DE112013003156T5 - Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse und Biomaterial-Analysevorrichtung - Google Patents

Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse und Biomaterial-Analysevorrichtung Download PDF

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c/o HITACHI HIGH-TECHNOLOGIES C Fujioka Michiru
c/o HITACHI HIGH-TECHNOLOGIES Haga Takanobu
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Abstract

Bei einer Biomaterialanalyse wird eine fehlerhafte Detektion von Fluoreszenz emittierenden Teilchen verhindert und wird eine hochempfindliche und hochgenaue optische Detektion ausgeführt. Eine Durchflusszelle (104) für die Biomaterialanalyse weist Folgendes auf: ein lichtdurchlässiges oberes Substrat (310), ein antireflektierendes unteres Substrat (313) und einen Innenschichtabschnitt, der zwischen dem oberen Substrat (310) und dem unteren Substrat (313) angeordnet ist und einen Durchflussweg (311) aufweist, in dem Teilchen (312), die Fluoreszenz emittieren sollen, bereitgestellt sind. Eine Biomaterial-Analysevorrichtung weist Folgendes auf: eine Durchflusszelle (104) zur Biomaterialanalyse, wie vorstehend beschrieben, und eine Bestrahlungseinheit, die dafür ausgelegt ist, Anregungslicht einzustrahlen, und eine optische Detektionseinheit (106), die dafür ausgelegt ist, von den Teilchen (312) emittierte Fluoreszenz zu detektieren.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse und eine Biomaterial-Analysevorrichtung.
  • STAND DER TECHNIK
  • Vor kurzem wurde eine neue Technologie zum Bestimmen von DNA- oder RNA-Basensequenzen entwickelt. Es wurde ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem eine große Anzahl zu analysierender DNA-Fragmente an einem Substrat befestigt wird und Basensequenzen solcher DNA-Fragmente parallel bestimmt werden.
  • In Nicht-Patentdokument 1 werden Teilchen als Träger zum Tragen von DNA-Fragmenten verwendet und wird die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) an den Teilchen ausgeführt. Dann werden PCR-amplifizierte DNA-Fragmente tragende Teilchen in eine Platte eingebracht, die mit vielen Löchern versehen ist, deren Durchmesser mit der Größe der Teilchen übereinstimmt, und es werden Basensequenzen unter Verwendung eines Pyrosequenzierungsverfahrens gelesen.
  • In Nicht-Patentdokument 2 werden Teilchen als Träger zum Tragen von DNA-Fragmenten verwendet, und die PCR wird an den Teilchen ausgeführt. Dann werden die Teilchen gestreut und an einem Glassubstrat befestigt, und es wird eine Enzymreaktion (Ligation) an dem Glassubstrat ausgeführt. Anschließend wird die Fluoreszenz detektiert, indem fluoreszierende Pigmente in ein Substrat aufgenommen werden. Auf diese Weise werden Sequenzinformationen über jedes der Fragmente erhalten. Beim in Nicht-Patentdokument 2 offenbarten Verfahren wird das Glassubstrat als Durchflusszelle verwendet.
  • Hier weist die Durchflusszelle einen Durchflussweg in einem oder mehreren Kanälen auf und weist auch ein Abstandselement auf, das sandwichförmig zwischen Glassubstrate gebondet oder geschweißt ist. Die Teilchen, welche die DNA-Fragmente tragen, sind an einer Innenwand des Durchflusswegs in der Durchflusszelle angebracht. Ein Bereich, der Zehntausende bis Hunderttausende der Teilchen aufweist, wird insgesamt mit Anregungslicht bestrahlt, und die von den Zehntausenden bis Hunderttausenden Teilchen emittierte Fluoreszenz (genauer gesagt die von fluoreszierenden Pigmenten, welche in die an den Teilchen befestigten DNA-Fragmente aufgenommen sind, emittierte Fluoreszenz) wird auf einmal mit einer Kamera detektiert. Ein optisches Detektionssystem, welches die Kamera aufweist, hat eine optische. Auflösung und eine Funktion zum Messen der Lichtintensität, wodurch es möglich ist, die Position von jedem der Teilchen zu spezifizieren. Das optische Detektionssystem detektiert, wo sich die Teilchen befinden und wie intensiv das von diesen Teilchen emittierte Licht ist.
  • Wie vorstehend beschrieben, wurde ein Verfahren zum parallelen Bestimmen von Sequenzinformationen vieler Fragmente durch Befestigen vieler Nukleinsäurefragmentproben an einem Substrat entwickelt und praktisch verwirklicht.
  • Die Patentdokumente 1 bis 3 offenbaren ein Verfahren zum Analysieren einer Basensequenz eines DNA-Fragments unter Verwendung einer Mikrofluidvorrichtung mit an verschiedenen Trägern befestigten DNA-Fragmenten.
  • DOKUMENT AUS DEM STAND DER TECHNIK
  • PATENTDOKUMENT
    • Patentdokument 1: japanische Patentanmeldung 2005-224110
    • Patentdokument 2: japanische Patentanmeldung 2005-130795
    • Patentdokument 3: japanische Patentanmeldung 2004-333255
  • NICHT-PATENTDOKUMENT
    • Nicht-Patentdokument 1: Marcel Margulies u. a., Nature, 2005, Band 437, S. 376–380
    • Nicht-Patentdokument 2: Jay Shendure u. a., Science, 2005, Band 309, S. 1728–1732
  • KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
  • DURCH DIE ERFINDUNG ZU LÖSENDES PROBLEM
  • Bei der DNA-Basensequenzanalyse unter Verwendung einer Durchflusszelle muss die Fluoreszenz, die von Teilchen emittiert wird, welche individuell verschiedene DNA-Fragmente binden, die an der Durchflusszelle bereitgestellt sind, genau erkannt werden und müssen ihre Positionen, Farben und Lichtintensitäten gleichzeitig detektiert werden. Es kann Zehntausende Teilchen geben, und es ist eine sehr hohe Messgenauigkeit für die Detektion der von diesen Teilchen emittierten Fluoreszenz erforderlich. Wegen der Struktur der Durchflusszelle interferieren die von benachbarten Teilchen emittierten Lichtstrahlen jedoch miteinander. Demgemäß wurde herausgefunden, dass das Problem besteht, dass die Genauigkeit der DNA-Basensequenzanalyse nicht über ein bestimmtes Niveau hinaus erhöht werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung wurde unter Berücksichtigung der vorstehend erwähnten Umstände gemacht. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine fehlerhafte Detektion Fluoreszenz emittierender Teilchen zu verhindern und eine hochempfindliche und hochgenaue optische Detektion bei der Biomaterialanalyse zu ermöglichen.
  • LÖSUNG DES PROBLEMS
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben intensiv untersucht, warum sich die Genauigkeit der Analyse der von Zehntausenden von Teilchen, die an der Durchflusszelle bereitgestellt sind, emittierten Fluoreszenz nicht über ein bestimmtes Niveau erhöhen lässt. Als Ergebnis haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass Licht, das von Teilchen emittiert wird, die an zu analysierende Teilchen angrenzen, von einer Grenzfläche zwischen einem unteren Substrat, das in der Durchflusszelle enthalten ist, und einer äußeren Luftschicht reflektiert wird und mit Licht gemischt wird, das von den zu analysierenden Teilchen emittiert wird, wodurch ein Analysefehler hervorgerufen wird.
  • Eine Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung weist Folgendes auf: ein lichtdurchlässiges oberes Substrat, ein antireflektierendes unteres Substrat und einen Innenschichtabschnitt, der zwischen dem oberen Substrat und dem unteren Substrat angeordnet ist und einen Durchflussweg aufweist, in dem Teilchen, die Fluoreszenz emittieren sollen, bereitgestellt sind. Eine Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung weist Folgendes auf: ein lichtdurchlässiges oberes Substrat, ein lichtdurchlässiges unteres Substrat und einen Innenschichtabschnitt, der zwischen dem oberen Substrat und dem unteren Substrat angeordnet ist, wobei der Innenschichtabschnitt Folgendes aufweist: einen Durchflussweg, in dem Teilchen bereitgestellt sind, die Fluoreszenz emittieren sollen, und ein antireflektierendes Abstandselement. Eine Biomaterial-Analysevorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung weist Folgendes auf: eine Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse, wie vorstehend beschrieben, und eine Bestrahlungseinheit, die dafür ausgelegt ist, Anregungslicht einzustrahlen, und eine optische Detektionseinheit, die dafür ausgelegt ist, von den Teilchen emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
  • VORTEILHAFTE WIRKUNGEN DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung verhindert eine fehlerhafte Detektion Fluoreszenz emittierender Teilchen und ermöglicht eine hochempfindliche und hochgenaue optische Detektion bei der Biomaterialanalyse.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
  • Es zeigen:
  • 1 ein schematisches Diagramm einer Biomaterial-Analysevorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
  • 2 ein Diagramm, welches zeigt, wie eine Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse an der Biomaterial-Analysevorrichtung gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung angebracht wird,
  • 3 eine schematische Teil-Schnittansicht der Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse und der Biomaterial-Analysevorrichtung gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
  • 4A eine schematische Teil-Schnittansicht der Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
  • 4B eine teilweise vergrößerte Ansicht von 4A,
  • 5A eine schematische Teil-Schnittansicht einer Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse gemäß einem Vergleichsbeispiel,
  • 5B eine teilweise vergrößerte Ansicht von 5A und
  • 6 ein Diagramm einer Konfiguration der Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • AUSFÜHRUNGSFORMEN ZUM VERWIRKLICHEN DER ERFINDUNG
  • Mit Bezug auf die Zeichnung werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nachstehend detailliert beschrieben. Es sei bemerkt, dass die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nicht auf die folgenden Ausführungsformen beschränkt sind. Jedoch sind Inhalte, die in den 1 bis 3 und der nachstehenden Beschreibung in Bezug auf die 1 bis 3 dargestellt sind, den Ausführungsformen und einem Vergleichsbeispiel der vorliegenden Erfindung gemeinsam.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet ein Biomaterial eine chemische Substanz, welche irgendeine Art von Funktionen innerhalb eines biologischen Körpers erfüllt, wie eine Nukleinsäure in der Art von DNA und RNA, ein Protein, ein Peptid, ein Antikörper und ein Antigen. Insbesondere bedeutet das Biomaterial eine chemische Substanz, die eine hoch geordnete Struktur aufweist, in der eine große Anzahl chemischer Substanzen, die jeweils als eine Einheit dienen, verbunden sind und durch die Anordnung der chemischen Substanzen als individuelle Einheiten Funktionen als das Gesamt-Biomaterial ausüben. Gemäß der vorliegenden Erfindung haben insbesondere Nukleinsäuren unter diesen Biomaterialien eine solche Eigenschaft.
  • Verschiedene Biomaterialanalysen werden unter Verwendung einer Durchflusszelle für die Biomaterialanalyse unter einer Biomaterial-Analysevorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt. Beispielsweise kann eine Bestimmung der DNA-Anordnung (DNA-Sequenz) und der Hybridisierung ausgeführt werden.
  • Mit Bezug auf 1 wird ein Überblick der Biomaterial-Analysevorrichtung gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben. Hier erfolgt die Beschreibung unter Verwendung einer Nukleinsäure als ein Ziel-Biomaterial.
  • Eine Biomaterial-Analysevorrichtung (Nukleinsäure-Analysevorrichtung) 101 gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist Folgendes auf: einen Reagenskühl- und -lagerkasten 102 zum Aufnehmen von Reagensbehältern und dergleichen, einen Flüssigkeitsabgabemechanismus 103 zum Abgeben einer Reaktionsflüssigkeit in jeden der Reagensbehälter, eine Durchflusszelle 104 mit einem Durchflussweg, worin DNA-Fragmente bindende Teilchen bereitgestellt sind, ein Temperatursteuersubstrat 105, das dafür ausgelegt ist, die Temperatur des Durchflusswegs in der Durchflusszelle 104 zu steuern, und eine optische Detektionseinheit 106, die dafür ausgelegt ist, die von fluoreszierenden Substanzen, welche in die an die Teilchen gebundenen DNA-Fragmente aufgenommen sind, emittierte Fluoreszenz zu detektieren. Eine Reaktionsflüssigkeit für die Nukleinsäureanalyse wird dem vorab eingestellten Durchflussweg in der Durchflusszelle 104 durch den Flüssigkeitsabgabemechanismus 103 zugeführt. Die Reaktionsflüssigkeit bewirkt eine Verlängerungsreaktion an den Teilchen in der Durchflusszelle 104, und die in die DNA-Fragmente aufgenommenen fluoreszierenden Substanzen emittieren die Fluoreszenz. Die optische Detektionseinheit 106 detektiert die emittierte Fluoreszenz für die Basensequenzanalyse. Überschüssige Reaktionsflüssigkeit, Reinigungsflüssigkeit und dergleichen werden nach der Reaktion in einem Abfalltank 107 untergebracht.
  • Gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließen Beispiele eines DNA-Sequenzanalyseverfahrens ein Beispiel ein, das eine schrittweise Ligation (Sequenzierung durch Oligonukleotid-Ligation und -Detektion) verwendet, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die schrittweise Ligation ist ein Verfahren zum sequenziellen Binden durch Fluoreszenz markierter Proben durch Verwenden einsträngiger DNA an den Teilchen als ein Template und durch anschließendes Bestimmen einer Sequenz für jeweils zwei Basen. Bei einer durch Ligase hervorgerufenen Enzymreaktion werden Oligonukleotide gebunden, die einen einer Zielsequenz der DNA-Fragmente entsprechenden fluoreszierenden Abschnitt aufweisen, um die Verlängerungsreaktion hervorzurufen. Nach Abschluss der Reaktion wird der fluoreszierende Abschnitt mit vier Farben von Anregungslicht bestrahlt, und die optische Detektionseinheit detektiert die Fluoreszenz. Danach wird der fluoreszierende Abschnitt abgetrennt, und es wird dann eine weitere Verlängerungsreaktion ausgeführt, um die der nächsten Sequenz entsprechende Fluoreszenz zu detektieren. Durch Wiederholen des vorstehend erwähnten Vorgangs werden Basensequenzen, die vier Fluoreszenzfarben entsprechen, nacheinander bestimmt, was zu einer Basensequenz der DNA-Fragmente führt. Dieses Verfahren ermöglicht eine Sequenzierung von mehreren zehn bis hundert bp pro Zyklus und eine Datenanalyse von mehreren zehn Gb pro Durchlauf. Bei der schrittweisen Ligation werden durch Fluoreszenz markierte Oligonukleotide wiederholt hybridisiert, wodurch eine parallele Sequenzierung ermöglicht wird.
  • 2 ist ein Diagramm, das zeigt, wie die Durchflusszelle für die Biomaterialanalyse an der Biomaterial-Analysevorrichtung gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung angebracht wird. Die Durchflusszelle 104 für die Biomaterialanalyse (welche nachstehend als ”Durchflusszelle” bezeichnet werden kann) wird auf dem Temperatursteuersubstrat 105 mit einer hohen Flachheit angeordnet und an einen Anbringungsteil 109 in der Biomaterial-Analysevorrichtung angepasst, indem eine Abdeckung 108 gegen den Anbringungsteil gedrückt wird. Eine große Anzahl von Durchflusszellen 104 kann parallel angeordnet werden. In 2 sind sechs Durchflusszellen 104 parallel angeordnet.
  • Überdies ist es zum Erleichtern einer Reaktion zwischen den DNA-Fragmenten und der Reaktionsflüssigkeit bevorzugt, dass die Biomaterial-Analysevorrichtung das Temperatursteuersubstrat 105 aufweist, um die Temperatur des Durchflusswegs in jeder der Durchflusszellen 104 zu steuern.
  • 3 ist eine schematische Teil-Schnittansicht der Durchflusszelle für die Biomaterialanalyse und der Biomaterial-Analysevorrichtung gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. 3 ist eine Schnittansicht entlang der Linie A-A in 2.
  • Eine Bestrahlungseinheit zum Einstrahlen von Anregungslicht weist eine Lampe 301, einen Spiegel 303 und eine Objektivlinse 304 auf. Das von der Lampe 301 zum Anregen der fluoreszierenden Substanzen emittierte Anregungslicht 302 wird vom Spiegel 303 reflektiert. Das Anregungslicht 302 läuft nach der Reflexion durch die Objektivlinse 304 und wird von oben auf die Teilchen 312 eingestrahlt, die in einem Durchflussweg 311 in einem Innenschichtabschnitt der auf dem Temperatursteuersubstrat 105 angeordneten Durchflusszelle 104 bereitgestellt sind. Die fluoreszierenden Substanzen, die auf den Oberflächen der Teilchen 312 vorhanden sind, werden durch das Anregungslicht 302 angeregt, Fluoreszenz 307 zu emittieren. Die Fluoreszenz 307 tritt durch die darüber liegende Objektivlinse 304 hindurch und tritt durch den Spiegel 303 und die Linse 305 hindurch, bevor sie eine in der optischen Detektionseinheit 106 vorhandene Kamera erreicht, die dazu dient, die von den Teilchen 312 emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
  • Die Durchflusszelle 104 weist ein lichtdurchlässiges oberes Substrat 310, ein unteres Substrat 313 und einen zwischen dem oberen Substrat 310 und dem unteren Substrat 313 angeordneten Innenschichtabschnitt auf, und es ist darin ein Durchflussweg 311 aufgenommen, in dem die Teilchen 312, welche die Fluoreszenz emittieren sollen, bereitgestellt sind. Die Durchflusszelle 104 weist an beiden Seiten des Durchflusswegs 311 im Innenschichtabschnitt einen Einlass 314, von dem die Reaktionsflüssigkeit eingebracht wird, und einen Auslass 316, von dem die Reaktionsflüssigkeit abgegeben wird, auf.
  • Die Teilchen 312, welche die Fluoreszenz emittieren, sind innerhalb des Durchflusswegs 311 im Innenschichtabschnitt der Durchflusszelle 104 bereitgestellt und können an jeder beliebigen Position bereitgestellt werden, solange die optische Detektionseinheit 106 die von den Teilchen 312 emittierte Fluoreszenz detektieren kann. In 3 sind die Teilchen 312, welche die Fluoreszenz emittieren, im oberen Teil des Durchflusswegs 311 im Innenschichtabschnitt der Durchflusszelle 104, d. h. unterhalb der unteren Fläche des oberen Substrats 310, bereitgestellt.
  • Es gibt auch einen Spalt, d. h. eine Luftschicht 315 zwischen der Durchflusszelle 104 und dem Temperatursteuersubstrat 105. Dies liegt daran, dass die Vorrichtung in einem Zustand schwer herstellbar ist, in dem die untere Fläche der Durchflusszelle 104 vollständig mit der oberen Fläche des Temperatursteuersubstrats 105 übereinstimmt.
  • 4A ist eine schematische Teil-Schnittansicht der Durchflusszelle für die Biomaterialanalyse gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. 4B ist eine teilweise vergrößerte Ansicht von 4A. Die 4A und 4B sind beide Schnittansichten entlang der Linie B-B in 2. Wenngleich die sechs Durchflusszellen 104 in 2 parallel angeordnet sind, zeigt 4A nur drei von ihnen.
  • In 4A weist die Durchflusszelle 104 wie im Fall von 3 das lichtdurchlässige obere Substrat 310, das untere Substrat 313 und den zwischen dem oberen Substrat 310 und dem unteren Substrat 313 eingefügten Innenschichtabschnitt auf und weist den Durchflussweg 311 auf, in dem die Teilchen 312 bereitgestellt sind, welche die Fluoreszenz emittieren sollen. Beide Enden des Durchflusswegs 311 sind durch Abstandselemente 407 hermetisch gedichtet. Weil die Durchflusszelle 104 etwas gekrümmt ist, gibt es einen Spalt, d. h. die Luftschicht 315 zwischen der Durchflusszelle 104 und dem Temperatursteuersubstrat 105. Ferner gibt es gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine antireflektierende Materialschicht 406 auf der Seitenfläche der Luftschicht 315 des unteren Substrats 313.
  • 5A ist eine schematische Teil-Schnittansicht einer Durchflusszelle für die Biomaterialanalyse gemäß einem Vergleichsbeispiel. 5B ist eine teilweise vergrößerte Ansicht von 5A. Die 5A und 5B sind beide Schnittansichten entlang der Linie B-B in 2. Wenngleich die sechs Durchflusszellen 104 in 2 parallel angeordnet sind, zeigt 5A nur drei von ihnen.
  • In 5A weist die Durchflusszelle 104 wie im Fall von 4A ein lichtdurchlässiges oberes Substrat 310, ein unteres Substrat 313 und einen zwischen dem oberen Substrat 310 und dem unteren Substrat 313 eingefügten Innenschichtabschnitt auf und weist einen Durchflussweg 311 auf, in dem die Teilchen 312 bereitgestellt sind, welche die Fluoreszenz emittieren sollen. Beide Enden des Durchflusswegs 311 sind durch Abstandselemente 407 hermetisch gedichtet. Weil die Durchflusszelle 104 etwas gekrümmt ist, gibt es einen Spalt, d. h. eine Luftschicht 315 zwischen der Durchflusszelle 104 und dem Temperatursteuersubstrat 105.
  • Das Vergleichsbeispiel wird mit Bezug auf 5B beschrieben.
  • Wenn das Anregungslicht auf die fluoreszierenden Substanzen eingestrahlt wird, welche in die DNA-Fragmente aufgenommen sind, die von den Teilchen 312 getragen werden, welche innerhalb des Durchflusswegs 311 im Innenschichtabschnitt der Durchflusszelle 104 bereitgestellt sind, wird Fluoreszenz 411 von den Teilchen 312 radial in alle Richtungen emittiert.
  • Ein Teil der emittierten Fluoreszenz 411 tritt durch das lichtdurchlässige obere Substrat 310 hindurch und wird von der optischen Detektionseinheit 106 empfangen, um die von den Teilchen 312 emittierte Fluoreszenz zu detektieren. Der Rest der emittierten Fluoreszenz 411 läuft durch das untere Substrat 313 und wird von einer Grenzfläche mit der Luftschicht 315 zwischen dem unteren Substrat 313 und dem Temperatursteuersubstrat 105 reflektiert. Ein Teil der von einer Grenzfläche zwischen dem unteren Substrat 313 und der Luftschicht 315 reflektierten Fluoreszenz 413 wird durch die optische. Detektionseinheit 106 empfangen, nachdem sie durch einen vom vorstehend beschriebenen verschiedenen optischen Weg gelaufen ist.
  • Wenn ein von der optischen Detektionseinheit 106 detektiertes optisches Signal als ein zweidimensionales Bild beobachtet wird, wird ein optisches Signal der von der Grenzfläche zwischen dem unteren Substrat 313 und der Luftschicht 315 reflektierten und dann von der optischen Detektionseinheit 106 empfangenen Fluoreszenz 413 so beobachtet, dass das optische Signal von einer Position erzeugt wird, die von einer Position verschieden ist, an der sich die Teilchen 312, welche die ursprüngliche Fluoreszenzquelle darstellen, befinden. Ein solches optisches Signal wird zu Hintergrundlicht (Streulicht), welches eine genaue Detektion der Position der die Fluoreszenz emittierenden Teilchen 312 behindert. Wenn dabei das optische Signal der von der optischen Detektionseinheit 106 empfangenen Fluoreszenz 413 beobachtet wird, so dass das optische Signal von den Teilchen 312 erzeugt wird, welche an die Teilchen 312 angrenzen, welche die ursprüngliche Fluoreszenzquelle bilden (Übersprechen), tritt ein Analysefehler auf, welcher die Zuverlässigkeit der Analyse verringert. Diese Phänomene verringern die Genauigkeit der Biomaterial-Analysevorrichtung.
  • Solche Phänomene sind besonders hervorstehend, wenn die Fluoreszenzintensität gering ist und die Detektion mit einer höheren Empfindlichkeit ausgeführt wird. Die hochempfindliche optische Detektionseinheit 106 detektiert sogar eine kleine Lichtmenge und reagiert demgemäß auf das an der Grenzfläche reflektierte Licht, wie vorstehend beschrieben, wodurch bewirkt wird, dass der gesamte Hintergrund des detektierten Bilds hell wird. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die eine kleine Fluoreszenzmenge emittierenden Teilchen 312 übersehen werden oder dass die Position der Teilchen 312 falsch detektiert wird.
  • Mit Bezug auf 4B wird die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben.
  • Wenn das Anregungslicht auf die fluoreszierenden Substanzen eingestrahlt wird, welche in die DNA-Fragmente aufgenommen sind, die von den Teilchen 312 getragen werden, welche innerhalb des Durchflusswegs 311 im Innenschichtabschnitt der Durchflusszelle 104 bereitgestellt sind, wird Fluoreszenz 411 von den Teilchen 312 radial in alle Richtungen emittiert.
  • Ein Teil der emittierten Fluoreszenz 411 tritt durch das lichtdurchlässige obere Substrat 310 hindurch und wird von der optischen Detektionseinheit 106 empfangen, um die von den Teilchen 312 emittierte Fluoreszenz zu detektieren. Der Rest der emittierten Fluoreszenz 411 läuft durch das untere Substrat 313 und tritt auf der Seitenfläche der Luftschicht 315 des unteren Substrats 313 in die antireflektierende Materialschicht 406 ein oder fällt auf diese, bevor er verschwindet oder absorbiert wird. Hier ist ein schwarzer Beschichtungsfilm als die antireflektierende Materialschicht 406 gebildet.
  • Dadurch kann das Phänomen unterdrückt werden, dass ein Teil der von den Teilchen 312 emittierten Fluoreszenz von der Grenzfläche mit der Luftschicht 315 zwischen dem unteren Substrat 313 und dem Temperatursteuersubstrat 105 reflektiert wird und von der optischen Detektionseinheit 106 empfangen wird. Demgemäß kann verhindert werden, dass die Genauigkeit der Biomaterial-Analysevorrichtung durch das Hintergrundlicht (Streulicht) verringert wird. Insbesondere kann eine fehlerhafte Detektion der die Fluoreszenz emittierenden Teilchen 312 verhindert werden, um eine hochempfindliche und hochgenaue optische Detektion zu ermöglichen.
  • In der Durchflusszelle 104 für die Biomaterialanalyse gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung muss das untere Substrat 313 antireflektierend sein, damit nicht ein Teil der von den Teilchen 312 emittierten Fluoreszenz von der Grenzfläche mit der Luftschicht 315 reflektiert wird. Damit das untere Substrat 313 antireflektierend ist, kann es aus einem antireflektierenden Material bestehen oder ein Substrat mit einer antireflektierenden Materialschicht 406 sein. Die antireflektierende Materialschicht 406 kann sich auf der Seitenfläche der Luftschicht 315 des unteren Substrats 313 befinden, sich auf der Seitenfläche des Innenschichtabschnitts des unteren Substrats 313 befinden oder sich auf der Innenseite zwischen diesen beiden befinden. Alternativ kann mehr als eine der vorstehend beschriebenen kombiniert verwendet werden.
  • Bei der Bildung der antireflektierenden Materialschicht 406 im unteren Substrat 313 kann ein Film oder eine Lage aus einem antireflektierenden Material auf das untere Substrat 313 laminiert werden, oder Druckfarbe oder ein Beschichtungsmittel kann auf die Oberfläche des unteren Substrats 313 aufgebracht werden. Bei der Bildung der antireflektierenden Materialschicht 406 ist es wichtig, die Schicht ohne einen Spalt zu bilden, um keine Luftschicht zu erzeugen. Überdies ist die Antireflexionseigenschaft für den Durchflussweg 311 in der Durchflusszelle 104 vorteilhaft. Demgemäß kann das antireflektierende Material nur in einem Abschnitt des unteren Substrats 313 verwendet werden, der dem Abschnitt entspricht, in dem sich der Durchflussweg 311 befindet.
  • Hier bedeutet die Antireflexionseigenschaft die Verringerung der Reflexion der von den Teilchen 312 emittierten Fluoreszenz und dergleichen. Genauer gesagt, ist es bevorzugt, ein Material zu verwenden, bei dem das Verhältnis zwischen der Intensität des reflektierten Lichts und der Intensität des einfallenden Lichts höchstens 50%, vorzugsweise höchstens 20% und bevorzugter höchstens 10% beträgt. Im Allgemeinen ist der größte Teil der für die Biomaterial-Analysevorrichtung in der Art der Nukleinsäure-Analysevorrichtung verwendeten und von den fluoreszierenden Substanzen, die in die DNA-Fragmente aufgenommen sind, verwendeten Fluoreszenz sichtbares Licht. Daher ist ein für sichtbares Licht antireflektierendes Material bevorzugt. Das sichtbare Licht weist eine Wellenlänge von etwa 400 nm bis 700 nm auf.
  • Nachfolgend werden spezifische Beispiele des für das Verhindern der Reflexion des sichtbaren Lichts wirksamen antireflektierenden Materials angegeben:
    • (1) Ein schwarzes Pigment oder ein schwarzer Farbstoff; ein Carbon-Black-Pigment, wie Carbon Black und Black Lead, ein schwarzes Metalloxidpigment, wie Ferrioxid, ein zusammengesetztes Oxid von Kupfer und Chrom, ein zusammengesetztes Oxid von Kupfer, Chrom und Zink, ein schwarzer Metallkomplexfarbstoff und dergleichen.
    • (2) Eine Harzzusammensetzung (thermisch härtend oder thermoplastisch), welche das vorstehende schwarze Pigment oder den vorstehenden schwarzen Farbstoff enthält; ein schwarzes Harz, eine schwarze Farbe, eine schwarze Tinte, ein schwarzes Beschichtungsmittel und dergleichen. Spezifische Beispiele des Harzes umfassen ein Acrylharz, ein Cycloolefinpolymer und dergleichen.
    • (3) Glas, welches das vorstehende schwarze Pigment oder den vorstehenden schwarzen Farbstoff und dergleichen enthält.
    • (4) Ein Film von Materialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes; ein einschichtiger oder mehrschichtiger Film wird aus Materialien mit unterschiedlichen Brechungsindizes, wie Magnesiumfluorid und Metalloxid, gebildet.
  • Bei der Bildung der antireflektierenden Materialschicht 406 im unteren Substrat 313 kann Glas, Acrylharz, Polycycloolefinharz oder dergleichen, wobei es sich um ein lichtdurchlässiges Material handelt, als das Material des unteren Substrats 313, das von der antireflektierenden Materialschicht 406 verschieden ist, verwendet werden, wie im Fall des später beschriebenen oberen Substrats 310.
  • 6 ist ein Diagramm einer Konfiguration der Durchflusszelle für die Biomaterialanalyse gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • Die Durchflusszelle für die Biomaterialanalyse gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das obere Substrat 310, das untere Substrat 313 und einen zwischen dem oberen Substrat 310 und dem unteren Substrat 313 angeordneten Innenschichtabschnitt 602 auf.
  • Der Innenschichtabschnitt 602 weist Folgendes auf: einen Durchflussweg, in dem Teilchen bereitgestellt sind, die Fluoreszenz emittieren sollen, und ein Abstandselement 407 um den Durchflussweg, um das Lecken einer dem Durchflussweg zuzuführenden Reaktionsflüssigkeit zu verhindern.
  • Das obere Substrat 310 ist lichtdurchlässig. Hier bedeutet Lichtdurchlässigkeit die Durchlässigkeit für die von den Teilchen und dergleichen emittierten Fluoreszenz, um die Detektion durch die optische Detektionseinheit 106 zu ermöglichen. Im Allgemeinen ist der größte Teil der für die Biomaterial-Analysevorrichtung in der Art der Nukleinsäure-Analysevorrichtung verwendeten und von den fluoreszierenden Substanzen, die in die DNA-Fragmente aufgenommen sind, verwendeten Fluoreszenz sichtbares Licht. Daher ist es bevorzugt, dass das obere Substrat 310 für sichtbares Licht durchlässig ist. Beispiele des lichtdurchlässigen Materials, das für das obere Substrat 310 verwendet werden kann, umfassen Glas, Acrylharz, Polycycloolefinharz und dergleichen.
  • Das obere Substrat 310 muss eine ausgezeichnete Lichtdurchlässigkeit aufweisen und wird demgemäß vorzugsweise mit einer geringen Dicke versehen. Andererseits weist das untere Substrat 313 im Interesse der Handhabbarkeit der Durchflusszelle 104 vorzugsweise eine bestimmte Dicke und mechanische Stärke auf. Daher ist es bevorzugt, dass die Dicke des oberen Substrats 310 kleiner oder gleich jener des unteren Substrats 313 ist.
  • Nachfolgend werden Beispiele eines Verfahrens zur Herstellung einer Durchflusszelle mit einem Durchflussweg angegeben, welches Folgendes aufweist:
    • (i) Einfügen einer Lage zwischen dem oberen Substrat 310 und dem unteren Substrat 313, wobei die Lage in einem Abschnitt, der dem Durchflussweg entspricht, einen Hohlraum aufweist und nur das Abstandselement 407 um den Durchflussweg aufweist, und
    • (ii) Entfernen eines Abschnitts des oberen Substrats 310 oder des unteren Substrats 313, wobei der Abschnitt dem Durchflussweg entspricht.
  • Beim vorstehenden Verfahren werden bei (i) zum Bilden des Durchflusswegs, in dem Teilchen bereitgestellt werden, welche Fluoreszenz emittieren sollen, diese Teilchen vorab im Abschnitt des oberen Substrats 310 oder des unteren Substrats 313 bereitgestellt, welcher dem Durchflussweg entspricht. Um die von den Teilchen emittierte Fluoreszenz mit höherer Genauigkeit zu detektieren, werden die Teilchen vorzugsweise an der unteren Fläche des oberen Substrats 310 bereitgestellt.
  • Die Höhe des Durchflusswegs 311, d. h. die Dicke des Abstandselements 407, beträgt für eine genaue Temperatursteuerung vorzugsweise höchstens 1 mm. Überdies ist es bevorzugt, dass der Durchflussweg 311 in der Durchflusszelle 104 einen oder mehrere Einlässe 314 und Auslässe 316 für die Reaktionsflüssigkeit aufweist.
  • Gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Teilchen 312, welche die DNA-Fragmente und dergleichen binden, als die Teilchen 312, welche Fluoreszenz emittieren, vorab präpariert und mit einem Befestigungsmittel oder dergleichen am oberen Substrat 310 oder am unteren Substrat 313 befestigt werden. Alternativ können Träger, welche die DNA-Fragmente und dergleichen binden, direkt in einem Teilchenmuster am oberen Substrat 310 oder am unteren Substrat 313 befestigt werden, ohne die Teilchen 312 vorab zu präparieren. Alternativ können die DNA-Fragmente und dergleichen direkt in einem Punktmuster am oberen Substrat 310 oder am unteren Substrat 313 befestigt werden.
  • Wenn die Fluoreszenz emittierenden Teilchen 312 auf dem oberen Substrat 310 oder dem unteren Substrat 313 bereitgestellt werden, ist es bevorzugt, eine aus einem anorganischen Oxid bestehende Befestigungsschicht vorab auf dem Substrat bereitzustellen, um die präparierten Teilchen, teilchenförmigen Träger, DNA-Fragmente oder dergleichen, die vorstehend beschrieben wurden, zu befestigen. Durch Bereitstellen der Befestigungsschicht können die Teilchen, teilchenförmigen Träger, DNA-Fragmente oder dergleichen sicherer am Substrat befestigt werden. Das anorganische Oxid kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die Titanoxid, Zirkoniumoxid, Aluminiumoxid, Zeolit, Vanadiumpentoxid, Quarz, Saphir, Wolframoxid, Tantalpentoxid und eine Verbindung wenigstens zweier der vorstehend erwähnten aufweist.
  • Eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nachstehend beschrieben, welche von der vorstehend beschriebenen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verschieden ist. Die zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet eine Durchflusszelle für die Biomaterialanalyse (nicht dargestellt), welche Folgendes aufweist: ein lichtdurchlässiges oberes Substrat, ein lichtdurchlässiges unteres Substrat und einen zwischen dem oberen Substrat und dem unteren Substrat angeordneten Innenschichtabschnitt mit einem Durchflussweg, in dem Teilchen bereitgestellt sind, die Fluoreszenz emittieren sollen, und einem antireflektierenden Abstandselement.
  • Gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind sowohl das obere als auch das untere Substrat lichtdurchlässig, wird Anregungslicht von oberhalb der Durchflusszelle eingestrahlt und wird die von den Teilchen emittierte Fluoreszenz durch eine optische Detektionseinheit unterhalb der Durchflusszelle detektiert.
  • Demgemäß wird ein Teil der von den Teilchen im Durchflussweg emittierten Fluoreszenz von einer Grenzfläche zwischen dem unteren Substrat und einer Luftschicht reflektiert.
  • Demgemäß ist es weniger wahrscheinlich, dass diese Fluoreszenz die Analyse behindert.
  • Ein Teil der von den Teilchen emittierten Fluoreszenz kann jedoch zu dem Abstandselement lecken und von der optischen Detektionseinheit unterhalb der Durchflusszelle detektiert werden, was zu einem Analysefehler führt. Weil das Abstandselement antireflektierend ist, wird daher ein Teil der in das Abstandselement eintretenden Fluoreszenz reflektiert, wodurch Messfehler verhindert werden können.
  • Bezugszeichenliste
    • 101
    Biomaterial-Analysevorrichtung (Nukleinsäure-Analysevorrichtung)
    102
    Reagenskühl- und -lagerkasten
    103
    Flüssigkeitsabgabemechanismus
    104
    Durchflusszelle
    105
    Temperatursteuersubstrat
    106
    optische Detektionseinheit
    107
    Abfalltank
    108
    Abdeckung
    109
    Anbringungsteil
    301
    Lampe
    310
    oberes Substrat
    311
    Durchflussweg
    312
    Teilchen
    313
    unteres Substrat
    315
    Luftschicht
    406
    antireflektierende Materialschicht
    407
    Abstandselement
    602
    Innenschichtabschnitt

Claims (17)

  1. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse, welche Folgendes umfasst: ein lichtdurchlässiges oberes Substrat, ein antireflektierendes unteres Substrat und einen Innenschichtabschnitt, der zwischen dem oberen Substrat und dem unteren Substrat angeordnet ist und einen Durchflussweg aufweist, in dem Teilchen, die Fluoreszenz emittieren sollen, bereitgestellt sind.
  2. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 1, wobei das untere Substrat aus einem antireflektierenden Material besteht oder eine antireflektierende Materialschicht aufweist.
  3. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 1, wobei die Dicke des oberen Substrats kleiner oder gleich der Dicke des unteren Substrats ist.
  4. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 1, wobei die Teilchen auf der unteren Fläche des oberen Substrats bereitgestellt sind.
  5. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 1, wobei das Biomaterial eine Nukleinsäure einschließt.
  6. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 5, wobei ein Nukleinsäurefragment an das Teilchen gebunden ist.
  7. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 5, wobei eine Reaktionsflüssigkeit zur Nukleinsäureanalyse dem Durchflussweg zugeführt wird.
  8. Biomaterial-Analysevorrichtung, welche Folgendes umfasst: eine Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 1, eine Bestrahlungseinheit, die dafür ausgelegt ist, Anregungslicht einzustrahlen, und eine optische Detektionseinheit, die dafür ausgelegt ist, von den Teilchen emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
  9. Biomaterial-Analysevorrichtung nach Anspruch 8, welche ferner Folgendes umfasst: ein Temperatursteuersubstrat, das dafür ausgelegt ist, die Temperatur des Durchflusswegs in der Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse zu steuern.
  10. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse, welche Folgendes umfasst: ein lichtdurchlässiges oberes Substrat, ein lichtdurchlässiges unteres Substrat und einen Innenschichtabschnitt, der zwischen dem oberen Substrat und dem unteren Substrat angeordnet ist, und wobei der Innenschichtabschnitt Folgendes aufweist: einen Durchflussweg, in dem Teilchen bereitgestellt sind, die Fluoreszenz emittieren sollen, und ein antireflektierendes Abstandselement.
  11. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 10, wobei die Dicke des oberen Substrats kleiner oder gleich der Dicke des unteren Substrats ist.
  12. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 10, wobei die Teilchen auf der unteren Fläche des oberen Substrats bereitgestellt sind.
  13. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 10, wobei das Biomaterial eine Nukleinsäure einschließt.
  14. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 13, wobei ein Nukleinsäurefragment an das Teilchen gebunden ist.
  15. Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 13, wobei eine Reaktionsflüssigkeit zur Nukleinsäureanalyse dem Durchflussweg zugeführt wird.
  16. Biomaterial-Analysevorrichtung, welche Folgendes umfasst: eine Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse nach Anspruch 10, eine Bestrahlungseinheit, die dafür ausgelegt ist, Anregungslicht einzustrahlen, und eine optische Detektionseinheit, die dafür ausgelegt ist, von den Teilchen emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
  17. Biomaterial-Analysevorrichtung nach Anspruch 16, welche ferner Folgendes umfasst: ein Temperatursteuersubstrat, das dafür ausgelegt ist, die Temperatur des Durchflusswegs in der Durchflusszelle zur Biomaterialanalyse zu steuern.
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