DE19938138A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Identifikation einer Biopolymersequenz auf Festkörperoberflächen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation eines auf ein einer ersten Oberfläche eines Festkörpersubstrats aufgebrachten ersten Biopolymers, wobei das erste Biopolymer mit einem dazu affinen zweiten Biopolymer in Kontakt gebracht wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Identifikation einer spezifischen Biopolymersequenz, die auf einer Festkörperoberfläche gebunden ist.

Aus der US 5,780,234 ist bekannt, daß Nukleinsäuren, an die kovalent Donator- und Akzeptorgruppen als Elektronentrans­ fereinheiten angebracht sind, eine extrem schnelle und lang­ reichweitige Elektronenleitung aufweisen können. Werden diese Elektronentransfereinheiten an zwei komplementären Nuklein­ säuren angebracht, kann diese Methode auch zur Detektion der Hybridisation eingesetzt werden.

In der US 5,780,234 wird auch die Möglichkeit genannt, Elek­ trodenoberflächen als eine der Elektronentransfereinheiten zu verwenden.

Die in DNA-Einzel- und Doppelsträngen auftretenden Leitfähig­ keitsphänomene wurden in zahlreichen Arbeiten eingehend un­ tersucht. So untersuchten H.-W. Fink et al. [H. W. Fink, C. Schönenberger, Nature 398, 407 (1999)] sowohl die Leitfähig­ keit von DNA-Molekülen, als auch den Einfluß elektroaktiver Gruppen. Die an einzelnen DNA-Doppelsträngen gemessenen Leit­ fähigkeiten wurden in der Größenordnung guter Halbleiter oder leitfähiger Polymere angegeben. Es wird jedoch auch auf die zum Teil noch eklatanten Diskrepanzen zwischen verschiedenen experimentellen Befunden und theoretischen Vorhersagen hinge­ wiesen.

Hohe Leitfähigkeit und schneller Ladungstransfer auch über große Abstände wurde auch an Monolagen von DNA-Doppelsträngen auf Elektrodenoberflächen gemessen [S. O. Kelley, N. M. Jack­ son, M. G. Hill, J. K. Barton, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 38, 941 (1999)]. Einzelne Mismatches in der Basensequenz der Dop­ pelhelices können diesen Ladungstransport allerdings ent­ scheidend behindern. Dies legt nahe, daß durch elektronische Detektion der DNA-Hybridisation eine hohe Spezifizität und Sensitivität auch auf einzelne Punktdefekte erreicht werden kann.

Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine neue Technologie be­ reitzustellen, die es ermöglicht, an eine feste Oberfläche fixierte Biopolymere eindeutig und sensitiv zu identifizie­ ren.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchskomplexex einzeln oder in Kombination gelöst.

Unter Biopolymer wird insbesondere ein aus Nukleotiden oder Aminosäuren gebildetes Polymer verstanten, z. B. DNA, RNA, PNA, PTO, Peptid, Protein u. dgl..

Die Identifikation wird durch eine hierzu affine Biopolymer­ sequenz vorgenommen, die sowohl in Lösung, als auch auf einer zweiten Festkörperoberfläche vorliegen kann. Die Detektion kann über elektronische und optische Verfahren erfolgen.

Die elektronische Detektion durch z. B. bei der Hybridisation auftretenden Leitfähigkeitsänderung zwischen zwei oder an ei­ ner Oberfläche sowohl im Bezug auf Sensitivität, Spezifizität und apparative Umsetzung bietet entscheidende Vorteile.

Mögliche Einsatzfelder der hier entwickelten Methode können eine große Bandbreite von der medizinischen Diagnostik bis hin zur Identifikations-, Codierungs- und Erkennungstechnik umfassen.

Die erfindungsgemäße Identifikation der Biopolymere auf einer Festkörperoberfläche erfolgt vorteilhafterweise nach folgen­ der Vorgehensweise:

• a) Die auf der Festkörperoberfläche fixierten (ersten) Biopo­ lymere werden mit dazu affinen (zweiten) Biopolymeren in Kon­ takt gebracht, was eine spezifische Reaktion (bei Nukleinsäu­ ren eine Hybridisation zu Doppelsträngen) zur Folge hat. Die zweiten Biopolymere können sich sowohl in Lösung befinden, als auch auf einer Gegenoberfläche fixiert sein, die z. B. durch Aufeinanderpressen mit den zu identifizierenden Molekü­ len in Kontakt gebracht wird.
• b) Die Hybridisation kann dann über eine Änderung in der Oberflächenleitfähigkeit oder der Leitfähigkeit im Bezug auf eine Gegenelektrode gemessen werden, wenn sich die zweiten Bioplymere bzw. Zielbiopolymere in Lösung befinden. Wenn die Hybridisation zwischen zwei parallelen Oberflächen erfolgt, kann die Änderung in der Leitfähigkeit zwischen den beiden Oberflächen zur Detektion verwendet werden. Dies gilt in bei­ den Ausgestaltungsformen sowohl für AC- und DC- Leitfähigkeitsphänomene. Zur Erhöhung der Leitfähigkeit kön­ nen in den biopolymeren Dünnfilm auch Metallatome, -Ionen, - Cluster und Komplexmoleküle eingelagert werden. Alternativ kann die Detektion auch über Fluoreszenz oder andere optische Methoden erfolgen. Leitfähige Cluster können hier auch zur Verstärkung optischer Signale eingesetzt werden.

In einer Ausgestaltungsform werden als zu identifizierende Biopolymere bzw. erste Biopolymere Nukleinsäuren einer be­ stimmten Sequenz kovalent an eine leitfähige Festkörperober­ fläche gebunden. Hierzu komplementäre Nukleinsäuren sind an ein zweites leitfähiges Substrat gebunden, das mit dem ersten durch Aufeinanderpressen in Kontakt gebracht wird. Findet Hy­ bridisation der Nukleinsäuren zwischen den beiden Oberflächen statt, wird dies eine wesentliche Verringerung des elektri­ schen Widerstandes zur Folge haben, was durch konventionelle elektronische Methoden problemlos nachweisbar ist. Durch die mit der Hybridisation verbundenen Änderungen der Kapazitäten in dieser Schichtstruktur werden auch veränderte Wechsel­ stromwiderstände detektierbar. Weiterhin ist auch der Einsatz elektrochemischer Signale, wie z. B. spezifischer Reduktions- und Oxidationspeaks zur Identifikation der Hybridisation ein­ setzbar.

Eine ähnliche Nachweismethode ist auch einsetzbar, wenn die Zielbiopolymere in Lösung vorliegen. Auch hier ist der Nach­ weis der Hybridisation über elektronische Meßgrößen möglich. Bevorzugt kann hier die Änderung in der Doppellagenkapazität auf der Oberfläche über AC- und/oder Impedanzsignale nachge­ wiesen werden. Dies kann entweder über eine Gegenelektrode erfolgen, oder aber über die strukturierte Ausgestaltung der Detektoroberfläche. Letzteres kann in einer Aufteilung der Oberfläche in zwei leitfähige und von einer Isolatorfläche getrennte Teilflächen erfolgen, von denen eine die nachzuwei­ senden Nukleinsäuren trägt und die andere als Gegenelektrode dient. Auch eine Dreiteilung zur Schaffung einer zusätzlichen Referenzelektrode für einen elektrochemischen Dreielektroden­ setup ist möglich. Die Elektroden können auch zu einer Anrei­ cherung geladener Zielmoleküle in der Nähe der Oberfläche ge­ nutzt werden. In einer speziellen Ausgestaltungsform kann auch eine Anreicherung und Detektion auf der Oberfläche er­ reicht werden, indem eine Wechselspannung oder ein Wechsel­ strom zwischen zwei Elektroden, die sich in einem kleinen Ab­ stand zueinander befinden und auf denen jeweils die zu detek­ tierenden Moleküle fixiert sind, angelegt wird.

Die elektronischen Meßgrößen können verstärkt werden, indem in den Dünnfilm der zu detektierenden Biopolymere Metallato­ me, -Cluster oder -Ionen eingebracht werden. Dies kann sowohl vor als auch nach der Hybridisierung z. B. durch Bedampfen oder elektrochemische Methoden erfolgen. Weiterhin ist auch der Einsatz von Komplexen Molekülen, die sich z. B. bei Nu­ kleinsäuren spezifisch an einzelsträngige Strukturen oder auch beispielsweise als Interkalatoren an doppelsträngige Konformationen anlagern und elektroaktive Zentren aufweisen.

Mögliche Anwendungen der hier beschriebenen Methoden können zum Beispiel im Falle der Hybridisation zwischen zwei Fest­ körperoberflächen im Bereich der Sicherheitstechnik in der fälschungssicheren Identifikation von Banknoten, Chipkarten, Ausweisen u. ä. liegen. Im falle der Detektion in flüssiger Phase kann die Detektionsmethode zur Identifikation z. B. von Chargen von Lebensmitteln, Medikamenten o. ä. eingesetzt wer­ den.

Beispiel 1

Oligonukleotide einer Länge von 21 Basen werden am 5'-Ende kovalent an die Oberfläche eines Leitfähigen Polykarbo­ nat/Kohlefaser-Kunststoffes fixiert. Die an der Oberfläche befindlichen Oligonukleotide werden mit in Lösung befindli­ chen komplementären Sonden hybridisiert. Wird zwischen der leitfähigen Kunststoffoberfläche und einer Ag/AgCl- Gegenelektrode eine Wechselspannung einer Frequenz von 250 Hz angelegt und der kapazitive Anteil des Wechselstromes gemes­ sen, so ergibt sich bei Hybridisation bei 0,4 V ein Abfall der Wechselstromleitfähigkeit um mehr als 10%, was einer direkten Detektion einer spezifischen Hybridisierung und damit der zu ermittelnden Sequenz gleichkommt. Kontrollversuche mit nicht spezifischen Oligonukleotiden ergeben keine wesentliche Leit­ fähigkeitsänderung.

Beispiel 2

Durch Aldehyd-Gruppen aktivierte Agarose-Beads werden mit Oligonukleotiden kovalent gekoppelt und auf eine Glasoberflä­ che immobilisiert. Die Oberfläche wird mit einer Testlösung in Kontakt gebracht, die dazu komplementäre Oligonukleotide enthält, die an einem Ende eine fluoreszierende FAM-Gruppe und am anderen Ende eine fluoreszenzunterdrückende dT(C2- Dabcyl)Phosphatgruppe enthalten. Weiterhin nehmen diese Nu­ kleinsäuren aufgrund ihrer teilweise selbstkomplementären Ba­ sensequenz in Lösung eine haarnadelförmige Sekundärstruktur ein. Fluoreszierende und fluoreszenzunterdrückende Gruppen befinden sich in unmittelbarer räumlicher Nähe. Bei Hybridi­ sation mit den an der Oberfläche fixierten Nukleinsäuren ent­ faltet sich die Sekundärstruktur der in Lösung befindlichen Nukleotide und es wird eine starke Erhöhung der optischen Si­ gnalintensität meßbar.

Claims (21)

1. Verfahren zur Identifikation eines auf ein einer ersten Oberfläche eines Festkörpersubstrats aufgebrachten ersten Biopolymers, wobei das erste Biopolymer mit einem dazu affi­ nen zweiten Biopolymer in Kontakt gebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich das zweite Biopo­ lymer sich auf einer zweiten Oberfläche oder in Lösung befin­ det.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Identifikation des ersten Biopolymers vorgenommen wird durch Auswertung eines elektronischen oder optischen Signals, insbesondere der durch affinitätsbedingte Adhäsion ausgelö­ sten Änderung der Impedanz, der Leitfähigkeit im Gleichstrom- und/oder Wechselstrombereich in Abhängigkeit von der aufge­ prägten Wechselspannungs- oder Wechselstromfrequenz.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Änderung der Leitfähigkeit zwischen zwei leitfähigen Festkörperoberflächen gemessen wird, an die jeweils zueinan­ der affine Biopolymere adsorbiert sind.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektion der oberflächenfixierten Biopolymere durch Re­ aktion mit in Lösung befindlichen affinen Biopolymeren und deren Detektion durch Fluoreszenz und/oder Fluoreszenzreso­ nanz-Energietransfer herbeigeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich die zu identifizierenden Biopolymere in Lösung befinden und die Detektion durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer vorgenommen wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektion durch die Messung optischer Signale vorgenommen wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die optischen Signale durch leitfähige Cluster verstärkt wer­ den, welche von der ersten die ersten Biopolymere tragenden Oberfläche durch eine Affinitäts- und/oder Spacerschicht ge­ trennt sind.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektion durch eine Wechselspannung oder einen Wechsel­ strom zwischen zwei leitfähigen, durch einen Isolator ge­ trennten mit dem ersten Biopolymer versehen Strukturen vorge­ nommen wird.

10. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüche, wobei in mindestens eine auf ein Substrat adsorbierte aus dem ersten oder zweiten Biopolymer gebildete Schicht elektroaktive Me­ tallatome, -Ionen, -Cluster oder Komplexmoleküle eingebracht werden.

11. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüche, wobei eine zusätzliche leitfähige Struktur als Referenzelektrode und/oder eine zusätzliche leitfähige Struktur als Gegenelek­ trode eingesetzt wird.

12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf einer ersten Oberflä­ che eines Festkörpersubstrats ein erstes Biopolymer aufge­ bracht ist, und wobei das erste Biopolymer mit einem dazu af­ finen zweiten Biopolymer in Kontakt bringbar ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei sich das zweite Bio­ polymer auf einer zweiten Oberfläche oder in Lösung befindet.

14. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei zur Identifikation des ersten Biopolymers eine Einrichtung zur Auswertung eines elektronischen oder optischen Signals vorgesehen ist, insbe­ sondere einer durch affinitätsbedingte Adhäsion ausgelösten Änderung der Impedanz und/oder der Leitfähigkeit im Gleich­ strom und/oder Wechselstrombereich in Abhängigkeit von der aufgeprägten Wechselspannungs- oder Wechselstromfrequenz.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die Änderung der Leitfähigkeit zwischen zwei leitfähigen Festkörperoberflächen meßbar ist, an die jeweils zueinander affine Biopolymere adsorbiert sind.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Detektion der ersten oberflächenfixierten Biopolymere durch affinitätsbedingte Reaktion mit in Lösung befindlichen zweiten Biopolymeren und deren Detektion durch Fluoreszenz- und/oder Fluoreszenzresonanz-Energietransfer herbeiführbar ist.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei die ersten Biopolymere in Lösung sich befinden und die Detek­ tion durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer vorgenommen wird.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei die Detektion durch die Messung optischer Signale vorgenommen wird, die durch leitfähige Cluster, welche von der ersten, die ersten Biopolymere tragenden Oberfläche durch eine Affi­ nitäts- und/oder Spacerschicht getrennt sind, verstärkbar sind.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei die Detektion durch eine Wechselspannung oder Wechselstrom zwischen zwei leitfähigen, durch einen Isolator getrennten Strukturen, an die jeweils spezifische Biopolymere adsorbiert sind, vorgenommen wird.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei in mindestens eine auf ein Substrat adsorbierte Schicht aus Bio­ polymeren elektroaktive Metallatome, -Ionen, -Cluster oder Komplexmoleküle eingebracht sind.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei eine zusätzliche leitfähige Struktur als Referenzelektrode und/oder eine zusätzliche leitfähige Struktur als Gegenelek­ trode vorgesehen ist.