DE4122839A1 - Nachweis und abbildung in biochemischen testverfahren unter verwendung von phosphor-screens - Google Patents

Nachweis und abbildung in biochemischen testverfahren unter verwendung von phosphor-screens

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DE4122839A1
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Makromo­ lekülen, die auf einer Matrix immobilisiert vorliegen.
Ein für alle molekularbiologischen Laboratorien essentielles Verfahren ist der Nachweis und die Abbildung von Makromolekü­ len. Dieses Verfahren findet unter anderem bei Proteintests, bei der Sequenzierung von DNA, bei der Kartierung von Genen und bei einer Vielzahl anderer Experimente und Bestimmungsverfah­ ren Verwendung. Bei dem üblicherweise verwendeten Verfahren wird das zu untersuchende Molekül oder die zu untersuchende Sequenz mit einer radioaktiven Spezies angelagert oder mar­ kiert und anschließend ein autoradiographisches Abbild der radioaktiven Emission auf einem Röntgenfilm aufgezeichnet.
Die Nachteile bei der Verwendung radioaktiver Spezies liegen darin, daß das Laborpersonal mit gefährlichen Substanzen umge­ hen muß, die radioaktiven Substanzen schwierig zu entsorgen sind und die Substanzen aufgrund des radioaktiven Zerfalls in Abständen durch neues Material ersetzt werden müssen. Markie­ rungen, die keine radioaktive Spezies verwenden, können nicht ohne weiteres auf einen Film oder einen Screen übertragen wer­ den, und sie besitzen im allgemeinen eine geringere Sensitivi­ tät als ihre radioaktiven Gegenstücke.
Röntgenfilme weisen ebenfalls bestimmte Limitierungen auf. Der dynamische Bereich eines typischen Röntgenfilms beträgt etwa das Fünfzigfache, wodurch der Grad an quantitativen Informa­ tionen, die durch einen derartigen Film erhältlich sind, be­ grenzt ist. Weiterhin sind im allgemeinen lange Expositions­ zeiten notwendig, um eine zufriedenstellende Abbildung zu er­ reichen, was auf die begrenzte Sensitivität des Films gegen­ über β-Teilchen-Emissionen zurückzuführen ist, die bei den meisten radioaktiven Markierungen verwendet werden. Weiterhin entstehen mögliche Unwägbarkeiten durch die Filmentwicklung, da hierzu eine Anzahl von Schritten erforderlich ist, bei der instabile Lösungen Verwendung finden.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustel­ len, wodurch die Nachteile des Standes der Technik vermieden werden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet Phosphor-Screens in Kombination mit Chemilumineszenz, um Makromoleküle nachzuwei­ sen und abzubilden, wobei die Notwendigkeit, Radioisotope zu verwenden, entfällt. Die Makromoleküle können erfindungsgemäß selektiv mit einer Spezies markiert werden, die eine Chemilu­ mineszenz-Reaktion in einem Substrat induziert, wobei das Sub­ strat gegen einen Phosphor-Screen exponiert wird, der in der Lage ist, auf die Chemilumineszenz-Emission zu antworten und der das Auftreten der Chemilumineszenz-Emission in einfach nachweisbarer Weise anzeigt.
Die Verwendung des Substrats als Zwischenelement zwischen der Markierung und dem Film oder dem Screen ermöglicht es, die Entstehung der Abbildung und die Intensität des Signals und damit die Sensitivität des Experiments zu kontrollieren, wäh­ rend gleichzeitig die von radioaktiven Materialien ausgehenden Gefahren vermieden werden. Weiterhin liegt das Substrat in flüssiger Form vor, was weitere Vorteile mit sich bringt, näm­ lich die Verstärkung des Kontakts mit der Markierung und die zur Verfügungstellung weiterer Parameter bei der Kontrolle und der Entstehung der Abbildung; derartige Parameter umfassen die Konzentration, die Lichtdurchlässigkeit und die Möglichkeit, Veränderungen in der physikalischen Anordnung und Konfigura­ tion der festen Elemente des Systems anzupassen.
Die Verwendung von Phosphor-Screens ermöglicht eine Abbildung mit einem hohen Grad an Sensitivität, Kontrast und Reprodu­ zierbarkeit in Verbindung mit relativ kurzen Expositionszei­ ten. Weitere Vorteile liegen darin, daß die Phosphor-Screens keine chemische Behandlung benötigen, um lesbar zu sein, und daß sie eine Chemilumineszenz-Emission bei ihrem Empfang auf­ nehmen können, und sie die Emissionsenergie solange zurückbe­ halten können, bis sie durch eine externe Quelle, wie z.B. In­ frarotlicht, stimuliert werden, worauf der Screen seine eigene entsprechende Emission freisetzt.
Weitere Eigenschaften, Vorteile und bevorzugte Ausführungsfor­ men der Erfindung sind aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit den Ansprüchen und den Abbildungen zu entneh­ men.
Fig. 1 zeigt eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Expe­ rimentes, wobei ein makromolekulares Immobilisie­ rungsmuster auf einen Phosphor-Screen übertragen wird.
Fig. 2 zeigt ein optisches System zur Erzeugung und zum Nachweis von Signalen, die das Muster auf dem Phos­ phor-Screen in eine visuell lesbare Form übersetzen.
Die Grundelemente der Erfindung sind die Markierung, das Che­ milumineszenz-Substrat und der Phosphor-Screen.
Im folgenden erfolgt zunächst eine Beschreibung der Markierung und des Chemilumineszenz-Substrats.
Die Markierung und das Substrat können aus solchen Materialien bestehen, die dazu neigen, bei Kontakt eine Chemilumineszenz- Emission zu bewirken. Hierzu gehören eine Vielzahl an Spezies, die in der Chemilumineszenz-Technik wohl bekannt sind. Die Markierung und das Substrat können zum Beispiel Reaktionspart­ ner sein, die sich verbinden, um einen angeregten Zustand zu bilden, der spontan unter Freisetzung einer fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Emission auf den Grundzustand absinkt oder Reaktionspartner, die sich verbinden, um ein Intermediat zu bilden, welches spontan zu einem angeregten Zustand abge­ baut wird, der dann der gleichen Umwandlung und Energiefrei­ setzung unterliegt. Alternativ hierzu kann die Reaktion voll­ ständig im Substrat enthalten sein. Das Substrat bei einer derartigen Reaktion kann eine einzelne Spezies sein und die Reaktion kann entweder eine Umwandlung oder ein Abbau sein, die eine Emission zur Folge haben, oder das Substrat kann eine Mischung von Spezies sein, die in eine Reaktion eintreten, worauf die Emission erfolgt.
Für Reaktionen, die im Substrat enthalten sind, kann die Mar­ kierung entweder ein Katalysator oder ein Enzym sein. Kataly­ sator- und Enzymmarkierungen sind bevorzugt; insbesondere be­ vorzugt sind Enzymmarkierungen, und zwar aufgrund ihrer suk­ zessiven und anhaltenden Interaktion mit den Reaktanten-Sub­ stratmolekülen. Hierdurch wird ermöglicht, daß die Emissionen über längere Zeiträume fortdauern, wodurch die Aufzeichnung und der Nachweis erleichtert wird und eine Signal-Amplifika­ tion entsteht, die durch die Menge an Substrat, die der Mar­ kierung zugängig gemacht wird, kontrollierbar ist.
Eine weite Vielzahl an Katalysatoren und Enzymen ist bekannt, die in der Lage sind, eine Chemilumineszenz-Reaktion zu indu­ zieren, und die deshalb zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Beispiele für derartige Katalysatoren sind verschiedene Metalle und solche Spezies wie Adenosintri­ phosphat. Beispiele für Enzyme sind die Lactatdehydrogenase, Luciferase und Phosphatasen wie die alkalische Phosphatase (AP). Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Enzyme, wobei insbe­ sondere bevorzugt Phosphatasen eingesetzt werden, und hier wiederum insbesondere bevorzugt die alkalische Phosphatase.
Erfindungsgemäß kann jede beliebige Chemilumineszenz-Reaktion verwendet werden. Peroxid-Abbaureaktionen sind eine derartige, erfindungsgemäß einsetzbare Klasse. Innerhalb dieser Klasse sind insbesondere 1,2-Dioxetan-Abbaureaktionen, einschließlich Abbaureaktionen von 1,2-Dioxetanonen (α-Peroxilactone) und 1,2-Dioxetandionen (Peroxioxalate) bevorzugt. Beispiele für andere Klassen sind Reaktionen unter Einschluß von Luminol (3- Aminophthalhydrazid) und dessen Analoga und Organometalle wie p-Chlorphenylmagnesiumbromid.
Insbesonders bevorzugte Reaktionen sind durch Enzyme regulier­ te 1,2-Dioxetan-Abbaureaktionen. Verbindungen, die sowohl die 1,2-Dioxetan-Gruppe als auch eine Estergruppe einer Ortho­ phosphorsäure enthalten, sind ein Beispiel für eine Klasse von Verbindungen, die diesen Bedingungen genügen und die erfin­ dungsgemäß einsetzbar sind. Der Abbau dieser Verbindungen wird durch eine Phosphatase katalysiert. Ein spezielles Beispiel hierfür ist das Substrat 3-(2′-Spiroadamantan)-4-methoxy-4­ (3′′-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan mit dem Enzym alkalische Phosphatase. Ersteres ist kommerziell erhältlich von der Firma Tropix Corporation, Bedford, Massachusetts, und von der Firma Lumigen Corporation, Detroit, Michigan, letzteres kann kommer­ ziell von verschiedenen Firmen bezogen werden.
Das Substrat wird in der flüssigen Phase sein. Demzufolge sind als Substrate insbesonders wasserlösliche Substanzen erfin­ dungsgemäß einsetzbar, und die flüssige Phase wird eine wäß­ rige Lösung sein. Es ist anzunehmen, daß die Substratmenge, die der Reaktion unterliegt, nicht ohne weiteres bestimmbar ist, weil die Gegenwart und die Menge der makromolekularen Spezies, und demnach der angelagerten Markierung, unbekannt ist. Gleichwohl sollte hier ein Überschuß an Substrat vorhan­ den sein, berechnet entweder aufgrund der erwarteten Menge oder der oberen Grenze der nachzuweisenden makromolekularen Spezies, so daß die gesamte, durch die Anlagerung an die ma­ kromolekulare Spezies immobilisierte Markierung in die Reak­ tion eingeht und der Emissionsgrad zu der Markierungsmenge in Bezug gesetzt werden kann. Bei Verwendung von Katalysator- oder Enzymmarkierungen wird ein großer Überschuß an Substrat bevorzugt, so daß die Chemilumineszenz-Lichtemissionen für eine ausreichende Zeitdauer anhalten, um die verbleibenden Verfahrensschritte auszuführen, während Licht einer ausrei­ chenden Intensität weiterhin emittiert wird. Erfindungsgemäß bevorzugt sind insbesondere Systeme, bei welchen eine ausrei­ chende Menge an Substrat einbezogen ist, wodurch Chemilumines­ zenz-Lichtemissionen entstehen, die für wenigstens eine Stun­ de, insbesondere bevorzugt wenigstens etwa 24 Stunden, anhal­ ten.
Im folgenden wird der Phosphor-Screen näher beschrieben. Eine weite Vielfalt an Phosphor ist erfindungsgemäß einsetzbar. Für jede besondere Anwendung wird die Auswahl eines geeigneten Phosphors abhängig sein vom Chemilumineszenz-Material, wobei der Phosphor so ausgewählt wird, daß er die durch das einzelne Chemilumineszenz-Material hervorgerufene Emission aufnehmen und darauf reagieren kann.
Die bei der Ausführung der Erfindung bevorzugt einsetzbaren Phosphore können aus dem gesamten Bereich bekannter Materia­ lien ausgewählt werden, die die Fähigkeit zur Phosphoreszenz besitzen. Im allgemeinen sind dies solche Materialien, die Licht absorbieren und im Ergebnis einen angeregten Zustand einnehmen und anschließend auf den Grundzustand zurückkehren, während sie Licht emittieren, entweder mit einer unterschied­ lichen Intensität oder Frequenz oder über eine unterschiedli­ che Zeitskale oder beidem. Zu den Materialien, die diese Vor­ aussetzungen erfüllen, gehören natürliche Mineralien, biologi­ sche Verbindungen und synthetisch hergestellte Materialien und Mischungen. Beispiele hierfür sind Metallhalophosphate wie
Ca₅(PO₄)₃(F,Cl) : Sb(III), Mn(II), Sr₅(PO₄)₃(Cl) : Eu(II),
Sr₅(PO₄)₃(F,Cl) : Sb(III), Mn(II) und [SrEu(II)]₅(PO₄)₃Cl;
Seltenerd-aktivierte Phosphore wie
Y₂O₃ : Eu(III), SrB₄O₇ : Eu(II), BaMg₂Al₁₆O₂₇ : Eu(II),
Y(VO₄) : Eu(III), Y(VO₄)PO₄ : Eu(III), Sr₂P₂O₇ : Eu(II),
SrMgP₂O₇ : Eu(II), Sr₃(PO₄)₂ : Eu(II),
Sr₅Si₄Cl₆O₁₀ : Eu(II), Ba₂MgSi₂O₇ : Eu(II),
GdOS : Tb(III), LaOS : Tb(III), LaOBr : Tb(III),
LaOBr : Tm(III) und Ba(F,Cl)₂ : Eu(II);
Aluminat-Wirtsphosphore wie Ce0,65Tb0,35MgAl₁₁O₁₉;
Silikat-Wirtsphosphore wie Zn₂SiO₄ : Mn(II);
und Fluorid-Wirtsphophore wie
Y0,79Yb0,20Er0,01F₃, La0,86Yb0,12Er0,02F₃ und Y0,639Yb0,35Tm0,001F₃ .
Von besonderem Interesse sind Phosphore, die im angeregten Zustand verbleiben, bis sie durch externe Stimulation in den Grundzustand zurückkehren. Hierzu gehören viele der oben ange­ führten sowie weitere Phosphore. Bevorzugte Beispiele sind Erdalkalimetallsulfide und -selenide, dotiert mit Samarium- und Europium- oder Cerium-Oxyd, -sulfid oder -fluorid, welches weiterhin ein schmelzbares Salz wie Lithiumfluorid, Bariumsul­ fat oder beide enthält, die als Flußmittel dienen. Tabellen und Beschreibungen derartiger Materialien sind in den US-Pa­ tenten No. 48 12 660 (März 14, 1989), 48 22 520 (April 18, 1989) und 48 30 875 (Mai 16, 1989) von Lindmayer, J. (Quantex Corp.) enthalten, auf welche hiermit vollinhaltlich Bezug ge­ nommen wird. Die Stimulation, welche die Energie freisetzt, kann in Form einer Wärme- oder elektromagnetischen Bestrahlung erfolgen, z. B. durch sichtbares Licht, Röntgenstrahlen, ultra­ violetter Bestrahlung und infraroter Bestrahlung, jeweils in Abhängigkeit von der verwendeten Phosphorart.
Das Substrat und die Phosphore werden so ausgewählt, daß sie bei der gleichen Wellenlänge emittieren bzw. absorbieren, wo­ durch sie einander bezüglich der Energieemission und der Ant­ wort ergänzen. Die Energie einer einzelnen Emission liegt im allgemeinen in Form eines Wellenlängenbandes vor, dessen Brei­ te im allgemeinen Sinn unkritisch ist. Bei verschiedenen An­ wendungen, die weiter unten detaillierter beschrieben werden, dienen enger definierte Bandbreiten spezifischen Funktionen. Bezüglich der tatsächlichen Wellenlängen der Emissionen werden erfindungsgemäß bei den meisten Anwendungen Emissionen mit Spitzenwellenlängen verwendet, die innerhalb eines Bereiches von etwa 350 nm bis etwa 700 nm, bevorzugt von etwa 400 nm bis etwa 600 nm, liegen.
Die Verwendung von gemischten Phosphoren, zusammen mit einer entsprechenden Mischung aus Markierungs-/Substrat-Systemen, bietet weitere Möglichkeiten für weitere erfindungsgemäße Ver­ wendungen. Z. B. emittiert Luminol, ein allgemein erhältliches Chemilumineszenz-Substrat, Licht bei 428 nm, wenn es aktiviert wird, und verschiedene, herkömmlich erhältliche Naphthyldioxe­ tanisomere emittieren Licht bei Wellenlängen von zwischen 463 nm bis 560 nm. Von den verschiedenen, von der Fa. Quantex Corp. erhältlichen Phosphoren antwortet der als "Q-16" benann­ te Phosphor auf Wellenlängen von 470 nm, jedoch nicht auf hö­ here Wellenlängen, während der mit "Q-42" benannte Phosphor auf Wellenlängen von bis zu etwa 600 nm antwortet.
Wenn diese Phosphore auf einem einzelnen Screen oder irgendei­ ner anderen Kombination, die ähnlich diskriminieren kann, kom­ biniert werden, können viele verschiedene Markierungs-/Substrat-Systeme von Wellenlängen verwendet werden, die denjenigen entsprechen, die von den Phosphoren aufgenommen werden. Die Markierungen können selektiv auf distinkte, vorgewählte Gruppen von Makromolekülen plaziert werden, und die Substrate können in einer einzelnen Substrat-Mischung kombiniert werden.
Da die Phosphore selbst bei distinkten Wellenlängen emittieren, kann die Diskriminierung im Anzeigeverfahren durch eine Vielzahl von Wegen in Abhängigkeit vom speziellen verwendeten Anzeigeverfahren erreicht werden. Bei Verwendung des Infrarot-Nachweises für die Anzeige kann z. B. ein Photomultiplierrohr zwischen den Q-16 Licht Emissionen, die grün sind, und den Q-42 Licht Emissionen, die orange sind, durch die Verwendung von Filtern diskriminieren.
Als ein weiteres Beispiel für die erfindungsgemäße Verwendung von kombinierten Systemen können gemischte Phosphore mit Chemilumineszenz als auch radioaktiven Emissionen in einem Multi-Signalsystem verwendet werden. Z. B. kann ein Teil der Nukleinsäuremoleküle (oder anderer Makromoleküle) mit einer Markierung wie z. B. alkalischer Phosphatase versehen sein, die eine Chemilumineszenz-Reaktion im Substrat induziert, z. B. eine solche, die Licht bei 600 nm emittiert, und ein anderer Teil kann mit Phsophor-32 oder einem anderen Radioisotop markiert sein, welches β-radioaktive Emissionen emittiert. In solchen Fällen kann ein Misch-Phosphor-Screen wie eine Q-16 und Q-42-Kombination verwendet werden. Da Q-42 Phosphor insensitiv für β-radioaktive Emissionen ist, werden die mit Phosphor-32 markierten Makromoleküle nur durch Q-16 abgebildet. Der Q-42 Phosphor jedoch ist für 600 nm Emissionen aus dem Chemilumineszenz-Substrat sensitiv. Ein Photomultiplierrohr könnte zwischen den Lichtemissionen von den zwei Phosphoren in der im vorangehenden Absatz beschriebenen Weise unterscheiden.
Die Verwendung von Mischphosphoren in diesen und anderen Kom­ binationssystemen ermöglicht eine unbegrenzte Vielfalt an Ver­ gleichen und Unterscheidungen. Z. B. ist man in der Lage, zwi­ schen distinkten Gruppen von Makromolekülen in einer einzelnen Probe zu diskriminieren oder gegen eine internen Standard zu vergleichen. Andere Möglichkeiten sind für den Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres ersichtlich.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann entweder als Nachweisver­ fahren oder Quantifizierungsverfahren oder für beides dienen. Es kann in Testverfahren oder anderen Bestimmungsverfahren in einer Vielzahl von Konfigurationen und Anordnungen verwendet werden, die für den auf diesem Gebiet arbeitenden Fachmann ohne weiteres offensichtlich sind. Im allgemeinen ist die Er­ findung auf alle Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizie­ rung eines immobilisierten Makromoleküls oder eines Teils ei­ nes Makromoleküls anwendbar. Es ist insbesondere interessant zur Abbildung von räumlichen Anordnungen von Makromolekülen, da es in einer Weise ausführbar ist, die eine lokalisierte Information ergibt. Eine derartige Abbildung ist insbesondere wertvoll bei räumlichen Anordnungen, die bei einer Vielzahl von Laborverfahren entstehen, einschließlich von Elektrophero­ grammen, Chromatogrammen, Dot-Blots und anderen Anordnungen, bei denen gelöste Stoffe oder Spezies getrennt angeordnet sind.
Der Ausdruck "immobilisiert" wird in dieser Beschreibung ver­ wendet, um die Retention einer Spezies an einem fixierten Ort auf einer nicht-flüssigen Oberfläche oder Matrix zu bezeich­ nen, und zwar in einer Weise, durch die die Spezies nicht von ihrem Ort verschoben oder bei Kontakt mit dem Flüssig-Phasen- Chemilumineszenz-Substrat losgelöst wird. Die nicht-flüssige Oberfläche oder Matrix kann ein Slab-Gel wie ein Polyacryl­ amid- oder Agarosegel, eine Blotting-Membran, z. B. aus Nitro­ zellulose oder derivatisiertem Nylon, oder eine feste Ober­ fläche wie eine beschichtete Glasplatte oder eine Kunststoff- Mikrotiterplatte sein.
Die selektive Verbindung des zu untersuchenden Makromoleküls mit der Markierung kann durch irgendeine der verschiedenen Mittel erreicht werden, die in der Biochemie wohl bekannt sind. Die Bindung kann eine kovalente Bindung, eine Bindung vom Affinitätstyp, eine hydrophobe Interaktion, eine Interak­ tion vom Hydridisierungstyp oder eine Verbindung anderer Art sein. Die Selektivität kann den Mitteln der Bindung inhärent wie bei kovalenten, hydrophoben und Hybridisierungs-Interak­ tionen oder sie kann das Ergebnis einer Bindungsspezifität vom immunologischen Typ oder eines anderen spezifischen Bindungs­ verhaltens sein. Bevorzugte Interaktionen sind Hybridisie­ rungsinteraktionen wie die Verwendung von DNA- oder RNA-Proben und spezifische Bindungsinteraktionen wie Antigen-Antikörper- Interaktionen und Avidin-Biotin-Interaktionen.
Bei diesen bevorzugten Interaktionen ist die Markierung an ein geeignetes Bindungselement konjugiert, welches an das immobi­ lisierte Makromolekül bindet. Letzteres ist demnach selektiv mit der Markierung "markiert" ("tagged"), d. h. unter Ausschluß der Oberfläche oder der Matrix selbst und anderer Makromolekü­ le, denen die die bei der Anziehung beteiligten spezifischen Bindungseigenschaften fehlen. Das Konjugat wird in herkömmli­ cher Weise durch eine kovalente Bindung gebildet, wobei in einigen Fällen eine Querverbindung mit umfaßt wird, wenn diese erwünscht oder vorteilhaft ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird so ausgeführt, daß die feste Phase, auf welcher die interessierenden Makromoleküle immobilisiert vorliegen, in das Flüssig-Phasen-Substrat einge­ taucht wird, wobei die Makromoleküle mit den oben beschriebe­ nen Markierungen derart verbunden sind, daß die Chemilumines­ zenz-Reaktion zwischen der Markierung und dem Substrat stattfindet und Lichtenergie emittiert wird. Das Flüssigsub­ strat mit der darin eingetauchten festen Phase wird gegen die Oberfläche des Phosphor-Screens exponiert und so für eine aus­ reichende Zeitdauer gehalten, um das Emissionsmuster aufzu­ zeichnen oder nachzuweisen. Dies wird bevorzugt durch eine lichtdurchlässige, die Flüssigkeit zurückhaltende Sperre durchgeführt, wobei die feste Phase und der Screen in ausrei­ chender Nähe sind, so daß der letztere eine gut-definierte Abbildung bildet, die für die Anordnung der Quelle auf der festen Phase entsprechend repräsentativ ist.
Eine herkömmliche Anordnung ist eine solche, bei der die feste Phase in einem flachen, geschlossenen Behälter, der mit der Substratlösung gefüllt ist, derart angeordnet ist, daß das Makromolekülmuster einer lichtdurchlässigen Wand des Behäl­ ters, mit einer dünnen Schicht an Lösung dazwischen, zugewandt ist. Der Screen wird gegen die gegenüberliegende Seite für eine ausreichende Zeit, wie sie oben angegeben wurde, gehal­ ten. Die minimale und optimale Zeitdauer sind durch Routineex­ perimente zu ermitteln, welche diese für den Fachmann ohne weiteres offensichtlich oder bestimmbar sind.
Die Erfindung kann in einem weiten Bereich von Testverfahren und Laborverfahren verwendet werden. Insbesondere genannt sei­ en als Beispiele Proteintests, Antikörpertests, Screening Ver­ fahren, Verdünnungsstudien, DNA-Sequenzierung und Genkartie­ rung. Andere Anwendungsbereiche sind für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der beiliegenden Zeich­ nungen erläutert.
Fig. 1 zeigt ein Verfahren, bei welchem eine Chemilumines­ zenz-Reaktion gemäß der Erfindung auftritt und die sich hier­ aus ergebenden Emissionen auf ein Rezeptormaterial auftreffen;
Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung einer Anordnung von Bestandteilen zur Anregung des Rezeptormaterials, um Signale zu emittieren, die der von ihm aufgenommenen Emission ent­ sprechen, und zum Aufnehmen der Signale und deren Umwandlung in eine lesbare Form.
Fig. 1 zeigt einen Träger 11, auf welchem eine oder mehrere makromolekulare Spezies immobilisiert sind. Wie oben angege­ ben, kann es sich hierbei um ein Slab-Gel, eine Filtermembran oder eine feste Oberfläche handeln, und zwar in Abhängigkeit vom durchgeführten Verfahren. Die makromolekulare Spezies 12 selbst ist auf der Trägeroberfläche in einer distinkten plana­ ren Anordnung lokalisiert und mit der Markierung 13 verbunden (markiert). Der gesamte Träger ist auf einem lichtdurchlässi­ gen Behälter angeordnet, wie z. B. einem Flüssigkeits-dichten Kunststoffbeutel 14, der mit der Chemilumineszenz-Substrat- Lösung 15 gefüllt ist. Wie in der Beschreibung oben angegeben, ist die Markierung bevorzugt eine Enzymmarkierung, und die Substratlösung enthält bevorzugt ausreichend Substrat, um für eine Zeitdauer von wenigstens 24 Stunden Emissionen zu bewir­ ken.
Über dem Kunststoffbeutel 15 ist eine Phosphor-Screen 16 an­ geordnet, und zwar direkt über dem Immobilisierungsmuster auf dem Träger, und er wird in dieser Position für eine ausrei­ chende Zeitdauer gehalten, um eine ausreichende, nachweisbare Emission aufzunehmen und weiterhin die gleiche räumliche An­ ordnung wie das Immobilisierungsmuster auf dem Träger zu zei­ gen. Bei dem Phosphor dieser Ausführungsform handelt es sich um einen solchen, der die Energie der Emission einfängt und nur dann freisetzt, wenn er mit einer externen Quelle, wie z. B. infrarotem Licht, stimuliert wird.
Wenn die Phosphore auf dem Screen 16 ausreichend angeregt sind, wird der Screen vom Kontakt mit dem Kunststoffbeutel 14 entfernt und in die in Fig. 2 gezeigte optische Anordnung ein­ gebracht. Um eine vollständige, zweidimensionale Abtastung des Screens zu ermöglichen, wird der Screen auf einer Überset­ zungsvorrichtung 21 angeordnet, die die Übersetzung entlang den X- und Y-Achsen ermöglicht. Die X-Stufen-Übersetzungkompo­ nente 22 und die Y-Stufen-Übersetzungskomponente 23 der Vor­ richtung werden von einer X-Y-Übersetzungs-Steuervorrichtung 24 gesteuert.
Der Phosphor-Screen 16 wird durch Lichtenergie stimuliert, die aus einem Infrarotlaser 25 herrührt, z. B. einem Nd:YAG-Laser, der Licht bei 1064 nm emittiert. Der den Laser verlassende Strahl wird durch Kollimationslinsen 26 kollimiert und durch einen YAG-Spiegel 27 umgelenkt. Der Strahl wird dann auf dem Phosphor-Screen 16 durch eine Linse fokussiert, beispielsweise durch ein 20 x Mikroskopobjektiv 28, kontrolliert durch einen z-Achsenmikrometer 29. Die Übersetzungsvorrichtung 21 bewirkt, daß der Strahl die gesamte Oberfläche des Screens abtastet.
Die vom Phosphor-Screen durch die Infrarotstimulation freige­ setzte Energie wird durch einen kalten Spiegel 30 durch ein kurzes Durchgangsfilter (short pass filter) 31 auf ein Photo­ multiplierrohr 32, welches durch ein Starkstromnetzgerät 33 mit Energie versorgt wird, umgelenkt. Das Signal aus dem Pho­ tomultiplierrohr wird auf ein Oscilloskop 34 gerichtet und auf ein Hochgeschwindigkeits-Digitalvoltmeter 35. Die Voltmeter­ ablesung wird durch ein Graphikdisplay 36 und die Vermittlung eines Computers 37 in eine sichtbare Form umgesetzt. Das Gra­ phikdisplay 36 ermöglicht eine vollständige Ablesung und Be­ stimmung der Gegenwart, Lokalisierung und Menge des auf der Trägerphase 11 von Fig. 1 immobilisierten Makromoleküls.
Alle Bestandteile dieser Ausführungsform können durch herkömm­ liche, bekannte Geräte und Ausrüstung, die in molekularbiolo­ gischen Laboratorien weit verbreitet sind, gestellt werden. Es wird nochmals darauf hingewiesen, daß diese Anordnung aus­ schließlich eine mögliche Ausführungsform der Erfindung dar­ stellt. Andere, erfindungsgemäß mögliche Ausführungsformen sind für den Fachmann ohne weiteres ausführbar. Diese Vorrich­ tung kann insbesondere so angepaßt werden, daß sie auf ein spezielles System, eine spezielle Umgebung oder die zur Ver­ fügung stehenden Komponenten abgestimmt ist.
Das folgende Beispiel dient nur zur Veranschaulichung der Er­ findung, wobei diese nicht darauf beschränkt ist.
Beispiel
Ein DNA-Strang wurde in einer solchen Weise synthetisiert, daß eine begrenzte Zahl an UTP-Nukleotiden mit kovalent verbunde­ nen Biotinmolekülen anstatt von TTP-Nukleotiden in einer Ran­ dom Primer-Markierungsreaktion verwendet wurde. Anschließend wurde eine Verdünnungsserie der DNA hergestellt und ein Trop­ fen jeder Verdünnung als Fleck (dot) auf einer Zeta-Probe ka­ tionisierter Nylonmembran (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) aufgebracht. Die entstandenen Dots enthielten je 100 pg 10 pg 1 pg 0,1 pg und 0,01 pg. Die Membran wurde anschließend mit einem Steptavidin-AP-Konjugat inkubiert, wo­ durch die DNA in allen Dots mit AP markiert wurde. Die Membran wurde anschließend in einen Kunststoffbehälter gebracht, der mit einer wäßrigen Lösung aus 3-(2′-Spiroadamantan)-4-methoxy­ 4-(3′′-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan (AMPPD) gefüllt war, die bei Eintritt der Chemilumineszenz Licht bei 470 nm emit­ tiert, bei einer Konzentration von 0,2 mM und einem Gesamtvo­ lumen von 5 ml.
Anschließend wurde ein Röntgenfilm (Kodak X-omat) gegen den Kunststoffbeutel direkt über den Dots, wie in Fig. 1 gezeigt, angeordnet und gegen das AMPPD 10 Minuten lang exponiert. Der Film wurde anschließend mit herkömmlichen Standardröntgenfilm- Entwicklungsverfahren entwickelt. Die Beobachtung des Screens ergab, daß Abbildungen, die den Dots mit 100 pg, 10 pg und 1 pg entsprachen, leicht nachweisbar waren. Eine Abbildung des 0,1 pg Dots war kaum nachweisbar, während eine Abbildung des 0,01 pg Dots nicht nachweisbar war.
Der gleiche Kunststoffbeutel mit dem gleichen Inhalt wurde anschließend gegen ein Quantex Q-16 Phosphor-Screen, der auf einem Aluminiumoxid-Träger hergestellt wurde, in gleicher Wei­ se wie der Röntgenfilm aufgebracht und 10 Minuten lang expo­ niert. Der Screen besteht aus einer Grundlage aus Strontiumsul­ fid, mit Samarium und Ceriumoxid als Dotiermittel und Barium­ sulfat und Lithiumfluorid als Flußmittel, mit einer Infrarot­ sensitivität von 1120 nm bis 1220 nm, einer Lichtemissionskur­ ve mit einer Spitze bei 510 nm, der durch Licht bei 470 nm beschickt wird. Nach der Exposition wurde der Screen einem In­ frarot-Laserscanning unterzogen, und zwar unter Verwendung der in Fig. 2 gezeigten Vorrichtung. Die Ergebnisse zeigen, daß der Phosphor-Screen in der Lage war, die 100 pg, 10 pg, 1 pg und 0,1 pg Dots klar abzubilden, nicht jedoch den 0,01 pg Dot.

Claims (10)

1. Verfahren zum Nachweis von auf einer Matrix immobilisier­ ten Makromolekülen, gekennzeichnet durch:
  • a) selektive Markierung der Makromoleküle mit einer Spezies, die in der Lage ist, eine Chemilumineszenz- Reaktion in einem Flüssigphasen-Chemilumineszenz- Substrat zu induzieren;
  • b) in Kontakt bringen der Matrix mit den derart mar­ kierten Makromolekülen mit dem Flüssigphasen-Chemi­ lumineszenz-Substrat, um die Chemilumineszenz-Reak­ tion zu induzieren;
  • c) Exponieren des Flüssigphasen-Chemilumineszenz-Sub­ strates gegen ein Phosphor-Screen, während die Ma­ trix und das Flüssigphasen-Chemilumineszenz-Substrat miteinander in Kontakt sind, um die Phosphore darauf anzuregen und hierdurch eine Abbildung zu bilden, die den Makromolekülen auf der Matrix entspricht und
  • d) Nachweis der Abbildung als Anzeichen für die Gegen­ wart der Makromoleküle auf der Matrix.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Flüssigphasen-Chemilumineszenz-Substrat Licht von wenigstens einer Wellenlänge innerhalb des Bereiches von etwa 400 nm bis etwa 600 nm emittiert und die Phosphore hierdurch angeregt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Makromoleküle auf der Matrix eine Vielzahl von distinkten Gruppen umfassen, Schritt (a) die selektive Markierung jeder Gruppe mit einer distinkten Markierung umfaßt, Schritt (b) das in Kontakt bringen der Matrix mit einer Flüssigphasen-Mischung einer Vielzahl von Chemilu­ mineszenz-Substraten umfaßt, wobei jedes Substrat selek­ tiv durch eine der Markierungen induzierbar ist, um eine Chemilumineszenz-Reaktion auszuführen, wobei Licht bei einer Wellenlänge emittiert wird, die von denen der ande­ ren Substrate verschieden ist, und daß der Phosphor- Screen von Schritt (c) eine Mischung von Phosphoren ent­ hält, wobei jeder Phosphor selektiv durch Licht bei einer dieser Wellenlängen erregbar ist.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbildung des Schrittes (c) eine latente Abbil­ dung ist und der Schritt (d) die Stimulierung der Phos­ phore durch elektromagnetische Bestrahlung, bestehend aus sichtbarem Licht, Röntgenstrahlen, ultravioletter Be­ strahlung oder Infrarotstrahlung, umfaßt, um Signale zu erzeugen, die für das latente Bild repräsentativ sind.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt (c) die Exposition des Flüssigphasen-Che­ milumineszenz-Substrates gegen den Phosphor-Screen durch eine lichtdurchlässige, Flüssigkeit-zurückhaltende Sperre umfaßt.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Spezies aus Schritt (a) mit einem Bindeelement konjugiert wird, welches für eine Interaktion vom Affini­ tätsbindungstyp mit den Makromolekülen empfindlich ist und Schritt (a) das In-Kontakt-Bringen des Bindeelementes und der Matrix umfaßt, um das Bindeelement an eines der in der Matrix vorhandenen Makromoleküle zu binden.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Spezies aus Schritt (a) eine Phosphatase ist, die Chemilumineszenz-Reaktion eine enzymatische Reaktion ist und das Chemilumineszenz-Substrat ein solches ist, bei welchem die Chemilumineszenz-Reaktion durch eine Phospha­ tase in der Geschwindigkeit erhöht wird.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Flüssigphasen-Chemilumineszenz-Substrat eine wäß­ rige Lösung einer wasserlöslichen Verbindung darstellt, die in der Lage ist, eine Chemilumineszenz-Reaktion ein­ zugehen.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix eine Membran darstellt, auf der die Makro­ moleküle in einer planaren Anordnung immobilisiert vor­ liegen, bei welchem das Flüssigphasen-Chemilumineszenz- Substrat in einem Behälter mit einer planaren lichtdurch­ lässigen Wand gehalten wird, Schritt (b) das Eintauchen der Membran mit der planaren Anordnung der Makromoleküle in den Behälter benachbart zur planaren lichtdurchlässi­ gen Wand umfaßt, der Phosphor-Screen aus Schritt (c) eine planare, feste Oberfläche bildet und Schritt (c) das Hal­ ten des Phosphor-Screens benachbart zur planaren lichtdurchlässigen Wand außerhalb des Behälters umfaßt.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt (b) das In-Kontakt-Bringen der Matrix mit einer ausreichenden Menge an Flüssigphasen-Chemilumines­ zenz-Substrat umfaßt, um zu bewirken, daß die Chemilumi­ neszenz-Lichtemissionen für wenigstens etwa 24 Stunden andauern.
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