JP4483608B2 - 蛍光分析装置 - Google Patents
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Description
本発明は、泳動用プレート内で電気泳動により分離した試料を蛍光検出する蛍光分析装置に関し、特にＤＮＡを蛍光検出するＳＮＰｓ解析装置に関するものである。
一般的な生体試料を考えた場合、大きくはＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質が存在している。そして、近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。
ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や副作用をあらかじめ予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
現在ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定方法）が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケンス法（Ｓａｎｇｅｒ法）である。なお、シーケンシングは、このＳａｎｇｅｒ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。そして、このようなシーケンシングによるＳＮＰｓの解析は、ターゲットとする遺伝子を単離した後、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定法（装置）を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行うものであるため、実験に膨大な作業量と時間、さらには多大のランニングコストを要し、またその際に使用する塩基配列決定のための自動化装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、高価な試薬を大量に必要とするという問題を有している。
こうした問題点は、アフィニティキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法を用いればほぼ解決できる。アフィニティキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（ＤＮＡとそれを相補するＤＮＡ、ＤＮＡとそのＤＮＡから転写されたＲＮＡ、酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（例えば、特許文献１参照）。
ここで、従来のアフィニティキャピラリー電気泳動では、塩基配列を特異的に認識するアフィニティ物質として、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある１本鎖ＤＮＡを使うが、ポリヌクレオチドを成分とするＤＮＡは負電荷を有しているため、電圧を印加すると、このアフィニティ物質として用いているＤＮＡがキャピラリー外に流出してしまう。これを防ぐため、従来では、アフィニティのために用いるＤＮＡである、前記被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係の１本鎖ＤＮＡを、キャピラリー内に固定化している。そして、固定化の方法としては、ビニル化ＤＮＡをリニアポリマー化したポリアクリルアミドと共重合し、それをキャピラリー内壁に共有結合的に固定化するものが提案されている。これにより、前記被検体ＤＮＡは、アフィニティ物質である固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）と強く相互作用してキャピラリー内に吸着され、一方ノイズＤＮＡは該固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）に吸着されずキャピラリー外に流出され、この結果、前記被検体ＤＮＡを検出することが可能となる（特許文献１参照）。
しかしながら、この方法では、アフィニティのために用いるＤＮＡ（以下：アフィニティＤＮＡ）がキャピラリー内壁にしか固定化できないので、アフィニティＤＮＡと試料ＤＮＡとの相互作用が壁面近傍に限られ、測定が難しく、且つ測定精度が悪くなるという問題がある。
そこで、本出願人は、アフィニティＤＮＡと試料との相互作用が壁面近傍に限られないように、該アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法を開発し、それぞれに電極を配置した第１容器と第２容器間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管で連絡し、次いで、このキャピラリー管の緩衝液の中に、該ＤＮＡ試料に含まれる異常ＤＡＮに水素結合可能な塩基配列を結合したリニアポリマーからなる分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填した後、続いて被検体であるＤＮＡ試料を充填し、その後、両電極間に電圧を印加して、キャピラリー管内の被検体ＤＮＡ試料を電気泳動させることで、該ＤＮＡ試料を分離する遺伝子診断装置と遺伝子診断方法を提案している（特許文献２参照）。
以下、アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法について説明すると、ＤＮＡは二本鎖を形成するものと一本鎖を形成するものと存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合しペアを形成する性質を有しており、ＤＮＡの二本鎖においてもＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一方のＤＮＡがＡＴＣＧＣＧＴと配列されている場合、他方のＤＮＡはＴＡＧＣＧＣＡという塩基配列をもっている。
ＤＮＡ試料を分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡのＤＮＡ配列がＡＴＣＧＣＧＴを含み、正常ＤＮＡがＡＴＣＡＣＧＴを含む場合、下線で示した部分で異常ＤＮＡと正常ＤＮＡの塩基が異なっている。このとき、分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分の配列をＴＡＧＣＧＣＡとすると、正常ＤＮＡは下線部においてＤＮＡコンジュゲートと相補的ではなくなる。これにより、全体の結合力は異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより１塩基分大きくなり、電気泳動時に異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより遅延して泳動される。
ＤＮＡ試料は血液などから、細胞を破壊してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡ配列を含む部分を増幅する。このとき、所定の塩基数にして増幅すると相補的配列を持つＤＮＡコンジュゲートの塩基数も決定できる。
前述した方法によれば、負に帯電した分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを、電気泳動させる際に、アフィニティＤＮＡと被ＤＮＡ検体との相互作用が壁面近傍に限られないように擬似的に固定し、そのＤＮＡ試料の移動速度差から、該正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとを分離することができ、この結果、ＳＮＰｓの遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判別することが可能になる。
しかし、前述した特許文献２の遺伝子診断装置と診断方法においては、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを充填する必要がある。このように、キャピラリー管１本１本に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料を充填するのは面倒な作業であるが、この問題に対しては、特許文献３，４に記載されているように、プラットホームであるプレートに微細な流路を埋設し、該プレートの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させるという方法が提案されている。
ここまでで説明した方法により、ＤＮＡ試料を分離し、流路と相対的に移動するようにした光学検出部が前記ＤＮＡ試料の蛍光度を検出することで、ＳＮＰｓの有無を判定することができる。
特に蛍光度を検出する場合、予め励起光を流路内の蛍光標識されたＤＮＡ試料に照射するが、前記のプレートの材料にポリカーボネートやアクリルなどの自家蛍光が大きなものを使用すると、自家蛍光がバックグラウンドノイズとなって正確な検出が出来なくなる。ここで、自家蛍光とは、プレートの材料自体（この場合、ポリカーボネートやアクリル）が励起光を照射された際に発生させる光のことである。
この自家蛍光の問題を解決するために、特許文献５に示すような技術が提案されている。以下に図７を使用して説明する。図７では、流路の代わりに、泳動用ゲル１０１にＤＮＡ試料が注入されており、前記泳動用ゲル１０１の周りを自家蛍光の大きな材料で出来たゲルカセット１０２が覆っている。ゲルカセット１０２の側面より、励起光１０７を泳動用ゲル１０１に照射し、ＤＮＡ試料を蛍光発光させる。受光側では、光学フィルタ１０４を透過した蛍光１０８を受光素子１０６で検出する構成となっている。また、光源１０５からの励起光１０７がゲルカセット１０２を照射することを防ぐ遮光手段として、光源１０５とゲルカセット１０２との間に黒色ウレタンなどの遮光材１０３が配置されている。この遮光材１０３により、ゲルカセット１０１に励起光１０７を直接照射されることを防ぎ、ゲルカセット１０２の自家蛍光を抑制することができる。
特開平７−３１１１９８号公報
特開２００２−３４０８５９号公報
特表２０００−５１３８１３号公報
特表２００１−５２３３４１号公報
特開２００４−２７９３０６号公報
上記の方法では、励起光１０７が直接ゲルカセット１０２に照射されるのを遮光材により遮光することで自家蛍光の問題を解決している。しかし、特許文献３，４に記載されている、プラットホームであるプレートに微細な流路を埋設している構成では、流路から漏れた励起光の一部がプレート内で反射し、迷光となってプレート内を照射する。従って、前記迷光によって励起されたプレートの特定の部位が自家蛍光を発する。
ここで、プレート内で反射する励起光の光路は、入射位置やプレートの構造によって全く変わる。例えば、プレート内を進む励起光の光路上に流路やプレートの厚み方向に開けられた穴などの構造物があると、そこで反射する。励起光が照射した部分では自家蛍光が発生するので、励起光を照射する位置や励起光の入射角度によって受光素子１０６で検出される自家蛍光の強度が大きく異なる。
このような迷光による自家蛍光の問題は、先ほどの特許文献５に示した方法でも発生する。
特に、励起光の照射対象が、比較的大きな泳動用ゲルなどではなく、微小な溝で形成された流路などである場合には、照射対象である流路から漏れて迷光になる励起光の強度も大きくなり、それによって発生する自家蛍光の強度も、本来検出するべきＤＮＡ試料の蛍光強度と比較して無視できないレベルになる。
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、プレート内部で反射し、迷光となった励起光により発生するプレートの自家蛍光を抑え、測定精度を高めた蛍光分析装置を提供することを目的とする。
前記従来の課題を解決するために、本発明の請求項１に記載のプレートは蛍光標識された試料が流れる流路が形成され、励起光が照射されるプレートであって、前記流路は、側壁と底面とを有する凹部形状を有しており、 前記プレートはさらに、前記流路の側壁の両側において、前記側壁を越えて延びるように、かつ、プレートの面に対して垂直になるよう配置された遮光手段を有することを特徴とする。
また本発明の請求項２に記載のプレートは、蛍光標識された試料が流れる流路が形成され、励起光が照射されるプレートであって、前記流路は、側壁と底面とを有する凹部形状を有しており、 前記プレートはさらに、前記流路の底面よりも下方の内部の層において、プレートの面に対して平行に拡がるよう配置された遮光手段を有することを特徴とする。
また本発明の請求項３に記載のプレートは、前記遮光手段を前記流路と一定の間隔をおいて設けた、ことを特徴とする。
また本発明の請求項４に記載のプレートは前記遮光手段を介して、プレートのもう片方の面にも流路を埋設したことを特徴とする。
また本発明の請求項５に記載のプレートは、遮光手段が黒色の染料または顔料を混合したアクリル樹脂か、前記励起光を透過させない金属のいずれかで構成したことを特徴とする。
本発明の蛍光分析装置によれば、流路から漏れた励起光がプレート内部で反射して迷光とならないように、遮光材をプレート内に配置することにより、蛍光検出時のバックグラウンドノイズとなるプレートの自家蛍光を抑え、精度の良い分析を行うことができる。
以下に、本発明の蛍光分析装置における実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
図１は、本発明の第１の実施例における蛍光分析装置の構成を示した図である。
プレート１には微細な流路２が埋設されている。流路２には予め蛍光標識された試料を含む液体が充填されており、光源４より励起光６が照射されることにより、試料が蛍光発光する。
受光側では、試料が発した蛍光７を受光素子５で検出する。プレート１と受光素子５との間には、プレート表面で反射した励起光の成分をカットするための光学フィルタ３が配置されている。
また、光源４はプレート１と相対的に移動可能であり、流路２をなぞるように、励起光のスポットを移動させる。これにより、流路２上の任意位置の蛍光度を検出することができる。
次に、図２を用いて、プレート１の詳細な構造について説明する。
図２は、本発明の実施例１におけるプレートの断面図である。
プレート２１に微小な流路２２が埋設されている。カバー２３は、プレート２１を覆うように貼り付けられて、流路２２から試料が漏れ出ないようになっている。また、カバー２３は、透明の樹脂で出来ており、励起光２５を透過させるようになっている。遮光材２４は、流路２２を囲むように配置されている。また、遮光材２４は、黒色の染料を混合したアクリル樹脂で出来ており、励起光２５を透過させないようになっている。
励起光２５は、流路２２を照射し、蛍光２６を発生させる。ここで、流路２２は遮光材２４によって囲まれているので、励起光２５は流路２２の外に漏れることが無い。したがって、プレート内の迷光は発生しない。
以上のように、本実施例１においては、遮光材２４が流路２２を囲むように配置される構成にすることにより、蛍光検出時のバックグラウンドノイズとなるプレートの自家蛍光を抑え、精度の良い分析を行うことができる。
なお、遮光材２４は、黒色の染料の替わりに、黒色の顔料を混合したアクリル樹脂を用いても同様の効果が得られることは言うまでもない。
なお、遮光材２４は、樹脂の替わりに、励起光２５を透過させない金属を用いても同様の効果が得られることは言うまでもない。
次に、本発明の第２の実施例における蛍光分析装置について、図３を用いて説明する。なお、プレート以外の装置構成は、図１と同じであるので説明を省略する。
図３は、本発明の実施例２におけるプレートの断面図である。
実施例１で示した図２の断面図と異なるところは、遮光材３４を流路３２から一定距離ｄだけ離れた位置に、プレート３１の面と垂直に配置していることである。遮光材３４は、実施例１の遮光材２４と同じく、黒色の染料を混合したアクリル樹脂で出来ており、励起光３５を透過させないようになっている。
これにより、流路３２から励起光３５がプレート内に漏れても、漏れた励起光３７はすぐに遮光材３４によって遮光される。したがって、プレート内の迷光は発生しない。なお、一定距離ｄは、漏れた励起光３７の光路長が十分短くなるよう設計されていれば良く、即ち、できるだけ小さいほうが望ましい。もちろん０でも構わない。
以上のように、本実施例２においては、遮光材３４を流路３２から一定距離ｄだけ離れた位置に、プレート３１の面と垂直に配置することにより、蛍光検出時のバックグラウンドノイズとなるプレートの自家蛍光を抑え、精度の良い分析を行うことができる。
なお、遮光材３４は、黒色の染料の替わりに、黒色の顔料を混合したアクリル樹脂を用いても同様の効果が得られることは言うまでもない。
なお、遮光材３４は、樹脂の替わりに、励起光３５を透過させない金属を用いても同様の効果が得られることは言うまでもない。
次に、本発明の第３の実施例における蛍光分析装置について、図４及び図５を用いて説明する。なお、プレート以外の装置構成は、図１と同じであるので説明を省略する。
図４は、本発明の実施例３におけるプレートの断面図である。実施例１で示した図２の断面図と異なるところは、遮光材４４を流路４２よりも内部の層にプレート４１の面と平行に設けている点である。遮光材４４は、実施例１の遮光材２４と同じく、黒色の染料を混合したアクリル樹脂で出来ており、励起光４５を透過させないようになっている。
これにより、流路４２から励起光がプレート内に漏れても、すぐに遮光材４４によって遮光される。
以上のように、本実施例３においては、遮光材４４を流路４２よりも内部の層にプレート４１と平行に配置することにより、蛍光検出時のバックグラウンドノイズとなるプレートの自家蛍光を抑え、精度の良い分析を行うことができる。
なお、遮光材４４は、黒色の染料の替わりに、黒色の顔料を混合したアクリル樹脂を用いても同様の効果が得られることは言うまでもない。
なお、遮光材４４は、樹脂の替わりに、励起光４５を透過させない金属を用いても同様の効果が得られることは言うまでもない。
なお、図５に示した断面図のように、プレートのもう片方の面にも流路を埋設した場合でも、同様の効果が得られることは言うまでもない。
次に、本発明の第４の実施例における蛍光分析装置について、図６を用いて説明する。なお、プレート以外の装置構成は、図１と同じであるので説明を省略する。
図６は、本発明の実施例４におけるプレートの断面図である。実施例１で示した図２の断面図と異なるところは、流路６２とカバー６３以外のプレート全体を遮光材６４とした点である。遮光材６４は、実施例１の遮光材２４と同じく、黒色の染料を混合したアクリル樹脂で出来ており、励起光６５を透過させないようになっている。
これにより、流路６２は遮光材６４によって囲まれているので、励起光６５は流路６２の外に漏れることが無い。したがって、プレート内の迷光は発生しない。
以上のように、本実施例４においては、流路６２とカバー６３以外のプレート全体を遮光材６４としたことにより、蛍光検出時のバックグラウンドノイズとなるプレートの自家蛍光を抑え、精度の良い分析を行うことができる。
なお、遮光材６４は、黒色の染料の替わりに、黒色の顔料を混合したアクリル樹脂を用いても同様の効果が得られることは言うまでもない。
なお、遮光材６４は、樹脂の替わりに、励起光６５を透過させない金属を用いても同様の効果が得られることは言うまでもない。
本発明にかかる蛍光分析装置は、蛍光検出時のバックグラウンドノイズとなるプレートの自家蛍光を抑え、精度の良い分析を行うことができるため、ＳＮＰｓ解析装置などの用途にも適用できる。
１ プレート
２ 流路
３ 光学フィルタ
４ 光源
５ 受光素子
６ 励起光
７ 蛍光
２１，３１，４１，５１ プレート
２２，３２，４２，５２，６２ 流路
２３，３３，４３，５３，６３ カバー
２４，３４，４４，５４，６４ 遮光材
２５，３５，４５，５５，６５ 励起光
２６，３６，４６，５６，６６ 蛍光
３７ 流路から漏れた励起光
１０１ 泳動用ゲル
１０２ ゲルカセット
１０３ 遮光材
１０４ 光学フィルタ
１０５ 光源
１０６ 受光素子
１０７ 励起光
１０８ 蛍光
２ 流路
３ 光学フィルタ
４ 光源
５ 受光素子
６ 励起光
７ 蛍光
２１，３１，４１，５１ プレート
２２，３２，４２，５２，６２ 流路
２３，３３，４３，５３，６３ カバー
２４，３４，４４，５４，６４ 遮光材
２５，３５，４５，５５，６５ 励起光
２６，３６，４６，５６，６６ 蛍光
３７ 流路から漏れた励起光
１０１ 泳動用ゲル
１０２ ゲルカセット
１０３ 遮光材
１０４ 光学フィルタ
１０５ 光源
１０６ 受光素子
１０７ 励起光
１０８ 蛍光
Claims (5)
- 蛍光標識された試料が流れる流路が形成され、励起光が照射されるプレートであって、前記流路は、側壁と底面とを有する凹部形状を有しており、 前記プレートはさらに、前記流路の側壁の両側において、前記側壁を越えて延びるように、かつ、プレートの面に対して垂直になるよう配置された遮光手段を有することを特徴とするプレート。
- 蛍光標識された試料が流れる流路が形成され、励起光が照射されるプレートであって、
前記流路は、側壁と底面とを有する凹部形状を有しており、 前記プレートはさらに、前記流路の底面よりも下方の内部の層において、プレートの面に対して平行に拡がるよう配置された遮光手段を有することを特徴とするプレート。 - 前記遮光手段を前記流路と一定の間隔をおいて設けた、ことを特徴とする請求項１に記載のプレート。
- 前記遮光手段を介して、プレートのもう片方の面にも流路を埋設したことを特徴とする請求項２に記載のプレート。
- 遮光手段が黒色の染料または顔料を混合したアクリル樹脂か、前記励起光を透過させない金属のいずれかで構成したことを特徴とする請求項１〜４にいずれかに記載のプレート。
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