CN101809444A - 数字磁珠分析的装置和方法 - Google Patents

Abstract

透光测定微珠或数字磁性微珠具有部分透光和部分不透光的数字编码结构。当数百或数千个LITAB固定在微板中的微井底部上时，通过精确和可靠地图像处理可以解码条形码。微板是标准生物测定格式；每个板可以含有96、384或1536个患者样本。因此，可以在一个单独微井中分析样本中的大量目标。图像译码算法包含四个主要处理：(1)图像的增强；(2)微珠的分割；(3)条形码狭缝的提取；和(4)条形码的解码。从光学洁净微板的底部拍摄微珠图像，并且可以通过图像软件来译码条形码图案。因此，可以不取出微珠地在微板中进行整个微珠生物测定实验。

Description

数字磁珠分析的装置和方法

交叉参考相关申请

本申请是2006年10月13日提交的美国专利申请第11/580,514号的部分继续申请；要求2005年8月9日提交的临时专利申请第60/706,896号的优先权的利益、2006年8月9日提交的美国专利申请第11/502,606号的部分继续申请；2008年2月11日提交的美国专利申请第12/069,720号的部分继续申请；和2007年8月8日提交的临时专利申请第60/964,108号的部分继续申请。本文在下面公开的所有其它公开和美国专利申请也通过引用并入，仿佛本文全面阐述似的。

技术领域

本发明涉及为蛋白质、核酸和分子诊断进行利用数百或数千个数字磁性条形码微珠(barcode microbead)的多元生物测定(multiplexed bioassay)；尤其，开发了一种光学图像译码算法和方法来迅速和同时分析在像微板(microplate)那样的细小微井(microwell)中的各单个微珠的条形码。数字磁珠是非球形、非传统乳胶微球体；因此，可以准确地成像和识别高密光学图案。

背景技术

由于现今在基因组学和蛋白质组学方面的研究，需要进行多元生物测定，因此需要可以在小体积样本中迅速筛选(screen)像核酸和蛋白质那样大量目标的技术。能够在平坦的平台上筛选数千或数百万个目标的微数组、DNA(脱氧核糖核酸)芯片(chip)、和蛋白质芯片皆需要以大体积的样本覆盖检测平台的大表面积。典型的表面积是1cm×1cm或接近显微镜载片。在相对大面积的芯片表面上分布着小体积液体样本，往往遇到在芯片表面上分子扩散缓慢、或非均匀混合或分布等缺陷。这些都是微数组测定需要极长反应时间的原因。而且，一旦印刷和制造好微数组芯片，就不可能对这些已完成制造的多元生物测定多增加任何测试，因此欠缺应用上的灵活性。

微珠技术潜在地克服了微数组技术的许多问题，并且在分析时提供了数据库内容、微珠数量、或微珠类型等灵活性。由于其小体积(在皮升每个微珠的范围内)，极少量样本就可以活化数千个微珠。大量编码的策略已经被应用于带有光谱可区分性的荧光珠、荧光半导体量子点、和带有彩色(吸收)或黑白条形编码的金属微棒。荧光珠和彩色条形码珠两者系通过反射或发射装置中的光学检测来识别。反射装置的困难在于：(1)光反射率低，尤其当微珠在微米量级上时；(2)光收集效率差；和(3)对于基于荧光的编码珠，荧光频带非常宽并重迭，因此限制了潜在代码数量。荧光珠的另一个缺点是，大多数微珠的测定依赖于荧光读数，因此造成更大的荧光谱或强度干扰。而大部分的彩色金属(Au、Pl、Ni、Ag等)微棒，编码方案皆难以制造，并且，因微棒之颜色需基于不同金属材料，导致颜色的数量受到限制。

本文通过引用并入其全部内容的2004年8月10日颁发的美国专利第6,773,886号公开了一种包含30-300nm直径×400-4000nm多层多金属棒的条形编码形式。这些棒通过到氧化铝模具中的电沉积来形成；此后除去氧化铝，留下这些小多层物体。该系统可以用多达7种不同金属让多达12个带状区编码，其中这些金属具有不同的反射率，因此取决于金属类型，在光学显微镜中表现为有明有暗，而测定读数是通过荧光从目标中读出的，以及探针的标识符是从条形码的明暗图案中读出的。

本文通过引用并入其全部内容的2003年10月7日颁发的美国专利第6,630,307号公开了一种起条形码作用的半导体纳米晶体，其中每个半导体纳米晶体产生不同发射光谱。如果光谱在可见光区域内，则可以通过颜色观察这些特征发射，或者可以译码特征发射，以提供有关观察到分立跃迁的特定波长的信息。

本文通过引用并入其全部内容的2004年5月11日颁发的美国专利第6,734,420号公开了一种包含与标签相关联的多个可识别组件的识别系统，该卷标包括响应激发能而生成波长/强度谱的标记器、和从相关标签的波长/强度谱中识别组件的分析器。

2002年2月26日颁发的美国专利第6,350,620号公开了这样一种方法，即，通过将微珠放在电铸了条形码的镍板与第二板之间，并将条形码压在微珠的表面上以形成带有条形码的微型蛋糕状颗粒，生成微型载体。

本文通过引用并入其全部内容的美国公布第US2005/0003556 A1号公开了一种识别系统，其使用光学图形，例如，条形码或点阵条形码和基于颜色信息信号的彩色信号用于产生亲合反应探珠。彩色图案以光学反射模式译码。

本文通过引用并入其全部内容的美国公布第US2005/0244955号公开了一种微型托板，其包括为可附着在板上的单个单元(cell)设计的小平坦表面、设计成保护单元的组件电镀区、和设计成允许或改善无逆流(flow-through)操作的造型。微型托板最好以可容易识别方式被印上图案，并做成可容纳大小相当的单个单元的大小。

磁珠广泛应用在高输出之自动化操作中。磁珠是顺磁性的，也就是说，当放入磁场内时，它们具有磁性，但当从磁场中移走时，没有剩磁。这使得微珠可利用磁场进行收集，并在移去磁场时使微珠重新悬浮。数字磁珠的收集和重新悬浮可以容易且迅速地重复任何次数。常见的机器人自动系统可简单地将96井、384井或1536井微板放在有助于磁针激发磁场的磁台上。这使得游离分子能够从微珠上洗去，改变缓冲溶液，或除去溶液中的任何杂质。例如，在DNA或RNA(核糖核酸)测定的情况下，可以在杂交(hybridization)后除去游离或非特定核苷酸。而在蛋白质测定的情况下，可以在抗体-抗原反应后除去游离或非特定抗体或抗原。在分子生物学应用期间往往需要迅速地、有效地、和困难最小地进行充分清洗。虽然磁珠已广泛用在生物测定中，但也可用高密度的非磁性条形码珠。

人们需要的是为可靠译码提供高光学对比度和高信噪比，并且以磁板格式为高吞吐量自动化清洗提供磁性的数字编码磁性微珠。解码方法应该既简单又耐用。数据处理应该既迅速又精确。

发明内容

本发明对现有技术系统和母申请作出改进，以便提供确定通过同时成像多个数字编码珠来表示的代码的高吞吐量处理。按照本发明，微珠分析系统包含支承件(例如，微井、微板、或显微镜载片)，用于支承至少一个微珠，其中所述微珠配有表示数字代码的标记；成像设备，用于获取所述支承件和包括标记的微珠的图像；和译码系统，用于分析成像设备所获得的图像，以便将微珠相互分开，或与背景中的支承件分开，以识别微珠，并确定微珠上的标记所表示的数字代码。本发明的图像处理手段不同于托板上现行的条形码扫描方法。现行方法中，托板不会与背景支承件一起成像，因此不会识别托板也不会将托板与任何背景或任何其它图像的其余部分分开。本发明尤其可用于有效分析大量含有表示数字代码标记的微珠，其中所述之成像设备，将获得含有每个微珠的标记的图像，而译码系统则用于分析图像，以识别和分开多个微珠，并确定每个微珠上的标记所表示的数字代码。通过识别每个微珠、将微珠相互分开、并将微珠与整个图像中的背景分开，可以确定每个微珠所表示的数字代码。

在一个方面中，本发明致力于一种图像处理方法，用于解译生物测定中的数字编码珠。此法用在微珠的稳定或静止状态下，而不是在微珠相对应于成像光学器件进行运动(例如，在流道中传送的微珠经过成像光学器件，或用运动光束扫描微珠)的状态下，进行微珠的成像。多个微珠可以分布在平坦表面(例如，显微镜载玻片)上，并且利用成像设备(例如，广角摄像机)二维地同时成像，从而允许解码多个微珠，以提高检测输出。数字编码可以通过对微珠进行基于光的发射、反射和/或透射的成像来观察。

在另一个方面中，本发明的微珠成像方面可以在微珠相对于成像光学器件进行运动(例如，在流道中传送的微珠经过成像光学器件，或用运动光束扫描微珠)的状态下，进行微珠的成像，只要微珠成像系统在微珠运动的同时，能够清楚地快拍微珠的静止图像即可。

在本发明的另一个方面中，微珠的数字编码包含条形码图案。带有一系列宽窄带的条形码图案为0和1提供了清晰的信号和差异。托板上的狭缝的位置将决定哪个位置是最低有效位(LSB)，哪个位是最高有效位(MSB)。LSB将处在与托板边缘较接近的位置上，以便将它与处在另一个较长端上的MSB区分开。在一个实施例中，编码珠之主体，包含由具有相对宽度(例如，一系列表示“0”代码的窄部和表示“1”代码的宽部，反之亦然)的一系列明暗交替部分(例如，透光和不透光部分)的条形码图像。数字条形码图案用成像设备成像。

图像译码处理包含四个主要子处理：(1)图像的增强；(2)微珠的分割；(3)条形码狭缝的提取；和(4)条形码的解码。在一个实施例中，译码微珠的图像牵涉到进行微珠图像的分辨，和提取数字编码信息等一系列步骤。这些步骤可以包括：(1)灰度级转换，以便保护微珠图像细节；(2)背景扣除，以便为微珠图像获得均匀背景；(3)微珠图像边缘检测；(4)如果微珠图像相互接触，进行附加过滤处理，以便分离相互接触之微珠图像；(5)各个微珠图像的标记(例如，使用颜色代码或编号)；(6)微珠图像的对准变换和用强度(例如，强度曲线)表示每个微珠图像中的数字编码(例如，条形码图案)；和(7)分析强度，以便确定数字代码(例如，识别条形码图案中的窄带和宽带)。

译码静止微珠的图像的精度可优于译码运动微珠的图像的精度。译码精度对于临床诊断非常重要，因为错误识别可能导致错误诊断和错误治疗。

在例示的实施例中，本发明致力于一种可提供高对比度和高信噪比的光学检测，以识别经透光测定之微珠(LITAB)或微型托板图像中，所显示之数字编码。该图像系透过含有部分透光(例如，对光透明、半透明、和/或光可透过)和部分不透光(例如，对光反射和/或吸收光)的物理结构所呈现。确定透射光的图案(例如，通过扫描或成像)便可解译编码珠所表示的代码。在一个实施例中，类似于1D或2D条形码图像(例如，一系列表示“0”代码的窄缝(例如，宽度为5微米)和表示“1”代码的宽缝(例如，宽度为10微米)，反之亦然)，编码珠包含了具有相对位置、宽度和间距的一系列透光和不透光交替部分的主体。为了解译图像，藉由主体的透光和不透光交替部分之扫描和成像(例如，利用CCD(电荷耦合器件)传感器)，可确定透射光之图像所表示的代码。

在本发明的又一方面中，可以使大量数字磁珠分布在平坦表面上，并利用摄像机同时检测它们。平坦表面可以在显微镜载片上或在微板的底部上。每个微珠上像“0”和“1”那样数字信号的条形码图案，可通过图像处理来确定。

在本发明的进一步方面中，数字条形码微珠具有顺磁性，也就是说，当放入磁场中时，它们具有磁性，但当从磁场中移走时，没有剩磁。通过用外部磁体收集微珠可以在微板中清洗磁珠，并在移去磁场时使微珠重新悬浮。多个数字磁珠可以在单个井中进行多元生物测定。微板在临床诊断中是标准高输出量格式；每个微板含有96、384、或1,536个患者样本。

在本发明的又一方面中，数字磁性微珠分析系统包含：(a)载片或带有多个井的微板；(b)载片的表面或微板的井底，至少有一个数字磁珠；(c)位于载片或微板上面或下面的光检测器，用于成像至少一个磁性微珠；和(d)利用图像软件的数字字处理系统，用于处理至少一个磁性微珠的成像图案。在一个实施例中，井的数量大约是96、384、或1,536个井。

在本发明的又一方面中，系在显微镜和摄像机下同时拍摄条形码图像和荧光图像两者。因此，可以在不用取出微珠的状况下，在微板中进行整个微珠实验。条形码用于识别哪个分子探针固定在微珠上，而荧光用于检测阳性反应还是阴性反应。因此可以同时分析大量目标。

在本发明的又一方面中，数字磁性微珠包含：第一层；第二层；和在第一层与第二层之间的中间层，中间层含有前述定义中的编码图案，并以部分透光和部分不透光表示与每个微珠相对应的代码。

在本发明的又一方面中，中间层包含定义编码图案的一系列交替透光部分和不透光部分。透光部分和/或不透光部分之间的相应位置、宽度和/或间距表示二进制代码。不透光部分包含阻光材料。每个微珠主体的最长正交轴为1mm或更小。

本发明的另一方面，利用蛋白质、核酸、小分子、化学制品、或它们的组合物，而将数字磁珠的第一层和第二层功能化。

在一个实施例中，编码珠的主体可配置有至少两个相对几何形状和/或大小方面不同的正交截面。并且，截面的几何形状可以是对称或非对称的，和/或规则或不规则的形状。在一个实施例中，编码珠的最长正交轴小于1mm。

在本发明的进一步方面中，透光部分定义为由穿过中间层的狭缝，而不透光部分由反光材料和/或吸光材料定义。狭缝包含第一宽度的狭缝和第二宽度的狭缝，其中第一宽度表示二进制代码中的“0”，而第二宽度表示二进制代码中的“1”。第一宽度大约1到10微米，而第二宽度大约1到50微米，其中第一宽度比第二宽度窄。二进制代码可以通过图像软件译码。

附图说明

为了更全面地理解本发明的范围和性质，以及优选使用模式，应该参考结合附图阅读的如下详细描述。在如下的图形中，相同的参考标号自始至终表示相同或相似的部分。

图1例示了依照本发明一个实施例，用于生物测定之透光测定微珠(LITAB)的制备过程：(a)微板的微井中的多个LITAB；(b)将LITAB用于生物测定；和(c)表示LITAB的影像的示意图；

图2(a)是依照本发明一个实施例的LITAB的顶视图；图2(b)是沿着图2(a)中的A-A线截取的剖视图；图2(c)示出了摄像机上表示0011111001的条形编码珠的透射数字信号；

图3例示了透过LITAB中的狭缝图案的光信号，所表示之最低有效位(LSB)或最高有效位(MSB)；

图4例示了依照本发明一个实施例的微珠形成步骤；

图5例示了作为夹在两个聚合物层之间的层的金属层，所述两个聚合物层可以为分子固定提供相同表面化学性质；

图6例示了条形码微珠的微观图像；

图7例示了勾画图像中的对象的边缘检测技术的使用；

图8例示了使用分界线分离离散微珠；

图9例示了将每个微珠与长轴对准的方法，并将灰度级图像转换成包含像素值的矩阵；

图10示出了将微珠图像转换成具有像素值函数的灰度级强度；

图11例示了根据每个微珠中条形码的宽度，所确定的数位代码；和

图12例示了依照本发明一个实施例的LITAB分析系统。

具体实施方式

本描述是当前设想的实现本发明的最佳方式。这个描述是为了例示本发明的一般原理而作出的，不应该从限制的意义上去理解。本发明的范围通过参考所附权利要求书得到最佳确定。

本发明的过程的详细描述主要从本发明的方法或过程、操作的符号表示、功能和特征方面呈现。这些方法描述和表示是本领域的普通技术人员向其它本领域的普通技术人员最有效传达他们工作的本质的手段。软件实现的方法或过程在这里一般被构思成导致所希望结果的一系列自洽步骤。这些步骤需要对物理量进行物理操纵。时常，但未必，这些量采取能够被存储、被传送、被组合、被比较、和要不然被操纵的电或磁信号的形式。

可用于进行本发明的软件实现操作的设备包括，但不局限于，通用或专用数字字处理和/或计算设备，该设备可以是独立设备或较大系统的一部分。该设备可以通过存储在设备中的程序、例程和/或一系列指令和/或逻辑有选择地启动或重新配置。简而言之，这里描述和建议的方法的使用不局限于特定处理配置。

为了例示本发明的原理而不受到限制，本文在下面系参考具有托板形状并用于生物分析的微珠，对本发明加以描述。但是，不言而喻，本发明同样可应用于其它总体几何形状、和为需要根据微珠的标识符识别的其它应用而应用的微珠，这不偏离本发明的范围和精神。为了有助于下面的讨论，将本发明的微珠称为代表透光测定微珠的LITAB。

LITAB上的数字编码，可藉由图像呈现高对比度和高信噪比之侦测。该图像系透过含有部分透光(例如，对光透明、半透明、和/或光可透过)和部分不透光(例如，对光反射和/或吸收光)的图案呈现其物理结构。确定透光图案(例如，通过扫描或成像)后，便可解译编码微珠上该图像所表示的代码。条形码图案可以设计为圆形、正方形、或其它几何形状，只要可以表示“1”或“0”，并可以通过译码器识别即可。但是，LITAB是非球形的；它不同于传统基于乳胶的球形珠。

在一个实施例中，编码珠具有相对位置、宽度和/或间距的一系列透光和不透光交替部分的主体，而形成类似于1D或2D条形码图像(例如，一系列代表“0”代码的窄缝(例如，宽度为大约1到5微米)和代表“1”代码的宽缝(例如，宽度为大约1到10微米)，反之亦然，形成二进制代码)。图2例示了依照本发明一个实施例的编码珠LITAB 11。LITAB 11含有具有平坦托板或托盘形状的主体25。编码珠的主体可由至少两个正交截面所构成，而截面之几何形状和/或大小可以不同。并且，截面的几何形状，可以是对称或非对称，和/或规则或不规则的形状。在这个特定实施例中，所有三个正交轴具有不同长度，并且所有三个正交截面的几何形状都是对称的且形状规则。图2(a)示出平坦几何形状类似于对称拉伸或拉长的卵形托板。图2(b)示出纵向(或最长)轴的截面。穿过主体25提供了一系列宽缝23和窄缝24，主体25可以由不透光材料(例如，反射或吸收)制成，或涂有不透光材料(例如，反射或吸收)。宽缝23和窄缝24分别表示“1”和“0”，反之亦然，两者一起可表示二进制代码(每个狭缝代表一个位)。在这个实施例中，该代码类似于条形码。窄缝24可以具有5微米的宽度，而宽缝23可以具有10微米的宽度。对于总尺度为100μm(微米)×30μm×10μm到300μm×100μm×40μm的LITAB，可以在LITAB托板上提供至少大约10个狭缝，以编码6位到12位或更多位，允许64个到4,096个或更多个唯一代码。在一个实施例中，编码珠的最长正交轴小于1mm。

虽然例示的实施例系表示出了狭缝有窄有宽的图案，但也可以使用狭缝具有固定宽度、但狭缝之间的间距可有窄有宽，用以表示1和0的图案，这不偏离本发明的范围和精神。图2(c)示出了通过CCD(电荷耦合器件)检测单一微珠所显示在计算机屏幕上的透射峰。当用光束照射微珠时，根据狭缝透射峰的“总强度”或“带宽”，可以通过摄像机和数字信号处理器，确定数字条形码0或1。如图所示，可以根据“带宽”容易地识别条形码图案。具体地说，如显示在图2(c)中的实施例所例示，微珠的10位条形码表示0011111001。

为了译码图像，由透光和不透光区交替所形成的主体部分系以可见光成像(例如，用CCD传感器)，并以此确定该图像所表示的代码。为了例示目的，图3表示了图2(a)中LITAB 11的狭缝23和24之一系列信号脉冲。这些信号对应于跨过LITAB 11纵轴的透射光与阻挡光之对比度。每个信号脉冲的宽度表示LITAB 11的代码中的“1”或“0”。在一特定实施例中，较宽的宽度代表1，而较窄的宽度代表0。LITAB 11上的狭缝的相对位置决定哪个位置是最低有效位(LSB)，哪个位是最高有效位(MSB)。在一个实施例中，最低有效位位于与LITAB的一个边缘或一端较接近的位置上，以便将它与处在相对边缘或相应端上的最高有效位区分开。译码信号脉冲的概念类似于对传统条形码的解码。

值得注意的是，在一个实施例中，透射部分不必然是可穿透整个LITAB主体的狭缝。该狭缝可以是全部或部分填充透明或半透明材料，与不透光部分相比，这依然提供了透光性。例如，LITAB可以含有被阻光材料(例如，反射材料，或反光或吸光染料)覆盖着的透明主体，阻光材料上存在着使透明主体暴露出来的开口作为狭缝。在这个LITAB上成像的光将在未被阻挡材料覆盖的部分(例如，狭缝)上使光透过主体，而在覆盖部分上阻挡光。在另一个实施例中，编码LITAB可配有反射薄膜或涂层(例如，利用金属薄膜电镀或涂覆LITAB的表面，或提供顺磁性金属薄膜中间夹层，或利用吸光染料涂覆)，以便为图像识别和译码而提高透射光与阻挡/反射光之间的对比度和光效率。

LITAB可在无尘室中使用传统制造薄膜的方法制造。LITAB的结构可以使用下列处理而获得，包括：传统光刻、印刷、丝网、固化、显影、蚀刻(例如，化学蚀刻、离子蚀刻、和/或其它除去处理)、电镀、切割、和其它众所周知，可用于这类结构和材料技术的处理步骤。参照图4(a)到图4(d)，在制造LITAB的处理的一个实施例中，在衬底50(例如大约1mm厚的洁净载玻片)上通过电子束蒸发作用来堆积钛层52(例如，100nm)。钛可作为导引用或替代释放用。LITAB的主体25可以使用一层聚合材料形成，例如感旋旋光性树脂感光聚合物(如SU-8等)。将一层聚合材料21螺旋涂覆在钛层52上，并且使用光刻过程在这钛层上形成狭缝23和24。例如，狭缝23和24可藉由决定宽缝和窄缝图案的光掩模(未示出)，以UV(紫外)光辐射在LITAB主体25的平坦形状上制成。LITAB数组可以在单个衬底上形成，每个LITAB具有代表不同代码的不同狭缝图案。光掩模也可以定义LITAB主体的数组范围，以便在定义狭缝的光刻处理结束后，将LITAB主体相互分离。因为SU-8是透明的，所以电子束蒸发器可用于在衬底50上的SU-8层21，堆积像金(Au，0.1μm)那样的金属顶层22(参见图2(b))。最终利用含氢氟酸(HF)的蚀刻溶液溶解替代(surrogate)钛层52，将各个LITAB主体25(如图2(b)所示)与底下衬底50分开。这样，LITAB上的金层可透过反射(藉由暴露的一侧和与SU-8层21相邻的一侧)来阻挡光线；而未被金层覆盖的狭缝则可透射光。因为金层22阻挡光，而开缝可透射光，所以当检测透射光时，LITAB“条形码”提供高的光学信号、和高光对比度。

图5示出了LITAB 80的另一个替代实施例，包括作为夹在两个聚合物层82之间的中间层的金属层81。条形码图案可在金属层81上制造。例如，在金属层81中形成不同宽度和/或间距的狭缝84。在该例示性实施例中，聚合物(感光聚合物：SU-8)层82是封闭层(即，没有狭缝)。形成LITAB 80的处理可以包括首先形成第一感光聚合物层82，然后形成金属层81，接着在其中蚀刻出狭缝84。在金属层81上形成第二感光聚合物层82(例如，通过螺旋涂覆和固化)，它填充狭缝84。或者，可以在形成第二感光聚合物层82之前，首先用另一种透明材料填充狭缝84。利用这个实施例，可以使LITAB的两个暴露平坦表面，有相似的表面涂层和固定分子的条件。其它实施例系利用像生物素、羧化物、或链霉亲和素那样的聚合物或功能分子来涂覆LITAB，使得整个微珠对于固定分子有着相同条件。

顺磁性材料被嵌入LITAB中的中间层中，因此被夹在聚合物薄膜的第一层和第二层之间。顺磁性材料包括镁、钼、锂、铝、镍和钽。LITAB上的顺磁性材料也有阻光材料的作用，因此，反射层是多余的。本发明允许顺磁性材料存在于基于透射光的解码技术中。但是，因为深棕色的磁性材料无法与需要黑白线交替的反射条形码兼容，所以现行的磁珠和码珠技术无法将磁性材料引入条形码微珠中。

图1例示了为生物测定所准备的LITAB实施例。如图1(a)所示，LITAB 11允许对体积微小的样本进行同质多元生物测定。将与不同代码14相对应的混合LITAB 11，引入细试管或微井板13的小体积生物样本12中。之后这些LITAB可既容易又迅速地以光学译码。在一个实施例中，图1(b)示出了与核酸探针15一起功能化以用于目标杂化16和荧光检测17的一个LITAB 11。有几种材料可用于微珠上将分子固定。在一个实施例中，LITAB可以涂上用在微数组中的共价DNA-结合剂，随后在溶液中与在5’末端上携带共价结合的荧光团杂交。图1(c)是利用显微镜在CCD上成像的LITAB。不同物镜提供不同视野。

藉由成像处理方法，在像载片那样的支承件上或在微板的底部上的微珠可以进行随机译码。当微珠最终沉淀和分布在微板平坦的底部上时，可以利用广角或扫描摄像机同时译码多个微珠。微板是使用于高输出量之临床测定的标准模式。微板上的每个井，分别用于一个样本；因此，对于96井、384井、和1,536井，每个微板即分别持有96、384、或1,536个患者样本。因此，实验可在不取出微珠的状况下，在微板中进行，并可以在译码的精度和灵敏度更佳的稳定状态下，拍摄微珠的图像。译码的精度对于临床诊断非常重要，因为任何错误识别都可以导致错误诊断和错误治疗。由于微珠的尺寸小，可以在最少重迭地的状况下，在微井底部上显示数百个甚至数千个微珠。为了使微珠重迭最少，将取决于微井的面积，使微珠的总数限制在一定数量以下。条形码图像和荧光图像可在传统显微镜或倒立式荧光显微镜上显示。

在例示于图12中的实施例中，数字磁性LITAB分析系统100含有照射微珠图案的光源102、和捕获支承件(例如，在例示性实施例中，微井106)底部微珠11图像的光学CCD 104。微井106底部是透明或半透明的，使足够的光得以穿过微珠。扫描或转译装置(在图12中示意性表示)将微井106对于光检测器104(例如，CCD)和光源进行相对运动，以对目标微井进行成像。光检测器104可用于条形码成像和荧光检测。1M像素之CCD应该含有足够的像素来分辨微珠11上的条形码图案14。透镜和滤光器108用于收集和选择激发光和荧光的波长。处理设备112用于控制系统100和/或图像处理过程，处理设备112配有依照本发明所公开的执行处理步骤之功能。微珠的图像在被处理设备112处理之前，可被存储和/或打印/显示，或者，可以将代表微珠图像的信号或数据馈送到处理设备112，以便实时或近实时处理。

在另一个实施例(未示出)中，共使用两个光源，其中一个光源102在微井的下面，以便以透射方式照射条形码，另一个光源103在微井的上面，以便以入射或反射方式激发荧光。条形码照射光源可以是白光，而用于激发荧光的光源则需要与荧光团的吸收相匹配之波长。通过测量荧光强度，我们可以识别哪些微珠存在阳性的生化反应。荧光强度的测量，可以透过与微珠成像相同或不同的光检测器加以进行。通过译码数字条形码图像，我们可以识别那个微珠的表面上有哪个生物探针。光源的选择取决于荧光团。例如，有滤光块的水银光源提供UV到可见光之激发光。红色二极管激光器(665nm)、和小型氩激光器(488nm)或绿色激光器(530nm)是用于各种荧光团(例如，藻红蛋白(PE)、Cy3、和Cy5等)的常用激光源。滤光装置被用于选择特定荧光团之激发光和荧光波长。

一旦从CCD中获得条形码图形，该图像数据即可透过图像软件迅速地处理。现有很多图像译码算法。取决于成像图案，不同的算法可能有不同的译码速度或精度。其中一种图像译码算法系由四个主要步骤所组成：(1)图像的增强；(2)微珠的分割；(3)条形码狭缝的提取；和(4)条形码的解码。当中的某些处理可使用数学软件来进行，譬如，从The Mathworks，Inc.公司获得的工具包(例如，

7.4.0.287(R2007a)版；2007年1月29日)。在以下段落中将说明这些步骤的功能。

(1)图像的增强：译码微珠的效能主要系依赖图像的质量。解码处理的精度可以透过成像增强来提高。这种图像增强系使用图像强度常态化来提供均匀强度的背景。不均匀的背景往往由不均匀照射引起。为了取得微珠的高图像对比度，首先应该藉由背景扣除和常态化来产生均匀的背景。

(2)微珠的分割：图像分割的目的是勾画图像中的微珠的范围，以供进一步分析用。基本分割例程系藉由可定位图像中微珠的直线、曲线那样的边界。依照一个实施例，应用

中的分界(watershed)算法来分开微珠。

中的分界算法要求图像是黑白图像，因此，在图像处理部分将图像转换成黑白图像。因为较高密度的黑色像素(由不透光区域引起)对应于微珠的边缘，所以分界变换求出图像中的脊线，并将高密像素围住的表面当作微珠。或者，可以将

中的新分界算法修改成使用灰度级图像，以便以较高精度进行微珠的分割和最终译码。因为LITAB具有不变面积，因此根据它们的面积分离和从图像中过滤出每个微珠。

(3)条形码狭缝的提取：在微珠分割之后，分开处理每个微珠，以便提取条形码。将从主图像中提取的微珠区域当作子图像，并逐一处理它们。子图像利用长轴和短轴沿着随机方向示出微珠的走向。计算微珠的长轴与图像的x轴夹成的角度。在将微珠的长轴旋转到x轴后，进行提取微珠中的狭缝。在微珠旋转之后，消除微珠的边界，并沿着线条的长轴(y轴)方向对强度值求平均。尽管这些子图像事实上是2-D的，它只携带透射强度信息。沿着微珠x轴的强度曲线则示出具有与1和0二进制位所对应两个宽度(窄和宽)的峰。

(4)条形码的解码：为了解码条形码，分析透射强度峰的宽度。将半峰线用于计算峰的宽度。为了提取二进制位信息，五个像素足以描述微珠的窄缝(‘0’)。使用10％的容限将宽度转化成二进制位。关于代表微珠的端部边缘的峰，取决于强度峰的上升沿和下降沿，我们可以将其识别成条形码的最高有效位(MSB)或最低有效位(LSB)。根据两个宽度的识别，可以解码二进制数位。

依照例示性实施例，图像处理软件用于图像译码系由以下个步骤所组成：

1.灰度级转换和保护微珠图像细节：读取图像，并将它们转换成如图6所示的灰度级图像。在这种程序设计中使用的一些图像处理算法来自并且由于它们要求图像是黑白图像。因此，在图像处理的过程中，如有需要，将经过处理的图像进一步转换成黑白图像。

2.背景扣除，以便获得均匀背景：消除背景的非均匀光照。为了获得均匀背景，使用结构元素和图像算术处理每个图像。从其背景中扣除图像，并调整图像的强度，以便作进一步处理。

3.微珠图像边缘检测：检测的边缘示出在图7中。这个处理识别微珠，并将微珠与图像的背景或其余部分分开。‘Sobel(索贝尔)’过滤技术用于抑制微珠的所有边缘边界，并强调每个微珠内的狭缝。

4.各个微珠图像的标记：一旦在图像中将微珠分离成各个区域，使用RGB颜色代码或将每个微珠编号来标记这些区域(图8)。使用区域上托(pops)算法来计算每个微珠之面积、取向的角度、像素清单等不同参数。

5.微珠图像的调整和用强度曲线表示数字编码：为了将每个微珠与长轴对准(图9)，拍摄原始灰度级图像，并将它转换成包含像素值的矩阵。从区域特性中获取微珠的像素索引列表。用每个微珠的像素索引列表取代灰度级图像，并使其余像素为零。使用较早计算的每个微珠的取向角度，沿着长轴旋转每个微珠。

6.分析强度，以便确定数字代码：微珠图像以强度与像素数间的关系(如图10所示)显示。分析每条强度曲线以获得微珠中的条形码。画一条与x轴平行的直线，并为直线与曲线的每个交点取出x值。在峰的平均值画上这条直线。这意味着将峰中的所有交点之总和除以交点数。然后，获取两个连续x值之间的差值。可替代值是每个微珠中条形码的宽度。透过计算条形码的边缘与第一狭缝之间的间距，可找出条形码的方向。较长的距离对应于读取条形码的正向。如果微珠反向地出现在图像中，将条形码位反向。像图11所示那样显示译码结果。

7.接触微珠的分割：当两个微珠沿着它的边缘接触时，条形码不重迭，因此，可以译码微珠。但是，两个微珠被分割成单个微珠。为了区分这样的接触微珠，利用使用‘距离变换’和‘分界线’的‘分界变换’算法。‘距离变换’是以映像表示，图像中的每个像素与最接近的边界像素之距离。利用图像梯度中的灰度级别峰作为分界，可以将图像数据表示成地形表面。在分割时，放大这些微珠的狭缝，并使用‘距离变换’找出分界线。分界线的创建需要黑白图像，因此，根据阈强度将每个图像转换成黑白的。使用假设之条形码狭缝的长方形结构元素，以进行图像放大。一旦创建了分界线，就使边缘检测图像与分界线重迭，以获得最终分离微珠。这些分离微珠尽管边缘是不规则的，但条形码可完好无损地用于解码。

尽管在本专利中阐述了长方形状微珠，但也可以扩展到弧形长方形状微珠。也就是说，微珠由长方形和两端上的两个半圆形组成。一个半圆形大于另一个半圆形，以表示MSB和LSB。为了译码条形码，进行图像处理，以除去除了半圆形之外的长方形。基于区域的滤波器只能从微珠中提取MSB半圆。使用‘Sobel过滤器’将这个实心半圆图像缩减成边缘图像。整个图像由形成半圆的曲线和直线组成。使用

中的Hough(霍夫)变换识别该直线。根据该直线，朝着与直线垂直但背离半圆区的方向构建微珠的条形码部分的长度的箱体。经由在所构建箱体内画出强度，来完成条形码的提取。

为了减少图像处理的计算时间，本发明已经做出了许多次尝试，以改善算法。将图像分辨率从1微米/像素降低到10微米/像素，以便进行分割微珠的初始处理。当微珠被分割时，使用高分辨率图像提取条形码。另一种尝试是将图像译码算法从

转换成C程序，并在执行之前预编译该C程序。这极大地提高了图像译码软件的执行速度。最后，利用像NVIDIA的协同处理器并使用CUDA库将程序与协同处理器耦合来运行译码程序。这种系统含有多达128个协同处理器以并行方式执行程序。

上面从功能模块的角度描述了本发明的处理和系统。不言而喻，除非本文另有说明，可以将一种或多种功能集成在单个物理设备中或软件产品中的软件模块中，或者可以在分离的物理设备或软件模块中实现一种功能，这不偏离本发明的范围和精神。应该进一步懂得，硬件和软件的界线未必那么清晰。

应该懂得，对包括处理的每个步骤的实际实现的详细讨论并非是理解本发明所必需的。只要本文公开了系统中的各种软件和硬件部件的系统属性、功能和相互关系，这种实际实现完全在程序设计人员和计算机工程人员的常规技能之内。本领域的普通技术人员无需过分实验就可以实践本发明。

虽然依照所述实施例，与所述实施例联系在一起描述了本发明，但对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，可以不偏离本发明的范围和精神地作出各种各样的修改和改进。于是，应该明白，本发明不受特定例示性实施例限制，而只受所附权利要求书限制。

Claims (15)

1.一种微珠分析系统，包含：

支承件，用于支承至少一个微珠，其中所述微珠配备有表示数字代码的标记；

成像设备，用于获取所述支承件和包括标记的微珠的图像；和

译码系统，配置成分析所述成像设备获得的图像，以便识别微珠和将微珠与图像的其余部分分开，并确定配备在所述微珠上的标记所表示的数字代码。

2.如权利要求1所述的微珠分析系统，其中，所述支承件支承多个微珠，每个微珠含有表示数字代码的标记，其中所述成像设备获得的图像包括含有在每个微珠上的标记的多个微珠，和其中所述译码系统被配置成分析图像，以便识别多个微珠，和将多个微珠相互分开并与背景中的所述支承件分开，并确定配备在每个微珠上的标记所表示的数字代码。

3.如权利要求2所述的微珠分析系统，其中，所述支承件包含含有多个井的板，和其中多个微珠被支承在所述井中。

4.如权利要求2所述的微珠分析系统，进一步包含为了成像而照射多个微珠的光源。

5.如权利要求4所述的微珠分析系统，其中，所述光源被定位成使光透过多个微珠到达所述成像设备。

6.如权利要求4所述的微珠分析系统，其中，所述光源被定位成使光入射到多个微珠。

7.如权利要求6所述的微珠分析系统，其中，所述微珠包括产生光学信号的材料，和其中所述成像设备包含检测光学信号的光学器件。

8.如权利要求2所述的微珠分析系统，其中，所述微珠每一个包含：

第一层；

第二层；和

在所述第一层与所述第二层之间的中间层，所述中间层含有定义在上面的编码图案，其中，所述中间层部分基本透光和部分基本不透光，表示与所述微珠相对应的数字代码。

9.如权利要求8所述的微珠分析系统，其中，所述中间层包含定义编码图案的一系列交替基本透光部分和基本不透光部分。

10.如权利要求9所述的微珠分析系统，其中，透光部分和/或不透光部分之间的相对位置、宽度和/或间距表示二进制代码。

11.如权利要求8所述的微珠分析系统，其中，透光部分由穿过所述中间层的狭缝定义，而不透光部分由反光材料或/或吸光材料定义。

12.如权利要求11所述的微珠分析系统，其中，所述狭缝包含第一宽度的狭缝和第二宽度的狭缝，和其中所述第一宽度代表二进制代码中的“0”，而所述第二宽度代表二进制代码中的“1”。

13.如权利要求2所述的微珠分析系统，其中，所述译码系统被配置成通过如下步骤识别特定微珠和将特定微珠与图像的其余部分分开，并确定配备在微珠上的标记所代表的数字代码：(1)灰度级转换，以便保护微珠图像细节；(2)背景扣除，以便为微珠图像获得均匀背景；(3)微珠图像边缘检测；(4)如果微珠图像接触，则进行附加过滤处理，以便分离接触微珠图像；(5)各个微珠图像的标记；(6)微珠图像的对准变换和用强度表示每个微珠图像中的数字编码；和(7)分析强度，以便确定数字代码。

14.一种分析微珠的方法，包含：

支承多个微珠，其中所述微珠配备有代表数字代码的标记；

获取支承件和包括标记的微珠的图像；和

分析图像，以便识别微珠和将微珠与图像的其余部分分开，并确定配备在所述微珠上的标记所表示的数字代码。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述分析步骤包含如下步骤：

(1)灰度级转换，以便保护微珠图像细节；

(2)背景扣除，以便为微珠图像获得均匀背景；

(3)微珠图像边缘检测；

(4)如果微珠图像接触，则进行附加过滤处理，以便分离接触微珠图像；

(5)各个微珠图像的标记；

(6)微珠图像的对准变换和用强度表示每个微珠图像中的数字编码；和

(7)分析强度，以便确定数字代码。

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