DE3856583T2

DE3856583T2 - Selbsttätige kapillare Elektroforesevorrichtung

Info

Publication number: DE3856583T2
Application number: DE3856583T
Authority: DE
Inventors: Norberto Guzman
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-11-25
Filing date: 1988-11-21
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2008-11-22
Also published as: EP0397699A1; ATE302942T1; WO1989004966A1; DE3855183T2; DE3856583D1; EP0397699B1; DE3855183D1; CA1322221C; AU2910889A; EP0397699A4; ATE136368T1

Description

Die Erfindung betrifft eine kapillare Elektrophorese-Vorrichtung mit einem Kapillarrohr von der Art, die elektrisch geladen werden kann, wobei das Kapillarrohr ein erstes und ein zweites Ende aufweist, eine erst Einrichtung, die mit der Vorrichtung verbunden ist zum Anlegen eines elektrischen Potentials über das Kapillarrohr, wobei ein Probenstrom durch das Kapillarrohr und an einem Detektor vorbei fließt.
Elektrophorese ist ein Vorgang, in dem geladene Teilchen in einem leitenden Puffermedium oder Fluid wandern, an das eine Potentialdifferenz angelegt ist. Die Wanderung erfolgt gegen eine Elektrode, die die entgegengesetzte Ladung, zu der der Teilchen trägt.
Die Elektrophorese ist eine der wichtigsten Methoden, die zur Untersuchung von biologischen Materialien zur Verfügung steht, und wahrscheinlich das wirkungsvollste Verfahren zur Trennung und zum Nachweis von Proteinen und anderen Substanzen.
Elektrophoresentrennung basiert auf den unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten unterschiedlich geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist primär eine Funktion der Ladung auf dem Teilchen und der angelegten Feldstärke und die Ladung auf einem Teilchen wird durch den pH des Puffermediums bestimmt. Die wichtigste Anwendung dieser Technik in biomedizinischer Forschung und klinischen Chemielaboratorien besteht in der elektrophoretischen Trennung von Proteinen, Nukleinsäuren, ihren Peptid- und Oligonukleotiden-Komponenten wie auch komplexen Makromolekhlen wie z.B. Lipoproteinen.
Einige verschiedene Systeme sind zur Durchführung elektrophoretischer Trennung bekannt und ein System, bekannt als Zonenverfahren, hat Vorteile, aber es hat auch gewisse Einschränkungen. Einige der häufigsten Einschränkungen sind: Die Probemenge, die notwendig ist, um die Komponenten durch die üblichen Färbeverfahren zu zeigen ist gewöhnlich groß, die Vorbereitung der Vorrichtung und des ganzen Systems, das in die elektrophoretische Trennung involviert ist, ist gewöhnlich langwierig und zeitaufwendig, die Zeit, die notwendig ist, um eine vollständige Trennung der Komponenten zu erhalten beträgt oft Stunden, die Zeit, die notwendig ist, um die Komponenten darzustellen und eine gewisse Quantifizierung der getrennten Substanzen zu erhalten beträgt im allgemeinen auch Stunden, die Ertragsrate der Komponenten als biologische Aktivitäten ist in den meisten Fällen sehr gering, die Reproduzierbarkeit der elektrophoretischen Trennung ist nicht genau hundert Prozent, und die Automation um den vollständigen Systembetrieb durchzuführen, fehlt meistens.
Die Kapillarelektrophorese hat sich als eine Technik erwiesen, um hohe Trennungseffizienz zu erreichen. Für einige Proteine und kleine Peptide wurde die Trennungseffizienz von ungefähr einer Million zu ungefähr ein paar Millionen gezeigt. Im allgemeinen verwendet diese Technik eine geschmolzene Siliziumdioxid-(Quarz)-Kapillare, mit einem Innendurchmesser im Bereich von ungefähr 25 Mikron bis ungefähr 200 Mikron, und einer Länge im Bereich von ungefähr 10 cm bis ungefähr 100 cm. Da das gesamte Volumen der Säule nur 0,5 bis ungefähr 30 Mikroliter (was wahrscheinlich der kleinste Gesamtoberflächenbereich der Säulenchromotographie ergibt) ist, ist das Injektionsvolumen gewöhnlich in dem niederen Nanoliterbereich. Als eine Folge ist die Empfindlichkeit dieser Technik recht hoch und es ist möglich, eine Quantifizierung im Bereich von Pikomolen zu erhalten (und wahrscheinlich Femtomolen oder Attomolen) in dem Fluoreszenz, elektrochemische, laserinduzierte Fluoreszenz und Massenspektrometerdetektoren verwendet werden, und um eine Quantifizierung im Bereich von Nanomolen zu erhalten, in dem ultraviolete Detektoren verwendet werden.
Bei der Kapillarelektrophorese erlaubt der wirksame Wärmetransport von den kleinen Durchmesserkapillaren die Anwendung von ungewöhnlich hohen Spannungen, im Bereich von ungefähr 5.000 Volt bis zu ungefähr 30.000 Volt, während ein geringer Strom aufrechterhalten wird, im Bereich von ungefähr 10 Mikroampere bis ungefähr 90 Mikroampere. Die Anwendung von hohen Spannungen fördert effektivere Trennungen und erhöht die Analysengeschwin digkeit auf Aufzeichnungszeiten von ungefähr 5 bis 40 Minuten.
Neben der hohen Trennungsleistung (theoretische Plateaus), einer recht hohen Auflösung, einer hohen Empfindlichkeitsquantifzierung und kleinen Wanderungs(Retentions)-Zeiten, zeigt die Kapillarelektrophorese ein paar weitere Vorteile gegenüber der konventionellen Elektrophorese, im allgemeinen zu anderen chromatographischen Verfahren. Einige von diesen Vorteilen sind:
a) die Anwendung bei einer breiten Vielfalt von Proben, die von kleinen Ionen bis zu Proteinen oder anderen Makromolekhlen mit einem Molekulargewicht von ungefähr 290.000 Daltons oder höher (wie zum Beispiel DNA-Fragmente, Viren und subzellulare Partikel) unter Verwendung im wesentlichen der gleichen Säule und wahrscheinlich der gleichen Bedingungen bei der elektrophoretischen Trennung; b) die Kapillaren sollten ein ideales System zur Verfügung stellen, um nicht wässrige Medien zu untersuchen, besonders mit Substanzen, die hochhydrophob sind; c) die Kapillaren sind viele Male wiederverwendbar, wodurch das elektrophoretische Trennungssystem sehr praktisch und wirtschaftlich ist; d) ein on-line-elektronischer Nachweis erlaubt eine gute Quantifizierung und erhöht weiter die Möglichkeiten für einen vollautomatischen Betrieb, wodurch das Kapillarelektrophoresesystem eine größere Auflösung, eine größere Geschwindigkeit und eine bessere Genauigkeit als konventionelle Methoden erhält.
Im Stand der Technik ist es allgemein bekannt, daß ein Material, das Gemische von zu analysierenden Substanzen enthält, durch ein Kapillarrohr und durch einen Detek tor unter dem Einfluß einer angelegten Spannung geführt werden kann. Die angelegte Spannung lädt die Substanzen, und die Ladungen auf den Substanzen bestimmt ihren Abstand und ihre Durchflußgeschwindigkeit entlang des Kapillarrohrs.
Der Stand der Technik, US-Patente 3 620 958, 3 948 753 und 4 459 198 zeigt Elektrophoresevorrichtungen mit einem Kapillarrohr, das zwischen zwei Behältern zur Aufnahme der zu analysierenden Substanz aufweist und ein elektrisches Potential hat, das zwischen den zwei Behältern und entlang des Kapillarrohrs angelegt ist. Obgleich die verschiedenen Vorrichtungsformen, die in diesen Patenten gezeigt werden, offensichtlich nützlich sind, erfordern sie hohe Konzentrationen der zu analysierenden Proben und keine ist geeignet, automatisiert zu werden oder offenbart eine Lehre bezüglich der Automation.
EP-A-0 241 940 zeigt ein Elektrophorese-System, das die Merkmale des Oberbegriffs des Anspruchs 1 aufweist. Dieses Dokument bezieht sich auf die Gestaltung und Konstruktion von Trennungskanälen und Detektoren zum Gebrauch in Elektrophorese. Das Basiskonzept beinhaltet die Verwendung eines Drahtes oder Kapillarrohres als Schablonenstrang, der dem Innendurchmesser und Form eines gewünschten Trennungskanals entspricht. Kunststoff wird um diese Anordnung herum polymerisiert durch herkömmliches Gießen oder Formen. Wenn die Schablone entfernt wird, hinterläßt sie einen Kapillarkanal mit einer vorbestimmten Seitenwandkonstruktion, die angepaßt ist an den Gebrauch mit Drahtelektroden oder optischen Fasern.
US-A-39 41 678 offenbart eine Elektrophorese-Vorrichtung mit einer gewickelten Kapillare aus einem Isolationsmaterial, beispielsweise Teflon. Die gewickelte Kapillare ist eine frei-stehende Struktur.
Der Artikel "Characterisation and automation of sample introduction methods for capillary zone electrophoreses", D. J. Rose; Analytical Chemistry, Band 60, Seiten 642-648, 1988, offenbart eine Kapillarelektrophoretische-Vorrichtung, die einen drehbaren Tisch aufweist, der Probenbehälter trägt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Hochspannungkapillarelektrophoresevorrichtung zur Verfügung, die neben anderen Dingen Mittel aufweist um kleine Konzentrationen eines Probenmaterials in ein Kapillarrohr zu führen, automatisch die geeignete Spannung anzulegen, um zu bewirken, daß die Komponenten der Probe geladen werden und entlang des Kapillarrohrs durch einen Detektor fließen, wobei die Komponenten nachgewiesen werden und eine gedruckte Aufzeichnung gemacht wird. Die Vorrichtung kann dann automatisch den Prozeß für die Analyse von vielen Proben wiederholen.
Die Grundvorrichtung der Erfindung ist für viele Modifikationen in ihren verschiedenen Teilen geeignet, einschließlich des Kapillarrohrteils. Darüber hinaus kann die Nachweismethode der Proben variiert werden und die Sammlung der Proben kann modifiziert werden. Die Erfindung kann auch geeignet sein, um den elektroosmotischen Fluß in einer Kapillare zu messen.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist eine perspektivische Ansicht der Rückseite der Vorrichtung als Ausführungsform der Erfindung;
2 ist eine Schnittansicht entlang der Linie 2-2 in 1;
3 ist eine perspektivische Ansicht eines Teils der in 1 gezeigten Vorrichtung;
4 ist eine perspektivische Ansicht eines Teils der Vorrichtung von 1;
5 ist eine Aufrißansicht im Schnitt eines Teils der Vorrichtung von 1;
6 ist eine vergrößerte perspektivische Ansicht eines Teils der Vorrichtung von 1;
7 ist eine Vorderansicht eines Teils der Vorrichtung von 1;
8 ist eine Seitenaufrißansicht einer Modifikation eines Teils der Vorrichtung von 1 mit Teilen davon im Schnitt;
9 ist eine Vorderaufrißansicht einer Modifikation eines Teils der in 1 gezeigten Vorrichtung;
10 ist eine schematische Darstellung des in der Erfindung benutzten elektronischen Steuersystems;
11 ist eine Schnittansicht einer Modifikation des kapillaren Teils der Vorrichtung von 1;
12 ist eine Draufsicht eines Teils eines in 1 mit der Vorrichtung von 11 verwendeten Detektors;
13 ist eine schematische Darstellung einer Betriebsart von mehreren Teilen der Vorrichtung des in 1 gezeigten Typs;
14A und 14B zusammen sind eine Bodenansicht einer Modifikation eines Basisträgers der Erfindung;
15 ist eine perspektivische Vorderansicht einer Modifikation der Erfindung;
16 ist eine perspektivische Ansicht einer modifizierten kapillaren Kassette, die mit der Vorrichtung der Erfindung benutzbar ist;
17 ist eine Perspektive der Vorrichtung, die Modifikationen der Erfindungen ausführt;
18 ist eine perspektivische vergrößerte Ansicht eines Schalters, der mit der Vorrichtung von 17 verwendet ist;
19 ist eine Vorderaufrißansicht eines Teils der Vorrichtung der Erfindung, die eine Modifikation davon darstellt;
20 ist eine Vorderaufrißansicht einer Modifikation der Vorrichtung, die in 19 gezeigt ist;
21 ist eine Vorderaufrißansicht eines Teils eines Kapillarrohrs und Vergrößerungsglases, das zur Analyse des elektroosmotischen Flusses verwendet wird;
22 ist eine perspektivische Ansicht einer Modifikation der Vorrichtung, die die Erfindung ausführt;
23 ist eine Modifikation des Kapillarrohrs, das mit der Erfindung verwendet wird;
24 ist eine Vorderaufrißansicht, die eine zusätzliche Vorrichtung zeigt, die in der Vorrichtung der Erfindung verwendet werden kann;
25 ist eine perspektivische Ansicht einer Modifikation der Erfindung, die mit einigen der Vorrichtungen von 24 verwendet wird;
26 ist eine perspektivische Ansicht einer Modifikation der Vorrichtung von 25;
27 ist eine Vorderaufrißansicht eines Teils der Vorrichtung der Erfindung, die eine Art des Betriebs davon zeigt;
28 zeigt Impulse, die durch das Verfahren von 27 nachgewiesen wurden;
29 zeigt eine Kurve, die von den Impulsen von 28 abgeleitet wird; und
30 ist eine Seitenaufrißansicht einer modifizierten Kapillare, die Mittel zum Reinigen der Kapillare enthält.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die automatische Elektrophoresevorrichtung der Erfindung 10, dargestellt von der Rückseite in 1, enthält ein Basissockelelement, an dem verschiedene Teile der Betriebsausstattung befestigt sind. Das Sockelelement 20 ist kastenähnlich und enthält eine obere Wand 30, eine vordere Wand 40 und eine Rückwand 50 und Abschlußwände 60 und 70, die sich alle abwärts von der oberen Wand erstrecken. Eine Bodenabdeckplatte 80 (1 und 2) ist auf dem Sockelelement 20 befestigt und stellt eine flache Stützoberfläche für die Vorrichtung 10 bereit.
Das Sockelelement 20 ist aus Metall oder Kunststoff und trägt auf der oberen Wand 30 einen linken Behälter 90 und einen rechten Behälter 100, wie in 1 dargestellt. Der linke Behälter 90 enthält eine isolierende Bodenplatte 110, aus einem Metall oder Kunststoff, das an der oberen Wand 30 befestigt ist und eine transparente Hülle aus Plexiglas oder dergleichen, die (1 und 2) linke und rechte Seitenwände 120 und 130, Vorder- und Rückwände 140 und 150 und eine obere Wand 160 aufweist. Die obere Wand 160 ist eine Abdeckung für den Behälter 90 und ist geeignet angehoben zu werden von dem Abteil mittels eines Knopfes 162 um den Zugang in das Innere bereit zu stellen. Die Hülle des Behälters 90 ist auf der Bodenplatte 110 passend befestigt.
Der Behälter 90 ist mit einem rotierenden horizontalen Tisch 170 versehen, der eine ringförmige Anordnung von Löchern oder Öffnungen 180 aufweist, in die Flüssigkeitsprobenbehälter 190 eingesetzt sind. Der Tisch ist lösbar an dem oberen Ende Pfosten 200 befestigt, so daß Tische mit verschiedenen Lochzahlen oder unterschiedlichen Lochgrößen oder mit anderen Formen auf dem Pfosten befestigt werden können. Der Pfosten 200 erstreckt sich durch und unterhalb der oberen Wand 30 des Sockelelements 20 (2 und 3), wo er in geeigneter Weise mit einem kleinen Motor 210 verbunden ist, der benutzt wird, um den Pfosten 200 und den Tisch 170 zu drehen. Der Motor 210 ist auf der unteren Oberfläche 32 der oberen Wand 30 befestigt und er ist von einem Typ, der, ermöglicht, daß der Pfosten 200 oder eine Verlängerung davon, die sich durch ihn erstreckt, davon angetrieben wird.
Das untere Ende des Pfostens 200 trägt eine horizontale Scheibe 203 (3), die mit dem Pfosten rotiert und ein Schlitz 205 enthält, die geeignet ist mit einem optischen Sensor 212 zusammenzuwirken, der dazu benachbart angeordnet ist.
Benachbart zu dem rotierenden Tisch 170 (vgl. 1, 2 und 6) ist ein hohler, röhrenförmiger vertikaler Pfosten 220, der eine Öffnung oder einen Schlitz 230 an seiner Seitenwand hat. Ein horizontaler Arm 240 hat ein Ende innerhalb des Pfostens 220 und ist an einer vertikalen Stange 250 befestigt, die in geeigneter Weise montiert ist, so daß sie vertikal hoch und runter bewegt werden kann. Das untere Ende der vertikalen Stange 250 oder eine Verlängerung davon geht durch einen kleinen Motor 260 durch, der an der unteren Fläche 32 der oberen Wand befestigt ist. Das untere Ende der Stange 250 trägt einen seitlich vorstehenden Arm 263, der eingestellt ist, um mit einem optischen Sensor 280 zusammenzuwirken, der daneben angeordnet ist.
Bezüglich des horizontalen Arms 240 (1, 2 und 6) endet das äußere Ende davon in einem kleinen festen Zylinder 243, der vertikal ausgerichtet ist und mit zwei durchgehenden Löchern 247 und 249 versehen ist, die mit einem hohlen Rohr 248 in Verbindung stehen, das sich von dem festen Zylinder in Verlängerung mit den Löchern 180 im Tisch 170 und der Probenbehälter darin nach unten erstreckt. Das hohle Rohr 248 hat einen kleinen Durchmesser und ist so dimensioniert, daß es in einem Probenbehälter 190 hineingelangen kann und bis ungefähr auf den Grund davon sich erstrecken kann, um darin Fluid einzufüllen.
Der Behälter 100 enthält die gleiche Vorrichtung wie Behälter 90, wie oben beschrieben. Die entsprechenden Teile in dem Behälter 100 tragen die gleichen Bezugszeichen wie die Teilen in dem Behälter 90, aber sind gestrichen.
Die Behälter 90 und 100 enthalten Mittel, um ein elektrisches Potential über die Vorrichtung 10 anzulegen. Diese Mittel enthalten eine erste Drahtelektrode 360, die ein Ende hat, das an einem Leistungseingangsanschluß 363 befestigt ist (1 und 2) in der Rückseite nach oben in dem hohlen Rohr 220, neben dem vertikalen Stab 250 und heraus aus der Öffnung 230 in der Seitenwand und durch das Loch 249 in dem Zylinder 243 nach unten durch das Rohr 248 zu dessen Ende, so daß es in einem Fluid in einem Probenbehälter bleiben kann, wenn die Vorrichtung 10 in Betrieb ist.
Die elektrischen Mittel beinhalten auch eine ähnliche Drahtelektrode 360', die an einem Leistungseingangsanschluß 365 an der rückwärtigen Wand 50 der Vorrichtung 10 befestigt ist. Diese Elektrode folgt einem ähnlichen Weg durch das Rohr 250' und dem Zylinder 243' in das Rohr 248', das damit zugeordnet ist für den endgültigen Einsatz in einen Probenbehälter. Die Elektroden 360 und 360' sind vorzugsweise aus Platin oder dergleichen und sind für Spannungen geeignet, die beim Betrieb der Erfindung verwendet werden. Eine Stromversorgung 367 ist für die Verbindung zu den Anschlüssen 363 und 365 zu den Elektroden 360 und 360' vorgesehen, um die erfor derlichen Spannungen bereitzustellen. Die Stromversorgung 367 kann auch jede von der Vorrichtung 10 benötigte Spannung zur Verfügung stellen, z.B. für die Motoren 210, 210' und 260, 260'. Andere Hilfsstromversorgungen können auch, wenn gewünscht, zur Verfügung gestellt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung, dargestellt in 2, kann die Stromversorgung 367 von solch kleiner Größe sein, daß sie innerhalb des Sockelelements 20 an jeder geeigneten Stelle befestigt sein kann, so daß die Vorrichtung 10 ihre eigene selbständige Stromversorgung hat, die manuell oder computergesteuert sein kann.
Wenn eine eingebaute Stromversorgung vorgesehen ist, vergleiche 7, sind ein Voltmeter 376 und ein Ampermeter 378 auf der vorderen Wand des Sockelements 20 befestigt, zusammen mit einem Rheostat zur Einstellung der Betriebsspannung, die auf dem Voltmeter angezeigt ist.
Einen bevorzugten Aufbau der vertikalen Pfosten 250, 250', ist in 8 dargestellt, um die elektrische Sicherheit sicherzustellen, wenn eine hohe Spannung an der Elektrode 360 angelegt ist. Diese Ausführungsform weist zur Erleichterung des Aufbaus einen äußeren Pfosten 420 und einen verschiebbaren inneren Pfosten 422 auf, die beide im allgemeinen quadratisch oder rechtwinklig im Aufbau sind. Der äußere Pfosten enthält einen Schlitz 426 in seiner Seitenwand und einen horizontalen Arm 428, der sich von dem inneren Pfosten 422 hindurch erstreckt. Der Arm 428 endet im Zylinder 243. Das Kabel 360 kommt von dem Anschluß 363 herauf und verläuft innerhalb des äußeren Pfostens 420 und endet in einer starren, relativ breitflächigen flachen Metallelektrode 430, die vielleicht auf der halben Strecke von dem Pfosten bis geringfügig unterhalb des Schlitzes 426 darin angeordnet ist.
In ähnlicher Weise trägt ein verschiebbarer innerer Pfosten 422 auf seiner äußeren Oberfläche eine relativ große Flächenelektrode 432, die in geeigneter Weise so positioniert ist, daß, wenn der innere Pfosten sich in eine Betriebsposition absenkt, die zwei Elektroden 430 und 432 im Kontakt miteinander sind. Ein dünnes Platin 434 verläuft von der Elektrode 432 durch den horizontalen Arm 428 und in den Zylinder 243 und das hohle Rohr 248 wie oben beschrieben.
Bezüglich 1 und 2, ist ein optischer Detektor 290 zur Verwendung in einem nachzuweisenden Material, das durch ein Kapillarrohr, das sich durch den Detektor erstreckt auf einem Halterahmen 300 angeordnet, der an der oberen Wand 30 des Sockelelements 20 neben dem Behälter 100 befestigt ist. Die Vorrichtung 10 ist für die Verwendung eines Detektors, wie er als on-Säulendetektor des Typs, der ultraviolettes oder fluoreszierendes Licht in dem Nachweisverfahren verwendet bekannt ist, aufgebaut. Solche Detektoren werden von ISCO von Lincoln, Nebraska und EM Science von Cherry Hill, New Jersey hergestellt.
Zur Verwendung mit der Vorrichtung der Erfindung 10, werden Modifikationen der kommerziellen Detektoren in ihre Küvette vorgenommen. Andere Modifikationen können auch vorgenommen werden.
Der Detektor 290 ist mit einer anderen Vorrichtung 294 verbunden, um eine Aufzeichnung des Nachweisbetriebs bereitzustellen und eine solche Vorrichtung ist der ISCO UA-5/V4 Absorbenz/Fluoreszenz variabelwellenlängen Detektor oder der EM SCIENCE L-4200/L-4000 UV/sichtbar variabel-wellenlängen Detektor, der einen Streifenkartenrecorder und/oder einen Integrator enthält.
Ein starrer Halter 308 ist zur Unterstützung eines Kapillarrohrs für die Vorrichtung 10 zwischen dem Behälter 90 und dem Behälter 100 (1 und 2) vorgesehen. Dieser Halter enthält ein erstes hohles starres Rohr 310, das an einem Ende der Kürette der optischen Einheit des Detektors 290 geschraubt befestigt ist, und entlang seiner Länge in einem Loch 320 in der Seitenwand 130 des Behälters 90 abgestützt ist und sich in den Behälter 90 erstreckt. Ein zweites hohles starres Rohr 330 ist an dem anderen Ende der Kürette des Detektors 290 geschraubt befestigt und ist entlang seiner Länge in einem Loch 320' in der Seitenwand 130' des Behälters 100 abgestützt und erstreckt in den Behälter 100. Die Rohre 310 und 330 sind untereinander ausgerichtet und mit einem optischen Sensorelement, das innerhalb des Detektors 290 angeordnet ist.
Vorzugsweise ist der Kapillarrohrhalter 308 mit einem umgebenden starren Rohr 309 (9) versehen, durch das eine Kühl- oder Heizflüssigkeit eines geeigneten Typs in irgendeiner geeigneten Art und Weise zirkuliert werden kann, um die Temperatur des Kapillarrohrhalters und des Kapillarrohrs darin zu steuern.
Die Vorrichtung 10 verwendet ein flexibles Quarzrohr 310 aus geschmolzenem Siliziumdioxid und einem kleinen Durchmesser, durch das ultraviolettes Licht oder fluoreszierendes Licht, das in dem Detektor 290 verwendet wird, durchgehen kann. Das Kapillarrohr kann, wie oben erwähnt, einen Innendurchmesser im Bereich von ungefähr 25 Mikron bis ungefähr 200 Mikron haben und eine Länge im Bereich von ungefähr 10 cm bis ungefähr 100 cm. Die Kapillare 350 ist in dem hohlen starren Halter 308 gestützt und erstreckt sich durch den on-Säulendetektor 290 und durch das optische Sensorelement oder die Kürette darin (12). Wenigstens der Teil der Kapillare, der sich durch die Kürette erstreckt ist für die Lichtart, die in dem Detektor benutzt wird, transparent. Das Einlaßende der Kapillare 310 in dem Behälter 90 erstreckt sich durch das Loch 247 (6) in den Zylinder 243 und in das Rohr 248 zu dessen Ende, so daß die Kapillare in einen Probenbehälter im Tisch 170 eingesetzt werden kann. Das Auslaßende der Kapillare 250 im Behälter 100 erstreckt sich durch das Loch 247' in den Zylinder 243' und in das hohle Rohr 248'.
Da hohe Spannungen beim Betrieb der Vorrichtung der Erfindung benutzt werden, ist es klar, daß das Kapillarrohr und die Elektroden 360 und 360' voneinander getrennt und gegeneinander isoliert sein sollten.
Die Vorrichtung 10 enthält eine Zeitsteuerung 370 zum Zweck, der beschrieben wird. Die Zeitsteuerung ist an der vorderen Wand des Sockelements 20 (7) befestigt und sie enthält zwei drehbare Steuerräder 372 und 374, wobei jedes von ihnen Ziffern 0 bis 9 trägt. Die Zeitsteuerung wird zur Steuerung der Anwendungszeit der Betriebsspannung an die Vorrichtung wie unten beschrieben, verwendet und sie kann manuell oder computergesteuert sein.
In der offenen Röhrenkapillarelektrophorese, bei der Potentialdifferenzen von ungefähr 5 bis ungefähr 30 KV verwendet werden, wird ein elektroosmotischer Pufferfluß in Kapillaren mit kleinen Bohrungen erzeugt, der gelöste Molekhle (Analyte) zu einem Nachweissystem transportiert. Geladene Analyte wandern auch mit oder gegen diesen Fluß, in Abhängigkeit von ihrer Mobilität und der Intensität des elektroosmotischen Flusses. In einigen Fällen ist es wünschenswert, den elektroosmotischen Flußeffekt zu eliminieren und dies kann dadurch erreicht werden, daß in dem Trägermedium in der Kapillare gewisse Substanzen, wie z.B. Methylzellulose oder gewisse Elektrolyte oder Polyacrylamidgele bereitgestellt werden. Die Elimination des elektroosmotischen Fließeffekts erlaubt die Wanderung eines geladenen Teilchens als Folge der Wirkung der angelegten Spannungen.
In der folgenden Beschreibung der Erfindung wird angenommen, daß Vorkehrungen ergriffen wurden, den elektroosmotischen Fluß zu vermindern, um steuerbare Trennungen zu erreichen.
Allgemein ausgedrückt wird in dem elektrophoretischen Prozeß, wie er mit der Vorrichtung 10 durchgeführt wird, das Kapillarrohr 310 mit einer Pufferlösung, die einen pH-Wert, der größer als der größte pK-Wert eines Proteins oder eines anderen Bestandteils in der zu ana lysierenden Probe ist gefüllt. Dies sorgt für die gewünschte negative Beladung der Kapillare und der zu analysierenden Probe und dem gewünschten resultierenden Fluß der negativ geladenen Probenteilchen in Richtung des Endes der Kapillare an der ein positives elektrisches Potential angelegt ist. Beim Betrieb der Vorrichtung 10, ist ein Massepotential an die Elektrode 360' angelegt und ein positives Potential an die Elektrode 360 angelegt. Das Kapillarrohr wird mit der gewünschten Pufferlösung gefüllt und dann wird eine Probenmenge in das hochspannungspositive Ende (wenn eine positive Hochspannungsstromversorgung verwendet wird) des Kapillarrohrs 350 eingespritzt. Die Komponenten der Probe werden elektrisch negativ geladen und jede Komponente nimmt eine unterschiedliche Größe der Ladung auf, die durch den pH-Wert der Pufferlösung bestimmt wird und die Wanderung findet in die Richtung des elektroosmotischen Flusses statt. Die geladenen Komponenten der Probe werden in dem Kapillarrohr voneinander getrennt und mit einem angemessenen Potential versorgt, die höher negativ geladenen Komponenten bewegen sich schneller durch die Kapillare zu dem on-Säulendetektor 290. Der Detektor nimmt den Durchgang der geladenen Teile wahr und der Rekorder 294 druckt einen Impuls für jedes geladene Teilchen, wobei der Impuls die Position der Partikel in dem Fließstrom und die Quantität der Partikel darin zeigt.
Genauer gesagt werden bei dem Betrieb der Vorrichtung 10 die folgenden Schritte durchgeführt:

1. Der erste Pfosten 250 wird angehoben, um den Zugang zu dem freien Ende des Kapillarrohrs 310 bereitzu stellen und das Kapillarrohr wird mit einer Pufferlösung mit einem ausgewählten pH-Wert gefüllt, in dem durch eine Kunststoffrohrkupplung ein Ende mit einer Saugpumpe verbunden wird, und eine milde Saugleistung angelegt wird. Um einen angemessenen elektrischen Betrieb der Pufferlösung sicherzustellen, wird sie durch eine Bewegung und Vakuum durch Ultraschallmethoden oder durch die Einleitung von Stickstoff oder Helium, die den Sauerstoff absorbieren, und als einen zusätzlichen Vorteil Bakterienwachstum verhindern entgast. Auch werden alle Proben und Puffer durch 0,22 Mikrometerfilter filtriert, um große Partikel zu eliminieren, die die Kapillaren verstopfen können.
2. Als nächstes wird, mit dem Puffer gefüllten Kapillarrohr, das richtig in das hohle Rohr 248 positioniert ist, der Pfosten 250 und der Arm 240 angehoben und der Tisch 170 wird in die Position bewegt, in der der erste Probenbehälter, der eine zu analysierende Probe enthält, unterhalb des Rohres liegt und das Rohr wird in die Probe in dem Probenbehälter herabgelassen.
3. Die Stromversorgung wird mit ihrem positiven Ausgang am Ausgang 363 an der Elektrode 360 verbunden und das andere Ende wird geerdet. Der Zeitgeber 370 wird manuell oder computergesteuert für die erforderliche Anzahl von Sekunden, die notwendig sind, um elektrokinetisch eine gewünschte Probenmenge in das Einlaßende der Kapillare zu ziehen gestellt und eine Spannung im Bereich von ungefähr 5.000 bis 10.000 Volt wird angelegt. Nachdem die festgelegte Anzahl von Sekunden verstrichen ist, ist eine zu testende Probenmenge am Einlaßende der Kapillare vorhanden.
4. Als nächstes wird die Spannung auf Null vermindert und dann der Arm 290 angehoben und der Tisch 175 wird bewegt, so daß der nächste Probenbehälter, der Pufferfluid enthält unter den Arm positioniert wird und der Arm wird abgelassen, so daß das Rohr 248 diesen Probenbehälter betritt.
5. Nun wird die Spannung bis ungefähr 30.000 Volt erhöht und diese Spannung wird für ungefähr 10 bis 40 Minuten angelegt in Abhängigkeit von der kleinsten angenommenen Ladung, die auf einer Komponente der Probe vorhanden ist, und um sicherzustellen, daß die ganze Probe durch die Kapillare fließt. Die Probe wird durch die Kapillare und durch den on-Säulendetektor 290 zu einem Probenbehälter am anderen Ende der Kapillare gezogen. Der gleiche Vorgang kann nun mit anderen zu analysierenden Proben durchgeführt werden.

Die Vorrichtung der Erfindung 10 und das vorangegangene Verfahren sind automatisiert und computergesteuert in dem System, das in 10 gezeigt ist. Die Vorrichtung, die in 10 gezeigt ist, enthält einen Computer 400, der einen zentralen Prozessor CPU 404 und einen Bus 410 hat, der Wege zur Verbindung von verschiedenen Operationsteilen der Erfindung bereitstellt.
Der Ausgang der Stromversorgung 367 ist mit den Elektroden 360, 360' verbunden und er ist mit dem Bus 410 und mit der CPU verbunden. Der Zeitgeber 370 ist auch mit dem Bus und der CPU verbunden, die die Zeitlänge steuert, während der Leistung durch die Stromversorgung an die Elektroden 360 und 360' angelegt ist. Wie oben beschrieben, kann dies auch manuell getan werden.
Die rotierenden Motoren 210 und 210' und die zugeordneten Sensoren 212 und 212' sind mit dem Bus verbunden und somit mit der CPU. In ähnlicher Weise sind die aufund-ab-Motoren 260 und 260' und ihre Sensoren 280, 280' mit dem Bus und der CPU verbunden. Darüber hinaus ist der on-Säulendetektor 290 mit dem Bus und mit der CPU und dem Aufzeichnungsgerät verbunden.
Im automatischen Betrieb der Vorrichtung 10, der durch ein Programm gesteuert ist, das in den Computer 400 und in die CPU 404 eingesetzt ist wird zuerst Leistung an die Komponenten des Systems angelegt, einschließlich der auf-und-ab-Motoren 260, 260' angelegt und die Pfosten 250 und 250' werden hochgehoben, um die Rohre 248 und 248' über die Tische 170 und 170' zu einer gewünschten Höhe, wie in dem Programm festgelegt, anzuheben. Als nächstes wird Leistung an die rotierenden Mo toren 210 und 210' angelegt, so daß die Tische 170 und 170' sich drehen und die Scheiben 203 und 203' in eine Position gedreht werden, in der die Schlitze 205, 205' darin die Sensoren 212, 212' erreichen, und die Lichtwege quer durch die optischen Sensoren 212 und 212' vervollständigen. Dies stellt die Tische mit einem ausgewählten ersten Loch 180 und Probenbehältern darin unter die Rohre 248 und 248'. Dies wird als normale oder Startposition der Vorrichtung 10 betrachtet.
Als nächstes füllt der Operator das Kapillarrohr 350 mit einer Pufferlösung, z.B. in dem er ein Ende an eine Saugpumpe anschließt und in dem die entgaste Pufferlösung langsam in die Kapillare gezogen wird. Nachdem die Kapillare mit Pufferlösung gefüllt ist, wird das Ende wieder in den Platz in das Rohr 248 oder 248' gesetzt. Zu dieser Zeit ist das Rohr 248 über dem willkürlich bezeichneten ersten Behälter positioniert und dieser Behälter enthält die erste zu analysierende Probe.
Wenn die Probe in dem nächsten Behälter ist, wird der Motor 210 mit Strom versorgt, um den Tisch ein durch das Programm gesteuertes Stück zu bewegen, der automatisch den nächsten Behälter, der eine Probe enthält unter das Rohr 248 stellt.
Nun wird der Motor 260 mit Strom versorgt, um den Arm 240 und die Vorrichtung einschließlich des Rohrs 248 in den das Probenmaterial enthaltenden Behälter abzusenken. Die Stromversorgung wird manuell oder automatisch angeschaltet, um ein Potential von ungefähr 5.000 bis 10.000 Volt an die Elektrode 360 anzulegen, wobei die Elektrode 360' mit Masse verbunden ist und dieses Po tential wird für eine Anzahl von Sekunden, die durch den Zeitgeber 370 festgesetzt und als erforderlich beurteilt wurde, angelegt. Während dieser Zeitspanne, wird eine Probenmenge in das Ende des Kapillarrohrs gezogen. Am Ende der ausgewählten Zeit wird die Leistung entweder mechanisch oder automatisch abgeschaltet und keine zusätzliche Probe wird in das Kapillarrohr gezogen. Vorsicht muß angewandt werden, um die Bildung von Blasen in dem Puffer oder irgendein anderes Phänomen, das den normalen Stromdurchgang nachteilig beeinflussen könnte zu vermeiden. Die Analyte in der Probe werden in der Pufferlösung geladen.
Als nächstes wird der auf-und-ab-Motor 260 mit Strom versorgt, um den Pfosten 240 und die zugeordnete Vorrichtung anzuheben und das Rohr 248 wird über den Tisch 170 angehoben. Dann wird der Motor 210 angeschaltet und der Tisch 170 wird automatisch gedreht, so daß der nächste Behälter 180, der eine Pufferlösung enthält, unter das Rohr 248 positioniert wird. Als nächstes wird der Motor 260 mit Strom versorgt, um den Pfosten 240 abzusenken, bis der Motor durch seinen Sensor 263 gerade an dem Punkt gestoppt wird, an dem die Spitze des Rohrs 248 ungefähr am Boden des Behälter 190 ist oder in geeigneter Weise innerhalb der Pufferlösung positioniert ist.
Als nächstes wird die Stromversorgung 367 manuell oder automatisch angeschaltet, um ein positives Potential von ungefähr 30.000 Volt an die Elektrode 360 anzulegen und dies bewirkt, daß die geladenen Komponenten oder Analyte in die Richtung des elektroosmotischen Flusses durch das Kapillarrohr und durch den on-Säulendetektor 290 fließen. Das Aufzeichnungsgerät 194 registriert einen Impuls für jede Komponente, die durch ihn hindurchgeht.
Wenn eine Probe durch den Detektor hindurchgeht, gehen geeignete Signale durch das System, um passende Komponenten des Behälters 100 mit Strom zu versorgen, um die Probe zu empfangen und dann den Tisch 170' in eine andere Position zu drehen, wenn solches erforderlich ist.
Nachdem die erste Probe durchgelaufen ist, kann eine zweite Probe in der gleichen Weise durchgehen.
Bei einer Modifikation der Erfindung, die in den 11 und 12 dargestellt ist, wird eine Vielzahl von Kapillarrohren 310 mit einem gleichen Durchmesser in dem Halter 308 bereitgestellt und diese werden parallel, oder in einem Bündel betrieben, um eine größere Probenhandhabungskapazität zu erreichen. 12 zeigt viele Kapillare 310 in der Detektorküvette 311.
Wie in 13 dargestellt, kann der Computer und Mikroprozessor den Betrieb von verschiedenen Vorrichtungen 10 simultan steuern.
Hinsichtlich der Injektion einer Probe in eine Kapillare kann, falls gewünscht, die Probe manuell oder in einer anderen geeigneten Art injiziert werden. In einer Anordnung können die Behälter 190 und 190' in verschiedenen Höhen positioniert sein, mit dem Behälter 190' niedriger, um eine Probenquantität oder einem anderen Fluid zu ermöglichen, in das Probenende der Kapillare zu fließen.
Als eine Modifikation der Erfindung kann die Vorrichtung 10 geeignet sein, Mittel aufzuweisen, durch die anstelle des Anhebens und Absenkens der Pfosten 250 und 250' und ihrer zugeordneter Vorrichtung entweder gerade die spezifischen Probenbehälter oder die gesamten Tische 170 und 170' anheben und absenken. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung, wurden die Motoren 210 und 210' gebaut sein, um sowohl die Pfosten 200 und 200' zu drehen und sie vertikal anzuheben und abzusenken als auch, falls erforderlich, die Tische 170 und 170' anzuheben und abzusenken. Alternativ Würde ein getrennter auf-und-ab-Motor 207, 207' (3) mit den Tischpfosten 200, 200' verbunden werden.
Da relative hohe Spannungen mit der Vorrichtung der Erfindung verwendet werden, sind Mittel vorgesehen, um die elektrische Leistung zu unterbrechen, wenn ein Bediener der hohen Spannung ausgesetzt sein könnte. Dies kann passieren, wenn der Bediener eine der Abdeckungen 160 und 160' auf den Behälter 90 oder 100 entfernt. So ist als eine Sicherheitsmaßnahme in einer in 2 dargestellten Ausführungsform hinsichtlich des Behälters 90 ein Schalter 163 innerhalb des Behälters auf einer der Seitenwände, z.B. an der Wand 120, und nahe an der Abdeckung 160 angeordnet, und geeignet mit der Abdeckung als eine Leistungsunterbrechung zu wirken. Auf diese Weise, z.B. mit dem nahe der Abdeckung befestigten Schalter 163, trägt die Abdeckung einen Dorn oder einen Arm, der den Schalter schließt, wenn die Abdeckung am Platz ist und den Schalter öffnet, wenn die Abdeckung entfernt wird und so die hohe Spannung von der Vorrichtung unterbricht.
Weiterhin ist eine Klammer 164 mit jeder der Abdeckungen 160 und 160' verbunden, und an einer Seitenwand gelenkig befestigt, und angeordnet, um mit der Abdeckung in Eingriff zu stehen. Die Klammer muß bewegt werden, bevor die Abdeckung entfernt werden kann. Auf diese Weise kann der Schalter 163, wenn gewünscht, so befestigt werden, daß er durch die Klammer bedient wird, oder es kann, wenn gewünscht, ein (nicht dargestellter) Hilfsschalter mit der Klammer verbunden sein.
Alle elektrischen Verbindungen zu den Schaltern und Stromversorgung, die mit der Vorrichtung der Erfindung verwendet werden, sind nicht gezeigt, da die Verbindung von Schaltern innerhalb einer Schaltung auf einfache Weise durch Fachleute zustande gebracht werden kann. Der Anschluß 166 zeigt Verbindungen von dem Schalter zum Stromversorgungskreis.
Es wird bemerkt, daß die Verwendung der Kapillaren mit kleinem Durchmesser (25 bis 200 Mikron) die Größe der Temperaturdifferenzen (Joulehitze) innerhalb einer Kapillare vermindert und die Effekte der auseinandergezogenen Zonen verkleinert, die gewöhnlich in Kapillaren mit größerem Durchmesser größer als 200 Mikron gefunden werden.
In einer Modifikation der Erfindung, die in 14A und 14B und teilweise in 1 gezeigt ist, sind der Behälter 90 und die davon getragenen Teile geeignet, auf der oberen Wand 30 des Sockelelements 20 zu gleiten, so daß der Abstand zwischen den zwei Behältern 90 und 100 eingestellt werden kann, um den Betrieb der Vorrichtung mit Kapillarrohren unterschiedlicher Länge zu ermöglichen.
Bei dieser Ausgestaltung der Erfindung ist die obere Wand 30 des Sockelelements 20 mit einem Schlitz 500 versehen, über den die Bodenplatte des Behälters 90 angeordnet ist. Die Motoren 210 und 260, sind an der unteren Oberfläche 32 der Basis 110 des Behälters 90 und unterhalb des Schlitzes 500 befestigt, und in der Tat innerhalb der Basis der Vorrichtung unter Bezugnahme auf 14A und 14B ist eine vertikale Isolierplatte 510 an der unteren Oberfläche der Basis 110 befestigt und erstreckt sich davon abwärts. Diese Platte 510 ist zwischen den Motoren 210 und 260 angeordnet. Auf einer Oberfläche trägt sie den Sensor 212 für den Motor 210 und auf der anderen Oberfläche trägt sie den Sensor für die Scheibe, die von dem Motor getragen wird.
Um den Schlitz 500 zu blockieren, so daß kein fremdes Material in das Sockelelement fallen kann, ist eine balgenähnliche Abdeckung 520 unterhalb der oberen Oberfläche des Sockelelements befestigt. Um die Balgen zu stützen, ist ein Behälter vorgesehen, der aus zwei L-förmigen verlängerten Streifen 530 und 540 hergestellt ist, die an der unteren Oberfläche des Sockelelements 20 mit zwei Endplatten 550 und 560 befestigt sind, um den Behälter zu vervollständigen.
Ein Motor 570 zum Bewegen des Behälters 90 ist auf der unteren Oberfläche der Wand 30 des Sockelelements 20 befestigt. Der Motor 570 trägt ein Treibrad 572, das mit Hilfe eines Treibriemens 580 mit einem zweiten Rad 582, das etwas entfernt davon angeordnet ist, verbunden ist. Der Motor 570 ist nahe dem Ende der Wand 30 unterhalb des Behälters 100 angeordnet und das Rad 582 ist nahe dem gegenüberliegenden Ende der Wand 30 unterhalb des Behälters 90 angeordnet. Das Rad 572 ist in geeigneter Weise auf der Wand 30 oder einer anderen Wand des Sockelelements 20 abgestützt. Der Treibriemen 580 ist an der vertikalen Platte 510 mit Hilfe einer Klammerplatte 590 befestigt mit dem Riemen zwischen der vertikalen Platte und der Klammerplatte. Mit dieser Verbindungsanordnung wird bewirkt, daß wenn der Motor 570 eingeschaltet ist der Riemen 580 die vertikale Platte 510 und die Basis 110 des Behälters 90, auf der er befestigt ist, bewegt wird. Wenn der Motor den Behälter 90 zurück und nach vorne bewegt, drückt sich der Balgen 520 zusammen und dehnt sich aus, wie es erforderlich ist, um den Schlitz 500 bedeckt zu halten.
Eine Modifikation der obigen Ausführungsform der Erfindung ist in 15 dargestellt. In 15 ist die Kapillarelektrophoresevorrichtung 600 in Modulen oder Teilen aufgebaut, die einfach zusammengesetzt und auseinandergebaut werden können, um die Länge der Vorrichtung zu variieren. Auf diese Weise enthält, wie in 15 dargestellt, die Vorrichtung Endabschnitte 610 und 620, die die Behälter 90 und 100 und ihre verbundene Vorrichtung enthalten, und Hilfsabschnitte 630, die gleiche Größe und Form wie die Endabschnitte haben, so daß alle Abschnitte zusammenpassen. Die Hilfsabschnitte 630 können in jeder gewünschten Anzahl zwischen den Endabschnitten, wobei die Verbindung Kupplungen in jeder geeigneten Weise bewirkt wird. In einer Kupplungsanordnung können die verschiedenen Abschnitte 610, 620 und 630 Dorne 640 an ihren Endoberflächen tragen, die in Löcher 650 in den benachbarten Endoberflächenabschnitten hineingehen, mit denen sie verbunden sind.
In der in 15 gezeigten Vorrichtung sind die erforderlichen elektrischen Verbindungen in irgendeiner geeigneten Weise ausgeführt. Zum Beispiel können die Stromversorgung und ihre Steuerungen alle in einem Endabschnitt befestigt sein, oder wenn gewünscht, kann eine Stromversorgung und Steuerungen in jedem Endabschnitt vorgesehen sein. Weiterhin können, falls gewünscht, Mittel wie z.B. Dorne 654 und Hülsen 656 in den Endoberflächen eines jeden Abschnitts vorgesehen sein, so daß, wenn Abschnitte miteinander verbunden werden, elektrische Verbindungen automatisch zwischen den angrenzenden Kontaktoberflächen zur gleichen Zeit hergestellt werden.
Die Vorrichtung 600 hat den Vorteil der Vereinfachung in der Handhabung der verschiedenen Modulen. Die Beförderung oder der Versand von verschiedenen kleinen Modulen ist vorteilhafter als der Versand oder die Beförderung einer einzelnen relativ großen Vorrichtung. Ferner erlauben die Hilfsabteilungen der Vorrichtung, mit Kapillarrohren unterschiedlicher Länge zu arbeiten.
Die Vorrichtung der Erfindung kann auch eine modifizierte Kapillare verwenden, die wie in 16 gezeigt, eine Kapillarkartusche 711 aufweist. Die Kartusche enthält eine Kapillarkassette, die ein spulenförmiges Kapillarrohr 713 aufweist, eingebettet in einem Körper aus Metall, Glas, Kunststoff oder dergleichen. In Spulenform kann das Kapillarrohr jede geeignete Länge haben und es kann verschiedene Chemikalien enthalten. Die Kapillarkassette ist in einem Gehäuse 721 gehalten, das aus zwei Platten aus Metall, Glas, Kunststoff oder dergleichen, die mit Schrauben oder dergleichen verbunden sind, hergestellt ist. Eine Temperatursteuerflüssigkeit die erhitzt oder gekühlt werden kann, kann durch das Gehäuse über Einlaß- und Auslaßrohre 723 und 725 zirkuliert werden. Es wird bemerkt, daß die Kapillarkassette einfach von dem Gehäuse 721 entfernt und durch eine andere Kassette mit einer unterschiedlichen Größe oder anderen Charakteristika ersetzt werden kann.
Die Nützlichkeit der Kapillaranordnung 711 als eine schnell ersetzbare Kartusche, die Kapillare von verschiedener Länge und Chemien bereitstellen kann, wird für die Fachleute klar sein. Eine Befestigungsanordnung für die Kapillaranordnung oder die Kartusche 711 ist in 17 dargestellt.
In einer Modifikation der Erfindung ist die elektrische Vorrichtung so modifiziert, daß Betriebsspannungen vorher festgesetzt werden können, so daß durch den Betrieb eines Drei-Positions-Schalters die gewünschte vorher festgesetzte niedere Spannung angelegt werden kann, um die Probe in die Kapillare zu ziehen, und dann die vorher festgesetzte hohe Spannung angelegt werden kann, um die Probe die Kapillare hinunterfließen zu lassen. In der dritten Position wird die Spannung Null angelegt, das System ist aus und kein Strom fließt.
In dieser Ausgestaltung der Erfindung, wie sie in den 17 und 18 dargestellt ist, ist die Vorderseite der oben beschriebenen Kapillarelektrophoresevorrichtung 10 modifiziert, um ein erstes Potentiometer 604 zu enthal ten, das mit der Stromversorgung in der Vorrichtung verbunden ist und das geeignet ist, auf eine ausgewählte niedere Spannung gesetzt zu werden, und ein zweites Potentiometer 608 ist mit der Stromversorgung der Vorrichtung verbunden, um auf eine ausgewählte hohe Spannung eingestellt zu werden. Ein einzelner Drei-Positionen-Steuerschalter 610 zur Anlage der Spannungen beim Betrieb der Vorrichtung, die in den Potentiometern eingestellt werden, ist auch auf der Vorderseite, erreichbar für den Betreiber, befestigt. Der Schalter 610, der in 18 schematisch dargestellt ist, enthält einen Schalterarm 618, einen Niederspannungsanschluß 616, einen Hochspannungsanschluß 612 und einen Nullspannungsausgang 613.
Auf diese Weise ist beim Betrieb der Vorrichtung, wie sie in 17 und 18 gezeigt ist, wenn es gewünscht wird, eine Probe in die Kapillare 310 durch Anlegen einer Niederspannung über die Kapillare zu ziehen, der Schalter 610 auf den Anschluß 616 gestellt, um die niedere Spannung, die in dem Potentiometer 604 eingestellt ist, über die Kapillare anzulegen. Dieser Betrieb erfordert gewöhnlich Sekunden der Betriebszeit. Wenn es gewünscht ist, eine Spannung anzulegen, um die Probe entlang des Kapillarrohrs fließen zu lassen, dann wird der Schalter 610 eingestellt, um den Anschluß 612 zu berühren, um eine hohe Spannung, die durch das Potentiometer 608 eingestellt wird, anzulegen. Dieser Betrieb erfordert gewöhnlich eine Zeit von Minuten. Der Schalter 610 kann in dem Computersteuersystem verwirklicht sein, wenn so etwas vorgesehen ist, für den automatischen Betrieb. Der Anschluß 613 des Schalters legt Nullspannung an, so daß das System in Wirklichkeit ausgeschaltet ist und kein Strom fließt.
Bei einer anderen Modifikation der Erfindung, die in 19 dargestellt ist, ist ein Vergrößerungsglas 614 vorgesehen, das mit dem Kapillarrohr 310 verbunden ist, um dem Betreiber zu gestatten, die Strömung der Pufferlösung in die und entlang der Kapillare zu beobachten und zu bestimmen, ob Gasblasen in der Pufferlösung vorhanden sind. Es erlaubt dem Betreiber auch, zu bestimmen, ob es eine normale Flüssigkeitsströmung durch das Kapillarrohr gibt. Wenn die Strömung sehr langsam ist oder wenn es überhaupt keine Strömung gibt, ist dies ein Hinweis auf eine nicht funktionierende Säule, wahrscheinlich in Folge einer Blockade der Strömung, weil große Makromolekühle oder Aggregate an den Wänden der Kapillare absorbiert sind oder weil die Salzlösung verdunstet ist und Salzaggregate eine wandähnliche Zwischenfläche gebildet haben, die die normale Fluidströmung stoppt.
In der in 19 dargestellten Modifikation ist das Vergrößerungsglas 614 auf eine Endwand 40 des Gehäuses 20 befestigt, so daß es für den Benutzer erreichbar ist. Das Kapillarrohr 310 hat sein linkes Ende durch ein Kunststoffverbindungsteil 614 mit einem Verbindungsrohr 619 aus Metall, Glas oder Kunststoff oder dergleichen verbunden hinter dem Vergrößerungsglas mit einer Vakuum- oder Peristaltikpumpe 635 und die Strömung der Pufferlösung oder eines anderen Fluids kann dadurch beobachtet werden.
In einer bevorzugten Ausführung ist die Vakuum- oder Peristaltikpumpe 635 eine Miniaturpumpe, die innerhalb des Gehäuses 20, wie in 20 gezeigt, befestigt werden kann.
Nachdem das Kapillarrohr gefüllt worden ist, wird das Rohr 619 entfernt und die Kapillare wird in ihre Betriebsposition in dem Halter, wie oben in 1 und 17 oder in irgendeiner anderen ausgewählten Vorrichtung gezeigt, gestellt.
In den 19 und 20 ist ein Becherglas 800 am Auslaßende der Vorrichtung gezeigt, um Proben von der Kapillare für Analysenzwecke zu erhalten.
Die poröse Glasverbindungsanordnung, die für einen elektrochemischen Nachweis entwickelt wurde, kann verwendet werden, um die Proben zu sammeln und den elektroosmotischen Fluß zu berechnen. Wie oben erwähnt, erzeugt die Anwendung einer positiven hohen Spannung eine große Strömung von Puffer und Analyten in Richtung zu der Masseelektrode.
Bei einer anderen Modifikation der Erfindung ist es möglich, den elektroosmotischen Fluß in zwei verschiedenen Weisen zu berechnen. Eine Weise ist, die Zeit zu messen, um einen Tropfen an der Spitze der Nachweiskapillare (das Kapillarrohr nach der porösen Glasverbindung) zu erzeugen. Dann wird unter einem Mikroskop der Tropfen durch die Kapillarität in ein Stück der Kapillarsäure eingesaugt. Da der Abstand zwischen den zwei gebildeten Menisken durch ein Kaliber gemessen werden kann, kann das Gesamtvolumen, das in ein Stück des Ka pillarrohrs verbracht wurde, nun berechnet werden mit der Formel des Volumens eines Zylinders, wobei der innere Durchmesser des Kapillarrohrs (siehe unten) bekannt ist.
Es ist auch möglich, den elektroosmotischen Fluß, vergleiche 21, durch die Beobachtung des Meniskus, der durch die Probe gebildet wird, zu messen, mit dem Vergrößerungsglas 614, das für diese Betriebsart ein Hochleistungsvergrößerungsglas oder Mikroskop oder dergleichen ist, das am Anschlußende der Nachweiskapillare 727 angeordnet ist. Wenn der elektroosmotische Fluß in dem System stattfindet, kann man, falls der Abstand bekannt ist, den der Miniskus zwischen zwei Punkten (P1 und P2) durchläuft, das Volumen der Probe durch Verwendung der Gleichung für einen Zylinder berechnen: V = π × (d2/4) × lwobei V = Zylindervolumen, p = konstant = 3,1416, d = Zylinderdurchmesser, und 1 = Abstand zwischen den zwei Punkten (P1 und P2). Weiter kann man, wenn die Zeit, die der Miniskus braucht, um sich zwischen den zwei Punkten in dem Kapillarrohr 727 zu bewegen, bekannt ist, die elektroosmotische Flußrate durch die Verwendung der Gleichung: elektroosmotischer Fluß = V/t berechnen, wobei V = Zylindervolumen, und t = Zeit, die der Miniskus braucht, um sich zwischen Punkten P1 und P2 zu bewegen.
Der elektroosmotische Fluß ist für mehrere Reihen von Systemparametern in der folgenden Tabelle gezeigt:
Tabelle. Theoretische Bestimmung des Injektionsvolumens und des elektroosmotischen Flusses unter Verwendung einer Kapillare aus geschmolzenem Siliziumdioxid mit verschiedenen Innendurchmessern. Die Resultate basieren auf Werten, die empirisch mit einer 75 mm × 100 cm Kapillarsäule bestimmt wurden, für eine Miniskusbewegungslänge von 3,36 mm, eine Bewegungszeit von 60 Sekunden. Die angewandte Spannung war 10 KV (100 V/cm).
Diese Berechnung ist einmal für die Systemparameter, z.B. konstante Temperatur, konstante Pufferzusammenset zung, konstante Kapillarsäulenabmessungen, konstante Spannung und Stromimpulse etc., gemacht.
Alternativ kann der Abstand und die Zeit, in der sich der Miniskus zwischen den Punkten P1 und P2 bewegt auch berechnet werden, indem ein elektronisches Sensorsystem verwendet wird.
In einer noch anderen Modifikation der Erfindung die zum Entgasen von Pufferlösungen verwendet wird, wie sie in 22 dargestellt ist, eine Quelle 640 eines inneren Gases, wie z.B. Helium, Stickstoff, Argon oder dergleichen bereitgestellt, die durch ein Sammelrohr 641 und Rohre 643 verbunden ist, die sich senkrecht von dem Sammelrohr 641 zu dem beweglichen Tisch 170 erstrecken. Die Anwesenheit von Blasen in dem Kapillarrohr wird den Fluß der Elektronen stoppen und das System wird nicht arbeiten. Daher ist die Entgasung der Puffer und Proben wesentlich. Wenn der Tisch 170 sich bewegt, wird das Entgasungsgas in jeden der Probenbehälter 190 eingefüllt. Die Mikorinjektorrohre 643 tragen kleine Mengen von steuerbaren Gasmengen, um das Entgasungssystem so vorsichtig wie möglich durchzuführen, ohne die zu analysierende Probe oder die Puffer, die für den elektrophoretischen Betrieb notwendig sind, zu beeinträchtigen oder zu kontaminieren.
Bei einer anderen Modifikation des Kapillarrohrs, das bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, vergleiche 23, enthält ein Kapillarrohr 645 verschiedene Abschnitte oder Segmente 647, 649 und 650 der Kapillare, wobei jede von ihnen eine unterschiedliche innere Beschichtung haben kann. Die unter schiedlichen Beschichtungen sind ausgewählt worden, um die Adsorption von Makromolekhlen an der Kapillarwand zu verhindern und um die Komponenten der Probe zu trennen, wobei eine effizientere Probenanalyse erreicht werden kann. Silanderviate sind eine von den geeigneten Beschichtungsmaterialien.
Die angrenzenden Enden der Rohrabschnitte können Ende an Ende aneinderstoßen und durch Hülsen 652 miteinander verbunden werden, die durch einen geeigneten Klebstoff, wie zum Beispiel Epoxid, an den äußeren Wänden der Kapillarabschnitte befestigt sind.
Bei einer anderen Modifikation der Erfindung, die schematisch in 24 dargestellt ist, ist das Einlaßende eines Kapillarrohrs (Trennungskapillare) 719 in einen Behälter 723 mit einer Pufferlösung und das Auslaßende (Nachweiskapillare) ist in eine poröse Glashülse 725 eingesetzt, die in einem Behälter 723' mit einer Pufferlösung angeordnet ist. Ein Kapillarrohr aus geschmolzenem Siliziumdioxid 727 erstreckt sich von dem Ende der Kapillare 719 heraus aus dem Pufferbehälter und Proben fließen als Tropfen aus dem Ende des Kapillarrohrs, wo sie gesammelt werden.
Das poröse Glasrohr 725 ist eine selektive Membran, die Ionen austreten läßt, aber die zu analysierenden Proben fließen durch das Rohr, um gesammelt zu werden.
Die Prinzipien dieser Erfindung, die ursprünglich für den Einsatz in das offene Ende der Nachweiskapillare einer Carbonfiberelektrode für den elektrochemischen Nachweis von gelösten Zonen verwendet wurden, können verwendet werden, um einen Fraktionssammler bereitzustellen. Wie schematisch in 25 dargestellt, ist das freie Ende des Kapillarrohrs 727 durch einen vertikalen Halter 731 geleitet, der mit einem horizontalen Arm 733 verbunden ist, und über den Probenbehältern 735 in dem beweglichen Tisch 737 angeordnet ist. Beim Betrieb der Vorrichtung, wie sie in den 17 und 25 gezeigt ist, wird ein hohes positives Potential an den Elektroden in den Probebehältern 735 in dem Behälter 90 (Autosampler oder Autoinjektorseite) angelegt und als Massepotential ist an eine Elektrode im Pufferbehälter 726 (Fraktionssammelseite) angelegt. Da das Massepotential in dem Puffer im Behälter 726 ist, gibt es kein Potential und kein Puffer ist erforderlich in den Probenbehältern 735 in dem Tisch 737 im Behälter 100 und diese Abschnitte der Gesamtvorrichtung können gehandhabt werden, ohne Sorge um einen elektrischen Schock.
Bei noch einer anderen Modifikation der Erfindung, die zuletzt beschrieben und dargestellt ist in 26, ist ein Lichtsensor 739 mit dem Ende des Rohres oberhalb des drehbaren Tisches verbunden und eine optische Glasfaser 721 oder dergleichen ist von dem Sensor zu dem Detektor 743 verbunden. Mit dieser Vorrichtung erfaßt der Sensor den Durchgang einer Probe 745 und diese wird durch den Detektor nachgewiesen, der verwendet wird, wenn der Tisch bewegt werden soll, so daß eine einzelne Probe in jeden Probenbehälter 735 gefüllt werden kann.
Während das Verfahren beim Betrieb der Vorrichtung 10, wie oben beschrieben, für viele Anwendungen zufriedenstellend ist, und eine geeignete Empfindlichkeit erreicht wird, stellt ein anderes Verfahren des Betriebs ein verbessertes Analysenspektrum und eine größere Fähigkeit die Proben zu identifizieren durch Bereitstellung einer kompletten Spektralanalyse zur Verfügung. Änderungen in der Zunahme der Wellenlänge so klein wie 1 oder 2 mm, können verwendet werden, um die Empfindlichkeit zu maximieren und den vollständigen Spektralbereich abzudecken.
Bei dieser Art des Betriebs, der in 27 dargestellt ist, ist der Detektor für eine erste Betriebswellenlänge eingestellt und, nachdem eine Probe 630 das Kapillarrohr hinunterfließt nach links zu dem Detektor 290 und durch den Detektor fließt und ein Auslaßimpuls von dem Detektor bei der ersten Wellenlänge liefert, wird die hohe Spannungspolarität umgedreht und die Richtung der Strömung des Puffers wird umgedreht, dadurch wird die Probenrichtung umgedreht und die Probe fließt nach rechts und wieder durch den Detektor, wobei der Detektor auf eine zweite Wellenlänge eingestellt ist. Dies verursacht, daß ein zweiter Impuls durch den Detektor geliefert wird. Nun wird die Polarität wieder umgedreht und die Probe fließt in die ursprüngliche Richtung nach links und liefert einen Ausgang, wobei der Detektor eingestellt wird, um eine dritte Lichtwellenlänge bereitzustellen. Dieser Betrieb der Potentialumkehrung und des Probenzyklus zurück und vor wird bei verschiedenen Detektorlichtwellenlängen wiederholt, bis eine Serie von Impulsen erhalten wird, die, wenn sie geplottet werden, zwei Peakwellenlängen liefert, mit einem zweiten Peak, der eine genaue Identifizierung der Probe bereitstellt. Fast jede reine Substanz liefert solch eine Serie von Impulsen, um deren Identifikation zu erlauben.
Eine typische Impulsserie 643, die erhalten werden kann, um ein komplettes Spektrum für eine Probe bereitzustellen, ist in 28 dargestellt, zusammen mit einem Plot einer Wellenlänge gegen Absorbanz, die in 29 dargestellt ist.
Licht oder Lampen 700 und 702, die in 17 auf der Vorderfront der Vorrichtung gezeigt sind, können verwendet werden, um anzuzeigen, in welche Richtung bei jedem Augenblick die Strömung stattfindet. Weiterhin ist ein Schalter 710 vorgesehen, um die Hochspannungspolarität umzukehren, um die oben beschriebene zyklische Verfahrensweise zu erhalten.
Nach vielen Probeninjektionen, besonders nach denen, die Substanzen enthalten, die eine Tendenz haben, an den Wänden der Kapillarsäule zu kleben wie zum Beispiel Serum oder andere biologische Flüssigkeiten, ist es notwendig, die Kapillarsäure wiederherzustellen. Da kommerziell erhältliche Kapillaren aus geschmolzenem Siliziumdioxid kostengünstig sind, ist eine Art, die Kapillarsäure wiederherzustellen, sie vollständig zu ersetzen.
Eine andere Alternative ist, die Kapillarsäure durch ein Reinigungsverfahren zu recyclen. Wie in 30 ersehen werden kann, ist eine T-förmige Verbindung 747 nahe dem Ende der Kapillarsäure mit einem kleinen Rohr aus einem Material wie zum Beispiel Metallglas, Kunststoff, Teflon oder dergleichen gemacht. Diese Verbindung ist nun Teil der Kapillarsäure. Das Verbindungsrohr ist an einem Ventil 750 und an einer Vakuumpumpe 752 befestigt. Dieses System kann durch eine Computersteuerung betrieben werden, die die Säule in einer abgestimmten Art und Weise reinigen läßt, wie zum Beispiel eine Reinigung mit Natriumhydroxid, gefolgt von entionisiertem Wasser und Puffer, die von den Behältern in dem beweglichen Tisch 170 oder anderen Vorrichtungen aufgesaugt werden und via eines Teflonkanals abgeleitet werden, der zu einem Siphon führt. Die Kapillarsäule ist dann für einen neuen Trennungstest fertig.

Claims

Kapillare Elektrophorese-Vorrichtung (10) mit einem Kapillarrohr (310, 713) von der Art, die elektrisch geladen werden kann, wobei dieses Kapillarrohr (310, 713) ein erstes und ein zweites Ende aufweist, einem ersten Mittel (360, 360'), das mit der Vorrichtung verbunden ist zum Anlegen eines elektrischen Potentials über das Kapillarrohr (310, 713), wobei eine Probe durch das Kapillarrohr (310, 713) und an einem Detektor (290) vorbei fließt, einem zweiten Mittel an dem ersten Ende des Kapillarrohrs (310, 713), das eine Quelle einer Pufferlösung und eine Quelle einer zu analysierenden Probensubstanz bereitstellt, wobei das zweite Mittel einen drehbaren Tisch (170), der eine Vielzahl von Probenbehältern (190) und einen Halter (240, 240') zum Halten eines Endes des Kapillarrohrs (310, 713) in betriebsbereiter Beziehung mit einem der Behäl ter (190) aufweist, wobei die Behälter (190) entweder eine Pufferlösung oder eine zu analysierende Probe enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil des Kapillarrohrs (713) in der Form einer Spule eines Glasrohres ist und diese Spule eines Glasrohres verbunden ist mit einem Trägerelement.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der gewundene Teil (713) eingebettet ist in eine Kapillarkassette.
Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillarkassette von der Vorrichtung entfernbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillarkassette einen Körper aus Metall, Glas oder Kunststoff aufweist, in den der gewundene Teil (713) des Kapillarrohres eingebettet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillarkassette in einem Gehäuse (721) gehalten ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse (721) gebildet ist aus zwei Platten aus Metall, Glas oder Kunststoff.
Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse versehen ist mit einem Einlaß und einem Auslaß (723, 725), mit deren Hilfe ein Temperatursteuerungsfluid durch das Gehäuse (721) zirkuliert werden kann.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillarkassette von dem Gehäuse (721) entfernbar ist.