WO2002095651A2 - Verfahren für biochemische nachweise von analyten - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for the detection and / or quantification of molecules from a sample on an analysis medium formatted with digital data code, a detection reaction causing a change in the code words which can be read and interpreted sequentially in the predetermined format.
  • Microarrays are one way of analyzing a large number of biological molecules.
  • Microarray technology in which many different biomolecules such as DNA or proteins are packed tightly in a predefined pattern on a substrate surface, has meanwhile become the standard method for the parallel analysis of biological samples. This technology is e.g. used in the analysis of gene expression, in genetic diagnostics, in biological and pharmaceutical research and for the determination of genetically manipulated organisms in the food industry.
  • biochemical sensor molecules such as DNA or proteins are applied to metal, glass, membrane or plastic surfaces, in particular polycarbonate supports. After contact with the applied sample, a detection of the molecular interaction and usually also a statement about the bound amount and / or about the strength of the interaction is made possible.
  • the bonds are mostly detected by generating and detecting an optical signal.
  • a microscope or a functionally similar device, in particular a CD reading head, is usually used (WO00 / 26677, WO00 / 36398).
  • image evaluation which in the case of higher density microarrays is typically carried out by computer software after an analog-to-digital conversion.
  • the information about a successful or non-successful binding at a certain point is marked by the deposition of granules (beads) at the location of the reaction of the analyte with the carrier-bound sensor molecule (e.g. EP918885 and Taton, Mirkin, Letsinger, Science 289 : 1757-1760 (2000)).
  • beads bound in this way are either identified directly as bodies or they bring about a chemical reaction such as a color change or dye precipitate. These are mainly verified using photometric methods. A combination of camera and microscope is used to generate data that is evaluated by an image analysis in the computer.
  • the aim of the present invention is to provide a quick and simple method for analyzing and detecting analytes, which enables a reliable interpretation of the results according to defined criteria and a quantitative statement.
  • the invention proposes a method with the features mentioned in claim 1. Developments of the invention are the subject of Subclaims, the wording of which, like the wording of the abstract, is made by ' reference to the content of the description.
  • the above-mentioned aim is achieved according to the invention by a method in which a molecular interaction at a specific point on the carrier leads to the generation of detectable structures, here referred to as signaling elements, which are in the context of the format defined in the form of a digital data code on the Analyzer carrier can be read and interpreted.
  • Detection fields with the sensor elements required for the respective detection as well as further data structures in a digital format are applied to the analysis carrier and combined into sequences of format structures which can be interpreted without any doubt as code words.
  • this is applied to the analysis carrier and a conversion of the digital signal level in the respective detection fields is initiated with the help of a signaling element.
  • one code word is exchanged for another code word that is permitted within the set of valid code words.
  • the statement about a successful or non-successful reaction is based on a comparison of the respective format structures before and after the proof.
  • the exemplary embodiments are a CD, a magnetic card, an optical card and a barcode card.
  • the method according to the invention has the advantage over known methods that an elaborate two-dimensional image analysis is unnecessary due to the digital data acquisition.
  • the creation of a digital information structure eliminates the complicated and error-prone analog signal processing. A reliable interpretation of the results according to defined criteria is made possible.
  • the analysis support and the reading device which is made up of common components from the consumer goods industry, can be easily coordinated with one another depending on the question, so that different tests can be developed and produced quickly and inexpensively in mass production.
  • Fig. 1 A) Schematic representation of an exemplary sequence of format elements on an analysis carrier, which consists of empty fields 5, address fields 6 (gray squares) and detection fields 7 (white squares) and forms a track. The lead-in area 8 serves to search for the track while reading and to start; B) Before the proof, the sequence of format elements represents code word A; C) After the proof has been provided, the sequence of format elements shown can represent the word A if there was no reaction (L), or the code word B if there was a reaction (II.).
  • the binary code words A and B differ by an exchange of a signal level in the fourth position, which corresponds to a detection field.
  • Fig.2 A) In a schematic representation, the simplest embodiment of the analysis carrier 1 with an exemplary linearly sketched track 2 of format elements and an inlet area 8; B) In a schematic representation, a further design option of the analysis carrier 1 with a track 2 of format elements and an inlet area 8, an optional center hole 3 for the
  • Fig. 3 Schematic representation of an analysis carrier 1 with several tracks arranged in parallel, which consist of rows of detection, information and empty fields.
  • An exemplary filling of the analysis carrier 1 by means of a microfluidic plate 9 with sensor elements or analyte solutions through microchannels 10 embedded in the carrier or otherwise spatially arranged is shown.
  • 4 Schematic representation of a detection according to Example 1.
  • a binding reaction between a sensor element 34, here an antibody, applied to the analysis carrier 1 and an analyte molecule 12, here a protein, from the sample is shown.
  • the detection is carried out in a sandwich immunoassay with the aid of a second antibody 11 which is directed against another epitope of the protein.
  • a colloidal gold particle 13 coupled to the second antibody leads to the deposition of a silver grain 14, which serves as a signaling element.
  • Fig. 6 Signaling elements using the example of polystyrene beads of 1 ⁇ . Diameters that are detected by two different methods and interpreted in binary. A) An image taken by a CD reading head; B) the same beads recorded with fluorescence microscopy; C) three-dimensional representation of the data from A), which can be interpreted in binary form.
  • Fig. 7 A) Simplified schematic representation of an optical system, which represents a conventional CD reading head, for the detection of the reflection signal, consisting of laser (L) 25, detector for focus control and signal detection (D F)
  • the analysis carrier 1 with mirroring 30 is shown in the side view in the beam path; B) Simplified schematic representation of an optical system for the detection of the transmission signal, consisting of a CD pickup of example A), the actual detector for transmission measurement (D) 26 and possibly an additional focusing device 31.
  • the analysis carrier 1 with mirroring 30 is in the Side view in the beam path between the focusing devices 28 and 31 shown.
  • Fig. 8 Schematic representation of an analysis carrier on which the detection fields are applied as parallel strips in such a way that they can be read out with a barcode reader.
  • the individual detection fields 23 are larger Detection areas arranged in the form of test strips 22. They can be accommodated in a test unit together with address fields 21, which contain information on test specifications, encodings (dongle) or product identification, for example. After a detection reaction with analytes from different samples 1 and 2, there are different patterns of signaling elements on the
  • Test strips that can be read with a barcode reader can consist of several detection fields 24, which are arranged orthogonally to the main reading direction and can contain, for example, series of concentrations.
  • Fig. 9 Image of fine lines in the micrometer range, which an antibody antigen
  • the present invention encompasses the following essential components which, in interaction, constitute the advantageous use of the method according to the invention:
  • An analysis carrier consisting of a base carrier and blank, information and verification fields applied to it, which are formatted in a digital data code;
  • the analysis medium is formatted with a defined digital data code.
  • the format is determined by the choice of the specific technical implementation and the detection system used or the reader in general.
  • the format is determined, for example, by the respective characteristics of pits and lands in CD technology, "high” and “low” levels in digital electronics, sound and pause in morse code, etc.
  • the detection systems known from CD technology e.g. a defined geometry, length and arrangement of pits and lands on an optical disc, according to the Red Book standard from Philips, the respective format.
  • the coding describes the set of rules according to which the information is evaluated.
  • a code is the sum of all valid code words, whereby each code word is defined by a unique sequence of the specified format structures. Coding generally contains additional regulations, such as redundant error-correcting information, such as the formation of a checksum or interleaving, as prescribed, for example, by the Red Book standard in the CD industry.
  • a binary code is given by a certain sequence of "0" and “1" levels (or “High” and “Low” levels) of a defined length.
  • the binary code consists of sequences of format structures, which are defined by format elements "empty fields” and “information fields” (FIG. 1A) with specific signal levels and signal lengths.
  • Information fields can be address fields or verification fields.
  • sequences of format elements form one or more tracks on the analysis carrier.
  • a track is divided into four different partial areas (FIG. 1A):
  • Blank fields The interruptions are essential to determine the position of the detection field to be read out by counting or by addressing.
  • the empty fields have a constant level ("0" or "1") and a variable length.
  • the address fields have a constant level ("1" or "0") and can have different lengths.
  • the address fields and the empty fields have inverse levels. If the empty fields have a "0" level, the level of the address field is "1" or vice versa.
  • the sensor elements are applied here.
  • the detection fields are characterized by a variable level ("0" or “1") and can have different lengths.
  • a change in level from “0” to “1” or from “1” to “0” on a detection field indicates that the analyte has been detected (see below). All conceivable defined arrangements of format elements in one or two dimensions are possible and are hereby part of the invention.
  • a basic idea of the present invention is to adapt the signaling elements on the detection fields to the specified format and to obtain the result of the respective biochemical detection from the comparison between the respective sequences of the format structures before and after the analysis carried out.
  • the vocabulary of the code consists of a limited number of code words with a predetermined length, which are composed of the format elements "empty fields" and "information fields” with defined levels and lengths. Each word can contain one or more fields of evidence. Undefined words are not allowed and are interpreted as errors by the interpreter software. A certain number of code words advantageously has no detection fields and is used, for example, to separate and / or address larger code blocks. By combining or lining up sequences of format elements, the number of tests carried out on a carrier can be easily scaled. To determine the result of the proof, a defined sequence of
  • Format elements two allowed code words A and B, which are characterized by the change in level differentiate from “0” to “1” or from “1” to “0” on at least one detection field (FIG. 1B).
  • the levels on the detection fields are such that the sequence of format elements represents code word A, for example.
  • a detection reaction results in an exchange of "0" for "1", or vice versa.
  • code word A is converted into code word B.
  • the respective sequence of format elements continues to represent code word A (FIG. IC). The result is interpreted by comparing the respective sequences of format structures before and after the analysis.
  • the morse code is implemented on the analysis medium by a predetermined sequence of "low” and “high” levels. Assume that the "Low” level is always 1 and is represented by the "0" symbol. In this example, it only serves as a separator.
  • the "high” level on the other hand, has either length 1 or 3 and is therefore represented by "1” or "111". Assume that code word A is defined by the sequence “1 0 1 1 1 0 1" and code word B by the sequence "1 0 1 0 1 0 1" (FIG. 1B).
  • Both words have the same total length 7, but the level in the fourth position, which is supposed to correspond to a detection field on the analysis carrier, is different.
  • a binding reaction on the detection field in the fourth position switches the "1" level to a "0" level at this point.
  • the permitted word A is converted into the permitted word B (FIG. IC).
  • the result of the proof results from the simple comparison between the starting word A given before the proof and the word read after the proof. If there is no reaction, word A is read ("test negative"), if there is a reaction, word B is read ("test positive”).
  • Another code word C or an undefined word would be recognized during the interpretation and identified as an error. This property of the method can advantageously be used as a quality control.
  • a format which is common in the consumer goods industry is preferably used on the analysis carrier according to the invention.
  • This can, for example, audio CD, optical disc, CD-R, CD-RW or MO (ECMA 154, ISO / IEC 10090), CD-ROM (ECMA 130, ISO / IEC 10149), DVD-R (ECMA 268, ISO / IEC 16449) or subsequent standards.
  • the invention is not limited to formats that use binary code. Other formats based on digital code systems are also conceivable and are therefore part of the invention.
  • Multi-dimensional codes such as two-dimensional bar codes
  • the use of such codes for biochemical detection can be advantageous because it enables parallel data processing, error correction and the acquisition of redundant information.
  • parallel data acquisition e.g. B. by means of a camera or CCD chips, advantageous because it allows the absolute positions to be determined and addressed once. This is in contrast to a serial readout, in which a position must be determined using brands, addresses or synchronization.
  • the analysis support can have an angular, round, oval or other two or three-dimensional shape.
  • a substrate is used as the carrier, which is similar in geometry and handling to the conventional magnetic card (FIG. 2A).
  • Magnetic and chip cards have found widespread use due to their practical size and easy handling. The main features are their robustness and the ability to accommodate a limited amount of information in a small space.
  • the magnetic card contains a linearly arranged data strip with a constant distance from one of its outer edges. In combination with the simple reader, this results in simple mechanical handling - the card can even be pulled by hand through a reader. Because magnetic cards are cheaply produced in large numbers and the readers are simple to manufacture, this embodiment of the invention allows the construction of readers which are orders of magnitude cheaper in production and easier to operate than known apparatuses for the detection of biological analytes.
  • magnetic storage media optical cards, a barcode card (FIG. 8) or combinations thereof can also be used as analysis media.
  • the external shape is not restricted to the usual card standards.
  • a classic CD Fig. 2D
  • its derivatives e.g. CD-R, DVD
  • Existing formatting of the format structures on the analysis carrier can be used with advantage, which eliminates the need for complicated and expensive reprogramming.
  • the detection area can be part of the support or applied to a separate additional support.
  • software In addition to the sensor elements, software, databases, signatures and other information such as e.g. Test specifications, protocols for
  • sequences of format elements on the analysis carrier form one or more tracks and the detection, information and empty fields are dimensioned in an equivalent way and each have an area of 5 ⁇ 5 ⁇ m 2 , in the example of the Morse code described above, a length of 35 ⁇ m is obtained for a test unit. If several such test units are arranged one behind the other, they form a track (FIG. 1A). With an assumed track length of 6 cm, a single analysis number of up to 2000 can be achieved in one track. It is possible to run up to 2000 different tests on one
  • FIG. 3 Several tracks of detection, information and empty fields per carrier arranged in parallel are possible (FIG. 3). This arrangement advantageously has an increase in the number of individual tests and a parallelization of the test execution and the reading of the test results
  • Polymer materials with various physico-chemical properties adapted to the analytical task but also glass, semiconductors, metals, metal alloys, ceramics, hybrid materials or combinations of these materials can be used as the carrier material.
  • supports made of glass, transparent plastics or polymer materials, in particular also optical quality polycarbonate, as used in the CD and DVD industry are used.
  • All substances that can be useful for biochemical or medical detection can serve as sensor elements. These include sugar, steroids, hormones, lipids, proteins, in particular mono- or polyclonal or recombinant Antibodies, peptides, antigens of all kinds, haptens, DNA, RNA as well as natural and artificial derivatives thereof, in particular aptamers and PNA, but also organic chemical agent libraries, such as those used in pharmacological research and development. Likewise, cells, microorganisms, viruses or parts thereof, membrane fragments, preparations and extracts from biological
  • the sensor elements of one type are each applied to defined detection fields with limited space.
  • the extent of the detection fields can be less than 10 ⁇ m in one or two dimensions, advantageously less than 2 ⁇ m and particularly advantageously less than 1 ⁇ m.
  • further molecules or signaling elements can be applied to adjacent detection fields, which are used for calibration or standardization of the analyzes.
  • the sensor elements can be connected covalently or noncovalently to the carrier surface or applied to the carrier surface.
  • the sensor elements can be applied mechanically to the analysis carrier, in particular by drop application, for example with the aid of inkjet printers (ink-jet printing) or printing needles (spotting), or by means of lithographic methods according to the prior art.
  • the wetting fields with the sensor elements can also be wetted by means of channels, preferably microchannels or microfluidic networks (FIG. 3).
  • the analysis carrier It is also possible to simply immerse the analysis carrier in a liquid bath containing the sensor elements after selective activation of detection fields or passivation of empty fields on a surface-activated carrier.
  • a spin coating process can also be used to ensure, for example, surface activation of the surface.
  • a material that is transparent for a specific light wavelength is used for the analysis carrier.
  • the light-guiding properties of the carrier can be used to couple or synthesize certain molecules at the predefined locations via the location-selective light guiding.
  • a synthesis controlled by electric fields directly on the carrier is also conceivable.
  • the covalent linkage of the sensor elements can be achieved, for example, by binding already existing or specially introduced amino, thio or phospho groups to an end group-functionalized silanized support surface.
  • biotinylated sensor elements can be specifically immobilized on the carrier surface by means of streptavidin coating.
  • a basic idea of the present invention is to adapt the physical parameters of the signaling elements, such as size, shape and signal level, to the format structure applied in the form of empty and address fields. This is in contrast to the usual procedure, in which a suitable format structure and devices are developed for the given signal.
  • the basic conditions such as positioning and dimensioning of the format elements and the signaling elements are predetermined by the coding.
  • electromagnetic effects pieo, resonance shift, change in capacitance, Hall effect, magnetic effects, electrical charge shift, etc.
  • Chemical processes such as silver deposition, oxide precipitation, oxidation or reduction of reagents, electroplating and the like can also be used for the detection.
  • Further chemical, physical or biological signal transmitters known to the person skilled in the art can equally be used and are therefore part of the invention.
  • a number of commercially available substances and bodies can be used as signaling elements, which can represent or form detectable structures. It can advantageously be microsphere (beads) (FIG. 6) in any shape and size, such as metal, magneto, silica or fluorescence-labeled beads, fluorescence or radioactive markers, and also molecular complexes or aggregates, layers of precipitates or dyes act.
  • silver granules are formed on an initiator coupled to analyte molecules, in particular an electron donor such as metal molecule or metal granules, at the site of the interaction, usually a bond (FIG. 4).
  • molecular complexes are formed in a reaction between two or more different binding partners, such as, for example, an avidin or streptavidin, and a further multiply biotinylated substance (FIG. 5).
  • Biological objects of a suitable size such as cells, bacteria, pollen, virus particles or parts thereof, can also be used advantageously as signaling elements.
  • the resulting detectable structure can also be generated by initiating a chemical reaction with another substance.
  • a further substance is applied to defined locations on the carrier.
  • the interaction between an analyte and the associated sensor element converts this substance into a detectable structure at the site of the reaction.
  • an enzyme coupled to the analyte such as horseradish peroxidase (HRP)
  • HRP horseradish peroxidase
  • the reaction is made possible either by a spatial approach between the enzyme and the substrate or by a release of the substrate into the solution during the interaction between the sensor element and the analyte or immediately afterwards.
  • the properties of the detectable structures in the form of signal-emitting elements which arise after an interaction between a sensor element and an analyte, and the resulting signal levels correspond to those specified on the carrier digital data format.
  • These structures can be dimensioned using various methods known to the person skilled in the art. For example, the stoichiometric ratios of the concentrations of substances used can achieve saturation in the formation of signaling elements, so that after the desired size has been reached, no further effective growth of the signaling element takes place.
  • the reactions leading to the formation of detectable structures can be blocked in a time-controlled manner. Blocking substances such as inhibitors in enzymatic reactions, competitors such as biotin in the example in FIG. 5, or substances which destroy free reactants, such as specific proteases, can be used for this purpose.
  • the concentrations of substances used can achieve saturation in the formation of signaling elements, so that after the desired size has been reached, no further effective growth of the signaling element takes place.
  • the reactions leading to the formation of detectable structures can be blocked
  • Detection reactions in a flow system so that the reactants involved can be rinsed out of the reaction sites with a buffer after an experimentally determined optimal reaction time, which is necessary for the formation of detectable structures with the desired dimensions. If catalytic reactions are involved, they can also be stopped by removing or blocking the catalyst. In light-dependent reactions, switching off the light source also leads to a controlled termination of the reaction.
  • Detection fields and signaling elements with dimensions smaller than 10 ⁇ m, in particular smaller than 2 ⁇ m and very particularly smaller than 1 ⁇ m are advantageously formed.
  • a downward limitation of the miniaturization is given only by the resolution of the detection unit.
  • detectable structures are created when there is an interaction between a sensor element and an analyte, which structures can be read and digitally interpreted in the data format previously applied to the carrier. In this way, the result can be interpreted directly as “test positive” or “test negative” by comparing the signals before and after detection in the context of the specified formatting.
  • a molecular interaction can be used to generate an additional signal as well as to
  • the appropriate contrast method ie the change in the signal level by the signaling element, must be selected depending on the standard protocol for the respective biochemical test, the measuring method and the analysis medium.
  • the window in front.
  • the window (“high”) can be generated on the detection fields by means of a local etching induced by a molecular interaction with the analyte and the associated resolution of the mirror layer ("low”). This method is comparable to the typical lithographic etching processes in semiconductor physics.
  • the invention comprises a reading device optimized for the respective analysis carrier, which, in an advantageous embodiment, allows the carrier to be positioned, carried out and read out semi-automatically or automatically.
  • the carrier can also be scanned automatically.
  • An existing product from consumer electronics is preferably used as the reading device or new devices from the common detection and mechanical units are combined. Examples include the CD, DVD, magnetic card and barcode readers.
  • the reading device corresponds in its mechanics and
  • Handling essentially a manual magnetic card reader.
  • the reader is either permanently installed mechanically and the analysis support is pulled through, or the analysis support is firmly inserted and the reader is guided linearly over the support using an appropriate mechanism.
  • the reading device is based on optical detection.
  • the reading device essentially consists of a “light barrier” on one or both sides.
  • a suitable reading head is used for detection, depending on the type of signal.
  • the optical reading device can have, for example, but not exclusively, the embodiments described below.
  • a commercially available CD reading head is used which works with reflection (FIG. 7A).
  • a modified CD reading head is used, which, in contrast to the reading unit used in the CD player, also works with transmitted light or alternatively only with transmitted light (FIG. 7B). In this case you can use the one required for a conventional CD Avoid mirroring, which results in cheaper production of the analysis carrier.
  • the analysis support can advantageously be oriented in both orientations, i.e. with the front, i.e. the side coated with sensor elements, to or away from the read-out unit, e.g. a CD reading head.
  • the appropriate orientation depends on the biochemical detection protocol to be carried out, the respective signaling element, general boundary conditions, e.g. a covering of the test areas or the base material of the analysis carrier, and the detection method.
  • the orientation of a mirrored front side with a light-scattering signal-emitting element to the optical readout unit is advantageous, because in this case a scattering element on the rear side would not be recognized.
  • a conventional barcode reader is used if the detection fields on the carrier are arranged in parallel strips in a barcode-like pattern (Fig. 8A).
  • a large number of parallel detection fields with identical substances can be found on one
  • Test strips must be placed next to each other. The test results are true to the angle, e.g. read orthogonal to the reading direction of the barcode reader (Fig. 8B). This enables multiple measurements to be carried out when a test is carried out in order to obtain statistical information.
  • a test strip subdivided in this way can have detection fields which contain different gradually arranged concentrations of sensor elements, so that quantitative statements can be made. In this way, evidence in micro and macro dimensions can be realized in any combination on a carrier.
  • the parallel traces of detection fields on an analysis carrier can advantageously also be read out in parallel with multi-focus optics, for example with 7 parallel light beams, such as are already used in part in modern CD-ROM devices.
  • the individual photo diodes of a CD reading head which are used for tracking, can also be used as detectors.
  • An HF filter is used as the isolating unit to ensure that Separate readout signal from tracking signal.
  • the detection can also be carried out two-dimensionally, for example with a camera. It is particularly advantageous in the case of a flat arrangement of the format elements, for example in the case of the 2D barcode.
  • CD-ROM, CD-R and DVD readers as well as magneto-optical and magnetic detectors, linear CCD arrays or photodiode arrays are equally suitable as detectors as CD reading heads.
  • the invention is not limited to optical data recording.
  • Magnetic detection methods in particular can serve as analysis carriers due to their wide use in consumer goods electronics.
  • Magnetic cards in banking and tapes and hard drives in the computer industry are examples of this.
  • the associated reading systems can be used as reading devices after minor adjustments to the geometry of the respective analysis carrier.
  • a reading head uses a senso-electrical converter to generate analog signals, which can be processed directly for transmission in an evaluation system using digital conversion and downstream microprocessor logic.
  • the analysis carrier is evaluated in four steps: a) Measurement of the analog signal level e.g. using a CD pickup; b) digitization of the analog signals, i.e. Generation of a digital signal sequence based on a threshold criterion; c) interpretation of the digital signal stream on the basis of predefined format structures; d) Comparison with the signal sequences permitted within the format structure.
  • the analog signal levels are digitized in a standard device, for example in an electronic module with a standard AD converter logic. Image processing is omitted because the device specifies binary threshold criteria (FIG. 9).
  • the data acquisition is automatically synchronized based on the specified sequence of verification, address and empty fields. In a more extensive version, it can be provided, with the aid of digital signal processing (DSP, microprocessor, etc.), to emphasize or suppress special features of the signaling elements in order to obtain clear statements. This can be achieved, for example, by means of filtering or frequency analysis, in that only signals with specific characteristics of the signaling elements and the format structures are taken into account in the evaluation.
  • the incoming digital data stream is checked in an interpreter to determine whether the chronological sequence of signal levels is permissible within the specified data format. This implements direct control and error detection.
  • the signal sequence to be analyzed also contains the position information required for the test. The received signal sequence is interpreted by a comparison with the permitted sequences. A sequence that is permitted but not expected within the coding clearly indicates an
  • a series of individual tests on an analysis carrier can be realized by several sequences of format elements arranged in rows.
  • the format elements including the detection fields are inserted directly into the track of the pits and lands on the CD.
  • the signal levels, the signal lengths and also the interpretation of the signal sequences are given here by the "Red Book” standard from Philips.
  • the evaluation steps a) to c) are implemented in every standard CD player. The test is then evaluated directly by comparing the specified input code word with the read output code word.
  • the downstream computer system requires special software for evaluating the test housed on the carrier, which is tailored to the respective analyzer carrier.
  • This software can be applied in an advantageous embodiment in the data areas present on the same carrier. If the analyzer is designed in form and function accordingly, readers such as diskette or
  • Removable disk drives, CD-ROM players or comparable devices and their successors, with which the carrier is compatible in principle, can be used to read the software.
  • a plurality of reading devices can advantageously also be present in one device.
  • the analysis software can also access databases optionally available on the carrier in order to keep access to standard values that are required in the context of the specific analysis.
  • the present invention can be used particularly advantageously in biochemical or biomedical detection methods.
  • the invention also includes the substance combinations ("kits") required for detection. The following are listed in detail:
  • an identification tag e.g. an implantable microchip that can be read through the skin without contact and can be read with a simple portable device;
  • Point-of-care application for performing diagnostic procedures on site, i.e. at a specialist or on an outpatient basis with the patient, e.g. for routine tests such as measuring blood sugar, blood lipids (LDL / HDL), determining the immune status, etc .;
  • Example 1 Detection of C-reactive protein by means of silver precipitate formation
  • a carrier made of polycarbonate is ultrasonically cleaned in ethanol / water (1: 2).
  • a monoclonal antibody (Clone 5 (4C28), HyTest, Finland) against human C-reactive protein (CRP) is then printed on defined areas of the support using a stamp made of polydimethylsiloxane (PDMS) in a micro-contact printing process.
  • the stamp and the carrier are arranged with the aid of an adjustment unit so that an exact positioning of at least 5 ⁇ m is ensured.
  • the carrier is then blocked for 30 min with a solution of 1% bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the support After washing with buffer (PBS, 10 mM Na phosphate, 145 mM NaCl, 4 mM KC1, pH 7.4), the support is incubated for 30 min with a test sample containing the CRP protein. After washing again with PBS, the carrier is washed for 30 min with a second, biotinylated, monoclonal antibody directed against another epitope of CRP (clone 7 (4C29), HyTest, Finland; in 1% BSA in PBS, 1: 300 of the stock solution) , incubated.
  • a sandwich immunoassay FIG.
  • the carrier is incubated for 20 min with an anti-biotin antibody conjugated with lnm colloidal gold particles, which is diluted 1: 400 in 1% BSA in PBS. After washing, a silver solution is added.
  • this consists of 110 mg of silver lactate, 850 mg of hydroquinone (alternatively: pyrogallol), 2.55 g of citric acid monohydrate, 2.35 g of tri-sodium citrate and 100 ml of water, which is freshly prepared immediately before the reaction.
  • further additives such as UV blockers and reaction inhibitors such as gum arabic can be added to the silver solution.
  • a carrier is pretreated and processed analogously to Example 1.
  • a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate is now added (Sigma-Chemie, Kunststoff; 20 min, in 1% BSA in PBS, 0.5 mg / ml) and then washed.
  • the support is incubated for 10 min with ELF-97 phosphatase substrate (Molecular Probes, 5mM in AP buffer: 150 mM NaCl; 1 mM MgC12; 1% BSA, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5) and then washed thoroughly.
  • ELF-97 phosphatase substrate Molecular Probes, 5mM in AP buffer: 150 mM NaCl; 1 mM MgC12; 1% BSA, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5
  • substrates and also other detection enzyme complexes can be used, for example alkaline phosphatase with BCIP / NBT from Sigma-Chemie; Streptavidin-peroxidase conjugate from Röche with 4-chloro-l-naphthol from Sigma-Chemie; Peroxidase with DAP / Co from Sigma-Chemie).
  • Biotinylated antibodies against a searched protein are mixed with a patient serum sample, which was previously diluted 1: 3 in PBS (see above). The mixture is 10 min. Centrifuged at 13000xg and the supernatant applied to a detection support which is coated at certain points in a process analogous to that described in Example 1 with another antibody which binds another epitope on the protein to be detected from the serum. After incubation for 30 minutes at room temperature and washing three times in PBS, a mixture of core-streptavidin and biotinylated ferritin freshly prepared in PBS cooled to 4 ° C. is applied to the detection support.
  • the ferritin was biotinylated with a kit according to the prior art in such a way that an average of 4-10 biotin molecules are bound per ferritin tetramer.
  • a kit according to the prior art in such a way that an average of 4-10 biotin molecules are bound per ferritin tetramer.
  • large cross-linked complexes form at the points at which the support is coated with the corresponding antibody (FIG. 5). These complexes are to be optically detected, their arrangement is subsequently read out and verified analogously to Example 1.
  • the DNA oligonucleotides bearing a terminal amine group are mounted on aminated polycarbonate supports (aminopropyltriethoxysilane, Fluka) using standard methods, e.g. Crosslinker BS3, Pierce, immobilized.
  • the single-stranded DNA serves as a sensor molecule for binding target DNA, which is biotinylated in a PCR reaction. After hybridization, the target DNA can be made visible by means of streptavidin-colloidal gold and a silver precipitation reaction and can be detected with the aid of a CD reading head.

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung von Analyten aus einer Probe auf einem mit einem digitalen Datencode formatierten Analysenträger. Auf dem Analysenträger sind Nachweisfelder mit den für den jeweiligen Nachweis benötigten Sensorelementen sowie weitere Datenstrukturen in einem definierten digitalen Format aufgebracht und zu Abfolgen von Formatstrukturen zusammengefasst, welche als Codewörter interpretiert werden können. Zum Nachweis und zur Quantifizierung eines Analyten in einer Probe wird diese auf den Analysenträger appliziert und die Ausbildung von signalgebenden Elementen an den Orten molekularer Interaktionen initiiert. Die Lokalisation von signalgebenden Elementen an den jeweiligen Nachweisfeldern bewirkt einen Austausch einer Formatstruktur an dieser Stelle gegen eine andere. Dies führt zur Umwandlung eines Codewortes in ein anderes innerhalb der vorgegebenen Menge von gültigen Codewörtern. Beide Codewörter können im vorgegebenen Format sequentiell gelesen und interpretiert werden. Die Aussage über eine erfolgte oder nicht erfolgte Reaktion basiert auf einem Vergleich der jeweiligen Codewörter vor und nach dem Nachweis. Die Detektion erfolgt mit einem Lesegerät, das vorzugsweise aus Komponenten der Konsumgüterindustrie aufgebaut ist.

Description

Verfahren für biochemische Nachweise von Analyten
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion und / oder Quantifizierung von Molekülen aus einer Probe auf einem mit digitalem Datencode formatierten Analysenträger, wobei eine Nachweisreaktion eine Änderung der Codewörter hervorruft, die im vorgegebenen Format sequentiell gelesen und interpretiert werden kann.
Oberflächen-basierte Nachweisverfahren sind seit vielen Jahren in den biochemischen Labors etabliert. Mit den wachsenden Anforderungen der molekularbiologischen Forschung wächst der Bedarf nach hochparallelisierten und miniaturisierten Techniken zum Studium von Bindungen in komplexen Molekülmischungen.
Die bekannten Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von Target-Molekülen aus einer Probe beinhalten mehrere Schritte, die vermittels verschiedener, zum Teil aufwändiger und teuerer Geräte ausgeführt werden. Eine der Möglichkeiten zur Analyse einer Vielzahl von biologischen Molekülen sind Microarrays. Die Microarray-Technologie, bei der viele verschiedene Biomoleküle wie DNA oder Proteine dicht gepackt in einem vordefinierten Muster auf einer Substrat-Oberfläche aufgebracht sind, ist mittlerweile zur Standardmethode für die parallele Analyse biologischer Proben geworden. Diese Technologie wird z.B. bei der Analyse der Genexpression, bei der genetischen Diagnostik, in der biologischen und pharmazeutischen Forschung und zur Bestimmung genmanipulierter Organismen in der Lebensmittelindustrie verwendet.
Bei der Microarray-Technologie werden biochemische Sensormoleküle wie DNA oder Proteine auf Metall-, Glas-, Membran- oder Kunststoff-Oberflächen, insbesondere Polycarbonatträger, aufgebracht. Nach einem Kontakt mit der applizierten Probe wird ein Nachweis der molekularen Interaktion und meist auch eine Aussage über die gebundene Menge und / oder über die Stärke der Interaktion ermöglicht.
Nach Stand der Technik werden die Bindungen meist über die Erzeugung und Detektion eines optischen Signals nachgewiesen. Dabei wird üblicherweise ein Mikroskop oder ein funktional ähnliches Gerät, insbesondere ein CD-Lesekopf, eingesetzt (WO00/26677, WO00/36398). Die Information über eine erfolgte oder nicht erfolgte Bindung an einer bestimmten Stelle wird durch Bildauswertung erhalten, welche bei Microarrays höherer Dichte typischerweise durch eine Computersoftware nach einer Analog-Digital- Wandlung erfolgt.
Bei einem der bekannten Verfahren wird die Information über eine erfolgte oder nicht erfolgte Bindung an einer bestimmten Stelle durch die Ablagerung von Körnchen (Beads) am Ort der Reaktion des Analyten mit dem trägergebundenen Sensormolekül markiert (z.B. EP918885 und Taton, Mirkin, Letsinger, Science 289:1757-1760 (2000)). Nach Stand der Technik werden solcherart gebundene Beads entweder direkt als Körper identifiziert oder sie bewirken eine chemische Umsetzung wie Farbumschlag oder Farbstoffpräzipitat. Diese werden im Wesentlichen mit photometrischen Methoden nachgewiesen. Eine Kombination von Kamera und Mikroskop dient zur Erzeugung von Daten, die durch eine Bildanalyse im Computer ausgewertet werden.
Einer der Nachteile der bekannten Verfahren zur Auswertung der Microarray- Analysen ist die Verwendung von komplizierten und teueren Geräten und Software zur Detektion und Auswertung von sehr schwachen Signalen, z.B. bei der Emission weniger Moleküle von Fluoreszenzfarbstoffen. Diese Lese- und Auswertegeräte sind Ergebnis langjähriger Entwicklungsarbeit, verwenden aufwändige Methoden wie z.B. konfokale Rastermikroskopie und sind sehr teuer. Außerdem benötigen diese Geräte spezielle Software zur Identifizierung und Lokalisierung von Molekül-Spots und zur Interpretation und Integration detektierter Signale.
In den nächsten Jahren werden erste Resultate der Genomforschung in die medizinische Diagnostik und Prognostik Einzug halten. Vor allem für die unterschiedlichen klinischen Fragestellungen werden einfache und schnelle molekulare Nachweisverfahren benötigt. Es besteht daher der Bedarf nach einer einfachen, preiswerten und mindestens zum Teil automatisierten Methode zur Detektion und Analyse von Molekülen in komplexen Gemischen. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein schnelles und einfaches Verfahren zur Analyse und Detektion von Analyten zu schaffen, welches eine zuverlässige Interpretation der Ergebnisse nach definierten Kriterien und eine quantitative Aussage ermöglicht.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung ein Verfahren mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen vor. Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand von Unteransprüchen, deren Wortlaut ebenso wie der Wortlaut der Zusammenfassung durch-' Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht wird.
Das oben genannte Ziel wird gemäß der Erfindung durch ein Verfahren erreicht, bei dem eine molekulare Interaktion an einer bestimmten Stelle des Trägers zur Erzeugung von detektierbaren Strukturen führt, hier als signalgebende Elemente bezeichnet, die im Kontext des in Form eines digitalen Datencodes definierten Formats auf dem Analysenträger gelesen und interpretiert werden können.
Auf dem Analysenträger sind Nachweisfelder mit den für den jeweiligen Nachweis benötigten Sensorelementen sowie weitere Datenstrukturen in einem digitalen Format aufgebracht und zu Abfolgen von Formatstrukturen zusammengefaßt, welche zweifelsfrei als Codewörter interpretiert werden können. Zum Nachweis und zur Quantifizierung eines Analyten in einer Probe wird diese auf den Analysenträger appliziert und eine Wandlung des digitalen Signalpegels auf den jeweiligen Nachweisfeldern mit Hilfe eines signalgebenden Elements initiiert. Dadurch wird ein Codewort gegen ein anderes, innerhalb der Menge von gültigen Codewörtern erlaubtes Codewort ausgetauscht. Die Aussage über eine erfolgte oder nicht erfolgte Reaktion basiert auf einem Vergleich der jeweiligen Formatstrukturen vor und nach dem Nachweis. Die Ausführungsbeispiele sind eine CD, eine Magnetkarte, eine optische Karte und eine Barcode-Karte.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt gegenüber bekannten Methoden den Vorteil, daß durch die digitale Datengewinnung eine aufwändinge zweidimensionale Bildanalyse überflüssig wird. Durch die Schaffung einer digitalen Informationsstruktur entfällt die komplizierte und fehleranfällige Analogsignalverarbeitung. Eine zuverlässige Interpretation der Ergebnisse nach definierten Kriterien wird ermöglicht. Ferner lassen sich der Analysenträger und das Lesegerät, das aus gängigen Komponenten aus der Konsumgüterindustrie aufgebaut ist, abhängig von der Fragestellung leicht aufeinander abstimmen, so daß unterschiedliche Tests schnell und preiswert in einer Massenproduktion entwickelt und hergestellt werden können.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der detallierten Beschreibung und Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Zeichnungen geschildert. In den Zeichnungen zeigen: Fig. 1: A) Schematische Darstellung einer beispielhaften Abfolge von Formatelementen auf einem Analysenträger, die aus Leerfeldern 5, Adressfeldern 6 (graue Vierecke) und Nachweisfelder 7 (weiße Vierecke) besteht und eine Spur bildet. Der Einlaufbereich 8 dient dazu, die Spur beim Lesen zu suchen und anzulaufen; B) Vor dem Nachweis representiert die Abfolge von Formatelementen das Codewort A; C) Nach dem erfolgten Nachweis kann die dargestellte Abfolge von Formatelementen das Wort A, wenn keine Reaktion stattfand (L), oder das Codewort B, im Falle einer Reaktion (II.), representieren. Die binären Codewörter A und B unterscheiden sich durch einen Austausch eines Signalpegels in der vierten Position, die einem Nachweisfeld entspricht.
Fig.2: A) In einer schematischen Darstellung die einfachste Ausführungsform des Analysenträgers 1 mit einer exemplarisch linear skizzierten Spur 2 von Formatelementen und einem Einlauf bereich 8; B) In einer schematischen Darstellung eine weitere Gestaltungsmöglichkeit des Analysenträgers 1 mit einer Spur 2 von Formatelementen und einem Einlauf bereich 8, einem optionalen Mittelloch 3 für die
Kombination von Analysenträger und CD samt spiralförmiger Datenspur 4 für die Datenspeicherung und Software; C) In einer schematischen Darstellung ein Beispiel einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Analysenträgers 1 mit einem Mittelloch 3, einer spiralförmiger Datenspur 4 im CD-R Standard für die Datenspeicherung und Software, und einer spiralförmigen Spur 32 von
Formatelementen im CD-R Standard; D) In einer schematischen Darstellung eine weitere Gestaltungsmöglichkeit des Analysenträgers in Form einer CD 33 mit einem Mittelloch 3, spiralförmiger Datenspur 4 im CD-R Standard für die Datenspeicherung und Software, und einer spiralförmigen Spur 32 von Formatelementen im CD- Standard.
Fig. 3: Schematische Darstellung eines Analysenträgers 1 mit mehreren parallel angeordneten Spuren, die aus Reihen von Nachweis-, Informations- und Leerfeldern bestehen. Eine beispielhafte Befüllung des Analysenträgers 1 mittels einer Mikrofluidik-Platte 9 mit Sensorelementen oder Analytlösungen durch in den Träger eingebettete oder anderweitig räumlich arrangierte Mikrokanäle 10 ist dargestellt. Fig. 4: Schematische Darstellung eines Nachweises nach Beispiel 1. Eine Bindungsreaktio zwischen einem auf dem Analysenträger 1 aufgebrachten Sensorelement 34, hier ein Antikörper, und einem Analytmolekül 12, hier ein Protein, aus der Probe ist dargestellt. Der Nachweis erfolgt in einem Sandwich-Immunoassay mit Hilfe eines zweiten Antikörpers 11, der gegen ein anderes Epitop des Proteins gerichtet ist. Ein am zweiten Antikörper gekoppeltes Kolloidgoldpartikel 13 führt zur Abscheidung eines Silberkörnchens 14, das als signalgebendes Element dient.
Fig. 5: Schematische Darstellung eines Nachweises nach Beispiel 3. Eine Bindungsreaktion zwischen einem auf dem Träger 1 aufgebrachten Rezeptor 15 und einem Liganden 16 aus der Probe, welcher an ein Haptenl7, hier Biotin, gekoppelt ist. Nach Zugabe einer
Mischung aus Streptavidin 18 und biotinyliertem Ferritin 19 bilden sich signalgebende Elemente in Form von Molekülkomplexen 20.
Fig. 6: Signalgebende Elemente am Beispiel von Polystyrol-Beads von 1 μ . Durchmesser, die nach zwei unterschiedlichen Verfahren detektiert und binär interprätiert sind. A) Ein von einem CD-Lesekopf aufgenommenes Bild; B) dieselben Beads aufgenommen mit der Fluoreszenzmikroskopie; C) dreidimensionalle Darstellung der Daten aus A), die binär interpretiert werden können.
Fig.7: A) Vereinfachte schematische Darstellung eines optischen Systems, das einen gewöhnlichen CD-Lesekopf representiert, für die Detektion des Reflektionssignals, bestehend aus Laser (L) 25, Detektor zur Fokusregelung und Signaldetektion (D F)
27, Fokussiereinrichtung 28 und teilverspiegelte Platte 29. Der Analysenträger 1 mit Verspiegelung 30 ist in der Seitenansicht im Strahlengang dargestellt; B) Vereinfachte schematische Darstellung eines optischen Systems für die Detektion des Transmissionssignals, bestehend aus einem CD-Pickup des Beispieles A), dem eigentlichen Detektor zur Transmissionsmessung (D) 26 und eventuell einer zusätzlichen Fokussiereinrichtungen 31. Der Analysenträger 1 mit Verspiegelung 30 ist in der Seitenansicht im Strahlengang zwischen den Fokussiereinrichtungen 28 und 31 dargestellt.
Fig. 8: Schematische Darstellung eines Analysenträgers, auf dem die Nachweisfelder als parallele Streifen derart aufgebracht sind, daß sie sich mit einem Barcode-Lesegerät auslesen lassen. A) Die einzelnen Nachweisfelder 23 sind in größeren Nachweisbereichen in Form von Teststreifen 22 angeordnet. Sie können zusammen mit Adressfeldern 21, die z.B. Informationen zu Testspezifikationen, Kodierungen (Dongle) oder Produkt-Identifikation enthalten, in einer Testeinheit untergebracht sein. Nach einer Nachweisreaktion mit Analyten aus verschiedenen Proben 1 und 2 ergeben sich unterschiedliche Muster von signalgebenden Elementen auf den
Teststreifen, die mit einem Barcode-Lesegerät ausgelesen werden können; B) Die Teststreifen 22 können aus mehreren Nachweisfeldern 24 bestehen, die zur Hauptleserichtung orthogonal angeordnet sind und beispielsweise Konzentrationsreihen enthalten können.
Fig. 9: Bild von feinen Linien im Mikrometerbereich, denen eine Antikörper-Antigen
Reaktion mit nachgeschalteter Silberabscheidung zugrunde liegt. A) Mit einem CD- Lesekopf aufgenommenes Analogbild; B) Analoge Bildzeile aus A), gelesen entlang der waagerechten gestrichelten Linie; C) Digitale Auswertung der Bildzeile aus B), erzeugt aus dem Analogsignal unter Verwendung eines Schwellenkriteriums, gekennzeichnet durch die waagerechte Linie in B).
Verfahren für biochemische Nachweise von Analyten
Detailierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfaßt die folgenden wesentlichen Komponenten, welche im Zusammenspiel den vorteilhaften Gebrauch des erfindungsgemäßen Verfahrens ausmachen:
- Ein Analysenträger, bestehend aus einem Basisträger und darauf aufgebrachten Leer-, Informations- und Nachweisfeldern, die in einem digitalen Datencode formatiert sind;
- Sensorelemente, aufgebracht auf ein definiertes Muster der Nachweisfelder;
- Ein Standardprotokoll zur Durchführung von spezifischen Wechselwirkungen zwischen Sensorelementen und Analyten aus der Probe sowie zur Ausbildung von signalgebenden Elementen auf den Nachweisfeldern;
- Ein Lesegerät zur Detektion von signalgebenden Elementen auf den Nachweisfeldern im Kontext des vorgegebenen digitalen Formats samt Steuerung und Auswertesoftware. Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wesentlichen Komponenten werden nachfolgend im Einzelnen erläutert.
Codierung
Der Analysenträger ist mit einem definierten digitalen Datencode formatiert. Das Format ist durch die Wahl der konkreten technischen Umsetzung und das verwendete Detektionssystem oder allgemein das Lesegerät vorgegeben. So wird das Format bespiels weise durch die jeweiligen Charakteristika von Pits und Lands in der CD-Techologie, "High"- und "Low"- Pegeln in der Digitalelektronik, Ton und Pause beim Morsecode etc., festgelegt. Im Falle der aus der CD-Technologie bekannten Detektionssysteme bestimmen z.B. eine definierte Geometrie, Länge und Anordnung von Pits und Lands auf einer optischen Disk, gemäß dem Red-Book-Standard von Philips, das jeweilige Format.
Die Codierung beschreibt das Regelwerk, nach dem die Information ausgewertet wird. Ein Code ist die Summe aller gültigen Code Wörter, wobei jedes Codewort durch eine eindeutige Abfolge der vorgegebenen Formatstrukturen definiert ist. Eine Codierung enthält im Allgemeinen zusätzliche Vorschriften wie redundante fehlerkorrigierende Informationen, wie eine Quersummenbildung oder eine Verschachtelung wie beispielsweise vom Red-Book- Standard in der CD-Industrie vorgegeben.
Die gängigsten Formate der Konsumgüterindutrie verwenden einen binären Code. Nachfolgend wird dieser Fall als bevorzugte Ausführung in Detail beschrieben. Ein binärer Code ist durch eine bestimmte Abfolge von "0"- und "1"-Pegeln (oder "High"- und "Low"- Pegeln) definierter Länge gegeben. Im Falle der vorliegenden Erfindung besteht der binäre Code aus Abfolgen von Formatstrukturen, die durch Formatelemente "Leerfelder" und "Informationsfelder" (Fig. 1A) mit bestimmten Signalpegeln und Signallängen definiert sind. Informationsfelder können Adressfelder oder Nachweisfelder sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführung bilden die Abfolgen von Formatelementen auf dem Analysenträger eine oder mehrere Spuren. Eine Spur wird in einer bevorzugten Ausführungsform in vier verschiedene Teilbereiche unterteilt (Fig. 1A):
1. Einlaufbereich. Hier wird die Spur gesucht und angelaufen (Tracking).
i 2. Leerfelder. Die Unterbrechungen sind essentiell, um die Position des auszulesenden Nachweisfeldes durch Abzählen oder über eine Adressierung zu bestimmen. Die Leerfelder besitzen einen unveränderlichen Pegel ("0" oder "1") und eine variable Länge.
3. Adressfelder. Sie enthalten eine Struktur- und Positionsinformation, mit der die Zuordnung des durch die molekulare Interaktion erhaltenen Signals zu einer definierten
Substanz ermöglicht wird. Die Adressfelder besitzen einen unveränderlichen Pegel ("1" oder "0") und können unterschiedliche Längen haben. Die Adressfelder und die Leerfelder weisen inverse Pegel auf. Besitzen die Leerfelder einen "0"-Pegel, so ist der Pegel des Adressfeldes "1" oder umgekehrt.
4. Nachweisfelder. Hier sind die Sensorelemente aufgebracht. Die Nachweisfelder sind durch einen veränderlichen Pegel ("0" oder "1") gekennzeichnet und können unterschiedliche Längen aufweisen. Ein Pegelwechsel von "0" nach "1" bzw. von "1" nach "0" auf einem Nachweisfeld zeigt einen erfolgten Nachweis des Analyten an (s. unten). Alle denkbaren definierten Anordnungen von Formatelementen in einer oder zwei Dimensionen sind möglich und sind hiermit Bestandteil der Erfindung.
Eine Grundidee der vorliegenden Erfindung ist es, die signalgebenden Elemente auf den Nachweisfeldern dem vorgegebenen Format anzupassen und das Ergebnis des jeweiligen biochemischen Nachweises aus dem Vergleich zwischen den jeweiligen Abfolgen der Formatstrukturen vor und nach der durchgeführten Analyse zu erhalten.
Erfindungsgemäß besteht der Wortschatz des Codes aus einer beschränkten Anzahl an Codewörtern mit einer vorgegebenen Länge, die sich aus den Formatelementen "Leerfelder" und "Informationsfelder" mit definierten Pegeln und Längen zusammenstellen. Jedes Wort kann ein oder mehrere Nachweisfelder enthalten. Undefinierte Wörter sind nicht erlaubt und werden von der Interpreter-Software als Fehler erkannt. Eine bestimmte Anzahl von Codewörtern weist vorteilhaft keine Nachweisfelder auf und wird beispielsweise zur Trennung und / oder Adressierug größerer Codeblöcke genutzt. Durch eine Kombination bzw. Aufreihung von Abfolgen von Formatelementen kann die Anzahl der auf einem Träger aufgebrachten Tests auf einfache Weise skaliert werden. Zur Bestimmung des Nachweisergebnisses repräsentiert eine definierte Abfolge von
Formatelementen zwei erlaubte Codewörter A und B, die sich durch die Änderung des Pegels von "0" nach "1" oder von "1" nach "0" auf mindestens einem Nachweisfeld unterscheiden (Fig. 1B). Vor dem Nachweis sind die Pegel auf den Nachweisfeldern derart, daß die Abfolge von Formatelementen z.B. das Codewort A repräsentiert. Durch eine Nachweisreaktion erfolgt ein Austausch von "0" gegen "1", oder umgekehrt. Dadurch wird das Codewort A in das Codewort B umgewandelt . Wenn keine Reaktion auf den Nachweisfeldern stattfindet, representiert die jeweilige Abfolge von Formatelementen weiterhin das Codewort A (Fig. IC). Die Interpretation des Ergebnisses erfolgt durch einen Vergleich zwischen den jeweiligen Abfolgen von Formatstrukturen vor und nach der Analyse.
Am Beispiel des Morsecodes soll eine Nachweisauswertung auf einem erfindungsgemäßen Analysenträger erläutert werden. Der Morsecode sei auf dem Analyseträger durch eine vorgegebene Abfolge von "Low"- und "High"-Pegeln implementiert. Angenommen, der "Low"-Pegel hat immer die Länge 1 und ist durch das Symbol "0" dargestellt. Er dient in diesem Beispiel nur als Trennzeichen. Der "High" -Pegel hat dagegen wahlweise die Länge 1 oder 3 und wird demzufolge durch "1" oder "111" representiert. Angenommen, das Codewort A ist durch die Abfolge "1 0 1 1 1 0 1" und das Codewort B durch die Abfolge "1 0 1 0 1 0 1" definiert (Fig. 1B). Beide Wörter besitzen die gleiche Gesamtlänge 7, aber der Pegel in der vierten Position, die hier einem Nachweisfeld auf dem Analysenträger entsprechen soll, ist unterschiedlich. Eine Bindungsreaktion auf dem Nachweisfeld in der vierten Position schaltet den "1 "-Pegel an dieser Stelle in einen "0"-Pegel um. Dadurch wird das erlaubte Wort A in das erlaubte Wort B umgewandelt (Fig. IC). Das Nachweisergebnis resultiert aus dem einfachen Vergleich zwischen dem vor dem Nachweis gegebenen Ausgangswort A und dem nach dem Nachweis gelesenen Wort. Wenn keine Reaktion stattfand, wird das Wort A gelesen ("Test negativ"), im Falle einer erfolgten Reaktion wird das Wort B gelesen ("Test positiv"). Ein anderes Codewort C oder ein Undefiniertes Wort würde im Rahmen der Interpretation erkannt und als Fehler identifiziert. Diese Eigenschaft des Verfahrens kann vorteilhaft als Qualitätskontrolle verwendet werden.
Diese indirekte, auf einer Codierung beruhende sequentielle binäre Datengewinnung besitzt gegenüber den bekannten Verfahren wesentliche Vorteile. Erstens wird eine aufwändige zweidimensionale Bildanalyse vermieden. Zweitens wird durch die Wahl eines binären Codes eine digitale Informationsstruktur festgelegt, womit eine komplizierte und fehleranfällige Analogsignalverarbeitung entfällt. Drittens ist durch eine Codierung binärer Signale eine Fehlerekennung und -korrektur möglich. Viertens können zur Detektion und Auswertung Standardbaugruppen oder ganze Geräte aus der Konsumgüterindustrie verwendet werden.
Auf dem erfindungsgemäßen Analysenträger wird bevorzugt ein Format verwendet, welches in der Konumgüterindustrie üblich ist. Dieses kann beispielsweise Audio-CD, Optical Disc, CD-R, CD-RW oder MO (ECMA 154, ISO/IEC 10090), CD-ROM (ECMA 130, ISO/IEC 10149), DVD-R (ECMA 268, ISO/IEC 16449) oder nachfolgende Standards sein.
Die Erfindung ist nicht auf Formate beschränkt, die einen binären Code verwenden. Auch andere, auf digitalen Codesystemen basierende Formate sind denkbar und sind somit Bestandteil der Erfindung.
Mehrdimensionale Codes, wie z.B. zweidimensionale Barcodes, sind eine direkte Erweiterung und damit Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Anwendung derartiger Codierungen für biochemische Nachweise können von Vorteil sein, da sie eine parallele Datenverarbeitung, Fehlerkorrekturen und eine Gewinnung von redundanten Informationen ermöglichen. In diesem Fall ist eine parallele Datenerfassung, z. B. mittels einer Kamera oder CCD-Chips, von Vorteil, weil damit die Absolutpositionen einmalig bestimmt und angesprochen werden können. Dies steht im Gegensatz zu einem seriellen Auslesen, bei dem eine Positionsbestimmung anhand von Marken, Adressen oder einer Synchronisierung erfolgen muß.
Analysenträger
Der Analysenträger kann eine eckige, runde, ovale oder sonstige zwei oder dreidimensionale Form haben. In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung wird als Träger ein Substrat verwendet, welches in der Geometrie und der Handhabung der üblichen Magnetkarte ähnlich ist (Fig.2A). Magnet- und Chipkarten haben durch ihre praktische Größe und eine einfache Handhabung weite Verbreitung gefunden. Die wesentlichen Eigenschaften sind ihre Robustheit und die Möglichkeit, eine begrenzte Menge Informationen auf kleinem Raum unterzubringen. In einer verbreiteten Variante beinhaltet die Magnetkarte einen linear angeordneten Datenstreifen mit einem konstanten Abstand zu einer ihrer Außenkanten. In Kombination mit dem einfachen Lesegerät resultiert daraus eine einfache mechanische Handhabung - die Karte kann sogar von Hand durch ein Lesegerät gezogen werden. Weil Magnetkarten in großer Stückzahl billig hergestellt werden und die Lesegeräte einfach in der Fertigung sind, gestattet diese Ausführung der Erfindung den Bau von Lesegeräten, die in der Produktion um Größenordnungen preiswerter und in der Bedienung einfacher sind als bekannte Apparate zum Nachweis von biologischen Analyten.
Ferner können als Analysenträger auch magnetische Speicherträger, optische Karten, eine Barcode-Karte (Fig. 8) oder Kombinationen von diesen verwendet werden. Erfindungsgemäß ist die äußere Formgebung nicht auf die üblichen Kartenstandards eingeschränkt. Eine klassische CD (Fig. 2D) und ihre Derivate, z.B. CD-R, DVD, können ebenfalls als Analysenträger verwendet werden. Eine vorhandene Formatierung der Formatstrukturen auf dem Analysenträger kann mit Vorteil genutzt werden, womit eine umständliche und teuere Umprogrammierung entfällt.
Das Nachweisareal kann Teil des Trägers oder auf einem separaten Zusatzträger aufbracht sein. Neben den Sensorelementen können auf dem gleichen Träger Software, Datenbanken, Signaturen und sonstige Informationen wie z.B. Testspezifikationen, Protokolle zur
Durführung des jeweiligen Tests, etc. in beliebiger Zusammenstellung untergebracht sein. Beliebige Kombination von konventionellen Datenspeichern wie Magnetstreifen, Kartenchips, Barcodes,CD (Fig.2B, 2C und 2D), CD-ROM, Audio-CD oder CD-R können in den Träger integriert sein.
Wenn die Abfolgen von Formatelementen auf dem Analysenträger eine oder mehrere Spuren bilden und die Nachweis-, Informations- und die Leerfelder äquivalent dimensioniert sind und eine Fläche von je 5x5 μm2 aufweisen, so kommt man im oben beschriebenen Beispiel des Morsecodes auf eine Länge von 35 μm für eine Testeinheit. Wenn mehrere solche Testeinheiten hintereinander angeordnet sind, bilden sie eine Spur (Fig. 1A). Bei einer angenommenen Spurlänge von 6 cm erreicht man eine Einzelanalysenzahl von bis zu 2000 in einer Spur. Es ist damit möglich, entweder bis zu 2000 unterschiedliche Tests auf einem
Analysenträger durchzuführen, oder unter Verwendung von Konzentrationsreihen eine breite Statistik zu einigen wenigen Nachweisen zu erhalten.
Mehrere parallel angeordneter Spuren von Nachweis-, Informations- und Leerfeldern pro Träger sind möglich (Fig. 3). Diese Anordnung hat mit Vorteil eine Erhöhung der Einzeltestzahl sowie eine Parallelisierung der Testdurchführung und des Auslesens der
Ergebnisse zur Folge. Ferner kann beispielsweise die Befüllung einzelner Nachweifelder mit Sensorelementen und / oder einer Probe über eine Mikrofluidik-Platte parallelisiert werden.
Selbstverständlich sind auch lineare, kurvenförmige, radiale, Spiral- und kreisförmige oder sonstige geometrische oder auch stochastische Anordnungen von Nachweis-, Informations- und Leerfeldern möglich und hiermit ein Bestandteil der Erfindung.
Als Träger-Material können Polymerkunststoffe mit verschiedenen, der analytischen Aufgabenstellung angepaßten physiko-chemischen Eigenschaften, aber auch Glas, Halbleiter, Metalle, Metallegierungen, Keramiken, Hybridmaterialien oder Kombinationen aus diesen Werkstoffen eingesetzt werden. In einer besonders vorteilhaften Ausführung in Verbindung mit optischen Ausleseverfahren werden Träger aus Glas, transparenten Kunststoffen oder Polymermaterialien, insbesondere auch Polycarbonat optischer Qualität, wie es in der CD- und DVD-Industrie Anwendung findet, verwendet.
Zur Herstellung eines Analysenträgers wird auf den Basisträger zuerst eine Grundformatierung aufgebracht. Für jeden spezifischen Test werden dann in einem vordefinierten Muster auf die als Nachweisfelder vorgesehenen Formatelemente die für den jeweiligen Nachweis notwendigen Sensorelemente aufgetragen.
Sensorelemente
Als Sensorelemente können alle Substanzen dienen, die für einen biochemischen oder medizinischen Nachweis von Nutzen sein können. Dies sind unter anderem Zucker, Steroide, Hormone, Lipide, Proteine, insbesondere mono- oder polyklonale oder rekombinante Antikörper, Peptide, Antigene aller Art, Haptene, DNA, RNA sowie natürliche und artifizielle Derivate hiervon, insbesondere Aptamere und PNA, aber auch organischchemische Wirkstoff -Bibliotheken, wie sie z.B. bei der pharmakologischen Forschung und Entwicklung eingesetzt werden. Gleichermaßen können Zellen, Mikroorganismen, Viren oder Teile davon, Membranfragmente, Präparationen und Extrakte aus biologischen
Materialien, Stoffwechselmetabolite und dergleichen als Sensorelemente verwendet werden. Weitere, dem Fachmann bekannte chemische, biologische, organische oder anorganische Elemente mit Sensorcharakter können gleichermaßen Verwendung finden und sind damit Bestandteil der Erfindung.
Die Erfindung sieht vor, daß man mit Vorteil eine Vielzahl von verschiedenen
Sensorelementen auf einer Substratoberfläche aufbringen kann. Die Sensorelemente einer Sorte sind dabei räumlich begrenzt jeweils auf definierte Nachweisfelder aufgebracht. Die Ausdehnung der Nachweisfelder kann in einer oder zwei Dimensionen kleiner als 10 μm, mit Vorteil kleiner als 2 μm und mit besonderem Vorteil kleiner als 1 μm sein. Neben den Sensorelementen können entsprechend einer vordefinierten Anordnung weitere Moleküle oder signalgebende Elemente auf benachbarten Nachweisfeldern aufgebracht sein, welche zur Kalibrierung oder Standardisierung der Analysen dienen.
Nach Stand der Technik sind dem Fachmann Lösungen bekannt, um die Sensorelemente an die Träger-Oberfläche zu binden, ohne ihre Funktionalität nachteilig zu beeinflussen. Die Sensorelemente können kovalent oder nichtkovalent mit der Träger-Oberfläche verbunden oder auf der Träger-Oberfläche aufgetragen sein. Das Aufbringen der Sensorelemente auf den Analysenträger kann mechanisch insbesondere durch eine Tropfenapplikation z.B. mit Hilfe von Tintenstrahldruckern (Ink-Jet Printing) oder Drucknadeln (Spotting), oder mittels lithographischer Methoden nach Stand der Technik geschehen. Das Benetzen der Nachweifelder mit den Sensorelementen kann auch mittels Kanälen, bevorzugt Mikrokanälen oder mikrofluidischer Netzwerke (Fig. 3) erfolgen. Auch ein einfaches Eintauchen des Analysenträgers in ein die Sensorelemente enthaltendes Flüssigkeitsbad nach selektiver Aktivierung von Nachweisfeldern bzw. einer Passivierung von Leerfeldern auf einem flächig aktivierten Träger ist möglich. Ein Spin-Coating Verfahren kann ebenfalls verwendet werden, um beispielsweise eine flächige Aktivierung der Oberfläche zu gewährleisten. In einer anderen vorteilhaften Variante wird für den Analyseträger ein für eine bestimmte Lichtwellenlänge transparentes Material verwendet. Die lichtleitenden Eigenschaften des Trägers können erfindungsgemäß dazu verwendet werden, um über die ortsselektive Lichtleitung bestimmte Moleküle an den vordefinierten Orten anzukoppeln bzw. zu synthetisieren. Ebenso ist eine durch elektrische Felder gesteuerte Synthese direkt auf dem Träger denkbar.
Die kovalente Verknüpfung der Sensorelemente kann beispielsweise über eine Bindung bereits vorhandener oder speziell eingeführter amino-, thio- oder phospho-Gruppen an eine endgruppen-funktionalisierte silanisierte Träger-Oberfläche erreicht werden. Alternativ können biotinylierte Sensorelemente mittels Streptavidin-Beschichtung auf der Träger- Oberfläche spezifisch immobilisiert werden.
Signalgebende Elemente
Ein Grundgedanke der vorliegenden Erfindung ist es, die physikalischen Parameter der signalgebenden Elemente wie Größe, Form und Signalpegel der in Form von Leer- und Adressfeldern aufgebrachten Formatstruktur anzupassen. Dies steht im Gegensatz zur üblichen Vorgehensweise, bei der zum gegebenen Signal eine passende Formatstruktur und Geräte entwickelt werden. Die Rahmenbedingungen wie Positionierung und Dimensionierung der Formatelemente und der signalgebenden Elemente ist durch die Codierung vorgegeben.
Zur Signalgebung können alle resonanten (Absorption, Fluoreszenz, Phosphoreszenz,
Plasmonenresonanz, Quenching etc.) und nichtresonanten (Reflektion, Beugung, Streuung etc.) Prozesse aus der Spektroskopie herangezogen werden. Alternativ können auch elektromagnetische Effekte (Piezo, Resonanzverschiebung, Kapazitätsänderung, Halleffekt, magnetische Effekte, elektrische Ladungsverschiebung etc.) zur Signalerzeugung dienen. Auch chemische Prozesse wie Silberabscheidung, Fällung von Oxiden, Oxidation oder Reduktion von Reagenzien, Elektroplating und dergleichen können für den Nachweis herangezogen werden. Weitere, dem Fachmann bekannte chemische, physikalische oder biologische Signalgeber könner gleichermaßen verwendet werden und sind damit Bestandteil der Erfindung. Als signalgebende Elemente kann eine Reihe von handelsüblichen Substanzen und Körper benutzt werden, die detektierbare Strukturen darstellen oder ausbilden können. Mit Vorteil kann es sich um Mikrosphähren (Beads) (Fig. 6) in jeglicher Form und Größe wie Metall-, Magneto-, Silica- oder fluoreszenzmarkierte Beads, Fluoreszenz- oder radioaktive Marker, sowie Molekülkomplexe oder -aggregate, Schichten von Präzipitaten oder Farbstoffen handeln.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der optischen Detektion werden Silberkörnchen an einem mit Analytmolekülen gekoppelten Initiator, insbesondere einem Elektronendonator wie Metallmolekül- oder Metallkörnchen, am Ort der Interaktion, meistens einer Bindung, gebildet (Fig. 4). Bei einer weiteren bevorzugten Variante der optischen Detektion werden in einer Reaktion zwischen zwei oder mehr unterschiedlichen Bindungspartnern, wie beispielsweise einem Avidin oder Streptavidin, und einer weiteren mehrfach biotinylierten Substanz Molekülkomplexe gebildet (Fig. 5). Auch biologische Objekte geeigneter Größe wie Zellen, Bakterien, Pollen, Viruspartikel oder Teile davon können vorteilhaft als signalgebende Elemente verwendet werden.
In einer anderen vorteilhaften Ausführung kann die entstehende detektierbare Struktur auch durch Initiation einer chemischen Reaktion mit einer weiteren Substanz erzeugt werden. Dazu wird zusätzlich zum Sensorelement, welches mit der zu analysierenden Probe wechselwirken soll, eine weitere Substanz an definierten Stellen des Trägers aufgebracht. Diese Substanz wird durch die Wechselwirkung zwischen einem Analyten und dem dazugehörigen Sensorelement in eine detektierbare Struktur am Ort der Reaktion umgesetzt. So kann beispielsweise ein an das Analyt gekoppeltes Enzym wie Meerrettich Peroxidase (HRP) durch die Bindung des Analyten an das entsprechende Sensorelement eine enzymatische Umsetzung des auf dem Träger lokalisierten Substrats in ein signalgebendes Element initiieren. Die Reaktion wird entweder durch eine räumliche Annäherung zwischen Enzym und Subsrat oder durch eine Freisetzung des Substrats in die Lösung während der Wechselwirkung zwischen dem Sensorelement und dem Analyten oder unmittelbar danach ermöglicht.
Die Eigenschaften der nach einer Wechselwirkung zwischen einem Sensorelement und einem Analyten entstehenden detektierbaren Strukturen in Form von signalgebenden Elementen und die daraus resultierenden Signalpegel entsprechen dem auf dem Träger vorgegebenen digitalen Datenformat. Die Dimensionierung dieser Strukturen kann über verschiedene, dem Fachmann bekannte Methoden erfolgen. So kann beispielsweise über die stöchiometrischen Verhältnisse der eingesetzten Konzentrationen von Substanzen eine Sättigung bei der Bildung von signalgebenden Elementen erzielt werden, so daß nach dem Erreichen einer gewünschten Größe kein weiteres effektives Wachsen des signalgebenden Elements erfolgt. Alternativ können die zur Bildung von detektierbaren Strukturen führenden Reaktionen zeitgesteuert blockiert werden. Dazu können insbesondere Blockierungs-Substanzen wie Inhibitoren bei enzymatischen Reaktionen, Kompetitoren wie Biotin im Beispiel der Fig. 5, oder Substanzen, die freie Reaktanden zerstören wie beispielsweise spezifische Proteasen, eingesetzt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführung erfolgen die
Nachweisreaktionen in einem Durchflußsystem, so daß die beteiligten Reaktanden nach einer experimentell ermittelten optimalen Reaktionszeit, die für die Ausbildung detektierbarer Strukturen mit gewünschten Dimensionen notwendig ist, mit einem Puffer von den Reaktionsorten ausgespült werden können. Wenn es sich um katalytische Reaktionen handelt, können sie auch durch die Wegnahme oder Blockierung des Katalysators gestoppt werden. Bei lichtabhängigen Reaktionen führt ein Ausschalten der Lichtquelle ebenfalls zum kontrollierten Abbruch der Reaktion.
Vorteilhaft werden Nachweisfelder und signalgebende Elemente mit Abmessungen kleiner als lOμm, insbesondere kleiner als 2 μm und ganz besonders kleiner als 1 μm ausgebildet. Eine Beschränkung der Miniaturisierung nach unten ist lediglich durch die Auflösung der Detektionseinheit gegeben.
Durch die Festlegung der Reaktionsbedingungen und die Wahl der Reaktanden entstehen bei einer Wechselwirkung zwischen einem Sensorelement und einem Analyten detektierbare Strukturen, die in dem auf dem Träger vorher aufgebrachten Datenformat gelesen und digital interpretiert werden können. Auf diese Weise läßt sich das Ergebnis direkt als "Test positiv" oder "Test negativ" interpretieren, indem die Signale vor und nach dem Nachweis im Kontext der vorgegebenen Formatierung miteinander verglichen werden.
Eine molekulare Interaktion kann sowohl zur Generierung eines Zusatzsignals als auch zur
Reduzierung des Signalpegels durch das signalgebende Element führen. Das geeignete Kontrastverfahren, d.h. die Veränderung des Signalpegels durch das signalgebende Element, muß dabei in Abhängigkeit vom Standardprotokoll für den jeweiligen biochemischen Test, dem Meßverfahren und vom Analysenträger ausgewählt werden.
Ein erfolgter Nachweis des Analyten wird durch eine veränderte Signalstruktur, d.h. eine Signalpegeländerung von "Low" nach "High" oder von "High" nach "Low", und ein nichterfolgter Nachweis des Analyten durch ein unverändertes Signal gekennzeichnet. Anhand von nachfolgend beschriebenen Beispielen seien die vier möglichen Kontrastmechanismen für die bevorzugte Variante der optischen Detektion mittels Reflektions- und Transmissionsmessungen exemplarisch dargelegt.
1. "Low"-"High" -Übergang bei einer Reflektionsmessung. Dieser Fall liegt z.B. bei einer schwachreflektierenden Analysenträger-Oberfläche und einem spiegelnden signalgebenden Element vor. Ein solcher Kontrast kann beispielsweise mittels einer schwarzen Fläche ("Low"-Pegel) und einer durch den positiven Test induzierten Silberfällung als signalgebendes Element ("High"-Pegel) realisiert werden. Ein ähnliches Prinzip wird bei der Schwarz- Weiß-Photographie verwendet.
2. "High"-"Low"-Übergang bei einer Reflektionsmessung. Hier kann beispielsweise eine Bindung oder Erzeugung eines Streukörpers ("Low") als signalgebendes Element auf einer verspiegelten Träger-Oberfläche ("High") durch einen erfolgten Nachweis ausgelöst werden. Ein solcher Streukörper kann z.B. ein Bead oder ein Silberkörnchen sein.
3. "Low"-"High"-Übergang bei einer Transmissionsmessung. Dieser Fall liegt z.B. bei einem verspiegelten Analysenträger und einem signalgebenden Element in Form eines
Fensters vor. Das Fenster ("High") kann mittels einer lokalen, durch eine molekulare Interaktion mit dem Analyten induzierten Ätzung und damit verbundenen Auflösung der Spiegelschicht ("Low") auf den Nachweisfeldern erzeugt werden. Diese Methode ist vergleichbar mit den typischen lithographischen Ätzverfahren in der Halbleiterphysik.
4. "High"-"Low"-Übergang bei einer Transmissionsmessung. Dieser Fall liegt z.B. bei einem unverspiegelten und transparenten Analysenträger und einem spiegelnden oder streuenden signalgebenden Element vor. Realisiert werden kann ein solcher Kontrast z.B. anhand einer unbeschichteten Glasplatte ("High") mittels einer Silberfällung als signalgebendes Element ("Low"), ähnlich der Schwarz- Weiß-Photographie. Das Licht wird durch die Silberkörnchen gestreut und das Transmissionssignal dadurch gedämpft. Eine weitere Möglichkeit für ein signalgebendes Element stellt ein lichtstreuendes Bead dar.
Quantitative Aussagen können erfindunggemäß durch Mehrfachbestimmungen und / oder durch Konzentrationsreihen der Sensorelemente und / oder Analyten und nachfolgende Statistik gewonnen werden.
Lesegerät
Weiterhin umfaßt die Erfindung ein für den jeweiligen Analysenträger optimiertes Lesegerät, welches in vorteilhafter Ausführung ein halbautomatisches bzw. automatisches Positionieren, Durchführen und Auslesen des Trägers gestatten. Der Träger kann auch automatisch abgetastet werden.
Als Lesegerät wird vorzugsweise ein bestehendes Produkt aus der Konsumgüterelektronik verwendet oder neue Geräte aus den gängigen Detektions- und Mechanikeinheiten kombiniert. Als Beispiele seien hier die CD-, DVD-, Magnetkarten- und Barcode-Leser genannt.
In einer bevorzugten Ausführung entspricht das Lesegerät in seiner Mechanik und
Handhabung im Wesentlichen einem manuellen Magnetkartenleser. Das Lesegerät wird dabei entweder mechanisch fest installiert und der Analysenträger wird durchgezogen, oder der Analysenträger wird fest eingelegt und das Lesegerät wird linear unter Verwendung einer entsprechenden Mechanik über den Träger geführt.
In vorteilhafter Ausführung der Erfindung basiert das Lesegerät auf optischer Detektion. Das Lesegerät besteht im Wesentlichen aus einer ein- oder beidseitigen „Lichtschranke". Entsprechend der Signalart wird zur Detektion ein geeigneter Lesekopf verwendet. Das optische Lesegerät kann beispielhaft, aber nicht ausschließlich, die im Folgenden beschriebenen Ausführungsformen haben.
In einer besonders bevorzugten Ausführung wird ein kommerziell erhältlicher CD-Lesekopf verwendet, der mit Reflektion arbeitet (Fig. 7A). Alternativ verwendet man einen abgewandelten CD-Lesekopf, der im Gegensatz zu der im CD-Player verwendeten Ausleseeinheit zusätzlich auch mit Durchlicht oder alternativ nur mit Durchlicht arbeitet (Fig. 7B). In diesem Fall kann man auf die bei einer konventionellen CD notwendige Verspiegelung verzichten, was eine preiswertere Herstellung des Analysenträgers zur Folge hat.
Der Analysenträger kann mit Vorteil in beiden Ausrichtungen orientiert sein, d.h. mit der Vorderseite, also der mit Sensorelementen beschichteten Seite, zum oder weg von der Ausleseeinheit, z.B. einem CD-Lesekopf. Die geeignete Orientierung hängt vom auszuführenden biochemischen Nachweisprotokoll, dem jeweiligen signalgebenden Element, allgemeinen Randbedingungen, wie z.B. einer Verdeckung der Testflächen oder dem Basismaterial des Analysenträgers, und der Detektionsmethode, ab. So ist beispielsweise bei einer Reflektionsmessung die Orientierung einer verspiegelten Vorderseite mit einem lichtstreuenden signalgebenden Element zur optischen Ausleseeinheit von Vorteil, weil in diesem Fall ein streuendes Element auf einer Rückseite nicht erkannt werden würde. Dagegen ist bei einer gekapselten Flüssigkeitsführung mittels Kanalstrukturen auf dem Analyseträger im Fall von spiegelnden signalgebenden Elementen eine Orientierung der Vorderseite weg von der Ausleseeinheit von Vorteil. Anderenfalls müßte das Licht bei einer Reflektionsmessung die Kanalstrukturen durchlaufen, so daß Schmutz- und Störeffekte durch die Lösungen in den Strukturen entstehen könnten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird ein konventioneller Barcode-Leser verwendet, wenn die Nachweisfelder auf dem Träger in parallelen Streifen in einem Barcode- ähnlichen Muster angeordnet sind (Abb. 8A). In Erweiterung dieser Ausführung kann eine Vielzahl von parallelen Nachweisfeldern mit identischen Substanzen auf einem solchen
Teststreifen nebeneinander untergebracht sein. Dabei werden die Testergebnisse winkeltreu, z.B. orthogonal zur Leserichtung des Barcode-Lesers (Abb. 8B), ausgelesen. Damit besteht die Möglichkeit zur Mehrfachmessung bei einem durchgeführten Nachweis, um statistische Aussagen zu gewinnen. Alternativ kann ein derart unterteilter Teststreifen Nachweisfelder aufweisen, die unterschiedliche graduell angeodnete Konzentrationen von Sensorelementen enthalten, so daß quantitative Aussagen möglich sind. Auf diese Weise sind auf einem Träger Nachweise in Mikro- und Makrodimensionen in beliebiger Kombination realisierbar.
Die parallelen Spuren von Nachweisfeldern auf einem Analysenträger können vorteilhaft auch mit Multi-Fokus-Optiken, z.B. mit 7 Parallel-Lichtstrahlen, wie sie zum Teil schon in modernen CD-ROM Geräten verwendet werden, parallel ausgelesen werden. Auch die einzelnen Photo-Dioden eines CD-Lesekopfes, welche zur Spurführung dienen, können als Detektor herangezogen werden. Dabei wird ein HF-Filter als Trennsteller eingesetzt, um das Auslesesignal vom Spurführungssignal zu trennen. Prinzipiell kann die Detektion auch zweidimensional z.B. mit einer Kamera erfolgen. Sie ist im Falle einer flächigen Anordnung der Formatelemente z.B. im Falle des 2D-Barcodes besonders vorteilhaft.
Als Detektoren gleichermaßen geeignet wie CD-Leseköpfe sind deren Weiterentwicklungen, wie in CD-ROM-, CD-R- und DVD-Lesern verwendet, sowie magneto-optische und magnetische Detektoren, lineare CCD-Arrays oder Photodioden- Arrays.
Die Erfindung ist nicht auf eine optische Datenaufnahme beschränkt. Insbesondere magnetische Detektionsverfahren können wegen einer breiten Anwendung in der Konsumgütererelektronik als Analysenträger dienen. Als Beispiele seien hier Magnetkarten im Bankenwesen sowie Tonbänder und Festplatten in der Computerindustrie genannt. Die dazugehörigen Lesesysteme können nach unwesentlichen Anpassungen an die Geometrie des jeweiligen Analysenträgers als Lesegeräte genutzt werden.
Innerhalb des Lesegerätes sorgt ein Lesekopf vermittels eines senso-elektrischen Wandlers für die Generierung von Analogsignalen, welche durch Digitalwandlung und nachgeschaltete Mikroprozessor-Logik direkt für die Übertragung in einem Auswertesystem aufbereitet werden können.
Die Auswertung des Analyseträgers erfolgt in vier Schritten: a) Messung der analogen Signalpegel z.B. mittels eines CD-Pickups; b) Digitalisierung der analogen Signale, d.h. Erzeugung einer digitalen Signalabfolge anhand eines Schwellenkriteriums; c) Interpretation des digitalen Signalstroms anhand vordefinierter Formatstrukturen; d) Vergleich mit den innerhalb der Formatstruktur erlaubten Signalabfolgen.
Die Digitalisierung der analogen Signalpegel erfolgt in einem Standardgerät z.B. in einer elektronischen Baugruppe mit einer Standard AD-Wandlerlogi . Eine Bildverarbeitung entfällt, weil binäre Schwellenwertkriterien durch das Gerät vorgegeben sind (Fig. 9). Die Synchronisation der Datenaufnahme erfolgt automatisch anhand der vorgegebenen Abfolge von Nachweis-, Adress- und Leerfeldern. In weitergehender Ausführung kann vorgesehen sein, mit Hilfe von digitaler Signalverarbeitung (DSP, Mikroprozessor etc.) spezielle Merkmale der signalgebenden Elemente hervorzuheben oder zu unterdrücken, um eindeutige Aussagen zu erhalten. Dies kann z.B. mittels Filterung oder Frequenzanalyse erreicht werden, indem nur Signale mit spezifischen Charakteristika der signalgebenden Elemente und der Formatstrukturen bei der Auswertung berücksichtigt werden. Der einlaufende digitale Datenstrom wird in einem Interpreter darauf hin überprüft, ob die zeitliche Abfolge an Signalpegeln innerhalb des vorgegebenen Datenformats zulässig ist. Damit ist eine direkte Kontrolle und Fehlererkennung implementiert. Die zu analysierende Signalabfolge enthält auch die für den Test benötigte Positionsinformation. Eine Interpretation der erhaltenen Signalabfolge erfolgt durch einen Vergleich mit den erlaubten Abfolgen. Eine innerhalb der Codierung zulässige aber nicht erwartete Abfolge weißt eindeutig auf einen Fehler hin.
Eine Serie von Einzeltests auf einem Analysenträger läßt sich durch mehrere in Reihen angeordnete Abfolgen von Formatelementen realisieren. Im Falle einer CD sind die Formatelemente samt Nachweisfelder direkt in die Spur der Pits und Lands auf der CD eingebracht. Die Signalpegel, die Signallängen und auch die Interpretation der Signalabfolgen sind hier durch den "Red-book"-Standard der Firma Philips gegeben. Die Auswerteschritte a) bis c) sind in jedem Standard-CD-Player implementiert. Eine Auswertung des Tests erfolgt dann direkt durch einen Vergleich des vorgegebenen Eingangs- mit dem ausgelesenen Ausgangscodewort.
Das nachgeschaltete Rechnersystem benötigt zur Auswertung des auf dem Träger untergebrachten Tests spezielle Software, welche auf den jeweiligen Analysenträger zugeschnitten ist. Diese Software kann in vorteilhafter Ausführung in den auf dem gleichen Träger vorhandenen Datenbereichen aufgebracht sein. Wenn der Analysenträger in Form und Funktion entsprechend ausgebildet ist, können Lesegeräte wie Disketten- oder
Wechselplattenlaufwerke, CD-ROM Player oder vergleichbare Geräte und deren Nachfolger, mit denen der Träger prinzipiell kompatibel ist, zum Auslesen der Software verwendet werden. Vorteilhaft können auch mehrere Lesevorrichtungen in einem Gerät vorhanden sein. Die Analysesoftware kann auch auf optional auf dem Träger vorhandene Datenbanken zugreifen, um Standardwerte, die im Kontext der spezifischen Analyse benötigt werden, im Zugriff zu halten.
Anwendungen
Aufgrund der einfachen Handhabung und der schnellen und präzisen Aussagen über die Nachweisergebnisse kann die vorliegende Erfindung besonders vorteilhaft in biochemischen oder biomedizinischen Nachweisverfahren Anwendung finden. Die Erfindung umfaßt ferner die für einen Nachweis notwendigen Substanz-Zusammenstellungen ("Kits"). Im Einzelnen seien aufgeführt:
- Krankenhauslabore und Genetik-Beratung zur routinemäßigen Paralleldiagnose von genetischen Prädispositionen;
- Facharztpraxen zur sensitiven Detektion von Krankheitserregern, Bakterien, Viren, Autoimmun- und Tumorerkrankungen, immunologischen Überreaktionen und Stoffwechselerkrankungen;
- Pharmazeutische Industrie für Hochdurchsatz-Screening auf pharmazeutisch relevante Wirkstoffe und Qualitätskontrolle bei Wirkstoffproduktion;
- Molekularbiologie in der Grundlagenforschung zur Charakterisierung von Wechselwirkungen in komplexen Molekülgemischen;
- Pflanzengenetik und Hybridentwicklung zur Nutzpflanzenzüchtung für die Agrarwirtschaft, parallele Analyse von Pflanzenmerkmalen wie z.B. Gendaten;
- Umweltanalytik zur Bestimmung von Bodengütefaktoren, Verschmutzungen, Vorkommen von und Belastung durch Mikroorganismen;
- Tierärztliche Praxis zur gleichzeitigen Durchführung von biochemischen Tests und eindeutigen Identifizierung des Tieres vor Ort mithilfe einer Identifizierungsmarke, z.B. eines implantierbaren, berührungslos durch die Haut auslesbaren Mikrochips, welcher mit einem einfachen transportablen Gerät gelesen werden kann;
- Point-Of-Care Anwendung zur Durchführung von Diagnoseverfahren vor Ort, also bei einem Facharzt oder ambulant beim Patienten, z.B. für routinemäßig durchzuführende Tests wie Messung von Blutzucker, Blutfetten (LDL/HDL), Bestimmung des Immunstatus etc.;
- Nahrungsmittelindustrie zum Nachweis gentechnisch manipulierter Organismen, Überwachung von mikrobiologischen oder biochemischen Prozessen und
Qualitätskontrolle ;
- Agrarwirtschaft zur Entwicklung von Agrochemikalien . Weitere Möglichkeiten für die Anwendungen der erfindungsgemäßen Analyseplattform s α ebenso möglich und damit Gegenstand der Erfindung.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Nachweis von C-reaktivem Protein mittels Silberpräzipitat-Bildung
Ein Träger aus Polycarbonat wird in Ethanol / Wasser (1:2) im Ultraschall gereinigt. Danach wird ein monoklonaler Antikörper (Clone 5 (4C28), HyTest, Finnland) gegen humanes C- reaktives Protein (CRP) mittels eines Stempels aus Polydimethylsiloxan (PDMS) in einem Mikrokontakt-Druck- Verfahren auf definierte Bereiche des Trägers aufgedruckt. Der Stempel und der Träger werden dabei mit Hilfe einer Justiereinheit so zueinander angeordnet, dass eine genaue Positionierung von mindestens 5 μm gewährleistet ist. Der Träger wird danach 30 min mit einer Lösung von 1% bovinem Serumalbumin (BSA) geblockt. Nach dem Waschen mit Puffer (PBS, 10 mM Na-Phosphat, 145 mM NaCl, 4 mM KC1, pH 7.4) wird der Trägers 30 min mit einer das CRP-Protein enthaltenden Testprobe inkubiert. Nach dem erneuten Waschen mit PBS wird der Träger 30 min mit einem zweiten, biotinylierten, gegen ein anderes Epitop von CRP gerichteten monoklonalen Antikörper (Clone 7 (4C29), HyTest, Finnland; in 1% BSA in PBS, 1:300 der Stocklösung), inkubiert. Zum Nachweis der erfolgten Bindung mittels eines Sandwich-Immunoassays (Fig. 4) wird der Träger 20 min mit einem mit lnm-Kolloidgoldpartikel konjugierten anti-Biotin Antikörper inkubiert, der 1:400 in 1%BSA in PBS verdünnt ist. Nach dem Waschen wird eine Silberlösung zugegeben. Diese besteht in einer vorteilhafter Ausführung aus 110mg Silberlaktat, 850mg Hydroquinon (alternativ: Pyrogallol), 2,55g Zitronensäuremonohydrat, 2,35g Tri-Natriumcitrat ad 100ml Wasser, welche direkt vor der Reaktion frisch angesetzt wird. Um eine gleichmässigere Präzipitatbildung zu gewährleisten, können der Silberlösung weitere Zusätze wie z.B. UV- Blocker und Reaktionshemmer wie Gummi Arabicum zugesetzt werden. Nach 2-4 min im Dunkeln wird die Reaktion durch Waschen mit destilliertem Wasser gestoppt und anschließend mit 3% (w/v) Natriumthiosulfat in Wasser für 5 min rückentwickelt. Alternativ kann anstelle von Silberlactat Silberacetat verwendet werden; in diesem Fall findet die Reaktion nicht im Dunkeln, sondern 15 min unter normalem Tageslicht statt. In einer weiteren vorteilhaften Ausführung kann stattdessen eine dem Fachmann aus der Immunhistologie bekannte kommerzielle "Silver-Enhancemenf'-Lösung (z.B. von Sigma- Chemie, München) verwendet werden. Nach erneutem Waschen mit destilliertem Wasser wird der Träger in einem im Wesentlichen handelsüblichen CD-Lesekopf ausgelesen. Beispiel 2: Nachweis von C-reaktivem Protein mittels alkalischer Phosphatase
Ein Träger wird analog zum Beispiel 1 vorbehandelt und prozessiert. An Stelle des anti- Biotin Antikörpers wird nun aber ein Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben (Sigma-Chemie, München; 20 min, in 1%BSA in PBS, 0.5 mg/ml) und danach gewaschen. Zur Signalentwicklung wird der Träger 10 min mit ELF-97 Phosphatase-Substrat (Molecular Probes, 5mM in AP-Puffer: 150 mM NaCl; 1 mM MgC12; 1% BSA, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5) inkubiert und danach gründlich gewaschen. Das durch das Enzym umgewandelte Substrat präzipitiert am Ort der Umwandlung. Alternativ können andere Substrate und auch andere Detektionsenzym-Komplexe angewendet werden, z.B. alkalische Phosphatase mit BCIP/NBT von Sigma-Chemie; Streptavidin-Peroxidase-Konjugat von Röche mit 4-Chloro-l-Naphthol von Sigma-Chemie; Peroxidase mit DAP/Co von Sigma- Chemie).
Beispiel 3: Nachweis von Proteinen über die Bildung von Molekülkomplexen
Biotinylierte Antikörper gegen ein gesuchtes Protein werden mit einer Patienten-Serumprobe, welche vorher 1:3 in PBS (s.o.) verdünnt wurde, gemischt. Die Mischung wird 10 min. bei 13000xg zentrifugiert und der Überstand auf einen Detektionsträger aufgebracht, welcher an bestimmten Stellen in einem Vorgang analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen mit einem weiteren Antikörper beschichtet ist, welcher ein anderes Epitop auf dem aus dem Serum nachzuweisenden Protein bindet. Nach dreißigminütiger Inkubation bei Raumtemperatur und dreifachem Waschen in PBS wird ein in auf 4°C gekühltem PBS frisch angesetztes Gemisch aus core-Streptavidin und biotinyliertem Ferritin auf den Detektionsträger aufgebracht. Das Ferritin wurde dabei mit einem Kit nach Stand der Technik derart biotinyliert, daß durchschnittlich 4-10 Biotin-Moleküle pro Ferritin-Tetramer gebunden sind. Innerhalb einer Inkubationszeit von typischerweise 30 Minuten bilden sich bei einem bestimmten Gehalt des gesuchten Proteins große kreuzvernetzte Komplexe an den Stellen, an denen der Träger mit dem entsprechenden Antikörper beschichtet ist (Fig. 5). Diese Komplexe sind optisch zu detektieren, ihre Anordnung wird im Weiteren analog zu Beispiel 1 ausgelesen und nachgewiesen.
Beispiel 4: Nachweis von DNA Sequenzen über die Bildung von Silberpräzipitaten
Die DNA-Oligonukleotide, die eine endständige Amingruppe tragen, werden auf aminierten Polycarbonat-Trägern (Aminopropyltriethoxysilane, Fluka) mittels Standardverfahren, z.B. Crosslinker BS3, Pierce, immobilisiert. Die Einzelstrang-DNA dient als Sensormolekül zur Bindung von Zielsequenzen-DNA, die in einer PCR-Reaktion biotinyliert ist. Nach einer Hybridiseirung kann die Ziel-DNA mittels Streptavidin-kolloidales Gold und Silberfällungsreaktion sichtbar gemacht und mit Hilfe eines CD-Lesekopfes detektiert werden.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Nachweis und / oder zur Quantifizierung von mindestens einem Analyten in einer Probe auf einem Analysenträger, wobei mindestens eine definierte Abfolge von Feldern auf der Oberfläche des Analysenträgers aufgebracht ist, dadurch gekennzeichnet, daß
- Eine Teilmenge der Felder Nachweisfelder darstellt;
- Auf jedem Feld ein Signal einer Sorte vorhanden ist;
Signale mindestens einer definierten Abfolge von Feldern als digitales Codewort interpretiert werden können;
- Sensorelemente gezielt auf den Nachweisfeldern aufgebracht sind;
- Analyten mit dem Analysenträger zum Zweck einer molekularen Interaktion mit den Sensorelementen auf den Nachweisfeldern in Kontakt gebracht werden;
Bei einer erfolgten molekularen Interaktion signalgebende Elemente auf den Nachweisfeldern lokalisiert sind;
- Durch die Lokalisation signalgebender Elemente eine Sorte des Signals auf dem
Nachweisfeld, auf dem die molekulare Interaktion stattgefunden hat, gegen eine andere Sorte des Signals in vorgegebener Weise ausgetauscht wird;
- Nach dem Austausch von einem Signal einer Sorte gegen ein Signal anderer Sorte auf mindestens einem Nachweisfeld innerhalb einer definierten Abfolge von Feldern die Interpretation dieser Abfolge von Feldern ein anderes Codewort ergibt als vor der molekularen Interaktion;
- Der Vergleich des gelesenen Codewortes nach dem Nachweis mit dem bekannten Codewort vor dem Nachweis das Nachweisergebnis ergibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Austausch von einem Signal einer Sorte gegen ein Signal anderer Sorte auf einem Nicht-Nachweisfeld innerhalb einer definierten Abfolge von Feldern bei der Interpretation als ein Fehler erkannt wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Signale auf den Feldern in einem aus digitalen Speichertechnologien bekannten Format gelesen und interpretiert werden können.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die signalgebenden Elemente derart ausgebildet und lokalisiert sind, daß sie in einem aus digitalen Speichertechnologien bekannten Format gelesen und interpretiert werden können.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine bestimmte Anzahl von Codewörtern keine Nachweisfelder aufweist und zur Trennung und / oder Adressierug größerer Codeblöcke genutzt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Sensorelemente einer Sorte mindestens einem definierten Nachweisfeld auf dem Analysenträger eindeutig zugeordnet werden können und umgekehrt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Felder auf dem Analysenträger punktförmig, streifenförmig, kreisförmig, spiralförmig sind oder eine sonstige geometrische Form aufweisen.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Felder auf dem Analysenträger in Form einer Punktmatrix, einer kreisförmigen, spiralförmigen, streifenförmigen, linearen oder sonstigen geometrischen oder stochastischen Struktur angeordnet sind.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Abfolgen von definierten Feldern, die Codewörter representieren, auf dem Analysenträger hintereinander in Form einer Spur angeordnet sind.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Spuren kreisförmig, spiralförmig, linear oder in einer sonstigen definierten Weise auf dem Analysenträger angeordnet sind.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß als Sensorelemente biologisch aktive Substanzen wie Zucker, Steroide, Hormone, Lipide,
Proteine, insbesondere mono- oder polyklonale oder rekombinante Antikörper, Peptide, Antigene aller Art, Haptene, DNA, RNA sowie natürliche und artifizielle Derivate hiervon, insbesondere Aptamere und PNA, organisch-chemische Wirkstoff-Bibliotheken, Zellen, Mikroorganismen, Viren oder Teile davon, Präparationen und Extrakte aus biologischen Materialien, Stoffwechselmetaboliten und dergleichen verwendet werden können.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß zur Erzeugung der Signale alle resonanten Prozesse wie Absorption, Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Plasmonenresonanz, Quenching etc., und nichtresonanten Prozesse wie Reflektion, Beugung, Streuung etc., aus der Spektroskopie verwendet werden können.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß zur Erzeugung der Signale elektromagnetische Effekte, wie Piezo, Resonanzverschiebung, Kapazitätsänderung, Halleffekt, magnetische Effekte, elektrische Ladungsverschiebung etc., verwendet werden können.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß als signalgebende Elemente Mikrosphären in jeglicher Form und Größe wie Metall-, Magneto-, Silica- oder fluoreszenzmarkierte Beads, Fluoreszenz- oder radioaktive Marker, sowie Molekülkomplexe oder -aggregate, Schichten von Präzipitaten,oder Farbstoffen verwendet werden.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß als signalgebende Elemente biologische Objekte wie Zellen, Bakterien, Pollen, Viruspartikel oder Teile davon verwendet werden können.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß als signalgebende Elemente Körper und Beschichtungen, insbesondere Metallkörnchen, an einem mit Analyt-Molekülen gekoppelten Initiator, insbesondere einem Elektronendonator, am Ort der Interaktion gebildet werden.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß zur Bildung von signalgebenden Elementen eine Bindungs-, Polymerisations-, Fällungs-, Abscheidungs-, Färb- oder sonstige chemische oder biochemische Reaktionen eingesetzt werden.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Digitalisierung der von den signalgebenden Elementen erzeugten Signale mittels eines
Schwellenkriteriums erfolgt.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Abmessungen der signalgebenden Elemente an die Dimensionen der Nachweisfelder angepasst werden können.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die signalgebenden Elemente derart ausgebildet sind, daß auf jedem Nachweisfeld genau ein signalgebendes Element lokalisiert ist.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Felder und die signalgebenden Elemente die Abmessungen kleiner als lOμm, bevorzugt kleiner als 2 μm und insbesondere kleiner als 1 μm aufweisen können.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Quantifizierung des Analyten in der Probe anhand von Kalibrierfeldern, definierter Schwellenwertkriterien und / oder einer Statistik über Mehrfachbestimmung erfolgt.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß auf dem Analysenträger eine Synchronisationsspur mit standardisierten Substanzen, Oberflächenbeschichtungen oder sonstigen Strukturen zur Kalibrierung des Lesegerätes und der Detektion aufgebracht ist.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß auf definierten Nachweisfeldern und / oder auf nebeneinander oder nachfolgend angeordneten Reihen solcher Nachweisfelder Standard-Substanzen zur Positiv- oder
Negativkontrollen aufgebracht sind.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß auf definierten Nachweisfeldern und/oder auf nebeneinander oder nachfolgend angeordneten Reihen solcher Nachweisfelder unterschiedliche Konzentrationen von Sensorelementen einer Sorte aufgebracht sind.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß auf dem Analysenträger beliebige Kombination von konventionellen Datenspeichern wie Magnetstreifen, Kartenchips, Barcodes, CD-ROM und CD-R integriert sind.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß auf dem Analysenträger Software, Datenbanken, Signaturen und sonstige Informationen in beliebiger Zusammenstellung vorhanden sind.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß auf dem Analysenträger eine Verschlüsselung oder Kennzeichnung des auf dem Analysenträger auszuführenden Nachweises im gleichen oder einem anderen separat aufgebrachten Format vorhanden ist.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Felder derart ausgebildet und angeordnet sind, daß sie mittels eines handelsüblichen Barcode-Lesegerätes ausgelesen werden können.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß der Analysenträger in seinen physikalischen Eigenschaften, wie Form, Material, optische Dichte, Materialstärke, sowie Handhabung, mit einer aus den Massenspeichertechnologien bekannten Magnetkarte vergleichbar ist.
31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß der Analysenträger in seinen physikalischen Eigenschaften, wie Form, Material, optische Dichte, Materialstärke, sowie Handhabung, mit einer aus den
Massenspeichertechnologien bekannten CD, CD-ROM, DVD, oder deren Abkömmlingen entspricht.
32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Felder auf dem Analysenträger in Form einer spiralig aufgebrachten CD-Datenspur angeordnet sind.
33. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß auf dem Analysenträger eine oder mehr beschreibbare Datenspuren aufgebracht sind.
34. Analysenträger, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine der in den vorhergehenden Ansprüchen beschriebenen Eigenschaften aufweist.
35. Gerät zum Auslesen des nach dem Anspruch 34 beschriebenen Analysenträgers, gekennzeichnet durch mindestens eines der folgenden Merkmale:
- Einrichtungen für Durchlicht und / oder Auflicht-Detektion;
- Einrichtungen für magnetische oder elektrische Detektion;
- Einrichtung zum automatischen Auffinden der Nachweisfelder;
- Einrichtung zum manuellen, halbautomatischen und automatischen Durchziehen des Analysenträgers durch das Gerät samt geeigneter mechanischer Führung;
- Einrichtung zur Erfassung von analogen Signalen;
- Einrichtung zur Digitalisierung der analogen Signale; - Einrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Synchronisation der Erfassung von analogen und
/ oder digitalen Signalen;
- Einrichtung zur Fehlerkorrektur beim Auslesen und / oder bei der Interpretation von
Signalen.
36. Kit, enthaltend die wesentlichen Substanzen zur Herstellung eines im Ansprach 34 beschriebenen Analysenträgers.
37. Kit, enthaltend die wesentlichen Substanzen zur Durchführung einer oder mehrerer Nachweise auf einem im Anspruch 34 beschriebenen Analysenträger.
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