JP2006308447A - 生体サンプル分析用プレート及び生体サンプル分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 流路に充填された緩衝材中で生体サンプルを移動させて検出を行う際に、緩衝剤や生体サンプルの注入作業が容易で、そして短時間で正確な検出結果の得られる、生体サンプル分析用のプレートを提供する。
【解決手段】 流路１１，１２は、生体サンプルを一定量だけ取得するための予め定められた容積を有する定量分取部１０に一端が連結されている。流路１１の他端には、前記軸心に対して定量分取部１０と同心円上の位置において、流路１１，１２に充填される緩衝剤が保持される緩衝剤貯留部７を設けてあり、更に緩衝剤貯留部７には、緩衝剤貯留部分に保持できない余剰の緩衝剤が流入するオーバーフローチャンバー１７を連結する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、ＤＮＡやタンパク、その他の生体サンプルを緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出して生体サンプルを分析するための生体サンプル分析用プレート及び生体サンプル分析方法に関する。

一般的な生体サンプルを考えた場合、大きくはＤＮＡとタンパクが存在している。そして、近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。

ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰｓの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や感受性を予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰｓを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。

現在ＳＮＰｓを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定）が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケリング（Ｓａｎｇｅｒ法）である。なお、シーケンシングは、このＳａｎｇｅｒ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基長の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。

また他の方法として、アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動法がある。アフィニティリガンドキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、塩基配列を特異的に認識するアフィニティリガンドを添加しておき、試料を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（例えば、特許文献１参照）。

一方、タンパク質は、細胞、組織、生体液中に存在し、生体活動の調節、細胞へのエネルギー供給、重要な物質の合成、生物構造体の維持、さらには細胞間でのコミュニケーションや細胞内情報伝達に関与している。現在では、タンパク質が様々な環境や、相互作用する他のタンパク質の存在、タンパク質が受けた修飾の程度や種類に応じて、複数の機能を有することが明らかになってきている。

タンパク質は、２０種類のアミノ酸が遺伝子の指示（配列情報）により順番につながることでつくられており、その種類は数千万種と言われるが、その遺伝子の配列がわかれば、どのアミノ酸がどういう順番でつながってできているかの情報を得ることができる。生物の遺伝子（ゲノム）から作られるタンパク質の一そろいのセットは、プロテオームと呼ばれるが、ヒトゲノムの塩基配列解読が終わった今、プロテオームの解析が盛んに進められている。

そして、このようなタンパク質の機能解析研究としては、同定やキャラクタリゼーションのみならず、生化学アッセイやタンパク質間相互作用研究、タンパク質ネットワーク、または細胞内外のシグナリング解明なども行っていく必要がある。このタンパク質機能の研究には、多方面の技術が使用され、酵素アッセイ、酵母 ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ アッセイ、クロマトグラフィーによる精製、情報ツールとデータベース等があるが、特に、電気泳動によるたんぱく質の判別は重要な手法である。そして、電気泳動のように、キャピラリー管中のサンプル、分析物、緩衝剤、及び試薬等の液体を移動させた際に得られる輸送反応を検出して、該サンプルの分析、判別、判定等を行う場合の前記液体の輸送及び方向付けに関しては、さまざまな報告がある（例えば、特許文献２、３）。
特開平７−３１１１９８号公報 特表２０００−５１３８１３号公報 特表２００１−５２３３４１号公報

上述したように生体サンプルの分析においては、キャピラリー電気泳動装置を利用した方法が広く使われている。

実際に輸送反応を行なう部分であるキャピラリーは、外形３００ミクロン、内径１００ミクロン程度のガラス管が使用される例が多く、折れにくくするために表面はポリイミド等でコーティングされている。しかしながら、内部試料を検出するために検出窓として焼いたり薬品で溶かしたりするなどしてコーティングを一部剥ぎ取る。この時、コーティングを剥いだ部分は折れやすくなり取り扱いに十分注意する必要がある。折れた場合はなお危険である。

また、サンプルの注入においても、加圧や吸引で行なうのが一般的な方法であるが、一定量注入する必要があり、時間で調整するもののキャピラリー内の緩衝剤の粘度や温度変化により注入量が実験のたびに異なるという問題がある。サンプルの量は測定結果に及ぼす影響は大きく、大変重要な項目である。

また、このようなキャピラリーを使用した装置の場合、構成上短い流路での電気泳動を行なうことは困難であり、必要以上の泳動距離と時間をかけて測定することになる。

上記の煩雑な作業を簡便にする方法として、キャピラリーの代わりに、微細な流路を形成したプレートを使って、電気泳動させる方法がある。

しかし、このプレート上の流路を利用した場合でも試料の分離を行うのに、例えば特許文献２，３に記載の方法では、試料をトラップする緩衝剤が充填された、複数のキャピラリーチャンネルを交差させ、且つ少なくとも３つ電極を設けて、該少なくとも３つ設けられた電極のうちの２つの電極に印加して、前記交差部を通して前記試料を移動させている。しかしながらこの方法では、流路が交差していることから、試料を電気泳動させる際にうまく泳動しない可能性があり、さらに、分離された試料は緩衝剤の粘度や温度変化により変化するため一定でないため、正確な測定結果が得られないという問題がある。

本発明は、流路に充填された緩衝剤中で生体サンプルを移動させて検出を行う際に、煩雑な準備作業が不要で、短時間で正確な検出結果の得られる、生体サンプル分析用のプレートを提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の生体サンプル分析プレートは、軸心周りに回転することで、注入された緩衝剤が遠心力によって充填される流路を有する生体サンプル分析用プレートにおいて、前記流路は、生体サンプルを一定量だけ取得するための予め定められた容積を有する定量分取部に一端が連結され、その定量分取部より前記軸心に対して外周方向に伸びる形状を有する第１の流路と第２の流路とにより形成されており、前記第１の流路の他端には、前記軸心に対して前記定量分取部と同心円上の位置、または、前記定量分取部よりも前記軸心側の位置において、前記流路に充填される緩衝剤が保持される緩衝剤貯留部を設けてあり、更に前記第２の流路には、緩衝剤貯留部分に保持できない余剰の緩衝剤が流入するオーバーフローチャンバーを連結したことを特徴とするものである。

また、本発明の生体サンプル分析方法は、前記生体サンプル判別用プレートを利用して行う分析方法において、前記緩衝剤貯留部分に緩衝剤を保持させて、前記生体サンプル分析用プレートをその軸心周りに回転させて遠心力を与えたときに、前記定量分取部に、一定量の生体サンプルを注入できるだけの体積空間を残し、その後に、残された空間に生体サンプルを注入するようにしたことを特徴とする分析方法である。

本発明によれば、遠心力によって、短時間で一定量の生体サンプルを緩衝剤中に確実に添加することができ、その後の電気泳動によって、正確な検出を行うことができる。さらに本発明によれば、緩衝剤や生体サンプルをプレートに供給する際に、緩衝剤注入部あるいは生体サンプル注入部の全体をほぼ満たすように注入するだけで、分析に必要な量の緩衝剤や生体サンプルを、過不足なく供給することができる。このため、従来のように、ピペットなどからプレートに供給する際に、一定量だけ吐出させるような、熟練した操作は必要とならず、簡単な操作で緩衝剤や生体サンプルを注入することができる。このように煩雑な準備作業が不要で、短時間で正確な検出結果の得られる、生体サンプル分析用のプレートを提供することができる。

（実施の形態１）
以下、図１〜図８を用いて、本実施の形態１について説明する。本発明は、生体サンプルを緩衝剤中で移動させて、生物学的、酵素的、免疫学的、及び化学的反応を行い、生体サンプルを容易かつ安価に精度よく短時間で判別することを実現するものである。

なお、本実施の形態１では、説明を具体的にするために、前記生体サンプルがＤＮＡサンプルで、前記緩衝剤が分離用ＤＮＡコンジュゲート及びＤＮＡ結合制御剤を含むものであるとし、本生体サンプル分析プレートが、流路中に充填させた分離用ＤＮＡコンジュゲート中に、定量された前記ＤＮＡサンプルを添加して電気泳動させ、該流路中の蛍光度あるいは吸光度を検出して、該ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するものとする。

まず、図１〜図３を用いて、本実施の形態１における生体サンプル分析プレートの構成について説明する。図１は、本実施の形態１における生体サンプル分析プレートの流路形成面からみた図である。図２は図１に示すプレート１に形成されたパターン２の詳細形状を示す図である。

本実施の形態１におけるプレート１には図２に示すパターン２が４個放射線状に形成されており、同時に４検体のＤＮＡ判別が可能である。

図１に示すように本実施の形態１におけるプレート１の外形は８センチ四方の正方形で４角は面取りされており、そのうちの１角は更に大きく面取りされている。

更に穴４を設けているが、これは外形を非対称にしてパターンの場所を特定できるようにされている。プレート１をこのような外形形状にしている訳は、図示しない光学読取装置にプレートを取り付けて、上記の蛍光度や、吸光度を検出する際の位置決めを容易にするためである。材料はアクリル系の樹脂を使用し厚みは２ｍｍである。流路形成面には溝が形成されさらに厚さ５０μｍのアクリル製フィルムを接着することで密閉流路が形成されている。

また、５は本プレートの軸心であり、軸心５を中心に本プレートを上記の光学読取装置の回転部に固定するための孔３を設けている。

図２に示す６は緩衝剤であるＤＮＡコンジュゲートを注入する、空気孔を兼ねた緩衝剤注入口、７は注入された緩衝剤を一旦保持するための緩衝剤注入部、８はＤＮＡサンプルを注入する、空気孔を兼ねたサンプル注入口、９は注入されたＤＮＡサンプルを一旦保持するためのサンプル注入部である。緩衝剤注入部７とサンプル注入部９の形状は相似しており、周辺断面を図３に示す。

図３は緩衝剤注入部やサンプル注入部近傍の断面を表した図であり、斜線でハッチングした部分がプレート１である。１９が緩衝剤注入口６およびサンプル注入口８にあたり、２０が緩衝剤注入部７およびサンプル注入部９である。２１が前述したフィルムであり溝にフタをするように貼り付けることで密閉流路が形成される。ちなみに流路形成面は下部である。

再び図２に戻り、サンプル注入部９はサンプル定量分取部１０と接続しており、緩衝剤注入部７も流路１１によって、定量分取部１０と接続している。また、定量分取部１０には空気抜きをするための空気孔１３と、注入されたＤＮＡサンプルを遠心力により、定量化するためのオーバーフローチャンバー１４と、電気泳動時に前記した光学読取装置にて走査するための流路１２が接続されており、流路１２の端部には、空気孔１５が接続されており、更に、緩衝剤貯留部分に保持できない余剰の緩衝剤が流入するためのオーバーフローチャンバー１７が設置されている。本実施の形態では、流路１１、１２の幅は５０μｍであり、流路の深さは５０μｍである。

それでは、以下前述した該ＤＮＡサンプルのＳＮＰｓ（一塩基多型）の有無を判別するまでの具体的操作および動作の一例を、外周側パターン２の詳細形状を示す図２を利用して説明する。

まず、検体となるＤＮＡサンプルを準備する。本来ＤＮＡは２本鎖の螺旋構造をしたものであるが、本実施の形態１においては、判別したいＳＮＰｓ部位を含む約６０塩基長の１本鎖ＤＮＡを準備する。抽出方法や１本鎖化については本発明とは直接関係がないので詳細説明は省略する。

次に、緩衝剤としてＤＮＡコンジュゲートを準備する。ＤＮＡコンジュゲートとは、６〜１２塩基長１本鎖ＤＮＡの５’末端に高分子のリニアポリマーが共有結合したものである。さらにＤＮＡは、正常型に対しては相補であるが変異型に対しては相補ではない配列であり、正常型ＤＮＡに対しての結合力が強く、変異型ＤＮＡに対しての結合力が弱い特性がある。また、電気泳動した場合、５’末端に結合したリニアポリマーがおもりとなり泳動速度がかなり遅いという特性もある。以後記述する「ＤＮＡコンジュゲート」とは、電解質の役目もするｐＨ緩衝剤およびＭｇＣｌ₂などのＤＮＡ結合力制御剤を含んだ物性とする。

試料の準備が終わったところで、ＤＮＡコンジュゲートおよびＤＮＡサンプルをプレート内へ注入する。まず、ＤＮＡコンジュゲートをピペッター等により緩衝剤注入口６から緩衝剤注入部７を充填するように分注する。分注量としては、パターンのスケールにより異なるが本実施の形態１においては、緩衝剤注入部７と流路１１と定量分取部１０と流路１２を満たすには、ＤＮＡコンジュゲートが３マイクロリットル必要である。緩衝剤注入部７の容積は、３マイクロリットルより若干多くなるように予め形成してある。

次に光学読取装置の回転部にプレート１を固定し、軸心５を軸に回転させる。この時分注されたＤＮＡコンジュゲートは、遠心力により外周方向へと移動する。緩衝剤注入部７内のＤＮＡコンジュゲートは流路１１を通り定量分取部１０へと移動した後、さらに流路１２まで移動する。回転数４０００ｒｐｍで回転開始から２分後、ＤＮＡコンジュゲートの移動が停止した状態が図４である。また、定量分取部１０周辺を拡大した図が、図５である。

ＤＮＡコンジュゲートの移動が終了した後、緩衝剤注入部７と流路１２内に存在するＤＮＡコンジュゲートの液面高さと定量分取部の液面高さは、軸心５を中心とする同一円周上となる。但し、緩衝剤注入部７内に注入するＤＮＡコンジュゲートの量が３マイクロリットルより少ない場合、図６ａに示すように、定量分取部１０や流路１２内にＤＮＡコンジュゲートが充填されない。充填していなければ、電気泳動ができなくなる。

一方、３マイクロリットルより多い場合においては、緩衝剤貯留部分に保持できない余剰の緩衝剤が流入するためのオーバーフローチャンバー１７を設置している。このため、ＤＮＡコンジュゲートの液面高さと定量分取部の液面高さは、常に軸心５を中心とする同一円周上となる。なお、オーバーフローチャンバー１７は、図６ｂに示すように、オーバーフローチャンバー１７を除くハッチング部分、すなわち、緩衝剤注入部７と流路１１と定量分取部１０と流路１２のハッチングした容積が３マイクロリットルになった時の、重心５を中心とする同一円周上の流路１２に配置されている。

次にＤＮＡコンジュゲートが流路内に輸送された後、ＤＮＡサンプルをプレート内へ注入する。ＤＮＡサンプルはピペッター等によりをサンプル注入口８よりサンプル注入部９へ分注する。本実施の形態１においては、ＤＮＡサンプルは１マイクロリットル必要とするので、サンプル注入部９の容積は、それより若干大きく形成しておく。

次に回転部にプレート１を固定し、軸心５を軸に回転させる。この時分注されたＤＮＡサンプルは、遠心力により外周方向へと移動する。

サンプル注入部９内のＤＮＡサンプルは空気孔１３により気泡が発生することなく、定量分取部１０へと移動する。このとき、定量分取部１０に移動したＤＮＡサンプルはオーバーフローチャンバー１４により、定量化することができ、不必要なＤＮＡサンプルはオーバーフローチャンバー１４内へと移動する。そして、４０００ｒｐｍでの回転開始から２分後、ＤＮＡサンプルの移動が停止した状態が図７である。また、定量分取部１０周辺を拡大した図が図８である。

以上の動作で定量分取部１０に残存したＤＮＡサンプルがＳＮＰｓの判別を行なう最終試料となる。

次に、電気泳動を行う。流路が形成されたプレート前面にはフィルム２１が貼られており、そこへ針状の電極を突き刺し内部へ挿入することで電圧印加が可能となる。電極を突き刺す場所は、正電極の場合、流路１２の端部に、負電極の場合は、緩衝剤注入部７に突き刺す。電気泳動は、電極間に数百Ｖの電圧を印加すると、流路１２さらには定量分取部１０において電界が発生し、定量分取部１０に一定量残存したＤＮＡサンプルは、流路１２中を正電極側（図７中Ａ方向）へ泳動する。

流路１２中にはＤＮＡコンジュゲートが充填されており、ＤＮＡサンプルはＤＮＡコンジュゲートとの結合を繰り返しながら電気泳動する。この時、上述したようにＤＮＡサンプル中の正常型ＤＮＡはＤＮＡコンジュゲートとの結合力が強いため泳動速度が遅くなり、変異型ＤＮＡは結合力が弱いため正常型に比べ泳動速度は速くなる。つまりＤＮＡサンプル中に正常型、変異型両方が存在した場合は、正常型のＤＮＡと変異型のＤＮＡが分離していくこととなり、ＳＮＰｓの判別が行なえるのである。

以上のように、本実施の形態１によれば、緩衝剤をプレートに供給する際に、緩衝剤注入部の全体を満たすように注入するだけで、分析に必要な量の緩衝剤を、過不足なく供給することができる。このため、従来のように、ピペットなどからプレートに供給する際に、一定量だけ吐出させるような、熟練した操作は必要とならず、簡単な操作で緩衝剤を注入することができる。また、定量分取部にオーバーフローチャンバーを設けることにより、緩衝剤中に一定量の生体サンプルを添加するようにしているので、この結果、該生体サンプルを緩衝材中で確実に電気泳動することができ、煩雑な準備作業が不要で、短時間で正確な検査が可能となる。

（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について、図９を用いて説明をする。実施の形態１の構成と大きく異なる点は、流路１２の端部に空気孔１５を設けるのではなく、緩衝剤注入部７ａを設け、更に緩衝剤注入部７ｂを設け、流路１６を介して緩衝剤注入部７と緩衝剤注入部７ａに接続した点である。以下、異なる部分について、説明を加える。

図９に示すように緩衝剤注入部７ｂを設け、流路１６を介して緩衝剤注入部７と緩衝剤注入部７ａに接続することで、ＤＮＡコンジュゲートをプレート１に注入する際、緩衝剤注入部７ｂの１箇所に注入するだけでよく、かつ、４０００ｒｐｍで回転させると、遠心力によるＤＮＡコンジュゲートの移動時間も２分よりは短く、１分４０秒で移動が完了する。また、流路の両端部から同時に緩衝剤の充填が行われるので、気泡などをかまずに、確実に充填されるための構成にするには、流路１１と流路１２の体積をほぼ等しくすることが望ましい。

本発明の生体サンプル分析プレート及び生体サンプル分析方法は、ＤＮＡサンプル等の生体サンプルの判別を、安価で、且つ簡便に行えるようにするものとして有用である。

本発明の実施の形態１にかかる生体サンプル分析用プレートの平面図 同生体サンプル分析用プレートのバターンを拡大して示す平面図 同生体サンプル分析用プレートのサンプル注入部、および緩衝剤注入部の断面図 同生体サンプル分析用プレートのパターンを示す平面図 同生体サンプル分析用プレートの定量分取部を拡大して示す平面図 同生体サンプル分析用プレートのパターンを示す平面図 同生体サンプル分析用プレートのパターン部分を示す平面図 同生体サンプル分析用プレートのパターンを示す平面図 同生体サンプル分析用プレートの定量分取部を拡大して示す平面図 本発明の実施の形態２にかかる生体サンプル分析用プレートのパターンを示す平面図

符号の説明

１ プレート
２ 流路パターン
３ 回転部固定用穴
４ 位置決め穴
５ プレート重心
６ 緩衝剤注入口
７，７ａ，７ｂ 緩衝剤注入部
８ サンプル注入口
９ サンプル注入部
１０ 定量分取部
１１，１２ 流路
１３ 空気孔
１４，１７，１８ オーバーフローチャンバー
１５ 空気孔
１６ 流路
３０ ＤＮＡコンジュゲート
３１ ＤＮＡサンプル
４０ スキャン流路

Claims (7)

1. 軸心周りに回転することで、注入された緩衝剤が遠心力によって充填される流路を有する生体サンプル分析用プレートにおいて、
   前記流路は、生体サンプルを一定量だけ取得するための予め定められた容積を有する定量分取部に一端が連結され、その定量分取部より前記軸心に対して外周方向に伸びる形状を有する第１の流路と第２の流路とにより形成されており、
   前記第１の流路の他端には、前記軸心に対して前記定量分取部と同心円上の位置、または、前記定量分取部よりも前記軸心側の位置において、前記流路に充填される緩衝剤が保持される緩衝剤貯留部を設けてあり、
   更に前記第２の流路には、緩衝剤貯留部分に保持できない余剰の緩衝剤が流入するオーバーフローチャンバーを連結したことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
2. 軸心周りに回転することで、注入された緩衝剤が遠心力によって充填される流路を有する生体サンプル分析用プレートにおいて、
   前記流路は、生体サンプルを一定量だけ取得するための予め定められた容積を有する定量分取部に一端が連結され、その定量分取部より前記軸心に対して外周方向に伸びる形状を有する第１の流路と第２の流路とにより形成されており、
   前記第１の流路および第２の流路の他端には、前記軸心に対して前記定量分取部と同心円上の位置、または、前記定量分取部よりも前記軸心側の位置において、前記流路に充填される緩衝剤が保持される緩衝剤貯留部を設けてあり、前記緩衝剤貯留部には、緩衝剤貯留部分に保持できない余剰の緩衝剤が流入するオーバーフローチャンバーを連結しており、更に、前記緩衝剤貯留部よりも軸心側の位置に、前記緩衝剤が注入される緩衝剤注入部を設け、前記緩衝剤貯留部と連結したことを特徴とする生体サンプル分析用プレート。
3. 緩衝剤の流路への充填を促進するために、前記流路または前記緩衝剤注入部に連通する空気孔を設けたことを特徴とする請求項１から請求項２のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレート。
4. 生体サンプルを注入するための生体サンプル注入部を、前記定量分取部に連結して設け、さらにその生体サンプル注入部に保持された生体サンプルの前記定量分取部への供給を促進するための空気孔を、前記定量分取部に連通して設けたことを特徴とする、請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレート。
5. 前記定量分取部は、一定量以上に供給された生体サンプルが流出する、オーバーフローチャンバーに連結していることを特徴とする請求項４に記載の生体サンプル分析用プレート。
6. 請求項１から５のいずれかに記載の生体サンプル分析用プレートを利用して行う分析方法であって、
   前記緩衝剤貯留部分に緩衝剤を保持させて、前記生体サンプル分析用プレートをその軸心周りに回転させて遠心力を与えたときに、前記定量分取部に、一定量の生体サンプルを注入できるだけの体積空間を残し、その後に、残された空間に生体サンプルを注入するようにしたことを特徴とする生体サンプル分析方法。
7. 一定量の生体サンプルを前記定量分取部に取得した後、生体サンプルを前記第１または第２の流路中を電気泳動させ分析することを特徴とする請求項６に記載の生体サンプル分析方法。
   
   

Images