DE4041880C2 - Verfahren zur Prüfung von Nucleinsäuren unter Verwendung von Naphthol-AS-Derivat-Phosphat - Google Patents

Verfahren zur Prüfung von Nucleinsäuren unter Verwendung von Naphthol-AS-Derivat-Phosphat

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prüfung (Assay) von Nucleinsäuren, chemischen Verbindungen unter Verwendung von Antikörpern, Proteinen oder dergleichen als Probe, bei dem die Probe effizient durch Fluoreszenz nachgewiesen wird.
Im medizinischen und biologischen Bereich ist die Verwendung von Mitteln zur Markierung, zum Beispiel einer DNA-(oder RNA-)Sonde, mit einem radioaktiven Isotop, die Hybridisierung der markierten Sonde mit einer Ziel- bzw. Targetnucleinsäure und der anschließende Nachweis der Zielnucleinsäure durch Autoradiographie gegenwärtig weit verbreitet.
Jedoch bringt das Isotopen-Verfahren viele Nachteile mit sich, die ernsthafte Hindernisse bei der Anwendung und Entwicklung dieser Technologie sind.
Die Nachteile des Isotopen-Verfahrens sind wie folgt:
  • (a) Bei der Nucleinsäure-Hybridisierung hat das Verfahren keine ausreichende räumliche Auflösung, um relative Stellungsbeziehungen zwischen benachbarten Signalen zu zeigen.
  • (b) Experimentelle Verfahren unter Verwendung von Isotopen können nur in Isotopen-Laboratorien ausgeführt werden, die mit speziellen Einrichtungen ausgerüstet sind. Dies ist ein Grund, der die Anwendung des Hybridisierungsverfahrens insbesondere bei klinischen Untersuchungen behindert.
  • (c) Die Verwendung von Isotopen ist für die im Laboratorium Arbeitenden selbst dort gefährlich. Außerdem besteht wegen des Abfalls etc. auch immer eine Gefahr für gewöhnliche Menschen.
  • (d) Für den Nachweis kann eine lange Zeit (mehrere Wochen bis mehrere Monate) erforderlich sein, so daß die Anwendung zur schnellen klinischen Diagnosestellung schwierig ist.
  • (e) Radioaktivität zerfällt mit einer bestimmten Halbwertszeit, so daß Experimente so geplant werden sollten, daß sie auf das Kaufdatum des Isotops fallen. Wenn der Arbeitsplan leicht geändert wird, besteht die Gefahr, in großem Umfang Isotope oder experimentelle Ergebnisse zu vergeuden.
  • (f) Um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen, ist es erforderlich, so viel Radioaktivität wie möglich in eine Nucleinsäure-Sonde einzubauen. Jedoch werden die Nucleinsäuren, die ausreichend markiert wurden, um ihre Radioaktivität zu erhöhen, leicht radioaktiv zerstört.
  • (g) Im allgemeinen sind Isotope extrem teuer und es ist nicht ungewöhnlich, in einem Versuchslauf Isotope im Werte von einigen Hundert Yen zu verbrauchen. Dies verhindert eine allgemeine Verbreitung des Hybridisierungsverfahrens.
Angesichts dieses Hintergrunds sind bisher anstelle von radioaktiven Isotopen einige DNA- oder RNA-Markierungsverfahren entwickelt worden. Zum Beispiel ist der BLUE GENE KIT bekannt, der im Handel von den Betesda Research Laboratories Inc. (BRL Inc.) erhältlich ist. Außerdem ist eine Nucleinsäure-Sonde und deren Verwendung ("Nucleic acid probe and use thereof") in der Offenlegungsschrift der Japanischen Patentanmeldung JP-A-60-2 26 888 offenbart.
Jedoch beseitigen diese Techniken lediglich einen Teil der oben beschriebenen Nachteile. Insbesondere ist die Nachweisempfindlichkeit nicht mit der des Isotopen- Verfahrens vergleichbar.
Das heißt, daß mit der oben genannten Markierung die Nachweisempfindlichkeit "10⁻¹² g DNA" und leicht geringer als "10⁻¹³ g DNA" im Isotopen-Verfahren ist.
Die US-A-4 889 798 offenbart ein Verfahren zum nicht­ radioaktiven Nachweis von Nucleinsäure, speziell DNA, bei dem auf einem Nitrocellulosefilter ein Enzym wie zum Beispiel saure oder alkalische Phosphatase an die DNA gebunden wird. Die anschließende Nachweisreaktion erfolgt auf herkömmliche Weise durch Farbreaktion des Enzyms mit einem entsprechenden Substrat, wobei der entstandene Farbstoff auf den Stellen des Nitrocellulosefilters niederschlägt, auf denen sich die DNA und damit das gebundene Enzym befindet.
Die Literaturstelle "Fluorometric Methods for Analysis of Acid and Alkaline Phosphatase", A. Vaughan et al., Analytical Chemistry, Vol. 43, No. 6, Mai 1971, Seiten 721 bis 724 (2), beschreibt die Analyse von saurer oder alkalischer Phosphatase mittels verschiedener Naphthol-AS-Derivate (2-Hydroxy-3- naphthoesäureanilid-Derivat-Phosphat), deren enzymatische Umsetzung mit Phosphatase einen Fluoreszenznachweis in Lösung ermöglichen. Aus dieser Literaturstelle ist ersichtlich, daß phosphatfreie Naphthol-AS-Verbindungen nach Präzipitierung nicht-fluoreszent sind.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Prüfung von Nucleinsäuren oder ähnlichen Proben anzugeben, das die Nachteile des Isotopen-Verfahrens, beispielsweise hinsichtlich der Sicherheits­ vorkehrungen, beseitigt und eine ausgezeichnete Nachweisempfindlichkeit der Probe liefert.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Prüfung von Nucleinsäuren, chemischen Verbindungen unter Verwendung von Antikörpern oder Proteinen als Probe zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Probe auf einem Nylonmembranfilter an Phosphatase bindet, die Phosphatase mit einem Naphthol-AS-Derivat-Phosphat umsetzt und das Reaktionsprodukt mit Anregungslicht bestrahlt und die emittierende Fluoreszenz nachweist, wobei das Naphthol-AS- Derivat-Phosphat durch die folgende Formel dargestellt wird
worin X eine der folgenden Formeln darstellt
Beispiele für die Phosphatase umfassen alkalische Phosphatase, saure Phosphatase etc.
Der Nachweis einer Probe umfaßt in der vorliegenden Erfindung den Nachweis von Nucleinsäure (DNA oder RNA), den Nachweis von Protein, den immunologischen Nachweis einer chemischen Verbindung unter Verwendung von Antikörpern etc.
Zur Herstellung der Naphthol-AS-Derivat-Phosphate gibt es zum Beispiel das nachstehend beschriebene Verfahren.
Das Verfahren zur Herstellung eines Naphthol-AS-Derivat-Phosphats umfaßt das Kochen von 2-Hydroxy-3-naphthoesäure, dargestellt durch:
und einem Arylamino-Derivat mit Phosphortrichlorid in Gegenwart von Toluol oder Xylol, um ein Naphthol-AS-Derivat mit der folgenden Formel zu ergeben:
(wobei X das gleiche wie in Formel (I) darstellt), und dann das Umsetzen des Naphthol-AS-Derivats mit Phosphoroxidchlorid in Pyridin.
In dem erfindungsgemäßen Prüfverfahren wird das Naphthol-AS-Derivat-Phosphat mit der oben beschriebenen Phosphatase umgesetzt, gefolgt von Bestrahlung mit Anregungslicht, wodurch das dephosphatierte Produkt des Naphthol-AS-Derivat-Phosphats Fluoreszenz emittiert. Die emittierte Fluoreszenz kann dann nachgewiesen werden.
Das oben erwähnte Naphthol-AS-Derivat-Phosphat wird zusammen mit einer Probe (z. B. Nucleinsäure) mit der Phosphatase auf einem Membranfilter aus Nylon umgesetzt, um ein dephosphatiertes Produkt des Naphthol-AS-Derivat-Phosphats zu erzeugen, das an dem Nylonmembranfilter haftet und Fluoreszenz zeigt. Dann werden die Fluoreszenz und deren Muster (durch Elektrophorese erzeugte Flecken und Banden) durch Bestrahlung mit Anregungslicht nachgewiesen.
In der vorliegenden Erfindung kann durch die Verwendung des oben beschriebenen Naphthol-AS-Derivat-Phosphats intensive Fluoreszenz erhalten werden, so daß die Nachweisempfindlichkeit verbessert werden kann; z. B. sind 10-13 g DNA nachweisbar.
In der vorliegenden Erfindung wird kein Isotop verwendet, und die Nachteile der bekannten radioaktiven Prüf­ verfahren können deshalb beseitigt werden.
Daher kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Prüfung von Proben wie Nucleinsäuren oder dergleichen angegeben werden, das eine ausgezeichnete Nachweisempfindlichkeit liefert.
Ferner kann das dephosphatierte Produkt des Naphthol-AS-Derivat-Phosphats gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit hoher Ausbeute dargestellt werden.
Beispiel 1
Zum Zwecke des Nachweises der Wirksamkeit des Naphthol-AS-Derivat-Phosphats als Sonde für Nucleinsäuren wurden ein DNA-Markierungs- und -Nachweis-Testsatz von Boehringer Mannheim und das Naphthol-AS-3,5-dimethylphenylphosphat aus dem später beschriebenen Beispiel 2 verwendet, um DNA auf einem Nylonmembranfilter nachzuweisen.
Die DNA wurde mit Digoxigenin (Dig) markiert, verdünnt und auf einen Nylonmembranfilter aufgetüpfelt. Jeder der Flecken enthielt DNA aus Hering-Spermatozoen in einer Menge von 50 ng (50×10-⁹ g) als DNA ohne Besonderheiten.
Das oben genannte Experiment wurde mit 0,08 bis 25 pg einer Dig-markierten DNA, wie in Fig. 1 gezeigt, durchgeführt. In der Figur zeigen 0 pg einen Blindversuch. Die Versuchsergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Das Bezugszeichen 1 bezeichnet einen Trägerfilter für eine Nucleinsäurenprobe und 11 bezeichnet fluoreszenzempfindliche Stellen. "+" bedeutet, daß die DNA nachgewiesen werden kann. "±" bedeutet, daß die DNA nicht eindeutig nachgewiesen werden kann. "-" bedeutet, daß die DNA nicht nachgewiesen werden kann. Aus dem Obigen ist ersichtlich, daß DNA selbst in der geringen Menge von 0,4 pg zufriedenstellend nachgewiesen werden konnte. Bei einer Menge von 0,08 pg war ein zufriedenstellender Nachweis nicht mehr möglich.
Dann wurde unter Verwendung einer geringeren Menge der oben genannten DNA ein weiteres Experiment mit 0,0156 bis 0,5 pg Dig-markierter DNA in der gleichen Art und Weise wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Versuchsergebnisse sind in Fig. 2 ähnlich wie in Fig. 1 gezeigt. Wie in Fig. 2 gezeigt, konnten mit 0,125 pg (125 fg) ein befriedigender Nachweis erzielt werden. Bei einer Menge von 0,0625 pg war der Nachweis nicht zufriedenstellend.
In dem vorigen Experiment wurde ein herkömmlicher Farbentwicklungsnachweis unter der Verwendung von Azo-Farbstoff, Fast Blue BB TM durchgeführt. Als Ergebnis dieses Nachweises enthielt der nachweisbare Fleck 0,5 pg (0,5×10⁻¹² g) der DNA.
Beispiel 2
Ein Naphthol-AS-Derivat-Phosphat der vorliegenden Erfindung wurde mit dem folgenden Verfahren hergestellt:
Gemäß der Beschreibung in "Enzyme Histochemistry" wurden 5 g (0,027 mol) 2-Hydroxy- 3-naphthoesäure, 40 ml wasserfreies Xylol und 0,023 mol 3,5-Dimethylanilin in einem 100 ml NASU-Kolben, der mit einem Graham-Kondensatorkühler versehen war, bei 80°C 10 Minuten gerührt.
Dann wurden 0,01 mol Phosphortrichlorid zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde 2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Danach wurde die Reaktionslösung in heißem Zustand dekantiert, um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Nach dem Abkühlen auf 4°C wurde die Flüssigkeit einer Filtration unterworfen. Der so erhaltene Niederschlag wurde mit Xylol und dann mit Wasser eluiert. Weiterhin wurde der Niederschlag mit 2%iger wäßriger Natriumcarbonatlösung neutralisiert, und das Xylol wurde daraus durch Kochen entfernt.
Dann wurde der Niederschlag mit 2%iger wäßriger Natriumcarbonatlösung auf pH= 9 gebracht, filtriert und gekühlt. Der so erhaltene Niederschlag wurde mit Wasser eluiert. Die Niederschläge wurden zu einer 3%igen HCl-Lösung gegeben, erhitzt, filtriert und dann gekühlt. Dann wurden die Niederschläge mit heißem Wasser gewaschen und getrocknet.
Als nächstes wurde der Niederschlag umkristallisiert, um 3-Hydroxy-2-naphthoesäure- 3′,5′-dimethylanilid zu liefern, dargestellt durch die folgende Formel:
1 g dieses Naphthol-AS-Derivats wurde in 8 ml Pyridin aufgelöst. Nach 30minütigem Rühren dieser Lösung bei 0°C wurde gleichermaßen gekühltes Phosphor(V)oxidchlorid (2,5 äq.) dazugegeben und 4 Stunden bei 0°C gerührt. Dann wurde Eis zu der Lösung gegeben, um die Reaktion zu beenden.
Das so erhaltene Reaktionsprodukt wurde auf einer Umkehrphasen-Silicagel-Säule und dann auf einer Normalphasen-Silicagel-Säule gereinigt, um 3-Hydroxy-2-naphthoesäure- 3′,5′-dimethylanilidphosphat herzustellen, dargestellt durch die folgende Formel.
Beispiele 3 bis 12
Verschiedene Naphthol-AS-Derivat-Phosphate wurden unter Verwendung der verschiedenen Anilinderivate auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 2 hergestellt.
Nachweisversuche ähnlich Beispiel 1 wurden mit jedem der Naphthol-AS-Derivat- Phosphate mit dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt, d. h. durch Auftüpfeln einer Probe der Nucleinsäuren auf den Trägerfilter.
Die oben genannten Anilinderivate und die damit erhaltenen Naphthol-AS-Derivat- Phosphate sind in Tabelle 1 angezeigt.
Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, kann eine extrem geringe Menge DNA mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden.
Die Naphthol-AS-Derivat-Phosphate, die in den Beispielen 2 bis 12 gezeigt sind, sind wie folgt:
Beispiel 2: 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-3′,5′-dimethylanilidphosphat
Beispiel 3: 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′,4′-dimethylanilidphosphat
Beispiel 4: 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-3′,4′,5′-trimethoxyanilidphosphat
Beispiel 5: 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2′,4′,6′-trimethylanilidphosphat
Tabelle 1
Tabelle 2
Versuchsbericht Vergleichsbeispiel
Auf der Basis einer Kombination der US-A 889 798 (Prüfen von DNA mittels Phosphatase-BCIP/NBT-System unter Verwendung von Nitrocellulosefilter) und "Fluorometric Methods for Analysis of Acid and Alkaline Phosphatase", A. Vaughan et al., Analytical Chemistry, Vol. 43, No. 6, Mai 1971, Seiten 721 bis 724 (2) (Prüfen von alkalischer Phosphatase in Lösungen mittels Fluoreszenz durch Substrate wie Naphthol-AS-, Naphthol-AS-BI- und Naphthol-AS-D-Phosphat) wurde DNA mittels der fluorogenen Substrate Naphthol-AS-, Naphthol-AS-BI- und Naphthol-AS-D- Phosphat auf einem Nitrocellulosefilter nachgewiesen.
Ein Flecken- bzw. "Spot"-Test wurde gemäß der in der US-A-4 889 798 beschriebenen Prozedur durchgeführt.
Ergebnisse
Flecken bzw. "Spots" waren bis zu einer Menge von 2 pg DNA deutlich erkennbar. 400 fg DNA waren nicht mehr erkennbar. Die "Spots" erschienen mit einer relativ geringen Auflösung ver­ schwommen.
Erfindungsgemäßes Beispiel
Flecken- bzw. "Spot"-Tests wurden gemäß der in der erfindungsgemäßen Prozedur unter Verwendung von Naphthol-AS- Derivats folgender Formel und Nylonmembranfilter durchgeführt.
Ergebnisse
Flecken bzw. "Spots" waren bis zu einer Menge DNA von 400 fg deutlich erkennbar. 80 fg DNA waren nicht mehr erkennbar. Die erhaltenen "Spots" waren deutlicher und hatten eine höhere Auflösung als jene aus dem vorangegangenen Vergleichsbeispiel.

Claims (1)

  1. Verfahren zur Prüfung von Nucleinsäuren, von chemischen Verbindungen unter Verwendung von Antikörpern oder von Proteinen als Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man
    die Probe auf einem Nylonmembranfilter an Phosphatase bindet;
    die Phosphatase mit einem Naphthol-AS-Derivat-Phosphat um­ setzt; und
    das Reaktionsprodukt mit Anregungslicht bestrahlt und die emittierende Fluoreszenz nachweist,
    wobei das Naphthol-AS-Derivat-Phosphat durch die folgende For­ mel dargestellt wird worin X eine der folgenden Formeln darstellt
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