DE4410655A1 - Verfahren und Vorrichtung zur schnellen kontinuierlichen Sequenzanalyse von verschiedenen linearen polymeren Substanzen nach einer einheitlichen Vorgehensweise - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, die es erlaubt eine Sequenzanalyse, nach einem einheitlichem Prinzip, von linearen polymeren Substanzen durch zu führen, ohne diese schrittweise abzubauen.

Dieses Verfahren ermöglicht es nach einer einheitlichen Arbeitsweise, die Abfolge der Monomere großer linearer polymerer Substanzen wie Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA), Proteine, lineare Polysaccharide oder strukturell verwandter Substanzen zu bestimmen, ohne diese in die Monomere zu überführen oder das entständige Monomer schrittweise abzuspalten zu müssen. Dies kann in einer vielfachen Geschwindigkeit im Vergleich zu den bisher bekannten Verfahren durchgeführt werden. Dieses Verfahren ermöglicht es weiterhin mehr als 10 000 Monomere einer polymeren Substanz in einem Analyseschritt zu bestimmen. Dies ist von großen praktischen Interesse, da so Sequenzanalysen erheblich schneller durchgeführt werden können und eine Kosteneinsparung möglich wird. Ferner erlaubt das Verfahren eine automatisierte Anwendung, sowohl in der wissenschaftlichen Einzelanalytik, als auch in der gewerblichen Routineanalytik.

Es sind bereits Verfahren zur Sequenzanalyse von polymeren Substanzen wie DNA, RNA, Proteinen und Polysacchariden bekannt, die nach verschiedenen Prinzipien arbeiten. Für jede Klasse polymerer Substanzen werden unterschiedliche Verfahren verwendet. Diese richten sich nach den chemischen bzw. physikalischen Verhalten der Polymere und deren Monomere. Aus diesem Grund sind die Analyseverfahren prinzipiell verschieden und benötigen so auch verschiedene Apparaturen und Vorgehensweisen. Sie arbeiten zumeist nach folgenden Grundprinzip. Zuerst werden einzelne endständige Monomere abgespalten, dann werden je nach Verfahren entweder die abgespaltenen oder Restpolymere in Verfahren wie Hochgeschwindigkeitschromatographie (HPLC), Dünnschichtchromatographie (DC) oder Säulenchromatographie aufgetrennt und analysiert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde eine kontinuierliche Sequenzanalyse polymerer linearer Substanzen wie DNA, RNA, Proteine oder Polysaccharide nach einem einheitlichem Verfahren zu ermöglichen, ohne dabei diese zuvor in ihre Monomere zu überführen oder das entständige Monomer abzuspalten zu müssen. Das Verfahren hat weitergehend die Aufgaben, auf einem schnellen Weg die Abfolge der Monomere in linearen Polymeren zu bestimmen, sowie große Sequenzen mit einem Arbeitsschritt erfassen zu können.

Nach der Erfindung wird ein Verfahren verwendet, daß molekulare Mechanik nutzt. Als Basis für dieses Verfahren dient eine Festphase als Trägermaterial (Fig. 1, 1), an dem molekulare Kohlenstoffketten (Fig. 1, 2) von 10 bis 20 oder mehr Kohlenstoffatomen kovalent, nach bekannten chemischen Verfahren, als Spacer (Fig. 1, 2), gebunden werden können. Diese Spacer werden durch Doppelbindungen oder Dreifachbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen in der Längsachse stabilisiert.

Über diese Spacer werden molekulare Ringstrukturen (Fig. 1, 3) wie z. B. Cyclopolysaccharide wie Cyclodextrine gezogen, so daß die Spacer durch die intakten Ringe hindurch stoßen. Dies kann unter Ausnutzung der chemisch- physikalischen Eigenschaften der Cyclopolysaccharide in einer in situ Reaktion geschehen, ohne das von außen Energie zugefügt werden muß oder besondere Techniken angewendet werden müssen.

Die molekularen Ringe (Fig. 1, 3) müssen neben ihrer Grundeigenschaft, der Ringstruktur, folgende weitere notwendige Eigenschaften besitzen. Sie müssen flexibel sein und müssen mit Spektroskopieverfahren wie Infrarotspektroskopie (IR), Ultraviolettspektroskopie (UV), Kernresonanzspektroskopie (MNR) oder Fluoreszensspektroskopie getrennt von den polymeren Substanzen detektierbar sein. Ferner müssen sie eine fixierte, möglichst große einheitliche elektrische Polarisierung besitzen. Die Ringgröße richtet sich nach dem größten Durchmesser des Monomers, des zu untersuchenden Polymers. Sie muß mindestens so groß sein, daß der Ring unter Einsatz von außen zugeführter Energie über das größte Monomer des Polymers durch den Ring geführt werden kann. Eine Deformation des Ringes (Fig. 1, 3) wird dabei beabsichtigt und ist notwendig. Diese Deformation ermöglicht es den Moment und die Art und Weise des Überganges des Ringes über das Monomer zu spektroskopisch bestimmen.

Zur Verbesserung der Detektionsmöglichkeiten der Ringstruktur können, nach bekannten chemischen Verfahren, Substituenten, wie Farbstoffe, als Liganden an den Ring kovalent gebunden werden. Es hat sich erwiesen, daß die Fluoreszensspektroskopie günstige Voraussetzungen bietet. Aus diesem Grund können an den Ringen kovalent fluoreszierende Farbstoffe gebunden werden. Zur weiteren Steigerung der Detektionsempfindlichkeit können, in alternierender Reihenfolge, zwei unterschiedliche Fluoreszensfarbstoffe an den Ring gebunden werden, z. B. Rhodamin B und Fluorescein. Dies kann über bekannte chemische Kopplungsverfahren geschehen.

Nach dem die modifizierten Ringe in der in situ Reaktion über den Spacer gebracht worden sind, wird das so veränderte Trägermaterial in eine Analysekammer (Fig. 2) in eine Halterung (Fig. 1, 4) eingespannt.

Es wird ein elektrisches Feld mit Hilfe zweier Pole (Fig. 1, 5) so angelegt, daß die elektrisch polarisierten Ringe (Fig. 1, 3) zum Trägermaterial (Fig. 1, 1) gezogen (Fig. 1, 6) werden. Dies ist möglich, da der Ring sich frei, in Richtung der Längsachse des Spacers, bewegen kann. Anschließend wird das endständige Monomer des linearen Polymers (Fig. 1, 7) kovalent, nach bekannten chemisch- physikalisch Verfahren, nach dem das elektromagnetische Feld ausgeschaltet worden ist, an den Spacer gebunden. Am gegenüberliegenden Ende des linearen Polymers wird anschließend eine Molekülgruppe (Fig. 1, 8) kovalent, nach bekannten chemisch-physikalisch Verfahren, gebunden. Diese ist im kleinsten Moleküldurchmesser so groß, daß der Ring nicht über diese Molekülgruppe mit Hilfe des elektromagnetischen Feldes gezogen werden kann. Ferner ist diese Molekülgruppe wie der Ring polarisiert.

Zur Analyse des linearen Polymers (Fig. 1, Schritt 6.) wird die Polung des elektrischen Feldes so eingerichtet, daß der molekulare Ring (Fig. 1, 3) über das lineare Polymer (Fig. 1, 7), mit Hilfe des elektromagnetischen Feldes, wandert bzw. gezogen werden kann. Die Feldstärke wird so eingestellt, das dies mit einer gleichbleibenden Geschwindigkeit geschieht. Während der Wanderung des Ringes über das Polymer werden gleichzeitig Spektren, entsprechend des Spektroskopieverfahrens oder Fluoreszensspektren, des Ringes und dessen Umgebung aufgenommen. Diese Spektren werden per Computersystem aufgezeichnet und ausgewertet. Sie sind abhängig von der Struktur des Ringes. Diese ist wiederum abhängig von der Gestalt des Monomers über das der Ring gerade wandert wird. Also kann das Monomer anhand der Momentanspektren identifiziert werden. Die Zahl der aufgenommenen Fluoreszensspektren pro Zeiteinheit muß mindestens dreimal so groß sein, wie die Wanderungsgeschwindigkeit der Ringe über die Monomere entlang des Polymers. Die Einheit, aus Energiequelle (Fig. 1, 9) des verwendeten Spektroskopieverfahrens und Detektor (Fig. 1, 10), wird synchron mit der Front der wandernden Ringe entlang der Kammer (Fig. 1, 6) gezogen. Dies ist bei kurzen Analysekammern oder Polymeren nicht notwendig.

Diese Analysekammer (Fig. 2) besteht aus einer Detektionskammer (Fig. 2, 1) aus einem Material, z. B. Quarzglas oder aus einem anderen Material das eine Detektion der Substanzen im inneren der Kammer zuläßt. An den Enden der Detektionskammer befindet sich jeweils ein elektrischer Pol (Fig. 2, 2), mit denen ein umpolbares und in seiner Feldstärke variables homogenes elektromagnetisches Feld erzeugt werden kann. Zwischen den Polen befindet sich eine Halterung (Fig. 2, 3) in die das modifizierte Trägermaterial eingespannt werden kann. Senkrecht oder gewinkelt zum elektromagnetischen Feld befindet sich eine Fluoreszenslichtquelle (Fig. 2, 4) oder eine der Art der Spektroskopie entsprechende Energiequelle, die Detektionskammer durchstrahlen kann (Fig. 2, 3). Gegenüber dieser ist ein Fluoreszensdetektor (Fig. 2, 5) oder eine der Art der Spektroskopie entsprechender Detektor (Fig. 2, 5). Beide sind so angebracht, daß sie sich parallel zueinander entlang der Detektionskammer, mit Hilfe eines mechanischen oder elektronischen Systems, bewegen können. Dieses besteht aus Steuerschienen (Fig. 2, 6) entlang denen sich Energiequelle und Detektor des Analysesystems mit Hilfe von Steuer- bzw. Antriebsmotoren (Fig. 2, 7) bewegen. An der Detektionskammer befindet sich ein Zufluß (Fig. 2, 8) und ein Abfluß (Fig. 2, 9) für Flüssigkeiten die in der Detektionskammer benötigt werden. Zur Aufrechterhaltung konstanter Temperatur-, Druck- und Umgebungsbedingungen ist um die Detektionskammer eine Isolierkammer (Fig. 2, 10) angebracht. Diese ist mit mindestens zwei Versorgungseingängen (Fig. 2, 11) versehen. Sowohl die Polung und die Feldstärke, als auch die Bewegung der Energiequelle und des Detektors sowie die Aufnahme und Auswertung der Spektroskopiedaten wird durch Computersysteme bewerkstelligt, die mit entsprechenden Computerprogrammen ausgerüstet sind.

Das Gesamtsystem besteht aus mehreren Komponenten, diese können als extreme oder interne Einheiten zusammengeschaltet sein. Die Detektionskammer (Fig. 3, 1) wird mit einem Thermoblock (Fig. 3, 2) und einem Versorgungsblock (Fig. 3, 3) verbunden. Für die Steuerung des elektromagnetischen Feldes wird ein Steuergerät (Fig. 3, 4) verwendet. Zur Stromversorgung wird ein Stromgeber (Fig. 3, 5), der wiederum am allgemeinen Stromnetz angeschlossen ist verwendet, um Spannungsschwankungen verkleinern. Alle Komponenten werden über ein Computersystem (Fig. 3, 6) angesteuert und über dieses aufeinander abgestimmt. Das Computersystem (Fig. 3, 6) ist seinerseits mit einem Druck­ medium (Fig. 3, 7) und einem Massenspeicher (Fig. 3, 8) verbunden.

Claims (6)

1. Verfahren zur Sequenzanalyse von linearen Polymere Substanzen, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß über molekulare Kohlenstoffketten (Spacer) die kovalent an einem Trägermaterial gebunden sind, molekulare Ringstrukturen gebracht werden und daß nach erfolgter Überstreifung dieser Ringstrukturen, diese durch ein elektromagnetische Feld an das Trägermaterial gezogen werden, und weiterhin gekennzeichnet ist, daß anschließend eine kovalente Kopplung des zu untersuchenden linearen Polymers über ein endständiges Monomer des Polymers an den Spacer stattfindet, ferner wird am gegenüberliegenden Ende des Polymers ein Blockmolekül kovalent gebunden, so daß sich die Ringstruktur längs der Polymerachse frei bewegen kann und anschließend nachdem durch eine Umpolung des elektromagnetischen Feldes eine Wanderung des Ringes über das Polymer erzwungen werden kann.

2. Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Detektionskammer vorhanden ist, die eine Detektion der wandernden Ringstruktur ermöglicht, diese besteht aus einem Material das eine Detektion der Substanzen im inneren der Kammer zuläßt, ferner ist an den Enden der Detektionskammer jeweils ein elektrischer Pol vorhanden, mit denen ein umpolbares und in seiner Feldstärke variables homogenes elektromagnetisches Feld erzeugt werden kann, ferner befindet sich zwischen den Polen sich eine Halterung in die ein modifiziertes Trägermaterial eingespannt werden kann, dazu senkrecht oder gewinkelt zum elektromagnetischen Feld befindet sich eine der Art der Spektroskopie entsprechende Energiequelle, die Detektionskammer durchstrahlen kann und gegenüber dieser ist ein entsprechender Detektor, diese sind so angebracht, daß sie sich parallel zueinander entlang der Detektionskammer, mit Hilfe eines mechanischen oder elektronischen Systems, bewegen können, ferner befindet sich an der Detektionskammer mindestens je ein Zufluß und ein Abfluß für Flüssigkeiten die in der Detektionskammer benötigt werden, ferner ist zur Aufrechterhaltung konstanter Temperatur-, Druck- und Umgebungsbedingungen um die Detektionskammer eine Isolierkammer herum angebracht, die mit mindestens zwei Versorgungseingängen versehen ist.

3. Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gesamtsystem aus mehreren extremen oder internen Komponenten besteht, dieses besteht aus einer Detektionskammer, nach Anspruch 2, die mit einem Thermoblock, einem Versorgungsblock verbunden ist, ferner das die Steuerung des elektromagnetischen Feldes über ein Steuergerät und über ein Stromgeber die Strom- und Spannungsversorgung gesteuert wird und ferner das allen Komponenten über ein Computersystem gesteuert und synchronisiert werden, an dem seinerseits ein Druckmedium und einem Massenspeicher verbunden ist.

4. Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wanderung der molekularen Ringstruktur durch eine Fluoreszensdetektion spektroskopisch verfolgt wird.

5. Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wanderung der molekularen Ringstruktur durch eine Fouriertransformations-Infrarotspektroskopie verfolgt wird.

6. Verbindung zum Ausführen des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Cyclodextrinringe Verwendung finden, an denen zwei verschiedene Fluoreszensfarbstoffe in alternierender Reihenfolge kovalent, nach bekannten chemischen Verfahren, kovalent gebunden sind.