DE19713086A1 - Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren oder dergleichen - Google Patents

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren oder dergleichen

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen oder dergleichen unter Verwendung eines fluoreszenten Substrates.
Auf vielen medizinischen oder biologischen Gebieten wird das Sequenzieren von Nukleinsäuren durchgeführt unter Verwendung von Nachweismethoden von Nukleinsäurefragmenten. In einem typischen, herkömmlichen Nachweis wird eine Nukleinsäuresonde mit einem radioaktiven Isotop markiert und mit einer Nukleinsäureprobe hybridisiert. Die Nukleinsäure wird dann durch Autoradiography nachgewiesen (J. Sambrook et al., Molecular Cloning 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Solche isotope bzw. radioaktive Verfahren haben jedoch Nachteile, z. B. daß das Verfahren keine ausreichend hohe dreidimensionale Auflösungskraft liefert, um die räumliche Beziehung zwischen benachbarten Genen (zwischen benachbarten Sequenzen einer Nukleinsäure) aufzudecken, und daß die Verfahren ein Isotopenlabor mit der für ein solches Labor eigenen Ausrüstung erfordert. Diese Nachteile haben die Anwendung und die weitere Entwicklung der Technologie behindert.
Um diese Nachteile zu beseitigen sind neue Markierungsverfahren für DNA oder RNA (DNS bzw. PNS) entwickelt worden, bei denen radioaktive Isotopen nicht gebraucht werden. Beispiele dieser neuen Verfahren schließen ein in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 4045 (J.J. Leary et al., 1983) beschriebenes colormetrisches Verfahren, ein in Nucleic Acids Res., 17, 5115 (S. Beck et al., 1989) beschriebenes chemilumineszentes Verfahren sowie ein in der Japanischen Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 4-91799 beschriebenes Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren oder dergleichen ein. Ein von Bethesda Research Laboratory erhältliches, kommerzielles DNA-Nachweis-Kit wendet ebenso eine nicht-radioaktive Makierungsmethode an.
Während diese Verfahren zwar einige der obigen Nachteile beseitigen, versagen sie jedoch darin, das Radioisotopen-Verfahren hinsichtlich der Nachweisempfindlichkeit zu übertreffen. Speziell ist die Nachweisempfindlichkeit der nicht-radioaktiven Verfahren leicht geringer; sie beträgt 10-14 g DNA, während 10-15 g DNA durch die radioaktive Nachweisverfahren erreicht werden.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen oder dergleichen mit einer verbesserten Empfindlichkeit bereitzustellen.
Gemäß einem Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und dergleichen bereitgestellt, umfassend die Schritte: das Binden eines Enzyms an eine Probe einer Nukleinsäure, eines Proteins oder dergleichen; das Umsetzen des Monophosphat-Esters eines Fluoresceinderivats mit dem an die Probe gebundenen Enzym; und das Bestrahlen des Hydrolysats des Fluoresceinderivat-Monophosphatesters, welches durch die Umsetzung mit dem Enzym erzeugt wurde, mit Anregungslicht, um die aus dem Hydrolysat emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
In diesem Verfahren wird das an die Probe gebundene Enzym mit dem Monophosphatester eines Fluoresceinderivats umgesetzt. Diese Enzyme-Substratreaktion bricht die Esterverknüpfung des Monophosphatesters des Fluoresceinderivat-Substrats auf, dadurch ein Hydrolysat des Monophosphatesters des Fluoresceinderivats erzeugend. Das Hydrolysat des Fluoresceinderivat-Monophosphatesters ist eine fluoreszente Substanz, welche Fluoreszenz emittiert, wenn sie mit Anregungslicht bestrahlt wird. Deshalb kann die Probe durch Detektion der von dem Hydrolysat aufgrund von Anregung emittierten Fluoreszenz nachgewiesen werden. Da die Fluoreszenz aus einer fluoreszenten Substanz stark ist, kann eine sehr geringe Menge an Substanz nachgewiesen werden. Deshalb kann das Verfahren eine sehr geringe Menge eines Enzym-Probenkomplexes nachweisen, wodurch die Nachweis­ empfindlichkeit verbessert wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt es, Nukleinsäuren, einschließlich DNA und RNA, sowie Proteine oder Protein-Nukleinsäure-Komplexe nachzuweisen.
Das Verfahren der Erfindung ist geeignet zum Nachweis einer Probe, welche in flüssiger Phase vorliegt, an einen Festphasenträger fixiert ist, in einer Zelle vorliegt, in einem Chromoson vorliegt, oder bei einer ähnlichen Probe.
Das oben beschriebene Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen oder dergleichen kann z. B. angewandt werden zur Bestimmung einer Gen-Lokalisierung, für Gen-Strukturanalysen und zum Nachweis von Virusgenen, wobei eine Sonde einer bekannten Basensequenz verwendet werden kann. Bezüglich des Proteinnachweises kann das Verfahren angewandt werden zum Studium von Virusinfektionen oder von Allergien, von klinischen Labortests und dergleichen.
Als Fluoresceinderivat-Monophosphatester von zum Umsetzen mit dem an die Probe gebundenen Enzym sind die Verbindungen mit den folgenden Formeln I-IV besonders gut geeignet.
Formel I
Formel II
Formel III
Formel IV
Das Hydrolysat des Fluoresceinderivat-Monophosphatesters, von dem im Verfahren der vorliegenden Erfindung Gebrauch gemacht wird, kann dementsprechend insbesondere eine Struktur aufweisen, wie sie durch eine der folgenden Formeln V bis VIII dargestellt wird, wodurch die Nachweisempfindlichkeit stark verbessert wird.
Formel V
Formel VI
Formel VII
Formel VIII
Das Anregungslicht zur Bestrahlung des Hydrolysats des Fluoresceinderivat-Monophosphatesters stellt eine elektromagnetische Strahlung dar, die die durch die Hydrolyse erzeugte fluoreszente Substanz anregt und die Emission von Fluoreszenz verursacht.
Die Fluoreszenz kann durch visuelle Beobachtung, einen Fluoreszenz-Spectrophotometer, eine Kamera (wie eine CCD- (charge-coupled device-) Kamera oder eine Sofortbildkamera) oder dergleichen detektiert werden.
Gemäß einem anderen Gegenstand der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und dergleichen bereitgestellt, umfassend die Schritte: das Binden eines Enzyms an eine Probe einer Nukleinsäure, eines Proteins oder dergleichen; das Umsetzen des Diphosphat-Esters eines Fluoresceinderivats mit dem an die Probe gebundenen Enzym; und das Bestrahlen des Hydrolysats des Fluoresceinderivat-Diphosphatesters, welches durch die Umsetzung mit dem Enzym erzeugt wurde, mit Anregungslicht, um die aus dem Hydrolysat emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
In diesem Verfahren wird das an die Probe gebundene Enzym mit dem Diphosphatester eines Fluoresceinderivats umgesetzt. Diese Enzyme-Substratreaktion bricht die Esterverknüpfung des Monophosphatesters des Fluoresceinderivat-Substrats auf, dadurch ein Hydrolysat des Monophosphatesters des Fluoresceinderivats erzeugend. Das Hydrolysat des Fluoresceinderivat-Diphosphatesters ist eine fluoreszente Substanz, welche Fluoreszenz emittiert, wenn sie mit Anregungslicht bestrahlt wird. Deshalb kann die Probe durch Detektion der von dem Hydrolysat aufgrund von Anregung emittierten Fluoreszenz nachgewiesen werden. Da die Fluoreszenz aus einer fluoreszenten Substanz stark ist, kann eine sehr geringe Menge an Substanz nachgewiesen werden. Deshalb kann das Verfahren eine sehr geringe Menge eines Enzym-Probenkomplexes nachweisen, wodurch die Nachweisempfindlichkeit verbessert wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt es, Nukleinsäuren, einschließlich DNA und RNA, sowie Proteine oder Protein-Nukleinsäure-Komplexe nachzuweisen.
Das Verfahren der Erfindung ist geeignet zum Nachweis einer Probe, welche in flüssiger Phase vorliegt, an einen Festphasenträger fixiert ist, in einer Zelle vorliegt, in einem Chromoson vorliegt, oder bei einer ähnlichen Probe.
Das oben beschriebene Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen oder dergleichen kann z. B. angewandt werden zur Bestimmung einer Gen-Lokalisierung, für Gen-Strukturanalysen und zum Nachweis von Virusgenen, wobei eine Sonde einer bekannten Basensequenz verwendet werden kann. Bezüglich des Proteinnachweises kann das Verfahren angewandt werden zum Studium von Virusinfektionen oder von Allergien, von klinischen Labortests und dergleichen.
Besonders geeignete Beispiele für Fluoresceinderivat-Diphosphatester, die zum Umsetzen mit dem an die Probe gebundenen Enzym eingesetzt werden, sind die Verbindungen besonders geeignet, die durch die folgenden Formeln IX bis XII dargestellt sind.
Formel IX
Formel X
Formel XI
Formel XII
Beispiele des Enzyms, welches mit dem Fluoresceinderivat reagieren soll, schließen alkalische Phosphatase, Saure Phosphatase, β-Galactosidase, Esterase, Peroxidase und Zuckerketten-spaltende Enzyme ein. Beispiele von Zuckerketten-spaltenden Enzymen schließen α-Glucosidase, β-Glucosidase, α-Glucuronidase und β-Glucuronidase ein. Diese Enzyme brechen die Esterverknüpfung des Phosphatesters des Fluoresceinderivats auf.
Das Enzym ist an die Probe zum Beispiel durch eine Methode gebunden, bei der ein an eine Probe gebundenes Hapten und ein an ein Anti-Hapten-Antikörper gebundenes Enzym durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion verbunden werden.
Beispiele für ein Hapten, welches zum Einsatz im Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist, schließen Biotin, Digoxigenin, Dinitrophenol, Trinitrophenol, Fluorescein, Tetramethyl-Rhodamin B-isothiocyanat, Rhodamin, 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl, Dansyl, Coumarin, DNA, RNA oder ein Virus ein.
Fig. 1 veranschaulicht eine mit Spots versehene Nylonmembran, die das Resultat des DNA-Nachweises durch das erste Beispiel des Nachweisverfahrens der Erfindung zeigt.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden hiernach im einzelnen unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung beschrieben.
Erste Ausführungsform
Eine erste Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und dergleichen der vorliegenden Erfindung umfaßt das Binden einer alkalischen Phosphatase an eine λ-DNA-Probe, dann das Umsetzen des Monophosphatesters eines Fluoresceinderivats mit der alkalischen Phosphatase und anschließend der Bestrahlung des Reaktionsproduktes mit Anregungslicht, um die emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
Der Monophosphatester des Fluoresceinderivats gemäß dieser Ausführungsform ist das phosphorylierte 5-(4- Biphenylcarboxamido)-3′-O-(1-naphthyl)methylfluorescein, welches durch die folgende Formel I dargestellt ist.
Ein Beispiel des DNA-Nachweisverfahrens gemäß der ersten Ausführungsform wird nachstehend beschrieben.
  • 1) Zunächst wird die Synthese des phosphorylierten 5-(4-Biphenylcarboxamido)-3′-O-(1-naphthyl)methyl­ fluorescein beschrieben, welches durch die Formel I dargestellt ist.
Zunächst werden 202 mg (1,019 mMol) 4-Phenylbenzoesäure in einen 30 ml-Kjeldahl-Kolben eingebracht, welcher dann durch eine Serumkappe (Ceptor Rubber, hergestellt von Aldrich) verschlossen wurde.
Nachdem die Luft in dem Kolben durch Argongas ersetzt wurde, wurden 2 ml entwässertes und destilliertes Dichlorethan zugegeben, und die Mischung wurde heftig unter der Argonatmosphäre gerührt.
Dann wurde eine katalytische Menge von Benzyltriethyl­ ammoniumchlorid als ein Phasentransferkatalysator zugegeben. Nachdem 81,4 µl (1,121 mMol) Thionylchlorid zugegeben wurde, wurde die Mischung erhitzt und für 3 Stunden unter Rückfluß gehalten.
Nach der Reaktion wurde der Überschuß an Thionylchlorid durch Vakuumdestillation entfernt. Die verbleibende Mischung wurde vakuumgetrocknet, wodurch 4-Biphenylcarbonylchlorid als ein erstes Zwischenprodukt mit einer Ausbeute von 80% erhalten wurde.
Als nächstes wurden 176,7 mg (0,815 mMol) des ersten Zwischenproduktes in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Nachdem die Luft im Kolben durch Argongas ersetzt wurde, wurde 1 ml entwässertes und destilliertes Aceton zugegeben, und die Mischung wurde unter der Argonatmosphäre stark gerührt.
Nachdem 283 mg (0,815 mMol) 5-Aminofluorescein zugegeben wurde, wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt, wodurch 5-(4-Biphenylcarboxy­ amido)fluorescein, d. h. ein zweites Zwischenprodukt, hergestellt wurde.
Das zweite Zwischenprodukt wurde durch eine Siliciumdioxydgel-Säulenchromatographie abgetrennt. Die Ausbeute an dem zweiten Zwischenprodukt betrug 97,2%. Die Struktur des zweiten Zwischenproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
Dann wurden 57,9 mg (0,11 mMol) an 5-(4- Biphenylcarboxyamido)fluorescein in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft in dem Kolben wurde dann durch Argon ersetzt. Unter der Argonatmosphäre wurden 400 µl entwässertes und destilliertes DMF zugegeben, und die Mischung wurde gerührt, bis es aufgelöst war.
Dann wurden 29,5 mg (0,167 mMol) von 1-(Chlormethyl)naphthalen zugegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 10 Stunden gerührt, wodurch 5-(4- Biphenylcarboxamido)-3′-O-(1-naphthyl)methylfluorescein als drittes Zwischenprodukt hergestellt wurde.
Das dritte Zwischenprodukt wurde durch Umkehrphasen- Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie abgetrennt. Die Ausbeute an dem dritten Zwischenprodukt betrug 41%. Die Struktur des dritten Zwischenprodukts wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
Danach wurden 23,1 mg (0,0346 mMol) des dritten Zwischenprodukts in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft in dem Kolben wurde dann durch Argongas ersetzt. Der Kolben wurde auf 0°C abgekühlt, und 300 µl entwässertes und destilliertes Pyridin wurden unter Argonatmosphäre zugegeben. Anschließend wurden 6,6 µl (0,0708 mMol) Phosphoroxychlorid bei 0°C zugegeben, und die Mischung wurde bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann in gekühltes destilliertes Wasser angebracht, um die Reaktion abzustoppen. Dadurch wurde phosphoryliertes 5-(4-Biphenylcarboxamido)-3′-O-(1-naphthyl)methylfluorescein als Endprodukt erhalten. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie (Solvens: Wasser/Methanol) abgetrennt.
Die Ausbeute an dem Endprodukt betrug 67%. Die Struktur des Endproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
  • 2) Der Nachweis der λ-DNA wurde durchgeführt unter Verwendung des wie oben beschrieben synthetisierten, phosphorylierten 5-(4-Biphenylcarboxamido)-3′-O-(1- naphthyl)methylfluoresceins. Die Nachweisgrenze bezüglich der Menge wurde wie unten beschrieben durch Spot-Tests bestimmt.
Zuerst wurde λ-DNA mit Digoxigenin (hiernach als "DIG" in Bezug genommen) unter Verwendung des DNA-Markierung & Detektion-Kits (Berlinger-Mannheim) markiert. Die markierte λ-DNA wurde mit Tris-Puffer (10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA) verdünnt, um DNA-Lösungen mit Konzentrationen von 0 fg (Femtogram)/µl, 5 fg/µl, 10 fg/µl, 20 fg/µl, 40 fg/µl, 80 fg/µl und 400 fg/µl herzustellen.
Für eine gleichmäßige Verteilung der markierten λ-DNA enthielt der Tris-Puffer Hering-Sperma-DNA als nicht spezifische DNA. Die Menge an Hering-Sperma-DNA wurde so eingestellt, daß 50 ng Hering-Sperma-DNA in jedem Spot auf der Nylonmembran (wie unten beschrieben) vorlagen.
Eine Nylonmembran 9 (3 cm × 7 cm, Biodyne A, 0,45 µm, Pall) wurde mit 1 µl der einzelnen DNA-Lösungen wie in Fig. 1 gezeigt bespottet, so daß die einzelnen Spots mit 0 fg, 5 fg, 10 fg, 20 fg, 40 fg, 80 fg bzw. 400 fg der λ-DNA-Proben versehen wurden. Die Spots mit 0 fg wurden als Nullproben (blank) bereitgestellt. In Fig. 1 sind die Spots der DNA-Lösungen durch die Bezugszahl 1 gekennzeichnet.
Die Nylonmembran wurde erhitzt und gehalten auf 80°C für 30 Minuten im Vakuum (während ständig Vakuum angelegt wurde). Nachdem sie in eine 0,1%ige Hautmilch-Pulverlösung für 30 Minuten eingetaucht worden war, wurde die Nylonmembran mit Anti-DIG-Fab-Fragmenten, die mit Alkalischer Phosphatase markiert waren, für 30 Minuten behandelt. Das Waschen der Nylonmembran mit einem Puffer (0,1 M Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl) für 10 Minuten wurde dreimal ausgeführt.
Dann wurden 2 ml einer Substratlösung (100 µg/ml, phosphoryliertes 5-(4-Biphenylcarboxamido)-3′-O-(1- naphthyl)methylfluorescein (synthetisches Substrat) in 100 mM Tris-Puffer, pH 8, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂) auf die Nylonmembran aufgebracht, so daß die Lösung die gesamte Oberfläche der Membran bedeckte. Die Nylonmembran wurde mit Parafilm überdeckt und in einem dunklen Raum bei 37°C für eine Stunde ruhen gelassen.
Dadurch wurde die Enzymreaktion zwischen dem synthetischen Substrat und der Phosphatase ausgeführt. Nachdem der Parafilm entfernt wurde, wurden 0,5 N NaOH auf die Nylonmembran aufgebracht, um die Reaktion zu beenden. Die Enzymreaktion hydrolisierte das durch Formel I dargestellte Substrat in ein durch Formel V dargestelltes Hydrolysat, welches auf der Nylonmembran niederschlug.
Die Nylonmembran wurde mit ultravioletten Strahlen (302 nm, 2 mW/cm²) bestrahlt, um das Reaktionsprodukt anzuregen. Die emittierte Fluoreszenz wurde durch eine CCD-Kamera (VP-1500 von SONY) empfangen und mithin für einen Ausdruck ausgegeben.
Wenn ein Spot nach UV-Bestrahlung sichtbar wurde, war damit bestimmt, daß die Fluoreszenz in dem Spot detektiert wurde. Wenn ein Spot unsichtbar blieb, wurde bestimmt, daß die Fluoreszenz in dem Spot nicht detektiert wurde.
Das Resultat bestand darin, daß die Fluoreszenz 10 in den Spots mit 5 fg oder mehr an λ-DNA, wie in Fig. 1 gezeigt, nachgewiesen wurde. Somit war das Verfahren dieses Beispiels in der Lage, 5 fg oder mehr λ-DNA nachzuweisen.
Formel V
Zweite Ausführungsform
Ein DNA-Nachweisverfahren gemäß einer zweiten Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform darin, daß in der zweiten Ausführungsform als ein Monoesterphosphat eines Fluoresceinderivats phosphoryliertes 5-(4-Biphenylcarboxamido)-3′-O-(2- naphthyl)methylfluorescein, welches durch die Formel II dargestellt ist, verwendet wurde.
Formel II
Ein Beispiel des DNA-Nachweisverfahrens gemäß der zweiten Ausführungsform wird nachstehend beschrieben.
  • 1) Zunächst wird die Synthese des durch Formel II dargestellten phosphorylierten 5-(4-Biphenylcarboxamido)- 3′-O-(2-naphthyl)methylfluorescein beschrieben.
Das zuvor bezeichnete zweite Zwischenprodukt 5-(4- Biphenylcarboxamido)fluorescein wurde auf die Art und Weise wie im Zusammenhang mit dem ersten Beispiel beschrieben synthetisiert. Dann wurden 57,9 mg (0,11 mMol) von 5-(4- Biphenylcarboxamido)fluorescein in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft innerhalb des Kolbens wurde dann durch Argon ersetzt. Unter der Argonatmosphäre wurden 400 µl entwässertes und destilliertes DMF zugegeben, und die Mischung wurde bis zur Auflösung gerührt.
Dann wurden 29,5 mg (0,167 mMol) von 2-(Chloromethyl)- naphthalen zugegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 10 Stunden gerührt, wodurch 5-(4- Biphenylcarboxamido)-3′-O-(2-naphthyl)methylfluorescein als ein drittes Zwischenprodukt hergestellt wurde.
Das dritte Zwischenprodukt wurde durch Umkehrphasen- Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie abgetrennt. Die Ausbeute des dritten Zwischenproduktes betrug 41%. Die Struktur des dritten Zwischenproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- und MS-Spektren bestätigt.
Danach wurden 23,1 mg (0,0346 mMol) des dritten Zwischenprodukts in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft in dem Kolben wurde dann durch Argongas ersetzt. Der Kolben wurde auf 0°C abgekühlt, und 300 µl entwässertes und destilliertes Pyridin wurden unter Argonatmosphäre zugegeben. Anschließend wurden 6,6 µl (0,0708 mMol) Phosphoroxychlorid bei 0°C zugegeben, und die Mischung wurde bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann in gekühltes destilliertes Wasser angebracht, um die Reaktion abzustoppen. Dadurch wurde phosphoryliertes 5-(4-Biphenylcarboxamido)-3′-O-(2-naphthyl)methylfluorescein als Endprodukt erhalten. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie (Solvens: Wasser/Methanol) abgetrennt.
Die Ausbeute an dem Endprodukt betrug 67%. Die Struktur des Endproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
  • 2) Die Nachweise der λ-DNA wurde unter Verwendung des durch Formel II dargestellten, phosphorylierten 5-(4- Biphenylcarboxamido)-3′-O-(2-naphthyl)methylfluoresceins wie in dem ersten Beispiel durchgeführt. Durch die Enzymreaktion wurde das durch Formel II dargestellte synthetische Substrat in ein durch Formel VI dargestelltes Hydrolysat hydrolisiert, welches auf einer Nylonmembran niederschlug.
Wie in dem ersten Beispiel wurde die Nylonmembran mit ultravioletten Strahlen bestrahlt, und das von dem Hydrolysat emittierte Licht wurde detektiert. Das Resultat zeigte, daß das Verfahren dieses Beispiels geeignet war, 5 fg oder mehr λ-DNA nachzuweisen.
Formel VI
Gemäß den oben beschriebenen Verfahren, welche Fluoresceinderivat-Monophosphatester, dargestellt durch die Formel I (erste Ausführungsform) bzw. II (zweite Ausführungsform) dargestellt sind, einsetzen, wird die Auflösungsfähigkeit ebenso verbessert. Dies beruht darauf, daß das Hydrolysat, welches durch die Formeln V bzw. VI der entsprechenden Fluoresceinderivat-Monophosphatester mit den Formeln I bzw. II dargestellt ist, stark auf der Nylonmembran niederschlägt.
Dritte Ausführungsform
Ein DNA-Nachweisverfahren gemäß einer dritten Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform darin, daß die dritte Ausführungsform als Monophosphatester eines Fluoresceinderivats 3′-(2,4- Dimethylbenzyloxy)-6′-hydroxy-5-(4-biphenylcarboxy­ amido)fluorescein-phosphat, dargestellt durch die Formel III, eingesetzt wird.
Formel III
Ein Beispiel des DNA-Nachweisverfahrens gemäß der dritten Ausführungsform wird nachstehend beschrieben.
  • 1) Zunächst wird die Synthese des oben bezeichneten 3′-(2,4-Dimethylbenzyloxy)-6′-hydroxy-5-(4-biphenylcarboxy­ amido)fluorescein-phosphats beschrieben.
Das zuvor bezeichnete zweite Zwischenprodukt 5-(4-Biphenylcarboxamido)fluorescein wurde auf die Art und Weise wie im Zusammenhang mit dem ersten Beispiel beschrieben synthetisiert. Dann wurden 59,0 mg (0,111 mMol) des zweiten Zwischenprodukts in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft innerhalb des Kolbens wurde dann durch Argon ersetzt. Unter der Argonatmosphäre wurden 400 µl entwässertes und destilliertes DMF zugegeben, und die Mischung wurde bis zur Auflösung gerührt. Nachdem 21,0 µl (0,144 mMol) von 2,4-Dimethylbenzylchlorid zugegeben wurden, wurde die Lösung bei Raumtemperatur für 10 Stunden gerührt, wodurch 3′-(2,4- dimethylbenzyloxy)-6′-hydroxy-5-(4- biphenylcarboxamido)fluorescein als ein drittes Zwischenprodukt hergestellt wurde. Das dritte Zwischenprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel- Säulenchromatographie abgetrennt. Die Ausbeute betrug 54%. Die Struktur des dritten Zwischenproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- und MS-Spektren bestätigt.
Danach wurden 31,9 mg (0,0494 mMol) des dritten Zwischenprodukts in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft in dem Kolben wurde dann durch Argongas ersetzt. Der Kolben wurde auf 0°C abgekühlt, und 300 µl entwässertes und destilliertes Pyridin wurden unter Argonatmosphäre zugegeben.
Anschließend wurden 7,0 µl (0,0751 mMol) Phosphoroxychlorid bei 0°C zugegeben, und die Mischung wurde bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann in gekühltes destilliertes Wasser angebracht, um die Reaktion abzustoppen.
Dadurch wurde phosphoryliertes 3′-(2,4- dimethylbenzyloxy))-6′-hydroxy-5-(4- biphenylcarboxamido)fluorescein als Endprodukt erhalten. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel- Säulenchromatographie (Solvens: Wasser/Methanol) abgetrennt. Die Ausbeute an dem Endprodukt betrug 53%. Die Struktur des Endproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
  • 2) Die Nachweise der λ-DNA wurde unter Verwendung von 3′-(2,4-dimethylbenzyloxy))-6′-hydroxy-5-(4- biphenylcarboxamido)fluorescein wie in dem ersten Beispiel durchgeführt. Durch die Enzymreaktion wurde das durch Formel III dargestellte synthetische Substrat in ein durch Formel VII dargestelltes Hydrolysat hydrolisiert, welches auf einer Nylonmembran niederschlug.
Wie in dem ersten Beispiel wurde die Nylonmembran mit ultravioletten Strahlen bestrahlt, und das von dem Hydrolysat emittierte Licht wurde detektiert. Das Resultat zeigte, daß das Verfahren dieses Beispiels geeignet war, 5 fg oder mehr λ-DNA nachzuweisen.
Formel VII
Vierte Ausführungsform
Ein DNA-Nachweisverfahren gemäß einer vierten Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten Ausführungsform darin, daß die vierte Ausführungsform als Monophosphatester eines Fluoresceinderivats 3′-(3,4- Dimethylbenzyloxy)-6′-hydroxy-5-(4-biphenylcarboxy­ amido)fluorescein-phosphat, dargestellt durch die Formel IV, eingesetzt wird.
Formel IV
Ein Beispiel des DNA-Nachweisverfahrens gemäß der vierten Ausführungsform wird nachstehend beschrieben.
  • 1) Zunächst wird die Synthese des oben bezeichneten 3′-(3,4-Dimethylbenzyloxy)-6′-hydroxy-5-(4-biphenylcarboxy­ amido)fluorescein-phosphats beschrieben.
Das zuvor bezeichnete zweite Zwischenprodukt 5-(4- Biphenylcarboxamido)fluorescein wurde auf die Art und Weise wie im Zusammenhang mit dem ersten Beispiel beschrieben synthetisiert. Dann wurden 41,0 mg (0,0777 mMol) des 5-(4- Biphenylcarboxamido)fluoresceins in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft innerhalb des Kolbens wurde dann durch Argon ersetzt. Unter der Argonatmosphäre wurden 400 µl entwässertes und destilliertes DMF zugegeben, und die Mischung wurde bis zur Auflösung gerührt.
Dann wurden 20,0 µl (0,137 mMol) von 2,4- Dimethylbenzylchlorid zugegeben, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 10 Stunden gerührt, wodurch 3′-(3,4- dimethylbenzyloxy)-6′-hydroxy-5-(4- biphenylcarboxamido)fluorescein als ein drittes Zwischenprodukt hergestellt wurde. Das dritte Zwischenprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel- Säulenchromatographie abgetrennt. Die Ausbeute an dem dritten Zwischenprodukt betrug 64%. Die Struktur des dritten Zwischenproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- und MS-Spektren bestätigt.
Danach wurden 17,3 mg (0,0268 mMol) des dritten Zwischenprodukts in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft in dem Kolben wurde dann durch Argongas ersetzt. Der Kolben wurde auf 0°C abgekühlt, und 300 µl entwässertes und destilliertes Pyridin wurden unter Argonatmosphäre zugegeben. Anschließend wurden 5,0 µl (0,0536 mMol) Phosphoroxychlorid bei 0°C zugegeben, und die Mischung wurde bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann in gekühltes destilliertes Wasser angebracht, um die Reaktion abzustoppen. Dadurch wurde 3′-(3,4- dimethylbenzyloxy))-6′-hydroxy-5-(4-biphenylcarboxamido)- fluorescein-phosphat als Endprodukt erhalten. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel- Säulenchromatographie (Solvens: Wasser/Methanol) abgetrennt.
Die Ausbeute an dem Endprodukt betrug 76%. Die Struktur des Endproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
  • 2) Die Nachweise der λ-DNA wurde unter Verwendung von 3′-(3,4-dimethylbenzyloxy))-6′-hydroxy-5-(4- biphenylcarboxamido)fluorescein-phosphat wie in dem ersten Beispiel durchgeführt. Durch die Enzymreaktion wurde das durch Formel IV dargestellte synthetische Substrat in ein durch Formel VIII dargestelltes Hydrolysat hydrolisiert, welches auf einer Nylonmembran niederschlug.
Wie in dem ersten Beispiel wurde die Nylonmembran mit ultravioletten Strahlen bestrahlt, und das von dem Hydrolysat emittierte Licht wurde detektiert. Das Resultat zeigte, daß das Verfahren dieses Beispiels geeignet war, 5 fg oder mehr λ-DNA nachzuweisen.
Formel VIII
Fünfte Ausführungsform
Ein DNA-Nachweisverfahren gemäß einer fünften Ausführungsform der Erfindung wird beschrieben. Diese Ausführungsform unterscheidet sich von den ersten bis vierten Ausführungsformen darin, daß die fünfte Ausführungsform ein Fluoresceinderivat-Diphosphatester als ein Phosphatester eines Fluoresceinderivats zur Umsetzung mit einem Enzym eingesetzt wird. Der Fluoresceinderivat- Diphosphatester gemäß der fünften Ausführungsform ist das durch die Formel IX dargestellte 3′,6′-dihydroxy-5-(2- methylphenyl)thioureidofluorescein-diphosphat.
Formel IX
Ein Beispiel des DNA-Nachweisverfahrens gemäß der fünften Ausführungsform wird nachstehend beschrieben.
  • 1) Zunächst wird die Synthese des 3′,6′-dihydroxy-5- (2-methylphenyl)thioureidofluorescein-diphosphats beschrieben.
Zunächst wurden 55 mg (0,14 mMol) Fluoresceinisocyanat in einen 10 ml-Kjeldahl-Kolben eingebracht, welcher dann durch eine Serumkappe verschlossen wurde. Nachdem die Luft in dem Kolben durch Argongas ersetzt wurde, wurden 300 µl entwässertes und destilliertes Ethanol zugegeben, und die Mischung wurde heftig unter der Argonatmosphäre gerührt, wodurch eine Fluoresceinisocyanat-Lösung erhalten wurde.
Als nächstes wurden 15,7 µl (0,15 mMol) 2-Methylanilin in 100 µl entwässertes und destilliertes Ethanol aufgelöst, um eine 2-Methylanilin-Lösung zu erhalten. Die 2-Methylanilin-Lösung wurde zu der Fluoresceinisocyanat-Lösung in dem Kjeldahl-Kolben zugegeben.
Die Lösung in dem Kjeldahl-Kolben wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt, wodurch 3′,6′-dihydroxy-5-(2- methylphenyl)thioureidofluorescein als ein erstes Zwischenprodukt erhalten wurde.
Das erste Zwischenprodukt wurde durch Siliciumdioxydgel- Säulenchromatographie abgetrennt. Die Ausbeute an dem ersten Zwischenprodukt betrug 90%. Die Struktur des ersten Zwischenproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
Dann wurden 55,6 mg (0,11 mMol) des ersten Zwischenproduktes in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft im Kolben wurde durch Argongas ersetzt. Der Kolben wurde auf 0°C abgekühlt, und 250 µl entwässertes und destilliertes Pyridin wurde unter der Argonatmosphäre zugegeben. Anschließend wurden 31,3 µl (0,34 mMol) Phosphoroxychlorid zugegeben, und die Mischung wurde bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann in gekühltes destilliertes Wasser angebracht, um die Reaktion abzustoppen. Dadurch wurde als Endprodukt 3′,6′- dihydroxy-5-(2-methylphenyl)thioureidofluorescein­ diphosphat erhalten. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie (Solvens: Wasser/Methanol) abgetrennt. Die Ausbeute an dem Endprodukt betrug 89%. Die Struktur des Endproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
  • 2) Der Nachweis der λ-DNA wurde unter Verwendung von 3′,6′-dihydroxy-5-(2-methylphenyl)thioureidofluorescein­ diphosphat wie in dem ersten Beispiel durchgeführt. Durch die Enzymreaktion wurde das durch Formel IX dargestellte synthetische Substrat in ein Hydrolysat hydrolisiert, welches auf einer Nylonmembran niederschlug.
Wie in dem ersten Beispiel wurde die Nylonmembran mit ultravioletten Strahlen bestrahlt, und das von dem Hydrolysat emittierte Licht wurde detektiert. Das Resultat zeigte, daß das Verfahren dieses Beispiels geeignet war, 80 fg oder mehr λ-DNA nachzuweisen.
Sechste Ausführungsform
Ein DNA-Nachweisverfahren gemäß einer sechsten Ausführungsform unterscheidet sich von der fünften Ausführungsform darin, daß die sechste Ausführungsform als Diphosphatester eines Fluoresceinderivats 3′,6′-dihydroxy- 5-(3,5-dimethylphenyl)thioureidofluorescein-diphosphat, dargestellt durch die Formel X, eingesetzt wird.
Formel X
Ein Beispiel des DNA-Nachweisverfahrens gemäß der sechsten Ausführungsform wird nachstehend beschrieben.
  • 1) Zunächst wird die Synthese des 3′,6′-dihydroxy-5- (3,5-dimethylphenyl)thioureidofluorescein-diphosphats beschrieben.
Zunächst wurden 100 mg (0,26 mMol) Fluoresceinisocyanat in einen 10 ml-Kjeldahl-Kolben eingebracht, welcher dann durch eine Serumkappe verschlossen wurde. Nachdem die Luft in dem Kolben durch Argongas ersetzt wurde, wurden 300 µl entwässertes und destilliertes Ethanol zugegeben, und die Mischung wurde heftig unter der Argonatmosphäre gerührt, wodurch eine Fluoresceinisocyanat-Lösung erhalten wurde.
Als nächstes wurden 32,3 Htl (0,26 mMol) 2-Dimethylanilin in 100 µl entwässertem und destilliertem Ethanol aufgelöst, um eine 3,5-Dimethylanilin-Lösung zu erhalten. Die 3,5-Dimethylanilin-Lösung wurde zu der Fluoresceinisocyanat-Lösung in dem Kjeldahl-Kolben zugegeben.
Die Lösung in dem Kjeldahl-Kolben wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt, wodurch 3′,6′- dihydroxy-5-(3,5-dimethylphenyl)thioureidofluorescein als ein erstes Zwischenprodukt erhalten wurde. Das erste Zwischenprodukt wurde durch Siliciumdioxydgel- Säulenchromatographie abgetrennt. Die Ausbeute an dem ersten Zwischenprodukt betrug 91%. Die Struktur des ersten Zwischenproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
Dann wurden 50 mg (0,1 mMol) des ersten Zwischenproduktes in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft im Kolben wurde durch Argongas ersetzt. Der Kolben wurde auf 0°C abgekühlt, und 250 µl entwässertes und destilliertes Pyridin wurde unter der Argonatmosphäre zugegeben. Anschließend wurden 18,6 µl (0,2 mMol) Phosphoroxychlorid zugegeben, und die Mischung wurde bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann in gekühltes destilliertes Wasser angebracht, um die Reaktion abzustoppen. Dadurch wurde als Endprodukt 3′,6′- dihydroxy-5-(3,5-dimethylphenyl)thioureidofluorescein­ diphosphat erhalten. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie (Solvens: Wasser/Methanol) abgetrennt. Die Ausbeute an dem Endprodukt betrug 90%. Die Struktur des Endproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
  • 2) Der Nachweis der λ-DNA wurde unter Verwendung von 3′,6′-dihydroxy-5-(3,5-dimethylphenyl)thioureido­ fluorescein-diphosphat wie in dem ersten Beispiel durchgeführt. Durch die Enzymreaktion wurde das durch Formel X dargestellte synthetische Substrat in ein Hydrolysat hydrolisiert, welches auf einer Nylonmembran niederschlug.
Wie in dem ersten Beispiel wurde die Nylonmembran mit ultravioletten Strahlen bestrahlt, und das von dem Hydrolysat emittierte Licht wurde detektiert. Das Resultat zeigte, daß das Verfahren dieses Beispiels geeignet war, 20 fg oder mehr λ-DNA nachzuweisen.
Siebte Ausführungsform
Ein DNA-Nachweisverfahren gemäß einer siebten Ausführungsform unterscheidet sich von der fünften Ausführungsform darin, daß die siebte Ausführungsform als Diphosphatester eines Fluoresceinderivats 3′,6′-dihydroxy- 5-(2-biphenylcarboxyamido)fluorescein-diphosphat, dargestellt durch die Formel XI, eingesetzt wird.
Formel XI
Ein Beispiel des DNA-Nachweisverfahrens gemäß der siebten Ausführungsform wird nachstehend beschrieben.
  • 1) Zunächst wird die Synthese des 3′,6′-dihydroxy-N- (2-biphenylcarbonyl)-5-aminofluorescein-diphosphats beschrieben.
Zunächst werden 202 mg (1,019 mMol) 2-Phenylbenzoesäure in einen 30 ml-Kjeldahl-Kolben eingebracht, welcher dann durch eine Serumkappe verschlossen wurde. Nachdem die Luft in dem Kolben durch Argongas ersetzt wurde, wurden 2 ml entwässertes und destilliertes Dichlorethan zugegeben, und die Mischung wurde heftig unter der Argonatmosphäre gerührt.
Dann wurde eine katalytische Menge von Benzyltriethyl­ ammoniumchlorid als ein Phasentransferkatalysator zugegeben. Nachdem 81,4 µl (1,121 mMol) Thionylchlorid zugegeben wurde, wurde die Mischung erhitzt und für 3 Stunden unter Rückfluß gehalten. Nach der Reaktion wurde der Überschuß an Thionylchlorid durch Vakuumdestillation entfernt. Die verbleibende Mischung wurde vakuumgetrocknet, wodurch 2-Biphenylcarbonylchlorid als ein erstes Zwischenprodukt mit einer Ausbeute von 80% erhalten wurde.
Als nächstes wurden 176,7 mg (0,815 mMol) des ersten Zwischenproduktes in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Nachdem die Luft im Kolben durch Argongas ersetzt wurde, wurde 1 ml entwässertes und destilliertes Aceton zugegeben, und die Mischung wurde unter der Argonatmosphäre stark gerührt.
Nachdem 283 mg (0,815 mMol) 5-Aminofluorescein zugegeben wurde, wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt, wodurch N-(2-Biphenylcarbonyl)-5- aminofluorescein als ein zweites Zwischenprodukt hergestellt wurde. Das zweite Zwischenprodukt wurde durch eine Siliciumdioxydgel-Säulenchromatographie abgetrennt. Die Ausbeute an dem zweiten Zwischenprodukt betrug 95%. Die Struktur des zweiten Zwischenproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
Dann wurden 13 mg (0,024 mMol) des zweiten Zwischenprodukts in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft in dem Kolben wurde dann durch Argon ersetzt.
Der Kolben wurde auf 0°C abgekühlt, und 100 µl entwässertes und destilliertes Pyridin wurden unter Argonatmosphäre zugegeben. Anschließend wurden 6,6 µl (0,07 mMol) Phosphoroxychlorid zugegeben, und die Mischung wurde bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann in gekühltes destilliertes Wasser angebracht, um die Reaktion abzustoppen. Dadurch wurde 3′,6′-dihydroxy-N-(2- biphenylcarbonyl)-5-aminofluorescein-diphosphat als Endprodukt erhalten. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie (Solvens: Wasser/Methanol) abgetrennt. Die Ausbeute an dem Endprodukt betrug 80%. Die Struktur des Endproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
  • 2) Der Nachweis der λ-DNA wurde unter Verwendung von 3′,6′-dihydroxy-N-(2-biphenylcarbonyl)-5-aminofluorescein­ diphosphat wie in dem ersten Beispiel durchgeführt. Durch die Enzymreaktion wurde das durch Formel XI dargestellte synthetische Substrat in ein Hydrolysat hydrolisiert, welches auf einer Nylonmembran niederschlug.
Wie in dem ersten Beispiel wurde die Nylonmembran mit ultravioletten Strahlen bestrahlt, und das von dem Hydrolysat emittierte Licht wurde detektiert. Das Resultat zeigte, daß das Verfahren dieses Beispiels geeignet war, 20 fg oder mehr λ-DNA nachzuweisen.
Achte Ausführungsform
Ein DNA-Nachweisverfahren gemäß einer achten Ausführungsform unterscheidet sich von der fünften Ausführungsform darin, daß die achte Ausführungsform als Diphosphatester eines Fluoresceinderivats 3′,6′-Dihydroxy- N-(4-biphenylcarbonyl)-5-aminofluorescein-diphosphat, dargestellt durch die Formel XII, eingesetzt wird.
Formel XII
Ein Beispiel des DNA-Nachweisverfahrens gemäß der dritten Ausführungsform wird nachstehend beschrieben.
  • 1) Zunächst wird die Synthese des 3′,6′-Dihydroxy-5- (4-biphenylcarboxyamido)fluorescein-diphosphats beschrieben.
Zunächst werden 202 mg (1,019 mMol) 4-Phenylbenzoesäure in einen 30 ml-Kjeldahl-Kolben eingebracht, welcher dann durch eine Serumkappe verschlossen wurde. Nachdem die Luft in dem Kolben durch Argongas ersetzt wurde, wurden 2 ml entwässertes und destilliertes Dichlorethan zugegeben, und die Mischung wurde heftig unter der Argonatmosphäre gerührt.
Dann wurde eine katalytische Menge (300 µg) von Benzyltriethylammoniumchlorid als ein Phasentransferkatalysator zugegeben. Nachdem 81,4 µl (1,121 mMol) Thionylchlorid zugegeben wurde, wurde die Mischung erhitzt und für 3 Stunden unter Rückfluß gehalten. Nach der Reaktion wurde der Überschuß an Thionylchlorid durch Vakuumdestillation entfernt. Die verbleibende Mischung wurde vakuumgetrocknet, wodurch 4-Biphenylcarbonylchlorid als ein erstes Zwischenprodukt mit einer Ausbeute von 80% erhalten wurde.
Als nächstes wurden 176,7 mg (0,815 mMol) des ersten Zwischenproduktes in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Nachdem die Luft im Kolben durch Argongas ersetzt wurde, wurde 1 ml entwässertes und destilliertes Aceton zugegeben, und die Mischung wurde unter der Argonatmosphäre stark gerührt.
Nachdem 283 mg (0,815 mMol) 5-Aminofluorescein zugegeben wurde, wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 12 Stunden gerührt, wodurch N-(4-Biphenylcarbonyl)-5- aminofluorescein als ein zweites Zwischenprodukt hergestellt wurde. Das zweite Zwischenprodukt wurde durch eine Siliciumdioxydgel-Säulenchromatographie abgetrennt. Die Ausbeute an dem zweiten Zwischenprodukt betrug 98%. Die Struktur des zweiten Zwischenproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
Dann wurden 50 mg (0,095 mMol) des zweiten Zwischenprodukts in einen 10 ml-Kjeldahlkolben eingebracht, welcher dann mit einer Serumkappe verschlossen wurde. Die Luft in dem Kolben wurde dann durch Argon ersetzt. Der Kolben wurde auf 0°C abgekühlt, und 250 µl entwässertes und destilliertes Pyridin wurden unter Argonatmosphäre zugegeben. Anschließend wurden 26,6 µl (0,29 mMol) Phosphoroxychlorid zugegeben, und die Mischung wurde bei 0°C für eine Stunde gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann in gekühltes destilliertes Wasser angebracht, um die Reaktion abzustoppen. Dadurch wurde 3′,6′-Dihydroxy-N- (4-biphenylcarbonyl)-5-aminofluorescein-diphosphat als Endprodukt erhalten. Das Endprodukt wurde durch Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie (Solvens: Wasser/Methanol) abgetrennt. Die Ausbeute an dem Endprodukt betrug 85%. Die Struktur des Endproduktes wurde durch ¹H-NMR-, IR- sowie MS-Spektren bestätigt.
  • 2) Der Nachweis der λ-DNA wurde unter Verwendung von 3′,6′-Dihydroxy-N-(4-biphenylcarbonyl)-5-aminofluorescein­ diphosphat wie in dem ersten Beispiel durchgeführt. Durch die Enzymreaktion wurde das durch Formel XII dargestellte synthetische Substrat in ein Hydrolysat hydrolisiert, welches auf einer Nylonmembran niederschlug.
Wie in dem ersten Beispiel wurde die Nylonmembran mit ultravioletten Strahlen bestrahlt, und das von dem Hydrolysat emittierte Licht wurde detektiert. Das Resultat zeigte, daß das Verfahren dieses Beispiels geeignet war, 20 fg oder mehr λ-DNA nachzuweisen.
Der DNA-Nachweis unter dem Einsatz des ersten bis achten Beispiels sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt. In der Tabelle 1 zeigt "+" an, daß λ-DNA nachgewiesen wurde, und "-" zeigt an, daß λ-DNA nicht nachgewiesen wurde. Zusätzlich zeigen "F1" bis "F4" sowie "F9" bis "F12" die Fluoresceinderivat-Phosphatester an, die in den Beispielen, entsprechend den Formel I bis IV bzw. XI bis XII, verwendet wurden, und "F5" bis "F8" zeigen die Hydrolysate der Fluoresceinderivat-phosphatester an, die den jeweiligen Formeln V bis VIII entsprechen.
Tabelle 1 zeigt, daß die Ausführungsformen des Verfahrens zum Nachweis von Nukleinsäuren (oder dergleichen) der Erfindung in der Lage sind, so kleine Mengen an λ-DNA von 5 bis 400 fg nachzuweisen.
Tabelle 1
Wie sich aus der obigen Beschreibung ergibt, reagiert in jeder der ersten bis vierten Ausführungsformen einer der Fluoresceinderivat-Monophosphatester, dargestellt durch die Formeln I bis IV, mit dem an die Probe gebundenen Enzym, und das durch die Enzymreaktion erzeugte Hydrolysat des Fluoresceinderivat-Monophosphatesters wird mit Anregungslicht bestrahlt, um die von dem Hydrolysat emittierte Fluoreszenz zu detektieren. Somit sind die Ausführungsformen in der Lage, Nukleinsäuren oder dergleichen mit hohen Nachweisempfindlichkeiten nachzuweisen.
Zusätzlich werden in jedem der fünften bis achten Ausführungsform Fluoresceinderivat-Diphosphatester, dargestellt durch die Formeln IX bis XII, mit dem an eine Probe gebundenen Enzym umgesetzt, und das durch die Enzymreaktion erzeugte Hydrolysat des Fluoresceinderivat-Diphosphatesters wird mit Anregungslicht bestrahlt, um die von dem Hydrolysat emittierte Fluoreszenz zu detektieren. Somit sind die Ausführungsformen in der Lage, Nukleinsäuren oder dergleichen mit hoher Nachweisempfindlichkeit nachzuweisen.
Während die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf das beschrieben worden ist, was als deren bevorzugte Ausführungsformen angesehen wurde, sollte klar sein, daß die Erfindung nicht auf die offenbarten Ausführungsformen bzw. Beispiele beschränkt ist. Im Gegensatz dazu soll die Erfindung ebenfalls verschiedene Modifikationen und äquivalente Ausgestaltungen umfassen, die von dem Umfang der beigefügten Ansprüche abgedeckt sind.
Die vollständige Offenbarung der Japanischen Patentanmeldungs-Nr. "Hei" 08-074815, eingereicht am 28. März 1996, einschließlich der Spezifikation, der Zeichnungen und der Zusammenfassung, soll hier vollständig durch Bezugnahme als Offenbarung eingeschlossen werden.

Claims (5)

1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und dergleichen, umfassend die Schritte:
das Binden eines Enzyms an eine Probe einer Nukleinsäure, eines Proteins oder dergleichen;
das Umsetzen des Monophosphatesters eines Fluoresceinderivats mit dem an die Probe gebundenen Enzym; und
das Bestrahlen des Hydrolysats des Fluoresceinderivat-Monophosphatesters, welches durch die Reaktion mit dem Enzym erzeugt wurde, mit Anregungslicht, um die aus dem Hydrolysat emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Monophosphatester des Fluoresceinderivats eine durch eine der folgenden Formeln I bis IV dargestellte Struktur aufweist:
Formel I
Formel II Formel III Formel IV
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysat des Fluoresceinderivat-Monophosphatesters eine gemäß einem der Formeln V bis VIII dargestellte Struktur aufweist:
Formel V
Formel VI Formel VII Formel VIII
4. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und dergleichen, umfassend die Schritte:
das Binden eines Enzyms an eine Probe Nukleinsäure, Protein oder dergleichen;
das Umsetzen eines Diphosphatesters eines Fluoresceinderivats mit dem an die Probe gebundenen Enzym; und
das Bestrahlen des durch die Reaktion mit dem Enzym erzeugten Hydrolysats des Fluoresceinderivat-Diphosphatesters mit Anregungslicht, um die aus dem Hydrolysat emittierte Fluoreszenz zu detektieren.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Diphosphatester des Fluoresceinderivats eine durch eine der folgenden Formeln IX bis XII dargestellte Struktur aufweist.
Formel IX
Formel X Formel XI Formel XII
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