捕集する直前に、
バクトメーターを用いて直接計数管理した大腸菌を試料
中に添加し、FISH解析結果を分析することにより得た。
例えば、ペクチネータス・フリシンゲンシスに汚染され
たビールに対し、直接計数法によって管理した大腸菌
（Ｃ個）を混入させ、ペクチネータス・フリシンゲンシ
スの23S rRNAに特異的な配列番号14に示す蛍光標識プロ
ーブを用いて実施例１のごとくFISH解析を行った。得ら
れる蛍光画像から、図２のごとくDAPIに染まった菌数
（Ａ）とFITC標識された菌数（Ｂ）を決定し、ビール中
に存在したペクチネータス・フリシンゲンシスの数を推
定できる。すなわち、試験に供したビール中に存在した
ペクチネータス・フリシンゲンシス数（Ｎ）は以下の関
係式で表すことができる。

【００２６】Ｎ＝Ｂ×Ｃ／Ａ−Ｂまた、ペクチネータス属菌の他、複数の種の細菌によっ
て汚染された試料については、上述した大腸菌の代わり
に試料中に存在しない細菌をカウンター株として用いる
ことによって、特定のペクチネータス属菌の試料中の菌
数を推定できる。使用しようとするカウンター株が試料
中に存在するか否かは、ＰＣＲ法による判定から容易に
知ることができた。例えば、ペクチネータス・フリシン
ゲンシスとそれ以外の複数種の微生物に汚染されている
が、ペクチネータス・セルビシフィラスに汚染されてい
ないビール中のペクチネータス・フリシンゲンシス数を
知りたい場合を例をとり、以下に説明する。ペクチネー
タス・フリシンゲンシスを含む複数種の微生物汚染ビー
ルに対し、直接計数法によって管理したペクチネータス
・セルビシフィラス（Ｃ個）を混入させ、ペクチネー
タス・フリシンゲンシスの23S rRNAに特異的な配列番号
14に示す蛍光標識プローブとペクチネータス・セルビシ
フィラスの23S r RNAに特異的な配列番号２に示すロー
ダミンで標識したプローブの共存下に、実施例１のごと
くFISH解析を行った。得られた蛍光画像からローダミン
標識された菌数（Ａ）とFITC標識された菌数（Ｂ）を決
定し、汚染ビール中に存在したペクチネータス・フリシ
ンゲンシスの数の推定が可能であった。蛍光顕微鏡観察
により、蛍光を発しない細胞（大腸菌）と発する細胞
（P菌）の比率からP菌数を定量できる。例えば、Pectin
atus frisingensis単独に汚染された試料に10⁷個の大腸
菌を添加して回収した検体に対し、蛍光標識した配列番
号14の相補鎖プローブを用いてFISH解析を行った場合、
蛍光標識されない大腸菌1000個に対し、蛍光標識された
細胞（Pectinatus frisingensis ）が10個認められる
と、 Pectinatus frisingensisはもとの試料中に10⁵個
存在したことになる。

【００２７】すなわち、試験に供したビール中に存在し
たペクチネータス・フリシンゲンシス数（Ｎ）は以下の
関係式で表すことができる。Ｎ＝Ｂ×Ｃ／Ａここで、カウンター株の23S rRNAと特異的にハイブリダ
イズするプローブの標識物質は標的細菌特異的なプロー
ブの標的物質と識別できるものであれば良い。

【００２８】実施例３：ドットブロットによるペクチネ
ータス属菌の同定市販品として入手可能なニトロセルロース、ナイロン、
PVDF等のフィルター上に細菌試料から公知の手法により
抽出した核酸を固定化した。目的に応じて、プローブは
ベーリンガー・マンハイム社のDIGオリゴヌクレオチド
テイリングキットを用いて標識し、ハイブリダイゼーシ
ョンに供した。検出は、ベーリンガー・マンハイム社の
DIG発光検出キットを用い、その手順書に従って行い、
最終的にフィルターを適当な時間X線フィルムに露光
し、ハイブリダイゼーションシグナルの有無から、ペク
チネータス属菌の種の同定を行った。ドットブロットの
結果を表４〜６に示す。ビールに混入する可能性のある
細菌と本発明に示すプローブとのドットブロットハイブ
リダイゼーションによる反応性は、●：反応性あり、
○：反応性無しを示す。

【００２９】

【表４】

【００３０】

【表５】

【００３１】

【表６】

【００３２】

【配列表】 <110> Asahi Breweries Ltd. <120> A nucleic acid probe for detecting Pectinatus bacteria and a meth od for detecting beer turbidity bacteria <130> 2000-26P <160> 34 <210> 1 <211> 2926 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 1 aattaagcga ataagggcat atggtggatg ccttggcgcc aggagccgaa gaaggacgcg 60 gtaagctgcg aaaaggtacg gggaagagca agcatctatt gatccgtaca tatccgaatg 120 gggcaacccg gcagaagaag ttctgtcatc cgaaaggaag gtaaacccgg ggaactgaaa 180 catctaagta cccggaggaa aagaaatcaa acgagatacc caaagtagcg gcgagcgaaa 240 tgggaagaag cccaaaccgt accacttcgg tggtacgggg ttgaggaccg gcacaagtta 300 agtaacgttc agctgaatga cctggaaagg tcaggcatag gaggtaaaac ccccgtaggc 360 gaaggacggg acgtaatggc cgggatccag agtatcgcgg gacacgagaa accctgcgag 420 aagctggggg gaccaccctc caaggcaaaa tactacctgg cgaccgatag cgcatagtac 480 cgtgagggaa aggtgaaaag aaccccggaa ggggagtgaa atagaacctg aaaccgtatg 540 tctacaagca gtcgaagctc cgtaagagag cgacggcgtg cctattgaag aatgaaccgg 600 cgagttacat tatattgcga ggttaagtgg aagacacgga gccgaagcga aagcgagtct 660 taatagggcg gcaagtaata tggtgtagac ccgaaaccgc agtgatctat gcatgtccag 720 gttgaagcgc aggtaaaaat gcgtggagga ccgaacccgt gagtgttgaa aaactttggg 780 atgaggtgtg catagggggt gaaatgccaa tcgaacgcgg agatagctgg tactccccga 840 aatagcttta gggctagcct caagggaaga ttacagacgg tagggcactg atcaggcaag 900 ggggcgtaaa gcctgccgac cctagtcaaa ctacgaatgg ctgtaataaa tacttgggag 960 tcagactgcg agtgataaga cccgtagtcg aaagggaaac agcccagatc accggctaag 1020 gtcccaaatg ctgtgctaag tggaaaagga tgtaggactt cataaacaac caggatgttg 1080 gctcagaagc agccaccatt aaaagagtgc gtaatagctc actggtcgag aggctctgcg 1140 ccgaaaatga ccggggctca agcacagaac cgaagccgtg gcaggatata gcaatatata 1200 ctgggtaggg gagcatactg tatgcgatag aaggtgtacc gtaaggagca ttggagcgta 1260 cagcagagag aatgccggta tgagtaacga aaagaacagt gagaatctgt tccaccgaaa 1320 gcctaagggt tcctgggcaa cgctcgtcga cccagggtaa gccgggacct aagccgaggc 1380 acagagcata ggcgatggac aacaggcgaa aattcctgta ccgtttcaga tcgattgagc 1440 gaaggagtga cacagaaagc agtttgagcg cgcggatgga agagcgcgtc gaagccggta 1500 ggctgcatgg caggcaaatc cgccatgtga aaaggccgag aggtgataga taggcaaatc 1560 ttcggaggag ccgaattgaa acgagctacg ctgtctcgag aaaagctcct agcgagagaa 1620 gaagcgcccg taccaaaacc gacacaggta ggcgcggaga gaatcctaag gtgcgcggga 1680 caaccctcgt taaggaactc ggcaaaatat atccgtaact tcgggaaaag gatagccgca 1740 gctggtaaag cccatatggg tagagctgga ggcggtggca caagagaggc ccaagcgact 1800 gtttagcaca aacacaggtg cctgcgaaag agaaatctga cgtataggtg ctgacacctg 1860 cccggtgccg gaaggttaag aagaggagtc aggagcaatc cgaagccccg aattgaagcc 1920 ccggtaaacg gcggccgtaa ctataacggt cctaaggtag cgaaattcct tgtcgggtaa 1980 gttccgaccc gcacgaaagg tgtaacgact tgggcactgt ctcaacgagg gacccggtga 2040 aattgaaata cctgtgaaga tgcaggttac ccgcgactgg acagaaagac cccatggagc 2100 tttactgtaa cctggcattg atattcggta aataacgtac aggataggtg ggagactagg 2160 agacaggtgc gcaagtgcct gaggagtcat tgttgggata ccacccttta tttaacgggc 2220 atctaactgg aagagcaacg atcttcaaga cagtgccagg cgggcagttt gactggggcg 2280 gtcgcctccg aaagagtaac ggaggcgccc aaaggttccc tcagcgcggc cagaaatcgt 2340 gcaaagagtg caaaggcaga agggagcttg actgcgagac caacaagtcg agcaggtgcg 2400 aaagcagggc ttagtgatcc ggtggtaccg agtggaaggg ccatcgctca acggataaaa 2460 gctaccctgg ggataacagg ctaatctctc ccaagagtcc atatcgacgg ggaggtttgg 2520 cacctctatt tgggttttat cacatcctgg ggctggagca ggtcccaagg gttgggctgt 2580 tcgcccatta aagtggtacg tgagctgggt tcagaacgtc gtgagacagt tcggtccata 2640 tccatcgcgg gcgtaagaaa cttgaagggg gctgctccta gtacgagagg accggagtga 2700 cgaaccaatg gtgtaccaat tatcccgcca ggggtacagt tgggtagcta cgttcggaaa 2760 ggataaacgc tgaaagcatc taagcgtgaa acctgcctta agatgaggtt tcccagagcc 2820 gtaaggcttg gaaggcacct tgaataagac gaggcagata ggccgggagt agaagtacag 2880 taatgtacga agcggactgg tactaataag ccgagagctt aactta 2926 <210> ２ <211> 33 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 2 ggaccggcac aagttaagta acgttcagct gaa 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 3 aggcgaagga cgggacgtaa tggccgggat cca 33 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 4 cgtttcagat cgattgagc 19 <210> ５ <211> 22 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 5 cacagaaagc agtttgagcg cg 22 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 6 tgcatggcag gcaaatccgc catgtgaaa 29 <210>７ <211> 27 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 7 attgaaacga gctacgctgt ctcgaga 27 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 8 gagagaagaa gcgcccgtac caa 23 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 9 cagctggtaa agcccatatg ggtagagctg ga 32 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 10 agactaggag acaggtgcgc aagtgcctga gga 33 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 11 cctctatttg ggttttatca ca 22 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 12 ccagagccgt aaggcttgga aggcacct 28 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus <400> 13 agtagaagta cagtaatgta cgaa 24 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 14 ggactgacaa aaaggatgga acgtttaggc gaa 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 15 agccgaaagg cgggtcatcc gggtcagtat cca 33 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 16 cgttgtattt tgactgagc 19 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 17 cacagcaggc agctcgagcg cg 22 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 18 tgcagtaaag ggaaatccgt actgcaaa 28 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 19 atttgagcat gccacactgt cgagaa 26 <210>20 <211> 25 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 20 gagaaatgca gcgcccgtac ggcaa 25 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 21 caggctgtga agtccgaacg gacggagcgg ca 32 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 22 agacttggaa ttagaggcgc aagtctttaa gga 33 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 23 cctcgatgtc ggctcatcac a 21 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 24 ccagaacgca agtttggaag gcccct 26 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Pectinatus frisingensis <400> 25 agtggaagta tggtgacata tgaa 24 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatus frisingensis <400> 26 gaggactgac aaaaaggatg gaacgtttag gcgaatgacc 40 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatus frisingensis <400> 27 ctagcctcag ggaatattac agacggtaga gca 33 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatus frisingensis <400> 28 atggctgtaa taaaatactt gggag 25 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatus frisingensis <400> 29 aagccgtggc aggatataga aatatatact gggtaggg 38 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatus frisingensis <400> 30 gcatacttgt atgcgactga aggtgtaccg taaggagcat 40 <210>31 <211> 27 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatus frisingensis <400> 31 agaggcagac ggtggcacaa gagaggc 27 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatus frisingensis <400> 32 aagaagagga gtcaggagca atccgaagcc ccgaattg 38 <210> 33 <211> 31 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatus frisingensis <400> 33 acctggcatt gatattcggt aaatgacgta c 31 <210> 34 <211> 38 <212> DNA <213> Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatus frisingensis <400> 34 aacgggcatc taactggaag agcaacgaac ttcaagac 38

【図面の簡単な説明】

【図１】 Fluorescence in situ hybridization法によ
るPectinatus属菌の検出を示す蛍光顕微鏡図。

【図２】蛍光顕微鏡によるPectinatus属菌の定量を示
す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｍ 1/40 Ｂ 1/40 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｑ 1/06 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/06 (Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者高橋恭子茨城県北相馬郡守谷町緑１−１−21 アサヒビール株式会社酒類研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA11 CA01 CA09 CA11 GA19 HA14 4B029 AA07 AA09 AA23 BB20 FA03 FA09 FA11 HA06 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ50 QQ54 QR08 QR31 QR56 QR62 QR84 QS03 QS12 QS13 QS16 QS24 QS34 QS36 QX01 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１に示される塩基配列の
一部または全部を含むペクチネータス・セルビシフィラ
ス（Pectinatus cerevisiiphilus）の23S rRNAをコー
ドする遺伝子の遺伝子配列。
【請求項２】ペクチネータス（Pectinatus）属菌に属す
るペクチネータス・セルビシフィラス（P.cerevisiiphi
lus）属菌を選択的に検出するため、ペクチネータス属
菌の23SrDNAならびに23S rRNAを標的とする配列であっ
て、該オリゴヌクレオチドが配列表の配列番号２〜13の
少なくとも１つを有するか、または対応する相補鎖を有
することを特徴とする一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３】ペクチネータス（Pectinatus）属菌に属す
るペクチネータス・フリシンゲンシス（P. frisingensi
s）属菌を選択的に検出するため、ペクチネータス属菌
の23S rDNAならびに23S rRNAを標的とする配列であっ
て、該オリゴヌクレオチドが配列表の配列番号14〜25の
少なくとも１つを有するか、または対応する相補鎖を有
することを特徴とする一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４】ペクチネータス（Pectinatus）属菌を選択
的に検出するため、ペクチネータス属菌の23S rDNAなら
びに23S rRNAを標的とする配列であって、該オリゴヌク
レオチドが配列表の配列番号26〜34の少なくとも１つを
有するか、または対応する相補鎖を有することを特徴と
する一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５】請求項１〜４に記載されたオリゴヌクレオ
チドの配列群より選択される配列中のいずれか10個の連
続したヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチドを
含むかまたは少なくとも90％相同であることを特徴とす
る一本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】トレーサーで標識されていることを特徴と
する請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレ
オチド。
【請求項７】固体支持体上に固定化されていることを特
徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴヌ
クレオチド。
【請求項８】試料から細菌を捕集する工程と、請求項１
〜６のいずれか１項に記載のものから選択されるオリゴ
ヌクレオチドである１つまたは複数の核酸プローブと、
適当なハイブリダイゼーション条件下に接触させる工程
と、該プローブとサンプルの核酸との間のハイブリダイ
ゼーション複合体の形成の有無を測定する工程からなる
ことを特徴とするペクチネータス属菌の検出方法。
【請求項９】試料から細菌を捕集する工程と、請求項１
〜６のいずれか１項に記載のものから選択されるオリゴ
ヌクレオチドである１つまたは複数の核酸プローブと、
適当なハイブリダイゼーション条件下に接触させる工程
と、該プローブとサンプルの核酸との間のハイブリダイ
ゼーション複合体の形成の有無を測定する工程からなる
ことを特徴とするペクチネータス属菌の同定方法。
【請求項１０】細菌を捕集する方法が、遠心分離法また
はメンブランフィルター捕集法のいずれかである、請求
項８記載のペクチネータス属菌の検出方法。
【請求項１１】細菌を捕集する方法が、遠心分離法また
はメンブランフィルター捕集法のいずれかである、請求
項９記載のペクチネータス属菌の同定方法。
【請求項１２】ハイブリダイゼーション複合体の形成の
有無を測定する方法が、FISH法（fluorescence in situ
hybridization）、ドット−ブロット法、サザンブロッ
ト法、ノーザンブロット法のいずれかである請求項８記
載のペクチネータス属菌の検出方法。
【請求項１３】ハイブリダイゼーション複合体の形成の
有無を測定する方法が、FISH法（fluorescence in situ
hybridization）、ドット−ブロット法、サザンブロッ
ト法、ノーザンブロット法のいずれかである請求項９記
載のペクチネータス属菌の同定方法。
【請求項１４】数的に管理した対照細菌を試料中に意図
的に混入させる工程と、請求項１〜６のいずれか１項に
記載のものから選択されるオリゴヌクレオチドである１
つまたは複数の核酸プローブと、適当なハイブリダイゼ
ーション条件下に接触させる工程と、該プローブとサン
プルの細菌の核酸との間のハイブリダイゼーション複合
体の形成の有無を測定する工程と、複合体形成のあった
細菌と対照細菌の数から細菌の数を推定することを特徴
とするペクチネータス属菌の定量方法。
【請求項１５】ハイブリダイゼーション複合体の形成の
有無を測定する方法がFISH法（fluorescence in situ h
ybridization）である請求項１４記載のペクチネータス
属菌の定量方法。
【請求項１６】請求項１〜５のいずれか１項に記載のオ
リゴヌクレオチドをポリメラーゼ存在下での核酸増幅の
ためのヌクレオチドプライマーとして使用する方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法で増幅させた核
酸を、電気泳動法および核酸染色法により検出する方
法。