ES2297402T3 - Substratos fluorescentes que permiten detectar una actividad de la enzima organofosfatasa. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula II: en la que: R11-R14 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C1-C6, cicloalquilo de C5-C8, haloalquilo de C1-C6, , perfluoroalquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, y alquinilo de C2-C6, y arilo, arilcarbonilo y heteroarilo, que pueden estar sustituidos opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, ciano, nitro, halo, amino, amido, azido, acetal, cetal, imido, sulfo, sulfonilo, sulfinilo, tiocianato, aldehído, ceto, carbamoílo, uretano, ureido y guanidino; X4-X9 son independientemente O ó S; n y m son 0 ó 1, pero m y n no pueden ser 0 simultáneamente; y R15-R24 pueden ser H o cualquier sustituyente, siempre y cuando el compuesto de fórmula II tras la hidrólisis proporcione un compuesto fluorescente.

Description

Substratos fluorescentes que permiten detectar una actividad de la enzima organofosfatasa.

Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas

La presente solicitud reivindica beneficio de las solicitudes de patente provisionales EE.UU. Nº 60/463.317, registrada el 17 de abril de 2003, y 60/487.935 registrada el 18 de julio de 2003, cuyas descripciones se incorporan en el presente documento como referencia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a determinados sustratos fluorescentes y a un método para detectar la actividad de órganofosfatasa, en general, y la actividad de paraoxonasa específicamente y, en particular, en fluidos biológicos como la sangre y el suero, a través del uso de sustratos fluorescentes.

Antecedentes de la invención

La degradación enzimática de órganofosfatos ((OPs) es realizada por enzimas especializadas incluyendo, entre los que se incluyen organofosforo hidrolasa bacteriana (OPH) y paraoxonasa de mamífero. Paraoxonasa, denominada también arilesterasa (EC 3.1.1.2), es una éster hidrolasa dependiente de calcio de peso molecular de 43 kDa que cataliza la hidrólisis de una amplia gama de ésteres, como por ejemplo OPs, y ésteres carboxílicos aromáticos y alifáticos insaturados. Su nombre se deriva de la capacidad de esta proteína de hidrolizar paraoxon, el metabolito tóxico del insecticida paratión. Además de paraoxon, paraoxonasa es capaz de destoxificar otros insecticidas diversos, v.g., diazonina, así como los potentes gases nerviosos sarina y soman que tienen como diana acetilcolinosterasa (AchE). La familia genética paraoxonasa (PON) consiste en al menos tres miembros: PON1, PON2 y PON3, que están localizados en el cromosoma 7q21.3-22.1 humano. No se ha detectado ninguna expresión endógena significativa de los genes PON2 y PON3. Sobre todo tiene lugar la expresión de PON1 en el hígado humano; desde ahí, se secreta la proteína hacia la sangre donde circula asociada con partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL). Paraoxonasa tiene la propiedad extraordinaria de que la proteína madura retiene su péptido de señal N-terminal hidrófobo, que se utiliza como ancla para la asociación con HDL. La enzima tiene tres sitios unidos a N potenciales y el carbohidrato da cuenta de aproximadamente el 16% de su masa molecular.

Existe una importante variación en la actividad de paraoxonasa en la población humana, como resultado del polimorfismo del promotor de PON1 que lleva a diferentes niveles de expresión, así como el polimorfo en la secuencia genética que lleva a formas de proteína de alelo con diferentes actividades específicas. Ambos tipos de polimorfismos son bastante comunes entre la población humana y generan una gama de actividad en suero de paraoxonasa en la población. La masa molecular aparente de paraoxonasa en suero varia según el resultado de la glucosilación heterogénea.

No se ha identificado todavía ni la función ni el (los) sustrato(s) naturales para paraoxonasa. Un sustrato posible es lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL) [1-3]. Se ha demostrado que paraoxonasa previene la formación de LDL oxidada e hidroliza los fosfolípidos oxidados derivados de LDL. Dado que la acumulación de LDL oxidada es uno de los factores clave en el desarrollo de aterosclerosis, la actividad de paraoxonasa puede corresponderse con el desarrollo de esta enfermedad. Por ejemplo, Shin y cols., han demostrado que ratones PON1 eran enormemente sensibles a la aterosclerosis inducida por la dieta en comparación con los ratones de tipo silvestre. Dado que existe una significativa variación en la actividad de paraoxonasa entre la población, la evaluación de los niveles de paraoxonasa de individuos puede tener un importante valor de diagnóstico, al predecir la posibilidad, desarrollo y pronóstico de aterosclerosis.

Otro posible sustrato natural es lipopolisacárido (LPS) o mediadores de shock séptico. Se ha demostrado que la proteína de alta densidad (HDL) puede inactivar LPS [4]. Por otra parte, la inyección intraperitoneal de ratones antes y hasta 2 horas después de la administración de LPS proporcionó protección contra shock séptico [5]. Asimismo, los ratones en los que se ha abatido (knockout) PON-1 son extremadamente sensibles a LPS [6].

La paraoxonasa es capaz de hidrolizar una serie de toxinas OP in vitro y la capacidad de paraoxonasa para proteger animales de entoxicamiento de OP agudo ha sido estudiado ampliamente. La inyección de paraoxonasa purificada protegió a los animales contra toxicidad por OP [7,8]. Otra prueba más de la capacidad de paraoxonasa de proteger a los animales se ha obtenido a partir de los estudios sobre ratones "knockout" PON1. La destrucción del gen PON1 a través de tecnología del knockout crea ratones que carecen de paraoxonasa. En comparación con sus contrapartidas cría de tipo silvestre, los ratones PON1 deficientes fueron enormemente sensibles a los efectos tóxicos de clorpirifos, un OP. Por consiguiente, el seguimiento de la actividad de paraoxonasa puede ayudar a evaluar la capacidad de una persona para soportar la entoxicación de OP asociada con el desarrollo de armas químicas.

En consecuencia, se puede utilizar el seguimiento de los niveles en sangre de paraoxonasa para identificar una predisposición a aterosclerosis, sepsis y entoxicación por OP. No obstante, la ausencia de una prueba sólida para la detección de los niveles de paraoxonasa en la sangre ha retrasado significativamente el avance del estudio del valor diagnóstico de paraoxonasa. Existen dos opcionales principales para la detección de esta actividad de enzima. La primera es un cambio en la densidad óptica y la segunda es la generación de un producto fluorescente.

Actualmente, los sustratos para paraoxonasa más comunes utilizados en la investigación son paraoxon y acetato de fenilo. La hidrólisis de paraoxon catalizada por paraoxonasa conduce a la liberación de nitrofenol, que se puede detectar llevando un seguimiento de la absorción a 405 nm. Esta reacción se utiliza para medir la actividad de paraoxonasa en la investigación clínica y fundamental. Las principales desventajas de este sustrato son la baja Vmax de hidrólisis, que tiene como resultado una sensibilidad relativamente baja y que, como consecuencia de su toxicidad, el paraoxon requiere condiciones de manejo especiales. La actividad arilestearasa de paraoxonasa se mide normalmente a través de la hidrólisis de acetato de fenilo. Esta reacción tiene una Vmax mucho más alta que la Vmax de hidrólisis de paraoxon; no obstante, el acetato de fenilo se hidroliza también a través de una serie de otras esterasas en extractos celulares y las muestras de suero, lo que disminuye significativamente la especificidad de detección. Por otra parte, la detección de hidrólisis de acetato de fenilo se basa en el seguimiento de la absorción a 270 nm lo que hace la detección de paraoxonasa difícil, o imposible, en soluciones ricas en proteínas o en extractos que contienen detergentes como Triton X-100. Por otra parte, See (Bioorganic & Medicina. Chemistry Letters (1999) 9, 1395-1396) describe difosfato de fluoresceína como un sustarto hidrolizado mediante fosfatasa ácida.

El gen OPH se encontró originalmente en dos microorganismos del suelo. Pseudomonas diminuta y Flavobacterium sp. Se ha sugerido que esta enzima ha evolucionado recientemente en estas bacterias como respuesta a la contaminación del suelo industrial con compuestos de órganofosfato. Al igual que paraoxonasa, OPH cataliza una amplia gama de ésteres de órganofosfato incluyendo sarina y VX. Debido a esta actividad, estos organismos pueden tener una utilidad adicional en la descontaminación de OPs del entorno. En este contexto, sería necesario un ensayo sensible y sólido para confirmar la expresión de OPH en presencia de un gran exceso de actividad de fosfatasa. Por lo tanto, es necesario que el sustrato tenga una afinidad para fosfatasas muy reducida o que no tenga afinidad con fosfatasas.

Todo esto demuestra que existe la necesidad de detectar la actividad de organofosfatasa incluyendo paraoxonasa con una alta especificidad y sensibilidad. Existe la necesidad de contar con sustratos con una alta especificidad para OPH y paraoxonasa. Las ventajas de la presente invención, así como las características de la presente invención, se pondrán de manifiesto a partir de la descripción detallada de los modos de realización de la invención.

Breve compendio de la invención

Todas las necesidades que se han mencionado han sido satisfechas en gran medida. La presente invención proporciona sustratos fluorescentes altamente sensibles y específicos.

De acuerdo con otro modo de realización, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula II:

1

en el que R^{11}-R^{14} se seleccionan del grupo que consiste en H y grupos o átomos distintos a H; X^{4}-X^{9} son independientemente O ó S. n y m son 0 ó 1, pero m y n no pueden ser 0 simultáneamente. R^{15}-R^{24} pueden ser H o cualquier sustituyente siempre y cuando el compuesto de fórmula II tras la hidrólisis proporcione un compuesto fluorescente.

La presente invención proporciona también un método para detectar y/o medir las organofosfatasas y en particular la actividad de paraoxonasa en un fluido que comprende el contacto del fluido con un sustrato fluorescente y la medida de la fluorescencia del producto fluorescente formado.

Los sustratos fluorescentes de la presente invención son específicos para las organofosfatasas, incluyendo la paraoxonasa y, cuando se hidrolizan, liberan productos altamente fluorescentes que se pueden medir, por ejemplo, a una longitud de onda de emisión de 460 nm seguido de la excitación a una longitud de onda de 355 nm para estructuras basadas en la estructura de cumarina y la emisión de 520 nm seguido de la excitación a 488 nm para estructuras a base de fluoresceína. En comparación con los otros sustratos utilizados para la detección de paraoxonasa, estos tienen una sensibilidad y especificidad significativamente más altas. Los sustratos de la presente invención facilitan métodos de gran producción para la detección y cuantificación de esta actividad de enzima. Dichos métodos se pueden utilizar para detectar paraoxonasa como un marcador de diagnóstico para la predicción del desarrollo de aterosclerosis, sepsis y sensibilidad a OPs.

Los sustratos son útiles para detectar y cuantificar la actividad de paraoxonasa en muestras de fluidos biológicos como la sangre. La medida de la actividad de paraoxonasa en la sangre puede ser útil como indicador de enfermedades cardiovasculares y sensibilidad a intoxicación de OP. Asimismo, se proporciona un método para detectar la actividad de paraoxonasa en una muestra del entorno. Dichas muestras pueden incluir aquellas que han sido tratadas con paraoxonasa para descontaminar OPs. Asimismo, se proporciona un método para el estudio de las propiedades básicas de paraoxonasa utilizando estos sustratos como reactivos de investigación. Se proporciona también un método de ensayo para determinar la presencia de OPs a través de la inhibición específica de fluorescencia inducida del sustrato. Los sustratos de la presente invención presentan una o más ventajas, v.g., una alta especificidad para paraoxonasa; detección fluorescente de alta sensibilidad y una Vmax de reacción significativa que los hacen al menos 10-20 veces más sensibles que cualquier otro sustrato conocido para la detección de paraoxonasa. En consecuencia, los sustratos pueden tener un uso práctico significativo en diversas áreas de la medicina y la detección de venenos de gas nervioso.

Los sustratos son útiles para detectar y cuantificar la actividad de OPH en muestras del entorno como por ejemplo extractos o escobillones de suelo. Dichas muestras pueden incluir aquellas que han sido tratadas con OPH para descontaminar OPs. Se proporciona también un método para estudiar las propiedades básicas de OPH utilizando estos sustratos como reactivos de investigación. Asimismo, se proporciona un método de ensayo para determinar la presencia de OPs a través de la inhibición específica de fluorescencia inducida del sustrato. Los sustratos de la presente invención presentan una o más de las ventajas mencionadas, v.g., una alta especificidad para OPH; una detección de fluorescencia de alta sensibilidad y una significativa Vmax de reacción que los hacen al menos de 10 a 20 veces más sensibles que otros sustratos conocidos para la detección de OPH. En consecuencia, los sustratos pueden tener un importante uso práctico en diferentes áreas de medicina y detección de venenos de gas nervioso.

Los sustratos propuestos pueden utilizarse para una amplia detección selectiva de la actividad de paraoxonasa en sangre humana. Los niveles de paraoxonasa en la sangre se corresponden con la resistencia al envenenamiento de organofosfato, el desarrollo de aterosclerosis, la capacidad de destoxificar LPS y disfunciones hepáticas generales. La presente invención proporciona un equipo de ensayo para la detección y cuantificación de paraoxonasa. Dicho equipo puede utilizarse para la detección de paraoxonasa como un marcador de diagnóstico para predecir el desarrollo de aterosclerosis. Un pronóstico de diagnóstico de la detección de paraoxonasa es comparable, o mejor, que los marcadores de sangre, como el nivel de colesterol en sangre. Dicho equipo se puede utilizar además para la detección de paraoxonasa como marcador de diagnóstico para predecir el desarrollo de sepsis. Otro uso potencial del equipo para la detección de paraoxonasa es predecir la resistencia de las pruebas de desafío con OP que puede tener un importante valor en una guerra contra el terrorismo químico o durante el combate en el que se utilizan armas químicas. Se contempla también que el equipo se pueda utilizar para confirmar que los niveles de protección de paraoxonasa se han alcanzado en los soldados de guerra tras la administración de niveles profilácticos de paraoxonasa recombinante. Por otra parte, un método rápido y sensible de detección de la actividad de organofosfatasa puede ser útil para la detección de sustratos alternativos, v.g., venenos nerviosos, toxinas de OP e insecticidas, presentes en muestras del entorno. Dichos sustratos alternativos para organofosfatasa pueden identificarse según su capacidad para competir con la unión y la hidrólisis de los sustratos de la presente invención.

La presente invención proporciona también un método para detectar selectivamente organofosfatasa en una muestra que contiene presuntamente organofosfatasa y una fosfatasa que comprende el contacto de la muestra con un sustrato de la invención, la medida de la fluorescencia de un producto fluorescente formado durante el contacto y la correlación de la fluorescencia medida con la actividad de la enzima de organofosfatasa. El espectro de las estructuras proporciona un método para descubrir diferentes organofosfatasas con diferentes espectros de especificidades de sustrato.

La presente invención proporciona también un método para detectar y/o medir la actividad de la enzima organofosfatasa inmovilizada en un soporte que comprende el contacto del soporte con un sustrato de la invención, la medida de la fluorescencia de un producto fluorescente formado durante el contacto, y la correlación de la fluorescencia medida con la actividad de la enzima de organofosfatasa.

Si bien se ha descrito y explicado la invención en conexión con ciertos modos de realización y procedimientos, no se pretende con ello limitar la invención a dichos modos de realización específicos, sino que se pretende cubrir todos los modos de realización alternativos, así como las modificaciones que entren dentro del espíritu y alcance de la invención.

Breve descripción de los gráficos

La figura 1 representa la detección de la actividad de paraoxonasa en muestras de suero utilizando 7-(dietil-fosforo]-6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo (DEPFMU) como sustrato. En este ensayo, se incubaron 10 \mul de suero de conejo y, por separado 10 \mul de suero de ratón, diluidos ambos previamente 10 veces con tampón de ensayo, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl y 2 mM de CaCl_{2}, con 100 \mul de tampón de ensayo que contenía 100 \muM de DEPFUU. Se llevó un seguimiento de las velocidades de cambio de la fluorescencia a 37ºC a 355/460.

La figura 2 representa la producción de fluorescencia asociada a membrana celular en células CHO no transfectadas y transfectadas con PON1 utilizando DEPFMU como sustrato. En este experimento, se transfectaron células de ovario de hámster chino (CHO) utilizando reactivo Fugene 6 (Roche) con el vector de expresión pHLSS122 que contenía ADNc PON1 humano. Se llevó a cabo la transfección en placas de microvaloración de 96 pocillos. 48 horas después de la transfección, se lavaron las células dos veces con PBS y se añadieron 100 \mul de tampón de ensayo que contenía 100 \mum de DEPFMU. Inmediatamente después de la adición, se llevó un seguimiento de las velocidades de cambio de fluorescencia a 37ºC a 355/460.

La figura 3 representa la medida de las Km de DEPFMU para paraoxonasa recombinante de conejo. La paraoxonasa recombinante de conejo se expresó en células CHO y se purificó parcialmente. v-A, v-B y c-C son las velocidades a diluciones 1/5, 1/10 y 1/20 de paraoxonasa recombinante, respectivamente. Se mezcló paraoxonasa recombinante parcialmente purificada con soluciones que contenían diferentes concentraciones de DEPFMU como sustrato. Se llevó un seguimiento del curso de la hidrólisis de DEPFMU a 37ºC utilizando una lectura de la fluorescencia a 355/460. Se obtuvo el valor recíproco de Km de DEPFMU y a partir de la intersección en el eje de las abscisas utilizando un gráfico Lineweaver-Burk (1/v) siendo v la velocidad de la reacción frente a a 1/[S] siendo [S] la concentración de sustrato.

La figura 4 representa una comparación de la sensibilidad de la detección de paraoxonasa utilizando ensayos basados en paraoxon y DEPFMU. Se llevó a cabo una evaluación de la sensibilidad relativa de ensayos basados en DEPFMU (A) y paraoxon (B) para el ensayo de paraoxonasa utilizando 10 \mul de diluciones en serie de muestras de suero de conejo incubadas con 100 \mul de tampón de ensayo que comprendía 4 mM de paraoxon o 100 \muM de DEPFMU en el tampón de ensayo. Tras la incubación, se midió la densidad óptica a 405 para detectar paraoxon y se leyó la fluorescencia (355/460) para DEPFMU. Las dos desviaciones típicas por encima de las lecturas de referencia se asignan como límites de la detección fiable. Tal como se puede deducir por la figura, la actividad de paraoxonasa puede detectarse de forma fiable con una dilución superior a 1:10.000 en el ensayo basado en DEPFMU, al tiempo que se requiere menos de 1:100 para la detección con ensayo a base de paraoxon.

La figura 5 representa la hidrólisis de DEPFMU mediante mutantes PON1.

La figura 6A representa los datos de hidrólisis para un sustrato de la presente invención, DEPFMU. La figura 6B representa los datos de hidrólisis para fosfato de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo (DiFMUP). Ver ejemplo 8.

La figura 7 representa la hidrólisis de éster tetraetílico de difosfato de fluoresceína (FDPTEE) a través de bacterias OPH.

La figura 8 representa la hidrólisis de FDPTEE en ratones normales contrastados con ratones en los que se ha abatido PON1 (knockout).

Descripción detallada de los modos de realización

Los compuestos de la presente invención se pueden preparar a través de cualquier método adecuado, por ejemplo, siguiendo los modos de realización conocidos de manera general en este campo que se indican a continuación; ver v.g., patentes EE.UU. 4.659.657; 5.428.059; 5.830.912; y 6.416.070; y publicación de solicitud de patente Nº US 2003/0032080 A1; cuyas descripciones se incorporan en el presente documento como referencia. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar la 7-hidroxicumarina apropiada con un compuesto de éster de fosfato (o tiofosfato) adecuado para obtener el éster o tioéster deseado. Para la preparación de los conjugados de tinte, ver G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press, 1996).

La presente invención proporciona un compuesto de fórmula II:

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en la que R^{11}-R^{14} se seleccionan del grupo que consiste en H y grupos o átomos distintos a H; X^{4}-X^{9} son independientemente O ó S. n y m son 0 ó 1, pero m y n no pueden ser 0 simultáneamente. R^{15}-R^{24} pueden ser H o cualquier sustituyente siempre y cuando el compuesto de fórmula II tras la hidrólisis, v.g., de enlaces P-X^{6} y/o P-X^{9} proporcione un compuesto fluorescente. Cuando m es n es 0, el sustituyente en esa posición es H.

En un modo de realización de la fórmula II, R^{11}-R^{14} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C_{1}-C_{6}, cicloalquilo de C_{5}-C_{8}, haloalquilo de C_{1}-C_{6}, perfluoroalquilo de C_{1}-C_{6}, alquenilo de C_{2}-C_{6}, y alquinilo de C_{2}-C_{6}, y arilo, arilcarbonilo y heteroarilo, que pueden estar sustituidos opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, ciano, nitro, halo, amino, amido, azido, acetal, cetal, imido, sulfo, sulfonilo, sulfinilo, tiocianato, aldehído, ceto, carbamoílo, uretano, ureido y guanidino; y X^{4}-X^{9} son independientemente O ó S, preferiblemente O. En un modo de realización preferible, m y n son 1.

De acuerdo con un modo de realización de la invención en la fórmula II, R^{15}-R^{24} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, hidroxilo, ciano, nitro, halo, amino, amido, azido, acetal, cetal, imido, sulfo, sulfonilo, sulfinilo, sulfometilo; una sal de sulfometilo, tiocianato, aldehído, ceto, carbamoílo, uretano, ureído, guanidino, alquil C_{1}-C_{6} amino, acil C_{1}-C_{6} amino, alquil C_{1}-C_{6} amino, alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, alquiltio de C_{1}-C_{6}, cicloalquilo de C_{5}-C_{8}, haloalquilo de C_{1}-C_{6}, perfluoroalquilo de C_{1}-C_{6}, formilo, carboxamida de fórmula -(C=O)NR^{1}R^{2} siendo R^{1} y R^{2} independientemente H, alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un arilo, o R^{1} y R^{2} tomados en combinación forman un anillo de 5 ó 6 eslabones saturado que tiene la fórmula -(CH_{2})_{2}-M-(CH_{2})_{2}- en la que la fracción M del anillo es un enlace simple, un átomo de oxígeno, un grupo metilo, o una amina secundaria -NR^{7}, siendo R^{7} H o alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, halocicloalquilo de C_{5}-C_{8}, hhidroxialquilo de C_{1}-C_{6}, hidroxicicloalquilo de C_{5}-C_{8}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{2}-C_{6} carbonilo, alcoxi C_{1}-C_{6}carbonil alquilo C_{1}-C_{6}, carboxi alquilo C_{1}-C_{6}, carboxi alcoxi C_{1}-C_{6}, dicarboxi alquilo C_{1}-C_{6}, dicarboxi alcoxi C_{1}-C_{6}, cianoalquilo C_{2}-C_{6}, fósfonoalquilo C_{1}-C_{6}, fosforil alquilo C_{1}-C_{6}, mono- di y trisacáridos, ácidos nucleicos, oligonucleotidos, amino ácidos, péptidos, y proteínas y alquenilo de C_{2}-C_{6}, alquinilo de C_{2}-C_{6}, arilo, arilcarbonilo y heteroarilo, que pueden estar sustituidos opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, ciano, nitro, halo, amino, amido, azido, acetal, ctal, imido, sulfo, sulfonilo, sulfinilo, tiocianato, aldehído, ceto, carbamoílo, uretano, ureido y guanidino.

En un modo de realización preferible del compuesto de fórmula II, R^{11}-R^{14} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C_{1}-C_{6}, alquenilo de C_{2}-C_{6}, alquinilo de C_{2}-C_{6}, arilo y heteroarilo, más preferiblemente, del grupo que consiste en H, alquilo de C_{1}-C_{6}, alquenilo de C_{2}-C_{6}, alquinilo de C_{2}-C_{6}. En otro modo de realización más, R^{11}-R^{14} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo de C_{1}-C_{6}, por ejemplo R^{11}-R^{14} son etilo, y m y n son 1. Como ejemplos específicos se puede mencionar un compuesto en el que X^{4}-R^{9} son O, R^{15}-R^{24} son H, R^{11}-R^{14} son etilo; y m y n son 1 y un compuesto en el que X^{4}, X^{5}, X^{7} y X^{8} son O; X^{6} y X^{9} son S; R^{15}-R^{24} son H; R^{11}-R^{14} son etilo; y m y n son 1.

En los compuestos de fórmula II, arilo es un grupo que contiene de 1 a 3 anillos aromáticos, preferiblemente fenilo; heteroarilo es un heterociclo aromático de 5 ó 6 eslabones que está condensado opcionalmente con un anillo aromático de 6 eslabones adicional o con uno o más anillos heteroaromáticos que contienen de 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S. Entre los ejemplos de heteroarilo se incluyen pirrol, tiofeno, furano, oxazol, isooxazol o imidazol, benzoxazol, benzotiazol, bencimidazol, benzofurano e indol.

Los compuestos de fórmula II se pueden preparar a través de cualquier método adecuado. Por ejemplo, se puede preparar éster tetraetílico de difosfato de fluoresceína tal como se muestra en el ejemplo 10.

En un modo de realización, los compuestos de la presente invención pueden estar unidos o conjugados con otras moléculas, grupos o sustancias, v.g., un colorante, un grupo reactivo, un anticuerpo o un soporte sólido.

"Tampón de ensayo" es un tampón utilizado para la detección de la actividad de paraoxonasa y se compone de 20 mM de Tris-CHCl, 150 mM de NaCl y 2 mM de CaCl_{2} a un pH de 8,0 a 25ºC.

"Fluido biológico" es una muestra de un fluido que se origina desde una fuente biológica. Entre los ejemplos de fluidos biológicos se incluyen, sin limitarse sólo a ellos sangre, composiciones derivadas de la sangre, suero, líquido cerebrorraquídeo, orina, saliva, leche, líquido ductal, lágrimas, semen, extracto celular o tisular, medio de cultivo de la expresión de paraoxonasa o mutaciones de paraoxonasa, muestras que surgen de el fraccionamiento de paraoxonasa o HDL desde muestras biológicas.

"DEPFMU" es la abreviatura de 7-dietil-fosfo-6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo, un compuesto químico que es uno de los sustratos fluorogénicos de reciente invención para la detección de la actividad de paraoxonasa.

"Muestra del entorno" es una muestra obtenida del entorno para fines de detección de paraoxonasa o OPs. Puede consistir en suelo, agua, aire o cualquier otro material obtenido del entorno natural.

"FDPTEE" es la abreviatura de éster tetraetílico de difosfato de fluoresceína.

"OP" es la abreviatura para organofosfato, que incluye diversos compuestos orgánicos que contienen fósforo y a menudo tienen una intensa actividad neurotóxica. Esto incluye compuestos como sarina y soman, que se desarrollaron originalmente como gases nerviosos, así como otros de uso extendido, como insecticidas y retardadores del fuego.

OPH se refiere a la proteína codificada por la organofosforo hidrolasa que es expresada a través de dos bacterias que habitan en el suelo, Pseudomonas diminuta y Flavobacterium ps. Hidroliza una serie de ésteres orgánicos, incluyendo paraoxon.

"Paraoxonasa" se refiere a la proteína codificada por el gen PON1. Paraoxonasa es una proteína de suero que posee actividad enzimática. Hidroliza una serie de ésteres orgánicos y fosfo-orgánicos incluyendo paraoxon. La función fisiológica de paraoxonasa no se conoce con certeza.

"PON1" se refiere al gen que codifica la proteína conocida como paraoxonasa, o arilestearasa (EC 3.1.1.2). Paraoxonasa está presente en el plasma humano normal y el ADNc, y los genes que codifican la proteína humana han sido secuenciados y caracterizados.

"Sustrato para organofosfatasa" se refiere a uno de una serie de compuestos químicos que se hidrolizan mediante OPH y/o paraoxonasa. Incluyen DEPFMU, acetato de fenilo, lípidos oxidados y paraoxon.

"355/460" se refiere a una longitud de onda de excitación de 355 nm y longitud de onda de emisión de 460 nm.

La presente invención proporciona además un método para detectar y/o medir la actividad de la organofosfatasa en un fluido que comprende el contacto del fluido con un compuesto de fórmula 1, en la que R^{3}-R^{6} y R^{8}-R^{10} pueden ser cualquier átomo o grupo y X^{1}, X^{2} y X^{3} son independientemente O ó S; o de la fórmula II, en la que R^{11}-R^{14} se seleccionan del grupo que consiste en H y grupos o átomos distintos a H; X^{4}-R^{9} son independientemente O ó S. n y m son 0 ó 1, pero m y n no pueden ser 0 simultáneamente. R^{15}-R^{25} pueden ser H o cualquier sustituyente siempre y cuando el compuesto de fórmula II, tras la hidrólisis, proporcione un compuesto fluorescente; la medición de la fluorescencia de un producto fluorescente formado durante el contacto; y la correlación de la fluorescencia medida con la actividad de la enzima paraoxonasa. Se puede emplear cualquiera de los compuestos que se han descrito en los párrafos [0029]-[0036] y [0038]-[0042] en el método de la presente invención.

En un modo de realización del método de detección y/o medida de la actividad de paraoxonasa, el compuesto de fórmula II puede ser un compuesto en el que X^{4}-R^{9} son O, m y n son 1, R^{11}-R^{24} son H.

De acuerdo con un modo de realización, los compuestos que se han descrito se pueden utilizar para la detección de la actividad de organofosfatasa y específicamente la actividad de paraoxonasa en un fluido biológico. Entre los ejemplos de fluidos biológicos se incluyen, sin limitarse sólo a ellos, sangre, composiciones derivadas de la sangre o suero, fluido cerebrorraquideo, orina, saliva, leche, fluido ductal, lágrimas, semen, extractos de cerebro, arterias, venas y glándulas. Otros fluidos pueden contener medio de cultivo de la expresión de paraoxonasa o mutaciones de paraoxonasa. Otros fluidos más pueden tomarse de métodos y procesos que tengan como resultado el fraccionamiento de paraoxonasa o HDL, de muestras biológicas. En un modo de realización, el fluido es un fluido del entorno, como por ejemplo, un extracto de suero, agua, o escobillón.

De acuerdo con un modo de realización, los compuestos que se han descrito se pueden utilizar para la detección de la actividad de organosfosfatasa y, específicamente, la actividad OPH en un fluido biológico o extracto del entorno. Entre los ejemplos de fluidos biológicos se incluyen, sin limitarse sólo a ellos, sangre, composiciones derivadas de la sangre o suero, fluido cerebrorraquideo, orina, saliva, leche, fluido ductal, lágrimas, semen, extractos de cerebro, arterias, venas y glándulas. Otros cultivos pueden contener medio de cultivo de la expresión de OPH o mutaciones de OPH. Otros fluidos más pueden tomarse de métodos y procesos que tengan como resultado el fraccionamiento de OPH desde muestras biológicas. En un modo de realización, el fluido es un fluido del entorno, como por ejemplo, un extracto de suero, agua, o escobillón.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona un método para predecir la existencia de enfermedades cardiovasculares. La presente invención proporciona también un método para predecir la sensibilidad de una persona hacia OPs. La actividad de paraoxonasa tal como se mide utilizando los compuestos de la presente invención se puede utilizar como signo de predicción de enfermedades cardiovasculares y sensibilidad a OPs.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona un método para predecir el potencial para shock séptico. La presente invención proporciona además un método para predecir la sensibilidad de una persona a LPS. La actividad de paraoxonasa tal como se mide utilizando los compuestos de la presente invención se puede utilizar como signo de predicción de la sensibilidad a LPS.

En otro modo de realización, la presente invención proporciona un método para evaluar y/o predecir la actividad funcional de preparaciones de HDL. La actividad de paraoxonasa medida por la fluorescencia de acuerdo con la presente invención puede utilizarse para la evaluación/predicción de la actividad funcional de preparaciones de lipoproteínas de alta densidad.

En otro modo de realización más, la detección de fluorescencia se consigue utilizando una longitud de onda de excitación y una longitud de onda de emisión. En otro modo de realización más, se puede llevar un seguimiento de la actividad OPH y paraoxonasa utilizando un fluorímetro con una longitud de onda de excitación a 355 nm y una longitud de onda de emisión a 460 nm. Otros formatos de ensayo incluyen análisis de la actividad de OPH en geles tras la separación de proteínas por electroforesis, o análisis de la expresión/secreción de paraoxonasa en células vivas o muertes embebidas en agarosa de bajo punto de fusión, inmunomanchado, análisis de mancha de western y detección de fluorescencia in situ con la detección por microscopio, inspección visual, vía película. Alternativamente, se pueden inmovilizar OPH o paraoxonasa en soportes como membranas, resinas y varillas de inmersión.

En otro modo de realización, se puede detectar la actividad de organofosfatasa en la superficie de células que expresan actividad paraoxonasa utilizando un clasificador de células (v.g., un clasificador de células asistido por fluorescencia o FACS).

En otro modo de realización más, los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para cuantificar la actividad de Opasas, como por ejemplo las asociadas con paraoxonasa o variantes de paraoxonasa incluyendo variantes naturales o formas mutantes creadas artificialmente de OPH.

En otro modo de realización más, los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para cuantificar la actividad de organofosfatasas, como por ejemplo las asociadas con OPH o variantes de OPH incluyendo las variantes naturales o las formas mutantes creadas artificialmente de OPH:

En otro modo de realización más, la presencia de sustratos (o compuestos) en competencia por organofosfatasa puede identificarse mediante la inhibición de la fluorescencia en presencia de un sustrato para OPH o paraoxonasa. En un modo de realización preferible, el sustrato es DEPFMU y el sustrato en competencia es un OP como por ejemplo sarina o saman. En otro modo de realización más, se inmoviliza paraoxonasa sobre un suporte y se mide su actividad según la producción de una señal fluorescente. Se añaden extractos del entorno incluyendo agua y aire, extractos de escobillones de paraoxonasa y sustratos alternativos identificados por una disminución de la fluorescencia. Se pueden extraer los extractos del entorno con disolventes acuosos u orgánicos, fluidos supercríticos, fluidos subcríticos y similares.

En otro modo de realización, se inmoviliza OPH sobre un soporte y se mide su actividad según la producción de una señal fluorescente. Se añaden extractos del entorno, incluyendo agua y aire, extractos de escobillones, a OPH y se identifican sustratos alternativos según una disminución de la fluorescencia. Se pueden extraer los extractos del entorno con disolventes acuosos u orgánicos, fluidos supercríticos, fluidos subcríticos y similares.

Se puede emplear una amplia gama de polímeros orgánicos o inorgánicos, tanto naturales como sintéticos, como material para inmovilizar organofosfatasas como OPH, o paraoxonasa. Entre los polímeros ilustrativos se incluyen polietileno, polipropileno, polimetacrilato, poliacrilato, rayón, nilón, celulosa, nitrocelulosa y polifluoruro de vinilideno. La organofosfatasa inmovilizada se puede cuantificar por contacto con un compuesto de la presente invención.

En otro modo de realización más, la presente invención proporciona un método para llevar un seguimiento de la descontaminación de las OPs del entorno. Puede ponerse en contacto el extracto del suelo tratado con paraoxonasa (para descontaminación) con un compuesto de la presente invención, y la fluorescencia producida puede ser una indicación de que se ha completado la descontaminación. En otro modo de realización más, se puede emplear el compuesto de la presente invención para identificar microorganismos o plantas que habitan en el suelo que expresan OPH o paraoxonasa.

En otro modo de realización más, se copula la organofosfatasa con una estructura secundaria como por ejemplo un anticuerpo con especificidad para una diana alternativa, de manera que se une la estructura secundaria con su diana para formar un complejo estructura secundaria de organofosfatasa: diana. La organofosfatasa puede unirse entonces con la proteína informadora y se puede identificar la presencia del complejo estructura secundaria organofosfatasa: diana utilizando los sustratos o compuestos de la presente invención.

En otro modo de realización, se co-transfecta el gen PON1 con otra proteína de interés y se utiliza como gen informador para la expresión de la proteína diana. En otro modo de realización más, el gen PON1 está bajo el control de diferentes promotores y el sustrato fluorescente se utiliza para determinar la actividad de diferentes promotores.

En otro modo de realización más, se co-transfecta el gen OPH con otra proteína de interés y se utiliza como gen informador para la expresión de la proteína diana. En otro modo de realización más, el gen OPH está bajo el control de diferentes promotores y el sustrato fluorescente se utiliza para determinar la actividad de diferentes promotores.

En otro modo de realización más, se añade el sustrato a células incubadas con diferentes moléculas que pueden regular el promotor PON1 y, por tanto, la expresión de paraoxonasa. Los reguladores de la expresión de paraoxonasa se identifican según el aumento de la señal fluorescente en presencia de sustrato de paraoxonasa. Estos reguladores pueden afectar a las rutas de transducción de señal, teniendo como resultado finalmente la regulación del promotor de gen.

De forma inesperada, el reemplazamiento de dos protones en el grupo fosfato de fosfato de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo por grupos etilo (y otros grupos de bajo peso molecular, v.g., grupos hidrocarburo) genera un sustrato pobre para fosfatasas derivadas de suero o células, pero un buen sustrato que se hidroliza selectivamente mediante paraoxonasas y OPH de suero y recombinantes. Esto está en claro contraste con sustratos específicos de fosfatasas, como fosfato de 6,8-difluoro-4-metil-umbeliferilo que es hidrolizado fácilmente por fosfatasas, pero no por paraoxonasa. Por lo tanto, DEPFMU puede utilizarse como sustrato específico de paraoxonasa, que puede detectar de forma precisa la actividad de paraoxonasa en suero incluso en presencia de fosfatasa endógena. En consecuencia, una ventaja principal de DEPFMU con respecto a la técnica anterior, es la inesperada baja especificidad de este sustrato para la fosfatasa y su alta especificidad para organofosfatasas como OPH y paraoxonasa.

La presente invención proporciona también un método para detectar y/o medir la actividad de organofosfatasa incluyendo paraoxonasa inmovilizada sobre un soporte que comprende el contacto del soporte con cualquiera de los compuestos de fórmula I ó II; la medida de la fluorescencia del producto fluorescente formado durante el contacto y la correlación de la fluorescencia medida con la actividad de la enzima paraoxonasa. En un modo de realización, el soporte es una membrana, resina, biosensor, placa de microvaloración, nanotubo o varilla de inmersión, fibra, copo de silicona, perlas magnéticas y diferentes geles.

La presente invención proporciona también un método para detectar selectivamente organofosfatasa en una muestra que contiene presuntamente organofosfatasa y una fosfatasa que comprende el contacto de la muestra con cualquiera de los compuestos de fórmula II, v.g., el compuesto de fórmula II; en el que X^{4}-X^{9} son O, m y n son 1; R^{11}R^{24} son H; la medida de la fluorescencia de un producto fluorescente formado durante el contacto; y la correlación de la fluorescencia medida con la actividad de la enzima organofosfatasa.

La presente invención proporciona además un método para detectar y/o medir la actividad de la enzima organofosfatasa inmovilizada sobre un soporte que comprende el contacto del soporte con cualquiera de los compuestos de fórmula II; v.g., el compuesto de fórmula II, en el que X^{4}-X^{9} son O, m y n son 1; R^{11}-R^{24} son H; la medida de la fluorescencia de un producto fluorescente formado durante el contacto; y la correlación de la fluorescencia medida con la actividad de la enzima organofosfatasa.

Los sustratos de la presente invención proporcionan una especificidad y sensibilidad inesperadas para la detección de OPasas incluso en presencia de las actividades de fosfatasa alcalinas y ácidas superiores encontradas en extractos celulares, plasma y suero. El hecho de que los sustratos de la presente invención sean reconocidos uniformemente por organofosfatasas es sorprendente a la vista del gran tamaño de los grupos fluorogénicos utilizados en relación con los sustratos conocidos para estas proteínas. Por consiguiente, no existen datos disponibles a priori que sugieran que dicho sustrato voluminoso podría ser accesible al sitio activo de organofosfatasas, como paraoxonasa, sino es porque es selectivamente hidrolizadas por la proteína.

Los ejemplos que se exponen a continuación, sirven para ilustrar la invención, pero naturalmente no deberán considerarse en ningún modo como limitativos de la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo sirve para demostrar la especificidad de 7-[dietil-fosfo]-8-difluor-4-metilumbeliferilo hacia paraoxonasa.

Los compuestos sometidos a prueba incluyeron: acetato de 4-metilumbeliferilo, oleato de 4-metilumbeliferilo, heptanoato de 4-metilumbeliferilo, palmitato de 4-metilumbeliferilo, octonato de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo, 7-[dietil-fosfo]-6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo [DEPFMU] y palmitato de ELF-97 (Sondas moleculares, OR), éster tetraetílico de difosfato de fluoresceína, (éster 4-metilumbeliferílico de cloruro de (3-carboxipropil)-trimetilamonio y 7-benciloxi-6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo. Se evaluaron todos los compuestos para la posible detección de actividad de paraoxonasa utilizando paraoxonasa humana recombinante, expresada en células CHO. Para la expresión de paraoxonasa recombinante, se obtuvo ADNc de hígado humano de Ambion Inc (Austin TX). Se amplificó ADNc PON1 humano por PCR con sondas específicas de gen, TRSSP 216 (AAGAATTCCACCATGGCGAAGCTGATTGCGCTC) [SEQ ID NO:1] y TRSSP 217 (AATCTAGATTAGAGCTCACAGTAAAGAGCTTTGTG) [SEQ ID NO: 2] que contenía sitios de restricción Xba I y EcoRI. Hassett C, Richter RJ, Humbert R, Chaplind C., Crabb JW, Omiecinski CJ, Furlong CE. Characterization of cDNA clones encoding rabbit and human serum paraoxonase: the mature protein retains its signal sequence. Biochemistry, Oct 22; 30(42): 10141-9 (1991). Se clonó el producto amplificado por PCR que contenía ADNc PON1 en el vector pBlueScript KS II (Stratagene, CA) como fragmento Xbal/EcoRI, secuenciado de sondas T3 y T7 para confirmar la identidad de ADN y después se subclonó en un vector de expresión que contenía promotor EF-1a y señal GC-MSF poli(A), formando el vector de expresión pHLSS131. Se propagó el ADN de vector de expresión en E. coli, cepa DH5a, y se purificó utilizando equipo Quagen Maxiprep para purificación de plásmido (Quagen, CA). Se obtuvieron células CHO de ATCC y se cultivaron según las condiciones recomendadas. Se transfectaron células CHO con el vector de expresión utilizando el reactivo Fugene 6 (Roche Diagnostic, Indianapolis, IN) según el manual del fabricante. 48 horas después de la transfección, el nivel de expresión de PON1 fue fácilmente detectable utilizando sustratos normales como paraoxon y acetato de fenilo. Se realizó la detección selectiva de los compuestos de ensayo para hidrólisis mediada por paraoxonasa por incubación con células CHO transfectadas. Se realizó el seguimiento de fluorescencia de la reacción utilizando un fluorímetro SpectraMax GenimiXS, Molecular Devises Inc. (Sunnyvale, CA).

Se hidrolizó específicamente DEPFMU con paraoxonasa. Tras la hidrólisis, se liberó 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo altamente fluorescente. Dado que DEPFMU por sí mismo no posee ninguna fluorescencia significativa, se puede llevar un seguimiento de la hidrólisis de forma fácil y segura utilizando cualquier fluoríimetro comercial con excitación a 355 nm y emisión a 460 nm.

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Ejemplo 2

En este ejemplo se ilustra un ensayo para la detección de la actividad de paraoxonasa. Se puede utilizar DEPFMU como sustrato para la detección de paraoxonasa derivada de suero, así como paraoxonasa recombinante expresada en cultivos de células. Se utilizaron las siguientes condiciones para la detección de paraoxonasa en plasma. Se pueden diluir muestras de suero o plasma de 1 a 100 veces en un tampón de ensayo. Se llevó a cabo este ensayo en una placa Nunc-inmuno de 96 pocillos. Por ejemplo, se añadieron 10 \mul de suero de conejo diluido a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenía 100 \mul de tampón de ensayo más 100 \muM de DEPFMU (se preparó DEPFMU de reserva como un concentrado 50 mM en dimetilformamida y se almacenó a -20ºC). Después del mezclado a fondo, se incubó la solución de ensayo que contenía plasma durante 20 minutos a 37ºC. Se cuantificó la hidrólisis de DEPFMU midiendo el nivel de fluorescencia a 355/460 utilizando un fluorímetro comercial. El nivel de fluorescencia se corresponde con el nivel de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo liberado desde DEPFMU como resultado de la hidrólisis mediada por paraoxonasa. Se puede calibrar la cantidad real de 6,8-difluoro-4-metil-umbeliferilo liberada en el ensayo con una cantidad conocida de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo. En la figura 1 se presenta un ejemplo de detección de paraoxonasa en diferentes muestras de suero. Se pueden emplear métodos similares para la detección de paraoxonasa recombinante expresada en cultivo celular.

Dado que un significativo porcentaje de paraoxonasa recombinante permanece asociado con la membrana celular, se desarrollaron métodos para evaluar la paraoxonasa asociada a membrana celular. Uno de dichos métodos consiste en recoger células que expresan paraoxonasa, lavarlas dos veces con PBS (Sistema de tampón fosfato de Dulbecco) para eliminar paraoxonasa endógena que se origina o bien desde la paraoxonasa presente en el medio de cultivo o bien es sintetizada y secretada por las células. Se aglomeran las células lavadas por centrifugado y se vuelven a suspender en PBS a una densidad de hasta 10^{7} células/ml. Se mezclan 10 \mul de suspensión de células con 100 \mul de solución de sustrato por pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos, se incuba durante 20 minutos y se mide el nivel de fluorescencia tal como se ha descrito antes. Como opción para este ensayo, se pueden colocar en placas células adhesivas en una placa de microvaloración un día o más antes de la evaluación. A continuación, se separa el medio y se lavan las células dos veces con PBS. Se añaden 100 \mul de solución de sustrato y se lleva un seguimiento de la fluorescencia al cabo de 20 minutos o más de incubación a 37ºC. En la figura 2 se muestra un ejemplo de la detección de la paraoxonasa asociada a membrana. Aquí se muestra la detección de la actividad de paraoxonasa con DEPFMU para células CHO transfectadas con PON1 frente a la fluorescencia de fondo utilizando células no
transfectadas.

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Ejemplo 3

En este ejemplo se ilustra un método para detectar la actividad de paraoxonasa recombinante en células CHO transfectadas con paraoxonasa.

Se recuperó ADNc PON1, se clonó en pBlueScript KS II y se secuenció para confirmar la identidad. Para los estudios sobre la expresión de paraoxonasa PON1, se subclonó ADNc en vector de expresión bajo el control del promotor EF-1a. Se transfectaron células CHO utilizando reactivo Fugene 6 con vector de expresión pHLSS122 que contenía ADNc PON1 humano bajo el promotor EF-1a en vector de clonación pBlueScript KSII. Se realizó la transfección con ADN de vector pBlueScript KS II para controlar células CHO. Se colocaron en placa células transfectadas en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos. 48 horas después de la transfección, se lavaron los pocillos dos veces con PBS y se añadieron 100 \mul de tampón de ensayo que contenía 100 \muM de DEPFMU. Inmediatamente después de la adición, se llevó a cabo un seguimiento de la fluorescencia de los pocillos utilizando una lectora de fluorescencia SpectraMax Gemini XS de 96 pocillos a 355/460.

Los datos de este experimento se presentan en la figura 2. Las células CHO transfectadas con vector vacío no hidrolizan DEPFMU, mientras que las células transfectadas con el vector que expresa la paraoxonasa catalizan una hidrólisis significativa del sustrato. Dado que la única diferencia entre las dos poblaciones de células es que las células transfectadas expresan actividad de paraoxonasa humana mientras que las células de control no. Esto demuestra además que los sustratos de la presente invención son altamente específicos para paraoxonasa y que no existen niveles significativos de enzima en células normales que sean capaces de hidrolizar DEPFMU.

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Ejemplo 4

En este ejemplo se ilustra un método para medir la Km de paraoxonasa de conejo recombinante para DEPFMU.

Se transfectaron células CHO con el plásmido pHLSS131 que expresaba ADNc PON1 de conejo. Consultar el ejemplo 1 y 2 sobre los detalles adicionales de la transfección y la expresión. Después de la transfección, se propagaron las células en medio de crecimiento, se recogieron y se purificó parcialmente paraoxonasa desde la membrana celular por extracción con 0,03% de Tergitol (Sigma) en PBS. Se separó la paraoxonasa extraída desde las células por centrifugado a 10000 g durante 10 minutos. Se consideró el sobrenadanete como una paraoxonasa parcialmente purificada. Se incubaron 10 \mul de tres diluciones diferentes 1/5, 1/10 y 1/20 o paraoxonasa recombinante (1/v-A, 1/v-B y 1/v-C) con 100 \mul de DEPFMU diluido en serie como sustrato, a 37ºC, en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Se midió el curso de la hidrólisis de DEFPMU llevando un seguimiento de la fluorescencia cada 5 minutos a 355/460 tal como se ha descrito anteriormente. En la figura 3 se muestran los datos de este experimento. Se calculó la velocidad de reacción como el cambio en el nivel de fluorescencia a lo largo del tiempo. Se observó una velocidad de reacción estable hasta los 30 minutos de reacción. Se calculó la Km real de paraoxonasa para DEPFMU como 666 \muM. En comparación, la Km de paraoxonasa humana para paraoxon está en torno a 500 \muM [9].

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Ejemplo 5

En este ejemplo se proporciona una comparación de la sensibilidad de paraoxon y un compuesto de la presente invención como sustrato para la detección de paraoxonasa.

En este experimento se demuestra la sensibilidad relativa del ensayo basado en DEPFMU en comparación con los ensayos basados en paraoxon. Se incubaron 10 \mul de muestras diluidas en serie de suero de conejo, durante 30 minutos, a 37ºC en presencia de 100 \muL de paraoxon 4 mM o 100 \mul de DEPFMU 100 \muM en el tampón de ensayo que se ha descrito anteriormente. Tras la incubación, se midió el cambio de la densidad óptica a una longitud de onda de 405 nm y se midió la fluorescencia de la hidrólisis de DEPFMU a 355/460. Los datos se presentan en la figura 4. Se consideró la detección de paraoxonasa fiable como la superior a dos unidades de desviación típica por encima del antecedente. Este experimento demuestra que el límite de detección de la actividad de enzima para el ensayo a base de paraoxon fue inferior a una dilución 1/1000 de suero, mientras que para DEPFMU fue superior a una dilución de 1/10.000. Por consiguiente, los ensayos a base de DEPFMU presentaron una sensibilidad significativamente mayor. La sensibilidad y velocidad de la detección fluorescente de DEPFMU fue por debajo de la óptima debido al uso de una concentración de sustrato (100 \muM), muy por debajo de la Km de [\sim666 \muM], mientras que el ensayo en el que se utilizó paraoxon estuvo bastante por encima de la Km.

Ejemplo 6

En este ejemplo se ilustra la hidrólisis de DEPFMU y la detección de la actividad de PON1 en células CHO transfectadas con diferentes mutantes de PON1.

Se transfectaron 2 x 10^{5} células CHO en una placa de 96 pocillos con 1 \mug de ADN con reactivo Fugene 6. El vector de ADN contenía ADNc de PON1 conducido por el promotor EF-1. Dado que las diferentes variantes naturales de PON1 tienen diferentes especificidades de sustrato, se utilizaron cuatro variantes/mutantes diferentes de PON (145-6, 142-2, 131-10 y 122-7). 48 horas después de la transfección, se lavaron las células con PBS y se añadieron 100 \mul de sustrato de DEPFMU. La concentración final del sustrato fue 40 \mug/mL de tampón Tris 50 mM pH 8,0, 100 mM de NaCl y 1 mM de CaCl_{2}. Al cabo de 10 minutos de incubación a 37ºC, se midió la fluorescencia a 355 nm de excitación y 460 nm de emisión. En la figura 5 se muestran los resultados. Los cuatro mutantes hidrolizaron el DEPFMU con una eficacia muy alta. La hidrólisis espontánea del sustrato mediante células no transfectadas CHO fue de aproximadamente 3%. El control de células CHO no hidrolizó el sustrato.

Ejemplo 7

En este ejemplo se ilustra la sensibilidad de la detección proporcionada por un modo de realización de la presente invención. Los autores de la invención compararon la sensibilidad de detección de diluciones en serie de OPH desde 10 \mug/ml hasta 0,5 ng/ml utilizando diferentes sustratos incluyendo paraoxon y DEPFMU. Se mezclaron 10 \mul de solución de OPH con 100 \mul de tampón que contenía 100 \muM de DEPFMU o 1,2 mM de paraoxon. Se incubaron las muestras durante 30 minutos a 37ºC llevando un seguimiento de los cambios en las propiedades ópticas cada 5 minutos. Asumiendo un peso molecular de 39.000 kDa y 100% de pureza, y actividad de la proteína, se detectó de forma fiable tan sólo 1 femtomol (fmol) de OPH por pocillo. Para paraoxon el nivel de detección fiable fue en torno a 100 fmoles de OPH por pocillo. La velocidad catalítica (K_{cat}) de hidrólisis mediada por OPH fue 1,5 x 10^{3} min^{-1} para DEPFMU y 4 x 10^{4} min^{-1} para paraoxon. Aunque la k_{cat} para paraoxon fue superior a 100 veces más la k_{cat} para DEPFMU, la proporción señal a ruido superior para el fluoroforo cumarina a lo largo del cambio óptico en nitrofenol, que se liberó tras la hidrólisis de paraoxon, hace que el sistema de ensayo a base de DEPFMU sea aproximadamente 100 veces más sensible para la detección de OPH que paraoxon. Se analizó la Km de DEPFMU para OPH. Para este experimento, se mezclaron 10\mul de solución de OPH que contenía 25 fmoles de enzima con 100 \mul de de DEPFMU 100 \muM. La velocidad de hidrólisis fue constante solamente durante los primeros 10 minutos de reacción para disminuir al cabo de 10-15 minutos. Se detectó un descenso de la hidrólisis únicamente al cabo de 25-30 minutos (no se muestran los datos), seguido de la hidrólisis de paraoxon mediada por OPH. Se evaluó la Km de DEPFMU para OPH utilizando concentraciones de DEPFMU comprendidas entre 290 \muM y 2 \muM. Se mezclaron 10 \mul de una solución que contenía 25 fmoles de OPH con 100 \mul de solución de sustrato. Se obtuvo el valor recíproco de la Km de DEPFMU a partir de la intersección del eje de abscisas utilizando un gráfico Lineweaver (1/v) en el que v es la velocidad de la reacción frente a 1/[S] siendo [S] la concentración de sustrato. Se calculó la Km aparente como 29 \muM.

Ejemplo 8

En este ejemplo se ilustra las propiedades superiores de un sustrato de la presente invención, DEPFMU, en relación con las de fosfato de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo (DiFMUP) como sustrato para la detección de paraoxonasa. Se transfectaron células CHO utilizando reactivo Fugene 6 con el vector de expresión pHLSS 122, que contenía ADNc PON humano bajo el promotor EF-1a en vector de clonación pBlueScript KS II. Se llevó a cabo la transfección con el ADN de vector pBlueScript KS II para células CHO de control. Se utilizaron diferentes plásmidos 182, 178, 190, 184, 188 y 186 que contenían diferentes mutantes y variantes naturales de PON1 para expresión. Se colocaron en placa células transfectadas en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos. 48 horas después de la transfección, se lavaron los pocillos dos veces con PBS y se añadieron 100 \mul de tampón de ensayo que contenía 100 \muM de DEPFMU o 100 \muM de DiFMUP. Inmediatamente después de la adición, se llevó un seguimiento de la fluorescencia utilizando una lectora de fluorescencia SpectraMax Gemini XS de 96 pocillos a una longitud de onda de excitación de 355 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Los datos de este experimento se presentan en las figuras 6a y 6b. En la figura 6a, se demuestra la hidrólisis de DEPFMU mediante células de control y células transfectadas. Tal como se puede educir de esta figura, las células CHO transfectadas simuladamente no hidrolizan DEPFMU, mientras que las células transfectadas con el vector que expresa paraoxonasa catalizan una hidrólisis significativa del sustrato. la figura 6b demuestra los datos de la hidrólisis de DiFMUP a través de células CHO de control y transfectadas. Las células de control, así como las células transfectadas experimentalmente hidrolizan una cantidad significativa de DiFMUP, lo que indica que existe una hidrólisis independiente de PON1 significativa de DiFMUP. De manera más probable, este alto nivel de hidrólisis viene mediado por fosfatasas celulares, que son abundantes en la mayoría de las líneas celulares. La hidrólisis independiente de paraoxonasa significativa de DiFMUP excluye este sustrato como útil para la detección de paraoxonasa.

Ejemplo 9

En este ejemplo se ilustra un método para la detección de organofosfatasa. Se utilizó éster tetraetílico de difosfato de fluoresceína (FDPTEE) como sustrato para la detección de la actividad de organofosfatasa. Se llevó a cabo el experimento tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 7. Brevemente, se prepararon diluciones en serie de OPH desde 10 \mug/ml a 0,5 ng/ml. Se mezclaron 10 \mul de las distintas diluciones de OPH con 100 \mul de tampón que contenía 100 \muM de FDPTEE. Se incubaron muestras durante 30 minutos a 37ºC y se llevó un seguimiento de la fluorescencia (Ex 488 nm/Em 520 nm) cada 5 minutos. En la figura 7 se muestran los resultados obtenidos. Asumiendo que la enzima tiene un peso molecular de 39.000 kDa y que es 100% puro y completamente activo, se detectó de forma fiable 100 femtomoles (fmoles) de OPH por pocillo, lo que demuestra su utilidad de aplicación como sustrato para OPasa.

Se demostró la especificidad de FDPTEE para paraoxonasa utilizando muestras de suero obtenidas de ratones en los que se había destruido el gen PON1 por tecnología de célula madre embriónica (PON1 KO)(10). En estos experimentos, se diluyeron 10 \mul de muestras de suero de ratones C57B1/6 normales y ratones Black/6 negros PON1 KO C57, 1/10 con 150 mM de NaCl y 20 mM de Tris, pH 8,0. Se mezclaron 10 \mul de sueros diluidos con 100 \mul de FDPTEE 100 \muM y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Tras la incubación, se midió el nivel de fluorescencia (excitación 488 nm/emisión 520 nm). En la figura 8 se muestran los resultados obtenidos. No se detectó fluorescencia en las muestras de los sueros obtenidos de ratones PON1 KO, en cambio se detectó una fluorescencia significativa en las muestras de suero obtenidas de ratones C57Black normales. Estos datos confirman que paraoxonasa de suero es la enzima responsable de la hidrólisis de FDPTEE y la generación de señal de fluorescencia en muestras normales.

Ejemplo 10

En este ejemplo se ilustra un método de preparación de un modo de realización del compuesto de fórmula II, en concreto éster tetraetílico de difosfato de fluoresceína. Se suspenden 2,5 g de fluoresceína (7,5 mmoles) en THF (60 mL) y CH_{2}Cl_{2} anhidro (mL). Se añaden 3,1 g de 1H-tetrazol (44 mmoles) y se agitó a temperatura ambiente durante \sim1,5 horas o hasta que la mezcla de reacción se convierte en una solución amarillo oscuro transparente. Se enfría la solución resultante a 0ºC y se añaden gota a gota 5,0 g de N,N-diisopropilfosforamidita de dietilo (23,0 mmoles), durante un período de 3 a 4 minutos para producir una solución amarillo muy claro. Se separa el baño de enfriado y se agita la reacción a temperatura ambiente hasta que la TLC muestra que no queda material de partida (\sim 5 minutos). Se vuelve a enfriar la reacción a 0ºC. Rf (difosfito de fluoresceína, éster tetraetílico) = 0,7-0,75, un punto de apagado que pasa a amarillo fluorescente tras el calentamiento; hexanos/EtOAc (3:2). Se prepara una solución de ácido 3-cloroperoxibenzoico (MCPBA) (5,5 g, 32 mmoles) en CH_{2}Cl_{2}/CHCl_{3} (9:1, 50 mM) y se lava con NaCl saturado (1 x 50 mL), seguido del secado sobre Na_{2}SO_{4}. Se añade la solución deshidratada a la mezcla de reacción de 0ºC para producir una solución turbia amarillenta. Se separa el baño de enfriado y se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente hasta que la TLC indica que se ha completado (\sim10 minutos). Se separa el disolvente de la mezcla de reacción al vacío y se disuelve la goma amarilla resultante en EtOAc (\sim 100 mL). Se lava la solución con 10-20% de tiosulfato sódico/H_{2}O (1 x 100 mL), NaHCO_{3} saturado (1 x 100 mL), y NaCl saturado (1 x 100 mL) y se seca sobre Na_{2}SO_{2}. Se elimina el disolvente al vacío. En este punto, la TLC en hexanos/EtOAc (3:2) muestra dos puntos: Rf - 0,65 0,7; un punto de apagado que se hace fluorescente con el calentamiento; y Rf -0,95 -1,0, un punto de apagado que no se hace fluorescente con el calentamiento. Se añaden 50 mL de metanol a la goma para hacer precipitar el material de Rf superior. Se separan los sólidos por filtración y se separa el metanol del filtrado al vacío. Se purifica el producto resultante por cromatografía de columna en las siguientes condiciones:

3

Se añaden aproximadamente 50 mL de hexano al material oleoso resultante para formar un sólido. Se recoge el sólido por filtración y se seca a un peso constante al vacío para producir éster tetraetílico de FDP (éster tetraetílico de difosfato de fluoresceína) como un sólido blanco. Rendimiento real 1,61 g (36%). Rf (VI) = 025, un punto de apagado que se hace amarillo fluorescente con el calentamiento; EtOAc/hexanos (2:1).

Referencia

1. Aviram, M. Billecke, S., Sorenson, R. Bisgaier, C., Newton, R. Rosenblat, M., Eroglul, J. Hsu, C., Dunlop, C., y LaDU, B. (1998). Paraoxonase active site requiered for protection against LDL oxidation involves its free sulfhydryl group and is differente from that requiered for its arylestearase/paraoxonase activities: selective action of human paraoxonase allozymes Q y R. Arterioscler Throm Vasc Biol, 18, 1617-24.

2. Mackness, B, Mackness, M.I., Arrol, S., Turkie, W., and Durrington, P.N. (1998). Effect of the human serum paraaoxonase 55 y 192 genetic polymorphisms on the protection by high density lipoprotein against low density lipoprotein oxidative modification. FEBS Lett. 423, 57-60.

3. Costa, L. G., Cole, T.B., Jarvik, G.P., y Furlong, C.E. (2003). Functional genomic of the paraoxonase (PON1) polymorphisms: effects on pesticide sensitivity, cardiovascular disease and drug matebolism. Annu rev. Med. 54, 37, 1-92.

4. Johnson, K.J. Ward, P.A. Goralnick; S., and Osborn, M.J. (1997). Isolation from human serum of an inactivator of bacterial lipopolisaccharide. Am. J. Pathol 88, 559-74.

5. La Du, B.N. Aviram, M. Billecke, S., Navab, M., Primo-Parmo, S., Sorenson, R.C.; and Standford, T.J. (1999). On the physiological role(s) of the paraoxonases. Chem. Biol., Interact 199-120, 379-88.

6. La Du, B., Draganov, D.I. Stetson, P.L. and Watson, C.E. (2000). PON3 and usese thereof. US patent 6.573.370.

7. Costa, L.G. MacDonald, B.E. Murphy, S.D., Omenn, G.S., Richter, R.J. Motulsky, A.G., and Furlong, C.E. (1990). Serum paraoxonase and its influence on paraoxon and chlorpyrifos-oxon toxicity in rats. Toxicol Appl Pharmacol 103, 66-76.

8. Li, W.F., Furlong, C.E. and Costa, L.G. (1995). Paraoxonase protects against chlorpyrifos toxicity in mice. Toxicol Lett. 76, 219-26.

9. Josse, D., Xie, W. Renault, F., Rochu, D., Schopfer, L.M. Masson, P., and Lockridge, O. (1999). Identification of residues essential for human paraoxonase (PON1) arylestearase/organophosphatase activities. Biochemistry 38, 2816-25.

10. Shih DM, Gu L, Xia YR, Navab M. Li WF, Hama S, Castellani LW, Furlong CE, Costa LG, Fogelman AM, Lusis AJ. Mice lacking serum paraoxonase are susceptible to organophosphate toxicity and atherosclerosis. Nature, 1998 Jul. 16; 394 (6690): 284-7.

El uso de los términos "uno" y "un" y "el", "la", así como determinantes similares en el contexto de la descripción de la invención (sobre todo en el contexto de las reivindicaciones adjuntas) deben interpretarse como englobadores de las formas tanto singular como plural, a no ser que se indiquen de otra forma aquí, o que lo contradiga claramente el contexto. Las expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir que significan "incluyendo, sin limitarse sólo a ellos") a no ser que se señale de otra forma. La indicación de los intervalos de valores en la presente descripción tienen como único fin servir como método práctico para referirse de manera individual a cada valor por separado que entra dentro del intervalo, a no ser que se indique de otra forma en la descripción, y cada uno de los valores por separado quedan incluidos en la presente memoria descriptiva como si se citaran de manera individual. Todos los métodos que aquí se describen se pueden llevar a cabo de cualquier forma adecuada a no ser que quede indicado en la presente descripción o lo contradiga claramente el contexto. El uso de cada uno y todos los ejemplos, o las referencias a ejemplos (v.g., tal como) que aparecen en la descripción tienen como único fin aclarar la invención y no se pretende con ello imponer ninguna limitación al alcance de la invención a no ser que se reivindique de otra forma. Ninguna expresión en la memoria descriptiva deberá interpretarse como indicadora de ningún elemento que no se reivindique como esencial de la práctica de la invención.

Se han descrito aquí los modos de realización preferibles de la presente invención, incluyendo el mejor modo de realización que los autores de la invención consideran para llevar a cabo la invención. Las personas especializadas en este campo podrán deducir variaciones de los modos de realización preferibles tras la lectura de la presente descripción. Los autores de la invención prevén que las personas especializadas en este campo empleen dichas variantes según sea apropiado, y los autores de la invención tienen previsto que que la invención se ponga en práctica de otra forma que la que se describe de manera específica aquí. Por consiguiente, la presente invención incluye todas las modificaciones y equivalentes del tema sujeto citado en las reivindicaciones adjuntas según lo permite la legislación aplicable. Por otra parte, toda combinación de los elementos que se han descrito en todas las variaciones posibles de las mismas, queda abarcado por la presente invención a no ser que se indique de otra forma o lo contradiga claramente el contexto.

<110> Cruz Roja americana

\hskip1cm

soukharev, serguei

\hskip1cm

Hammond, David

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> SUSTRATOS FLUORESCENTES PARA DETECTAR ACTIVIDAD DE ENZIMA ORGANOFOSFATASA

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<130> 227959

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<150> 60/463.317 <151> 2003-04-17

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/487.935 <151> 2003-07-18

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<160> 2

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Organismo desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagaattcca ccatggcgaa gctgattgcg ctc

\hfill

33

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<210> 2

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Desconocido

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<220>

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<223> Organismo desconocido

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

aatctagatt agagctcaca gtaaagagct ttgtg

\hfill

35

Claims (13)

1. Un compuesto de fórmula II:

4

en la que:

R^{11}-R^{14} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo de C_{1}-C_{6}, cicloalquilo de C_{5}-C_{8}, haloalquilo de C_{1}-C_{6},, perfluoroalquilo de C_{1}-C_{6}, alquenilo de C_{2}-C_{6}, y alquinilo de C_{2}-C_{6}, y arilo, arilcarbonilo y heteroarilo, que pueden estar sustituidos opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, ciano, nitro, halo, amino, amido, azido, acetal, cetal, imido, sulfo, sulfonilo, sulfinilo, tiocianato, aldehído, ceto, carbamoílo, uretano, ureido y guanidino;

X^{4}-X^{9} son independientemente O ó S;

n y m son 0 ó 1, pero m y n no pueden ser 0 simultáneamente; y

R^{15}-R^{24} pueden ser H o cualquier sustituyente, siempre y cuando el compuesto de fórmula II tras la hidrólisis proporcione un compuesto fluorescente.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que la hidrólisis tiene lugar en los enlaces P-X^{6} y/o P-X^{9}.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que m y n son 1.

4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{15}-R^{24} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, hidroxilo, ciano, nitro, halo, amino, amido, azido, acetal, cetal, imido, sulfo, sulfonilo, sulfinilo, sulfometilo; una sal de sulfometilo, tiocianato, aldehído, ceto, carbamoílo, uretano, ureído, guanidino, alquil C_{1}-C_{6} amino, acil C_{1}-C_{6} amino, alquil C_{1}-C_{6} amino, alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, alquiltio de C_{1}-C_{6}, cicloalquilo de C_{5}-C_{8}, haloalquilo de C_{1}-C_{6}, perfluoroalquilo de C_{1}-C_{6}, formilo, carboxamida de fórmula -(C=O)NR^{1}R^{2} siendo R^{1} y R^{2} independientemente H, alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un arilo, o R^{1} y R^{2} tomados en combinación forman un anillo de 5 ó 6 eslabones saturado que tiene la fórmula -(CH_{2})_{2}-M-(CH_{2})_{2}- en la que la fracción M del anillo es un enlace simple, un átomo de oxígeno, un grupo metileno, o una amina secundaria -NR^{7}, siendo R^{7} H o alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un arilo, o R^{1} y R^{2} tomados en combinación forman un anillo de 5 ó 6 eslabones saturado que tiene la fórmula -(CH_{2})_{2}-M-(CH_{2})_{2}- en la que la fracción M del anillo es un enlace simple, un átomo de oxígeno, un grupo metileno, o una amina secundaria -NR^{7}, siendo R^{7} H o alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, halocicloalquilo de C_{5}-C_{8}, hidroxialquilo de C_{1}-C_{6}, hidroxicicloalquilo de C_{5}-C_{8}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{2}-C_{6} carbonilo, alcoxi C_{2}-C_{6}carbonil alquilo C_{1}-C_{6}, carboxi alquilo C_{1}-C_{6}, carboxi alcoxi C_{1}-C_{6}, dicarboxi alquilo C_{1}-C_{6}, dicarboxi alcoxi C_{1}-C_{6}, cianoalquilo C_{2}-C_{6}, fósfonoalquilo C_{1}-C_{6}, fosforil alquilo C_{1}-C_{6}, mono- di y trisacáridos, ácidos nucleicos, oligonucleotidos, amino ácidos, péptidos, y proteínas y alquenilo de C_{2}-C_{6}, alquinilo de C_{2}-C_{6}, arilo, arilcarbonilo y heteroarilo, que pueden estar sustituidos opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, ciano, nitro, halo, amino, amido, azido, acetal, cetal, imido, sulfo, sulfonilo, sulfinilo, tiocianato, aldehído, ceto, carbamoílo, uretano, ureido y guanidino.

5. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{11}-R^{14} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo de C_{1}-C_{6}, alquenilo de C_{2}-C_{6}, y alquinilo de C_{2}-C_{6}, arilo y heteroarilo.

6. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{11}-R^{14} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo de C_{1}-C_{6}, alquenilo de C_{2}-C_{6}, y alquinilo de C_{2}-C_{6}.

7. El compuesto de la reivindicación 1, en el que los grupos R^{11}-R^{14} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo de C_{1}-C_{6}.

8. El compuesto de la reivindicación 1, en el que R^{11}-R^{14} son etilo.

9. El compuesto de fórmula II:

5

en la que X^{4}-X^{9} son O, R^{15}-R^{24} son H, R^{11}-R^{14} son etilo; y m y n son 1.

10. Un compuesto de fórmula II:

6

en la que X^{4}, X^{5}, X^{7} y X^{8} son O; X^{6} y X^{9} son S; R^{15}-R^{24} son H; R^{11}-R^{14} son etilo; y m y n son 1.

11. Un método para detectar y/o medir de manera específica y selectiva la actividad de una enzima de organofosfatasa en un fluido que contiene al menos organofosfatasas y fosfatasas, comprendiendo dicho método:

(a) contacto del fluido con un compuesto de fórmula II:

7

en la que:

R^{11}-R^{14} se seleccionan del grupo que consiste en H y grupos o átomos distintos a H, X^{4}-X^{9} son independientemente O ó S, n y m son 0 ó 1, pero m y n no pueden ser 0 simultáneamente, y R^{15}-R^{24} pueden ser H o cualquier sustituyente siempre y cuando el compuesto de fórmula II tras la hidrólisis proporcione un producto fluorescente;

(b) recogida del producto fluorescente;

(c) medida de la fluorescencia de un producto fluorescente formado durante el contacto; y

(d) correlación de la fluorescencia medida con la actividad de la enzima organofosfatasa.

12. Un método para detectar selectivamente una enzima de organofosfatasa en una muestra que contiene presuntamente una organofosfatasa y una fosfatasa que comprende:

(a) contacto de la muestra con un compuesto de fórmula II:

8

en la que:

R^{11}-R^{14} se seleccionan del grupo que consiste en H y grupos o átomos distintos a H, X^{4}-X^{9} son independientemente O ó S, n y m son 0 ó 1, pero m y n no pueden ser 0 simultáneamente, y R^{15}-R^{24} pueden ser H o cualquier sustituyente siempre y cuando el compuesto de fórmula II tras la hidrólisis proporcione un producto fluorescente;

(b) recogida del producto fluorescente;

(c) medida de la fluorescencia de un producto fluorescente formado durante el contacto; y

(d) correlación de la fluorescencia medida con la actividad de la enzima organofosfatasa.

13. Un método para detectar y/o medir específica y selectivamente la actividad de una enzima organofosfatasa inmovilizada en un soporte que comprende:

(a) contacto del soporte con un compuesto de fórmula II:

9

en la que:

R^{11}-R^{14} se seleccionan del grupo que consiste en H y grupos o átomos distintos a H, X^{4}-X^{9} son independientemente O ó S, n y m son 0 ó 1, pero m y n no pueden ser 0 simultáneamente, y R^{15}-R^{24} pueden ser H o cualquier sustituyente siempre y cuando el compuesto de fórmula II tras la hidrólisis proporcione un producto fluorescente;

(b) recogida del producto fluorescente;

(c) medida de la fluorescencia de un producto fluorescente formado durante el contacto; y

(d) correlación de la fluorescencia medida con la actividad de la enzima organofosfatasa.