DE60016275T2

DE60016275T2 - Helicobacter pylori antigene in blut

Info

Publication number: DE60016275T2
Application number: DE60016275T
Authority: DE
Inventors: Sui Ching YI; Chung-Ho Hung
Original assignee: Joy Biomedical Corp
Current assignee: Joy Biomedical Corp Taoyuan Tw
Priority date: 1999-12-14
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2020-12-15
Also published as: US20050009108A1; EP1238279A1; US7270982B2; JP2003517483A; ATE283482T1; AU2261001A; WO2001044815A1; TWI237695B; US6794153B2; DE60016275D1; US20020090660A1; EP1238279B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG:
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Auffinden von Helicobacter pylori (H. pylori)-Antigenen und Antigenfragmenten davon im Blut, was Gesamtblut, Plasma und Serum einschließt. Die im Blut gefundenen H. pylori-Antigene schließen H. pylori-DNA, -RNA oder Fragmente davon oder H. pylori-Proteine/Peptide oder andere Antigenkomponenten davon ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. H. pylori-DNA oder Fragmente davon werden durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR), durch DNA-Hybridisierung, durch den Verzweigungs-DNA-Signalverstärkungs-Test oder durch andere Signalverstärkungsmethoden detektiert. H. pylori-RNA davon werden durch die PCR, durch die Hybridisierung oder durch andere Signalverstärkungstests detektiert. H. pylori-Proteine oder -Peptide oder andere Antigenkomponenten davon werden durch Immunoassays oder Immunoblotting unter Verwendung eines Affinitäts-gereinigten Antikörpers gegen H. pylori detektiert. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf das Diagnostizieren einer H. pylori-Infektion durch Detektion des H. pylori-Antigens im Blut.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gramnegatives Bakterium, das die Magenschleimhaut infiziert und meistens für die peptische Geschwürerkrankung (peptische Ulkus-Erkrankung, PUD) verantwortlich. Bis vor kurzem wurde angenommen, daß Geschwüre und andere Formen der Dyspepsie mit Streßgraden oder Eßgewohnheiten in Beziehung stehen. Kürzlich haben medizinische Kreise bestätigt, daß H. pylori das ursächliche Agens für bestimmte Formen von Magenleiden ist, einschließlich von Geschwüren und Magenkrebs. Die Ausrottung von H. pylori unterstützt das Heilen von Geschwüren und vermindert das Auftreten von Krebs und PUD deutlich.
H. pylori verursacht die meisten Magen- und Duodenalgeschwüre sowie die peptische Ulkus-Erkrankung (PUD). Die Verknüpfung von H. pylori und PUD wurde zuerst durch die australischen Mediziner Warren und Marshall 1984 entdeckt und veröffentlicht (Lancet I: 1311–1344). Die H. pylori-Infektion wird nun als die häufigste Ursache der Gastritis anerkannt und ist etiologisch beim Magengeschwür, Duodenalgeschwür, dem Magenadenokarzinom und dem Primären B-Zell-Lymphom involviert.
Es hat sich gezeigt, daß die PUD heilbar ist, und zwar ziemlich leicht. Die Ursache von PUD ist meistens eine Infektion mit H. pylori. Die H. pylori-Infektion wird jedoch nicht routinemäßig diagnostiziert, möglicherweise weil Methoden des Testens der H. pylori-Infektion für Mediziner nicht zufriedenstellend sind, insbesondere für Erste-Hilfe-Mediziner (d.h. einem invasiven Biopsietest). Deshalb neigten erst Mediziner dazu, symptomatische Patienten mit antisekretorischen Mitteln zu behandeln.
Mediziner benötigen einen einfachen, genauen und kostengünstigen Diagnosetest der H. pylori-Infektion, so daß sie wissen, wann Patienten zu behandeln sind und wann die Patienten an einen Gastroenterologen zu überweisen sind. Die gegenwärtig verfügbaren H. pylori-Tests, die in invasive Tests und nicht-invasive Tests unterteilt werden können, sind jedoch nicht vollständig zufriedenstellend.
Die invasiven Tests benötigen die Verwendung eines Endoskops, gefolgt von einer Biopsieprozedur. Die durch die Biopsieprozedur entnommenen Gewebeproben können dann mittels Kultur-, Histologie- oder Urease-Tests analysiert werden.
Obgleich das Kultivieren der Biopsieproben die zuverlässigsten Ergebnisse der H. pylori-Testung liefern, liegen die Berichte von Erfolgsraten in einem guten Labor lediglich zwischen 70% und 80% (Han, S. W., et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. (1995), 14: 349–352). Die histologische Untersuchung speziell angefärbter Biopsieproben können einen direkten Beleg von akuten oder chronischen Entzündungsschleimzellen und Läsionen liefern. Dies erfordert jedoch die Zusammenarbeit von sowohl einem Endoskopisten und einem Pathologen (Genta, R. M., et al., Hum. Pathol. (1994), 25: 221–226). Ureaseschnelltests detektieren den Anstieg im pH aufgrund von Ammoniak, der durch die H. pylori Urease erzeugt wurde, die Harnstoff in Ammoniak und Kohlendioxid spaltet. Dies erfordert jedoch eine hohe Bakteriendichte, und alles, was die Bakterienlast verringert, kann zu einem falsch-negativen Ergebnis führen (Cutler, A. F., Am. J. Med. (1996), 100: 35S–39S).
Seit 1990 sind eine Reihe nicht-invasiver Tests entwickelt worden, um das Vorliegen einer H. pylori-Infektion zu detektieren. Der Harnatmungstest zum Beispiel basiert auf der Urease-Aktivität des Organismus, die mit ¹³C oder ¹⁴C markierten Harnstoff in nicht-radioaktives ¹³CO₂ oder radioaktives ¹⁴CO₂ spaltet. Der Harnstoffatmungstest wird zur Bestätigung der Ausrottung von H. pylori vier Wochen nach der Therapie breit empfohlen.
Die US-Patentnummern 5716791, 5871942 und 5932430 offenbaren Immunoassays zum Nachweisen von H. pylori-Antigenen in Stuhlproben unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, der aus der Sensibilisierung von Tieren mit H. pylori-Zellen (d.h. dem ATCC-Stamm 43504) erhalten wurde. Der Antikörper wird über DEAE-(Diethylaminoethyl-Cellulose)-Säule gereinigt. Obgleich berichtet wurde, daß der Stuhlantigentest zufriedenstellend ist, hat sich die Sammlung und Prozessierung der Stuhlproben als schwierig und unangenehm erwiesen. Viele Patienten sträuben sich, dem Mediziner aufgrund des starken Geruchs und dem Fehlen einer bequemen Sammelvorrichtung Stuhlproben bereitzustellen.
Das serologische Testen von Serum auf H. pylori-Antikörper unter Verwendung eines ELISA ist ein anderer weit verbreiteter Test. Beispiele der letzteren Techniken können in dem US Patent Nr. 5262156 und dem EP-Patent Nr. 0329570 gefunden werden. Es gab mehrere Hauptantigene, die beim Nachweis von H. pylori-Antikörpern identifiziert und in Immunoassays verwendet wurden. Diese Assays haben jedoch nicht die Spezifität und die Empfindlichkeit gezeigt, die bei der Serodiagnose erwünscht sind (Newell, D. G., et al., Serodian. Immunother. Infec. Dis., (1989), 3: 1–6). Eines der Probleme rührt von der Kreuz-Reaktivität her. Dies deshalb, weil die dominanten Antigene im H. pylori (z.B. das angebliche Flagellenprotein, das ein Molekulargewicht von 60 Da aufweist) nicht spezifisch für H. pylori sind. Einige dieser Antigene können in anderen Bakterien wie C. jeuni und C. coli gefunden werden. Ein zweites Problem, das beim Aufbau von Immunoassays für H. pylori zum Tragen kam, ist die Stammvariation. Substantielle Unterschiede in den Antigenen sind in verschiedenen Stämmen von H. pylori beobachtet worden. Diese Probleme schließen den Aufbau eines Assays um die Verwendung eines einzigen Antigens herum aus. Ein Weg, der zur Verbesserung der Spezifität und Selektivität von Antikörper-Immunoassays für H. pylori unternommen wurde, bestand in der Verwendung einer Mischung von Antigenen aus verschiedenen H. pylori-Stämmen, die mit bestimmten Antigenfragmenten angereichert waren. Ein ELISA, der H. pylori-Antikörper in Blutseren detektiert, ist kommerziell erhältlich. Dieser Assay verwendet ein bakterielles Gesamtzell-Lysat als dem Antigen.
Es gibt andere Nachteile der Verwendung eines ELISA, der Antigene zum Nachweisen des Auftretens von H. pylori-Antikörpern im Serum anwendet. Speziell bleibt der Antikörpertiter in menschlichem Serum für eine ausgedehnte Dauer hoch (in einigen Fällen sogar zwölf Monate), nachdem die Infektion behandelt wurde.
Folglich bedeutet ein positiver Test unter Verwendung dieses ELISA nicht notwendigerweise, daß der Patient laufend infiziert ist und eine Behandlung der H. pylori-Infektion benötigt. Wenn sie mit einem positiven ELISA konfrontiert sind, ordnen behandelnde Mediziner häufig eine Magenbiopsie an, um die Anwesenheit der Bakterien zu bestätigen, bevor eine Antibiotikatherapie begonnen wird. Deshalb beseitigt der Antigen-basierte ELISA nicht den Bedarf für die invasive Prozedur.
Es ist deshalb die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen nicht-invasiven und sehr genauen diagnostischen Test der H. pylori-Infektion zu schaffen. Im Verlauf der Untersuchung werden H. pylori-Antigene im Blut gefunden, die in Form von DNA oder Fragmenten davon oder von Proteinen/Peptiden oder antigenen Komponenten davon im Blut existierend vorliegen, einschließlich Gesamtblut, Plasma und Serum. Somit werden spezielle Methoden zum Nachweisen dieser H. pylori-Antigene ausgestaltet, um den Beleg dafür zu liefern, daß antigene Fragmente von H. pylori im Blut existieren. Diese Methoden schließen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR) und die DNA-Hybridisierung zum Nachweisen von Nukleinsäurefragmenten von H. pylori unter Verwendung von Primern oder Oligonukleotiden, die für H. pylori spezifisch sind, und/oder DNA-Sonden, die aus H. pylori-Stämmen stammen, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zusätzlich werden Immunoassays und Immunblotten ebenfalls zum Nachweis von Proteinen/Peptiden oder irgendwelchen antigenen Komponenten von H. pylori unter Verwendung eines Affinitäts-gereingten Antikörpers gegen H. pylori entwickelt.
Der Artikel von J.-J. Lu et al. in Journal of Clinical Microbiology, März 1999, S. 772–774 berichtet über einen Vergleich von fünf PCR-Methoden zum Detektieren von Helicobacter pylori-DNA im Magengewebe.
Die WO 00 29432 A1, die einen Stand der Technik gemäß Artikel 158(2) und 54(3) und (4) EPÜ darstellt, offenbart den Nachweis von H. pylori-Antigenen im Blut unter Verwendung von Antikörpern.
Bisher gab es keinen Bericht bezüglich der Existenz von H. pylori-Antigenen im Blut. Die vorliegende Erfindung ist die erste, die nachweist, daß H. pylori-Antigene nicht nur im Blut existieren, sondern auch durch die in den folgenden Abschnitten gezeigten Methoden nachgewiesen werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen von Helicobacter pylori (H. pylori) gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 4, 7, 11 und 17 bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweisen von H. pylori-Antigenen bereit, die im Blut des Patienten vorliegen und die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR), die DNA-Hybridisierung, die RNA-Hybridisierung, den Verzweigungs-DNA-Test, das Immunblotten, und durch Immunoassay nachgewiesen werden können. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso diagnostische Kits zum Nachweisen von H. pylori in einer Serumprobe gemäß den Ansprüchen 30 bis 34 sowie eine Vorrichtung für einen immunochromatographischen Assay gemäß Anspruch 36 zur Verfügung. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen zu den jeweiligen obigen Ansprüchen festgelegt.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck "Antigene" schließt im breiten Sinne jegliche Substanzen ein, die direkt oder indirekt in der Lage sind, unter passenden Bedingungen eine spezifische Immunantwort zu induzieren und mit Produkten der Immunantwort, das heißt mit spezifischen Antikörpern oder spezifisch sensibilisierten T-Lymphozyten oder mit beidem zu reagieren. Beispiele dieser Substanzen schließen Proteine/Peptide, Polysaccharide, Lipide und Poly- oder Oligonucleotide ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Es gibt insbesondere zwei spezielle Arten von H. pylori-Antigenen, die im Blut nachgewiesen werden können. Die erste Art bezieht sich auf Polynucleotide oder Oligonucleotide, die chromosomale DNA, RNA oder Fragmente davon aus H. pylori sind. Diese Art von H. pylori kann durch die Methoden der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der Ligase-Kettenreaktion (LCR) und der Hybridisierung (vorzugsweise Punkt-DNA-Hybridisierung) oder andere Vervielfältigungsmethoden nachgewiesen werden.
Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellte PCR-Methode erfordert die Verwendung eines Paars von Primern, die zum Nachweis von H. pylori spezifisch sind. Der hier verwendete Ausdruck "Primer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid – egal ob natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt – das in der Lage ist, als ein Initiationspunkt der Nucleinsäuresynthese zu wirken, wenn er unter Bedingungen angebracht wird, in denen eine Synthese eines Primerprodukts der zu einem Nucleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird, d.h. in Gegenwart der vier verschiedenen Nucleotidtriphosphate mit passenden Enzymen bei einer geeigneten Temperatur. Der hier verwendete Ausdruck "Oligonucleotid" wird definiert als ein Molekül, das zwei oder mehr Deoxyribonucleotide und/oder Ribonucleotide, vorzugsweise mehr als drei umfaßt. Seine exakte Länge hängt von vielen Faktoren ab, die ihrerseits von der Zielfunktion oder der Verwendung des Oligonucleotids abhängen. Das Oligonucleotid kann aus einer Synthese oder einer Klonierung stammen.
Die Primer werden auf der Basis einer konservierten Sequenz hergestellt, die in Konsensus-Fragmenten von H. pylori-Stämmen wie den ATCC-Stämmen 43504, 43571, 43629 und 49053 gefunden werden. Der bevorzugte Primerbereich reicht von 15 bis 25 Basenpaaren (BP), ist am günstigsten etwa 20 BP lang. Eine bessere Vervielfältigung kann erhalten werden, wenn beide Primer (Vorwärts- und Rückwärts-Primer) die gleiche Länge haben und grob gesagt dieselbe Nucleotidzusammensetzung aufweisen. Die bevorzugte Blutprobe für die PCR ist Plasma.
Die mit der vorliegenden Erfindung bereitgestellte LCR-Methode erfordert die Verwendung einer DNA-Ligase und zwei Sätze von Oligonucleotiden, die für H. pylori spezifisch sind. Die bevorzugte DNA-Ligase ist die Pfu-DNA-Ligase, die eine aus Pyrococcus furiosus isolierte, thermostabile DNA-Ligase ist und kommerziell erhältlich ist. Die zwei Sätze von Oligonucleotiden für die LCR sind vorzugsweise in der Länge länger als die Primer für die PCR. Wie die PCR-Primer stammen die LCR-Oligonucleotide aus einer konservierten Sequenz der Konsensus-Fragmente von H. pylori-Stämmen, wie den ATCC-Stämmen 43504, 43571, 43629 und 49053.
Die LCR wird durch wiederholte Zyklen einer Hitzedenaturierung eines eine Zielsequenz enthaltenden DNA-Templates, einem Annealen eines ersten Satzes von zwei nebeneinander liegenden Oligonucleotidsonden mit der Ziel-DNA-Sequenz auf einzigartige Weise sowie eines zweiten Satzes von komplementären Oligonucleotidsonden, die mit der der Ziel-DNA-Sequenz gegenüberliegenden Sequenz hybridisieren, durchgeführt. Der hier verwendete Ausdruck "Zielsequenz" bezieht sich auf die "chromosomale DNA oder Fragmenten davon", die in Blutproben gefunden wird. Danach kann die DNA-Ligase jedes Paar von nebeneinander liegenden Sonden kovalent verknüpfen, vorausgesetzt, eine vollständige Komplementarität an der Verknüpfungsstelle der zwei nebeneinander liegenden Sonden liegt vor.
Die Hybridisierungsmethode erfordert die Herstellung einer H. pylori-DNA-Sonde. Die H. pylori-DNA-Sonde wird hergestellt, indem DNA-Fragmente aus H. pylori-Nucleinsäurenextrakten nach einer Agarose-Gelelektrophorese ausgeschnitten und extrahiert wird. Die Sonde besitzt normalerweise mindestens 25 Basen, gewöhnlicher mindestens etwa 30 Basen, und kann bis zu etwa 10.000 Basen oder mehr, gewöhnlicherweise nicht mehr als etwa 5.000 Basen, aufweisen. Dieses DNA-Fragment wird dann mit Restriktionsendonukleasen verdaut und mit einem Vektor ligiert, um ein rekombinantes Plasmidkonstrukt zu bilden, das eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen transformieren kann. Das DNA-Fragment kann in Wirtszellen vervielfältigt und erneut isoliert werden. Das vervielfältigte DNA-Fragment kann dann mit einem Radioisotop (wie etwa ³²P, ³H, ¹⁴C oder dergleichen) oder mit Fluoreszenz (wie mit der Verwendung von Digoxigenin- und Biotin-markierten DNA-Sonden, die mit Fluoreszenz-Detektionsmethoden gekoppelt werden) markiert und als eine DNA-Sonde verwendet werden.
Die Hybridisierungsmethode wird durchgeführt, indem die Nucleinsäurenprobe aus dem Blut, vorzugsweise Serum, mit einem Denaturierungsagens zur Denaturierung von DNA auf einem Festphasenträger wie einem Nitrocellulose-Filter behandelt wird. Das bevorzugte Denaturierungsagens schließt eine Alkalilösung, erhöhte Temperaturen, organische Reagenzien (z.B. Alkohole, Amide, Amine, Harnstoffe, Phenole und Sulfoxide) oder bestimmte anorganische Ionen (z.B. Thiocyanat und Perchlorat) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die markierte DNA-Sonde wird dann zu dem Filter, auf das die denaturierte DNA aufgebracht ist, hinzugegeben. Das Filter kann dann auf das Vorliegen von DNA-Hybriden aus der Art der Markierung heraus getestet werden. Wenn die Markierung radioaktiv ist, kann der Filter einem Röntgenfilm ausgesetzt werden. Wenn die Markierung Fluoreszenz ist, kann der Filter direkt unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops betrachtet werden.
Die zweite Art von Antigenen bezieht sich auf H. pylori-Proteine und/oder -Peptide oder irgendwelche Substanzen, die Antigenepitope enthalten, im Blut, die durch Immunoblotten oder ein Immunoassay nachgewiesen werden können, vorzugsweise unter Verwendung eines Affinitäts-gereinigten Antikörpers gegen H. pylori-Antigene. Sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper können zum Nachweis oder Messen von H. pylori-Antigenen im Blut erforderlich sein, je nach der Art der Methode, die beim Nachweis verwendet wird. Ein primärer Antikörper ist ein Antikörper, der gegen ein Antigen gezogen wurde, was im vorliegenden Fall das H. pylori-Antigen ist. Der sekundäre Antikörper ist ein Antikörper gegen das Immunglobulin einer Spezies, die einen primären Antikörper produziert (etwa Ziege-Anti-Kaninchen-IgG). Die bevorzugte Blutprobe für diesen Nachweis ist Serum.
Die Immunoblottingmethode wird durchgeführt, indem zuerst eine Blutprobe mit SDS-PAGE analysiert wird. Nach der Elektrophorese werden die Protein/Peptid-Banden auf einen Nitrocellulose-Filter übertragen, der dann mit einer ausreichenden Menge eines Anti-H. pylori-Antikörpers inkubiert wird. Dem Nitrocellulose-Filter kann ein Enzym-konjugierter sekundärer Antikörper gegen das Immunglobulin der Tierspezies, die das Anti-H. pylori produziert, hinzugefügt werden. Eines der bevorzugten Enzyme für diese Methode ist die Alkalische Phosphatase, wobei die Reaktion durch Zugabe von 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat nachgewiesen werden kann. Ein anderer bevorzugter Enzymmarker, der bei dieser Methode verwendet wird, ist die Meerrettich-Peroxidase, die durch Hinzufügen von 4-Chlor-1-Naphthol, Tetramethylbenzidin oder 3,3'-Diaminobenzidin zum Erzeugen eines gefärbten unlöslichen Produkts zur Sichtbarmachung nachgewiesen werden kann.
Die Immunoassaymethoden schließen einen Basis-Sandwich-Assay, einen Triple-Sandwich-Assay und einen immunochromatographischen Assay ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Beim Basis-Sandwich-Assay sind zwei primäre Antikörper erforderlich, von denen einer an einen festen Träger gebunden ist und der andere mit einem Nachweisagens markiert ist. Der Triple-Sandwich-Assay erfordert die kombinierte Verbindung von zwei primären Antikörpern (nämlich dem ersten Antikörper und dem zweiten Antikörper) gegen H. pylori, von denen nur ein primärer Antikörper an einen festen Träger gebunden sein muß, so wie einen sekundären Antikörper gegen das IgG der den ungebunden primären Antikörper produzierenden Tierspezies, um einen Komplex gegen den Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Der sekundäre Antikörper ist mit einem Detektionsagens markiert.
Der feste Träger für die Sandwich-Assays kann durch Kunststoffkügelchen, Polyethylen, Polystyrol, Polypropylen etc. gebildet sein. Das Nachweisagens kann ein Enzymmarker (etwa Alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase), ein fluoreszentes oder lumineszentes Agens (wie Fluorescein, Rhodamin oder Europium, Luminol oder Acridium), eine Radioisotopmarkierung (etwa I¹²⁵) oder ein Farbpartikel (etwa Gold, Silber, blaues Latex oder Selen) sein.
Sowohl der Basis- als auch der Triple-Sandwich-Immunoassay erfordern die Interaktion eines ersten primären Antikörpers gegen H. pylori zum Bilden eines Antigen-Antikörper-Komplexes, gefolgt vom Kontaktieren des Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem sekundären Antikörper gegen H. pylori.
Der immunochromatographische Assay erfordert ebenfalls die kombinierte Verwendung der zwei primären Antikörper gegen H. pylori. Im Gegensatz zu den Basis- und Triple-Sandwich-Assays ist der erste Antikörper (d.h. der Antikörper, der zuerst mit der biologischen Probe in Kontakt kommt) mit Farbpartikeln markiert. Der sekundäre Antikörper ist an einen festen Träger gebunden, wie etwa einer Nitrocellulose-Membran (oder eines Nitrocellulosederivats), einer Nylon-Membran, einer Polyester-Membran, einem Filterpapier, Agarose oder einem Sephedex-Gel. Der bevorzugte feste Träger für den immunochromatographischen Assay ist die Nitrocellulose-Membran. Wahlweise kann ein sekundärer Antikörper gegen die den ersten Antikörper produzierende Tierspezies zu dem festen Träger in der Nähe des Endes des Chromatographiestreifens, gegenüber der Probenzugabestelle, hinzugefügt und/oder daran gebunden werden. Dieser sekundäre Antikörper wird als Kontrolle zum Einfangen der ungebundenen Farbpartikel am Ende des Chromatographielaufs verwendet. Somit wird der Farbpartikel-markierte erste Antikörper, wenn die Probe H. pylori-Antigene nicht enthält, durch den sekundären Antikörper, ohne daran gebunden zu werden, durchlaufen, weil kein Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird. Da der sekundäre Antikörper jedoch gegen das IgG des Tiers, das den ersten Antikörper produziert, gerichtet ist, wird er an den ersten Antikörper binden, wenn er durchläuft, egal ob der erste Antikörper mit der Probe einen Komplex gebildet hat oder nicht. Das Binden zwischen dem ersten Antikörper und dem sekundären Antikörper zeigt das Ende des immunochromatographischen Laufs an.
Eines der Probleme beim Befassen mit Serumproben besteht darin, daß ein mit H. pylori infizierter Patient häufig H. pylori-Antikörper in seinem/ihrem Serum trägt. Diese Serum-H. pylori-Antikörper können Immunkomplexe mit den Serum-H. pylori-Antigenen bilden, was einen Einfluß auf die Genauigkeit der Immunassys der vorliegenden Erfindung haben kann. Wege zur Dissoziierung der H. pylori-Immunkomplexe schließen das Dissoziieren der Komplexe mit einem Dissoziier-Reagens oder unter einer Probendissoziations-Bedingung ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Beispiele des Dissoziier-Reagens schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf starke Salze (z.B. mindestens 1 M NaCl oder KCl), Detergenzien (z.B. mindestens 1% von SDS, Tween 20, Octylglucosid, Deoxycholat oder Triton X-100), chaotrope Agenzien (z.B. Guanidin-HCl, Harnstoff oder KSCN), organische Lösungsmittel (z.B. Dioxan oder Ethylenglycol), Enzyme (z.B. Proteasen [etwa Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, V8-Protease und Subtilisin] oder Lipasen [etwa Lipoproteinlipase aus Rindermilch, und Lipase aus Candida rugosa]). Beispiele einer Probendissoziationsbedingung schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf hohen pH (z.B. pH ≥ 9) oder niedrigen pH (z.B. pH ≤ 3) und/oder erhöhte Temperatur (z.B. mindestens 50°C).
Ferner kann die Dissoziier-behandelte Serumprobe mit einem Protein basierten Reagens behandelt werden, um eine Kreuzreaktivität zu minimieren. Das bevorzugte Protein-basierte Reagens enthält mindestens eines der folgenden Proteine: fötales Rinderserum, Schweineserum, normales Ziegenserum, Pferdeserum, Kasein, Albumin, Gelatine und Rinderserumalbumin.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
Obgleich zahlreiche Versuche berichtet wurden, die quantitative und qualitative Messungen zur H. pylori-Infektion in Patienten liefern, ist keiner auf das Testen von H. pylori in Blutproben gerichtet. Der Hauptgrund besteht darin, daß keiner der Untersuchenden jemals vermutet hat, daß H. pylori-Antigene im Blutstrom gefunden werden könnten.
In den Tabellen (d.h. Tabellen 1–3), die im Rahmen der Beispiele 9 (Tabelle 1) und 11 (Tabellen 2 und 3) unten noch vorzustellen sind, werden jedoch Belege zeigen, daß H. pylori-Antigene in Serumproben von Patienten mit einer H. pylori-Infektion gefunden werden können und gefunden worden sind.
Auf der Basis dieser Erkenntnisse besteht der Gegenstand der vorliegenden Erfindung darin, die nachweisbaren H. pylori-Antigene im Blut als Werkzeuge zum Diagnostizieren von H. pylori-Infektionen zu nutzen. Die diagnostischen Verfahren, die zum Nachweisen unterschiedlicher Arten von H. pylori-Antigenen verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ligase-Kettenreaktion (LCR), den Verzweigungs-DNA-Vervielfältigungsassay, den Hybridisierungsassay, das Immunoblotting, die Immunopräzipitation, die Durchflußcytometrie, die Immunoelektrophorese und Immunoassays (z.B. enzym-verknüpfter Immunosorbensassay [ELISA], Radioimmunoassay [RIA] und Immunchromatographie).
Die PCR ist eine Technik, die spezifische DNA-Sequenzen mit beachtlicher Effizienz amplifiziert bzw. vervielfältigt. Wiederholte Zyklen der Denaturierung, Primer-Anlagerung und -Verlängerung, die mit einer Polymerase, z.B. einem hitzestabilen Taq-Polymerase-Enzym, durchgeführt wird, führen zur exponentiellen Zunahme der Konzentration der gewünschten DNA-Sequenzen. Jede der DNA-Sequenzen kann durch Agarose Gelelektrophorese aufgetrennt werden, gefolgt durch die Nucleinsäure-Sequenzierung. Die bevorzugte Art der Blutprobe für die PCR ist das Plasma. Dies deshalb, weil die Häm-Moleküle aus dem innerhalb der roten Blutzellen enthaltenen Hämoglobin mit der PCR-Vervielfältigung interferieren kann, falls eine Hämolyse auftritt.
Die Lipase-Kettenreaktion (LCR) ist eine DNA-Vervielfältigungstechnik, die zum Nachweisen von Spurenmengen bekannter Nucleinsäure-Sequenzen verwendet werden kann. Die LCR beinhaltet eine zyklische Zweischritt-Reaktion: (1) einen Hochtemperatur-Aufschmelzschritt, bei dem doppelsträngige Ziel-DNA entbunden wird, um einzelsträngig zu werden, und (2) einen Kühlschritt, bei dem zwei Sätze von nebeneinanderliegenden, komplementären Oligonucleotiden an die einzelsträngigen Ziel-Moleküle anbinden und mit der DNA-Lipase zusammen ligiert werden. Die Ligierungsprodukte aus einem Zyklus dienen als Template für die Ligierungsreaktion im nächsten Zyklus. Die LCR führt zur exponentiellen Vervielfältigung der Ligationsprodukte auf eine Weise, die zur exponentiellen Vervielfältigung des Templates bei der PCR-Reaktion analog ist.
Sowohl die PCR als auch die LCR erfordert das Auffinden von H. pylori-spezifischen Primern oder Oligonucleotiden, um die Nucleinsäure-Kettenreaktion zu initiieren. Da H. pylori-Stämme auf der genetischen Ebene stark divergieren (Fujimoto et al., J. Clin. Microbiol., (1994), 32: 331–334) und da ein Individuum mit mehr als einem Stamm infiziert sein kann, ist es deshalb maßgeblich, Primer oder Oligonucleotide auf der Basis der konser vierten Sequenz von Konsensus-Fragmenten, die in unterschiedlichen H. pylori-Stämmen gefunden werden, zu entwickeln.
H. pylori-Zellen aus dem ATCC-Stamm 43504 wurden als besonders nützlich zur Produktion von primären Antikörpern gegen H. pylori in Stuhlproben gefunden (siehe U.S. Patent Nr. 5716791). Dies deshalb, weil die Antikörper, die durch Sensibilisierung unter Verwendung von Zellen aus dem 43504-Stamm erzeugt wurden, den Organismus über geographische Regionen und Ernährungsgewohnheiten hinweg nachgewiesen werden können. Andere H. pylori-Stämme, wie etwa ATCC 43571, 43629 und 49053, haben eine ähnliche Antigenfähigkeit gezeigt. Deshalb ist es lohnend, Konsensus-Fragmente unter diesen Stämmen zu finden. Dies kann ausgeführt werden, indem die extrahierten Nucleinsäuren aus den oben erwähnten H. pylori-Stämmen mit der (den) gleichen Restriktionsendonuclease(n) extrahiert werden, gefolgt durch ein Durchlaufen der verdauten H. pylori-Nucleinsäurefragmente durch eine Agarose-Gelelektrophorese. Die Konsensus-Fragmente können herausgeschnitten und extrahiert werden. Die Nucleotid-Sequenzen der Konsensus-Fragmente können analysiert werden. Die konservierte Sequenz der Konsensus-Fragmente kann dann zum Entwickeln der Primer oder Oligonucleotide für die PCR oder die LCR verwendet werden.
Zusätzlich zur PCR oder LCR kann die Gegenwart von H. pylori-Antigenen in einer Blutprobe unter Verwendung von Nucleinsäure-Hybridisierungssonden nachgewiesen werden. Die bevorzugte Nucleinsäure-Hybridisierungssonde hat nicht mehr als etwa 5.000 Basen. Die Sondensequenz ist vorzugsweise mindestens im wesentlichen komplementär zur Nucleotid-Sequenz eines Konsensus-Fragments unter den H. pylori-Stämmen. Zusätzlich zu dem in unterschiedlichen H. pylori-Stämmen gefundenen Konsensus-Fragment kann die Sonde auch von einer Messenger-RNA oder einer cDNA erhalten werden, die durch reverse Transkription der Messenger-RNA mit Reverser Transkriptase oder durch Spaltung des Genoms erhalten wurde. Nach der Isolierung und Charakterisierung der gewünschten Sonde kann das DNA-Fragment der Sonde in Wirtszellen kloniert und vervielfältigt werden. Die vervielfältigte Sonde kann dann mit einem Atom oder einem anorganischen Rest, am gewöhnlichsten unter Verwendung von Radionucleiden, aber vielleicht auch mit Schwermetallen oder mit Fluoreszenz markiert werden. Es ist möglich, einen Antikörper anzuwenden, der spezifisch an die Sonde bindet, die mit der einzelsträngigen DNA des H. pylori-Antigens hybridisiert. In diesem Fall wäre der Antikörper markiert, um die Detektion zu ermöglichen. Dieselben Arten von Markierungen, die für die Sonde verwendet werden, können auch an den Antikörper in Übereinstimmung mit bekannten Techniken gebunden werden.
Für die Markierung der Sonde kann eine radioaktive Markierung wie ³²P, ³H, ¹⁴C oder dergleichen verwendet werden, obgleich andere radioaktive Markierungen ebenfalls verwendet werden können, solange sie ein passendes Signal mit ausreichender Halbwertszeit liefern. Andere Markierungen schließen Liganden, die als spezifisches Bindungselement dienen können, Fluoroszenzmittel, Chemilumineszenzmittel, Enzyme, Antikörper, die als spezifisches Bindepaarelement für einen markierten Liganden dienen können, und dergleichen ein. Die große Vielzahl von Markierungen, die in Immunoassays verwendet werden, können ebenfalls verwendet werden. Die Wahl der Markierung ist durch den Effekt der Markierung auf die Hybridisierungsrate und das Binden der Sonde an die DNA-Probe beherrscht. Es ist nötig, daß die Markierung eine ausreichende Empfindlichkeit zum Nachweis der für die Hybridisierung verfügbaren DNA-Menge liefert. Andere Beurteilungen schließen die Einfachheit der Synthese der Sonde, die einfache Verfügbarkeit der Instrumente, die Möglichkeit der Automatisierung, die Bequemlichkeit und dergleichen ein.
Die Art und Weise, mit der die Markierung an die Sonde gebunden wird, variiert je nach Art der Markierung. Für eine radioaktive Markierung können eine Vielzahl von Techniken verwendet werden. Gewöhnlich wird eine Nick-Translation mit einem α-³²P-dNTP oder eine terminale Phosphatase-Hydrolyse mit Alkalischer Phosphatase, gefolgt von einer Markierung mit radioaktivem ³²P unter Einsatz von γ-³²P-NTP und T4-Polynucleotid-Kinase angewandt. Alternativ können Nucleotide synthetisiert werden, wobei eine oder mehrere vorliegende Elemente durch ein radioaktives Isotop, z.B. Wasserstoff durch Tritium ersetzt werden.
Enzyme, die als Markierungen interessieren, schließen Hydrolasen, insbesondere Esterasen und Glycosidasen, oder Oxidoreductasen, insbesondere Peroxidase ein. Fluoreszierende Verbindungen schließen Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon etc. ein. Chemilumineszenzmittel schließen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindione, z.B. Luminol, ein.
Die Hybridisierung wird gewöhnlicherweise durch Anwenden der Sonde auf die DNA-Probe, die an einem wasser-unlöslichen porösen Träger befestigt ist, ausgeführt. Die DNA-Probe wird denaturiert, so daß einzelsträngige Nucleinsäure befestigt ist. Zum Lysieren wird gewöhnlich ein chemisches Lysieren angewandt, normalerweise mit verdünntem mäßigem Alkali, z.B. 0,1 bis 1 M NaOH. Der Alkali kann auch zum Denaturieren der DNA dienen. Andere Denaturierungsmittel schließen erhöhte Temperaturen, organische Reagentien, z.B. Alkohole, Amide, Amine, Urease, Phenole und Sulfoxide, oder bestimmte anorganische Ionen, z.B. Thiocyanat und Perchlorat, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Blut-H. pylori-Antigene können auch durch immunologische Methoden nachgewiesen werden, die das Immunoblotten und Immunoassays (wie der Basis-Sandwich-Immunoassay, der Triple-Sandwich-Immunoassay und die Immunochromatographie) unter Verwendung eines Affinitäts-gereinigten Antikörpers gegen H. pylori einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Die bevorzugte Blutprobe ist das Serum.
Das Immunoblotten erfordert eine Fraktionierung der Blutprobe unter Verwendung einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese, gefolgt vom Übertragen der getrennten Protein/Peptid-Banden auf eine Nitrocellulose-Membran. Die getrennten Protein/Peptid-Banden werden dann mit einem primären Antikörper gegen H. pylori zum Bilden eines Antigen-Antikörper-Komplexes umgesetzt. Ein sekundärer Antikörper, der mit einem Nachweismittel markiert ist, gegen den primären Antikörper, wird dann zum Anzeigen der Nachweisreaktion hinzugefügt.
Sowohl der Basis- als auch der Triple-Sandwich-Immunoassay erfordert ein Minimum von mindestens drei Bestandteilen: einen ersten Antikörper gegen das H. pylori-Antigen, einen zweiten Antikörper gegen die H. pylori-Antigene, und eine zu testende Probe (d.h. eine Serumprobe).
Die ersten und zweiten Antikörper (d.h. gegen das H. pylori-Antigen) sind vorzugsweise polyklonale Antikörper. Dieser Antikörper kann durch Spritzen von Kaninchen oder anderen Säugern wie Ziegen oder Kühen mit H. pylori-Zellen erhalten werden, die vorzugsweise durch Ultraschall oder andere zellaufbrechenden Mittel aufgeschlossen sind, um multiple Antigenstellen zu präsentieren.
Im allgemeinen werden die Antikörper erzeugt durch anfängliche Injektion, gefolgt von anschließenden Booster-Injektionen, um die Antwort zu maximieren. Zum Erzeugen der Antikörper werden die Antigene mit Adjuvanzien zur Immunisierung von Tieren, wie etwa dem Freund'schen Adjuvans, kombiniert, um die Immunantwort zu verstärken. Die injizierte Antigenmenge muß passen, um eine ausreichende, nachweisbare Antikörpermenge hervorzurufen. Mehrfache Injektionen bei regelmäßigen Abständen können erfolgen, um die Antikörperproduktion zu optimieren. Der Plan der Injektionen hängt vom verwendeten Tier ab. Den Tieren wird Blut entnommen, wobei zunächst die Antikörperproduktion durch Testblutentnahmen abgeschätzt wird. Die Antikörperproduktion wird unter Verwendung einer Versuchsblutentnahme und eines Enzymimmunoassays (EIA) verifiziert. Die Antikörper werden durch Chromatographie, vorzugsweise eine Affinitätssäulen-Chromatographie, gereinigt.
Im Basis-Sandwich-Assay muß der sekundäre Antikörper, wenn der erste Antikörper an einen festen Träger gebunden ist, mit einem Detektionsmittel markiert sein, das irgendeine Markierung sein kann, die in bekannten Immunmeßtests verwendet wird. Zum Beispiel gehören Enzymmarker (wie Alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase etc.), fluoreszente, lumineszente oder radioaktive Markierungen (wie Fluorescein, Rhodamin, Europium, Luminol, Acridium und radioaktive Isotope I¹²⁵ etc.) oder Kolloidteilchen (wie Gold und Selen etc.) zu den Markierungen, die in den Immunassays verwendet werden können. Unter diesen Markierungen ist das gewöhnlichste die enzymatische Markierung wie mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder Alkalischer Phosphatase. Insbesondere kann die HRP-Markierung in einem Farbtest nachgewiesen werden durch Umsetzen der HRP mit Diaminobenzidin, Tetramethylbenzidin, 4-Chlor-1-Naphtol, oder durch eine ähnliche chemische Reaktion. Das Farbreaktionsprodukt kann in einem Plattenleser, Scanner, Densitometer oder durch visuelle Beobachtung nachgewiesen werden. Die Menge des H. pylori kann durch Vergleich der Proben-Lesewerte mit jenen von Standards, die eine bekannte Menge des Antigens enthalten, bestimmt werden. Bevorzugt werden mehrere Standards verwendet, um die Konzentration der Markierung in der Testprobe "einzuklammern".
Ein Radioisotop wie ¹²⁵I-Iod oder ein β-Emitter wie ¹⁴C-Kohlenstoff ist eine andere gewöhnlich verwendete Markierung, die mit Gamma-Zählern oder Szintillations-Zählern detektiert werden können. Fluoreszenzmarkierungen können ebenfalls zur Markierung von Antikörpern für die Detektion durch die Fluoroimetrie verwendet werden.
Der feste Träger kann irgendein fester Träger sein, der zur Verwendung für Immunoassays bekannt ist. Es kann ein Träger wie etwa eine Mikrotiterplatte für einen ELISA sein, die in einem Plattenleser abgelesen werden kann. Alternativ kann er einer sein, der eine chromatographische Analyse der Probe in Form einer Flüssigkeit oder in mobiler Phase solubilisiert ermöglicht. Beispiele eines solchen Trägers schließen Membrane wie Nitrocellulose oder Medien für die Säulen-Chromatographie ein.
Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele werden zur Veranschaulichung des Nachweises von H. pylori-Antigenen im Blut eingeschlossen.
BEISPIEL 1
Herstellung von H. pylori-Antigenen und -Nucleinsäuren
H. pylori-Saatvorräte von ATCC-Stämmen 43504, 43571, 43629 und 49053 wurden einzeln auf Raumtemperatur aufgetaut und mit 5 ml Brucella-Brühe verdünnt. Unmittelbar nach der Verdünnung wurden 0,2 ml der verdünnten Bakteriensuspension auf einer Trypticase-Soja-Blut-Agarplatte, die mit 5% Schafsblut versetzt war, ausgebreitet. Die Platten wurden unter Microaeroben-Bedingungen zum Wachsenlassen der Bakterien inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kolonien dann von der Platte gekratzt und zweimal mit PBS gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden dann in PBS suspendiert.
Zum Sammeln von Antigenen von jedem H. pylori-Stamm wurden H. pylori-Zellen in einen auf Eis gekühlten Behälter übertragen und einer Ultraschallbehandlung mit einem Microson XL200-Ultraschall-Zellaufschließer für 10 Minuten unterworfen. Die beschallte Bakteriensuspension wurde dann für 30 Minuten bei 2–8°C bei 25.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Verwendung als Immunogen zur Erzeugung von H. pylori-Antikörpern aufbewahrt.
Zum Sammeln von Nucleinsäuren aus jedem H. pylori-Stamm können H. pylori-Zellen unter Verwendung von 1% SDS in 100 mM Tris-HCl (pH 8,8) lysiert werden. Das Lysat kann dann einmal mit gleichem Volumen Phenol/Chloroform extrahiert werden, gefolgt von zweimaligem Extrahieren mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1). Nach den Chloroform-Phenol-Extraktionen kann die chromosomale DNA mit 0,6 Volumen Isopropanol bei Raumtemperatur gefällt werden. Nach der Zentrifugation für 15 Minuten bei 13.000 × g kann das Nucleinsäure-Pellet mit 70% Ethanol gewaschen und in 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0 aufgelöst werden.
BEISPIEL 2
Nachweis von H. pylori-DNA in Blut unter Verwendung der PCR-Amplifikation
Die aus den H. pylori-Stämmen erhaltene DNA kann mit Restriktionsendonucleasen verdaut werden. Geeignete Restriktionsendonucleasen schließen HindIII, EcoRI, BamHI, ClaI und XbaI ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die resultierenden Fragmente können auf einem Agarose-Gel in einem Tris-Acetat-EDTA-Puffer elektrophoretisiert werden. Die DNA-Fragmente können aus dem Agarose-Gel mit einem von Boehringer Mannheim (Deutschland) gekauften Agarose-Gel-Extraktionskit extrahiert werden. Da H. pylori-Stämme auf genetischer Ebene hoch diversifiziert sind, ist es vorteilhaft, die DNA-Fragmente aus jedem der H. pylori-Stämme zu vergleichen, um Konsensus-Fragmente zu finden.
Die DNA-Sequenz des Konsensus-Fragments kann auf beiden Strängen unter Verwendung von doppelsträngigen DNA-Templaten und der Dideoxy-Kettenterminationsprozedur bestimmt werden, wie durch Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 71: 1342–1346 beschrieben. Auf der Basis der konservierten Sequenz der Konsensus-Fragmente können Oligonucleotid-Primer unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers durch Befolgen des Protokolls des Herstellers synthetisiert werden. Primer für die PCR sind gewöhnlicherweise etwa 20 BP lang, und der bevorzugte Bereich ist von 15–25 BP. Eine bessere Vervielfältigung kann erhalten werden, wenn beide Primer gleich lang sind und grob dieselbe Nucleotidzusammensetzung aufweisen. PCR-Primer, die nur mit für das Antigen spezifischen Nucleinsäuren hybridisieren, sind bevorzugt, da das Vorliegen einer Vervielfältigung das Vorliegen der spezifischen H. pylori-Nucleotid-Sequenzen anzeigt.
DNA-kodierende antigenische Fragmente können durch den Fachmann unter Verwendung von Routinemethoden und einem Routineaufwand an Experimenten unter Befolgen der Prozesse zum Erhalten der exemplarischen Nucleinsäuren erhalten werden.
Die PCR-Vervielfältigung kann in einer Reaktionsmischung ausgeführt werden, die Plasma-DNR-Extrakt als Template, H. pylori-Antigen-Primer, Dynazyme-Puffer (der von Finnzymes, Espoo, Finnland gekauft werden kann), eine Mischung von allen vier Deoxynucleotiden und Dynazyme enthält. Die Plasma-DNA wird auf die gleiche Weise wie die Nucleinsäure-Extraktion der H. pylori-Zellen extrahiert, außer daß ein zusätzlicher Schritt des Durchlaufenlassens des Extrakts durch einen Microcon 100-Filter am Ende hinzugefügt wird. Der abschließende Schritt besteht darin, verbleibende nicht-biologische hemmende Substanzen sowie komplexe Polysaccharide zu entfernen, die sich als potente PCR-Inhibitoren erwiesen haben, und was eine Eliminierung der DNA-Fällung gestattet.
Die Reaktionen können mit Mineralöl überschichtet werden und für 10 Minuten auf 94°C erhitzt werden, vor dem Start des PCR-Zyklus in einem Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler (Norwalk, CT, USA). Die ersten 5 Zyklusparameter können sein: Denaturieren für 2 Minuten bei 94°C, Anlagern für 1 Minute bei 42°C, und Verlängerung für 1 Minute bei 72°C. Dem können eine 30-Zyklus-PCR folgen unter Verwendung der folgenden Parameter: Denaturie ren für 2 Minuten bei 94°C, Anlagern für 1 Minute bei 59°C, und Verlängerung für 1 Minute bei 72°C. Während des abschließenden Zyklus kann die Verlängerung für 10 Minuten erfolgen. Die PCR-Reaktionen können bei 4°C gestoppt werden, und die PCR-Produkte können auf einem Agarose-Gel analysiert werden. Die Größe der PCR-Produkte kann geschätzt und mit den Konsensus-Fragmenten, die in den H. pylori-Stämmen gefunden wurden, verglichen werden.
Eine Größe, die gleich der Größe des Konsensus-Fragments ist, wird als ein positives Ergebnis angesehen. Das PCR-Produkt kann als H. pylori-Sequenz bestätigt werden durch eine Southern-Blot-Hybridisierung mit einer ³²P-CTP-markierten DNA-Sonde, die aus dem Konsensus-Fragment amplifiziert worden war. Alternaiv können das PCR-Produkt und das Konsensus-Fragment mit Restriktions-Enzymen wie AluI, HinfI und HaeIII verdaut werden, und die Verdauungen können auf ihr Verdauungsmuster mittels Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert werden. Ein identisches Muster zeigt an, daß das PCR-Produkt aus den H. pylori-Sequenzen stammt.
BEISPIEL 3
Nachweis von H. pylori-DNA im Blut unter Verwendung einer LCR-Amplifikation
Der Ligase-Kettenreaktions-(LCR)-Assay erfordert zwei Sätze von zwei Oligonucleotiden und eine DNA-Ligase. Der erste Satz von Oligonucleotiden (d.h. Oligo A und Oligo B) sind einander fortlaufend und zu einem Strang des Ziel-DNA-Duplexes komplementär. Der zweite Satz von Oligonucleotiden (d.h. Oligo C und Oligo D) sind komplementär zum ersten Satz und belegen deshalb nebeneinander liegende Stellen auf dem zweiten Strang der Ziel-DNA. Alle vier Oligonucleotid-Sonden können gemäß der konservierten Sequenz der H. pylori-Stämme konstruiert und auf einem Oligonucleotid-Synthetisierer von Applied Biosystems (Foster City, CA) synthetisiert und mittels PAGE gereinigt werden. Oligo A und Oligo D können an ihren 5'-Enden radiomarkiert werden durch Inkubieren für 30 Minuten bei 37°C in Gegenwart von Adenosin-5'-(γ-³²P)-Triphosphat und Polynucleotid-Kinase in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl₂ und 1 mM Dithiothreitol. Die Polynucleotid-Kinase kann dann durch Erhitzen auf 70°C inaktiviert werden. Gleiche Mengen von jeder der radiomarkierten Oligonucleotid-Sonden A und D und von jeder der Oligonucleotid-Sonden B und C können einem Eppendorfgefäß hinzugefügt werden, zusammen mit dem aus der Serumprobe extrahierten DNA-Templat. Jedes Gefäß enthält einen Reaktionspuffer, der aus 50 mM bis-Tris pH 6,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM NH₄Cl, 10 mM KCl, 1 mM Dithiothreitol und 1 mM NAD besteht. Dann kann in jedem Gefäß eine passende Menge Mineralöl überdecken, und die Gefäße können für 3 Minuten auf 100°C erhitzt werden, gefolgt von einem Kühlen für 1 Minute auf 85°C, und bei 55°C gehalten werden, während die DNA-Ligase hinzugefügt wird. Die bevorzugte DNA-Ligase ist die Pfu-DNA-Ligase, die aus Pyrococcus furiosus stammt. Die Reaktionsgefäße können dann in einem DNA-Thermocycler (RoboCycler, Stratagene) eingebracht und 20, 30 oder 40 mal zwischen 85°C und 50°C für 1 Minute bei jeder Temperatur cyclisiert werden. Ein Volumenanteil von jeder Reaktion kann 1:1 mit 95%-igem Formamid-Abstop-Farbstoff verdünnt werden. Diese verdünnte Probe kann auf einem Acrylamid-Gel analysiert werden.
BEISPIEL 4
Herstellung von H. pylori-DNA-Sonden
Das H. pylori-DNA-Fragment (das normalerweise mindestens 25 Basen, gewöhnlicher mindestens etwa 30 Basen aufweist und das bis zu etwa 10.000 Basen oder mehr aufweisen kann, normalerweise jedoch nicht mehr als etwa 5.000 Basen hat) aus H. pylori-Stämmen kann aus dem Agarose-Gel nach der Elektrophorese herausgeschnitten und extrahiert werden. Dieses DNA-Fragment kann mit einer Restriktionsendonuklease verdaut und mit einem Vektor zum Bilden eines rekombinanten Plasmidkonstrukts ligiert wer den. Das DNA-Fragment kann zum Beispiel mit ClaI verdaut und in einen ClaI-verdauten Pev-Vrf-Expressionsvektor ligiert werden (Crowl et al., Gene (1985), 38: 31–38). Das rekombinante Plasmid kann dann eine Wirtszelle transformieren, die eine prokaryotische Zelle wie E. coli RRI oder eine eukaryotische Zelle wie NIH 3T3-Zellen oder HeLa-Zellen sein kann. Die rekombinanten Plasmide können durch Replikationen in den Wirtszellen vervielfältigt werden. Die vervielfältigten rekombinanten Plasmide können gemäß So et al., Infect. Immun. (1978), 21: 405–411 isoliert werden. Das DNA-Fragment aus H. pylori kann aus den Plasmiden mittels Verdauung mit derselben Restruktionsendonuklease freigesetzt werden. Das freigesetzte H. pylori-DNA-Fragment kann durch Agarose-Gel oder Polyacrylamid-Elektrophorese bestätigt werden. Das vervielfältigte DNA-Fragment kann dann mit einem Radioisotop (wie ³²P, ³H, ¹⁴C oder dergleichen) oder mit Fluoreszenz (wie der Verwendung von Digoxigenin- und Biotin-markierten DNA-Sonden, die mit Fluoreszenz-Detektionsmethoden gekoppelt sind) markiert und als eine DNA-Sonde verwendet werden.
BEISPIEL 5
Preparation der Spot-Hybridisierung unter Verwendung von H. pylori-DNA-Sonden
Nitrocellulose-Filter können durch Kochen in Wasser sterilisiert oder autoklaviert werden. Ein einzelnes steriles Filter kann auf die Oberfläche des Agars aufgebracht und mit Serum, das zur Freisetzung seiner DNA behandelt worden ist, gespottet werden. Die Serumprobe kann zum Beispiel mit verdünntem wäßrigem Alkali (z.B. 0,1 bis 1 M NaOH) lysiert werden. Der Alkali kann auch zum Denaturieren der DNA dienen. Andere Denaturierungsmittel schließen erhöhte Temperaturen, organische Reagenzien (z.B. Alkohole, Amide, Amine, Harnstoffe, Phenole und Sulfoxide) oder bestimmte anorganische Ionen (z.B. Thiocyanat und Perchlorat) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Nach der Denaturierung der Probe kann der Filter in einer wäßrigen gepufferten Lösung, im allgemeinen bei einem pH von etwa 6 bis 8, gewöhnlicherweise 7 gewaschen werden. Nach dem Lysieren, dem Denaturieren und den Waschungen kann der mit der Proben-DNA gespottete Filter bei einer erhöhten Temperatur, im allgemeinen von etwa 50°C bis 70°C getrocknet werden, um die Proben-DNA auf dem Filter zu fixieren.
Der Filter kann dann bei einer mild erhöhten Temperatur für eine ausreichende Zeit mit der Hybridisierungslösung ohne die Sonde inkubiert werden, um den Filter gründlich naß zu machen. Verschiedentliche Hybridisierungslösungen können verwendet werden, die von etwa 20 bis 60 Volumen-, vorzugsweise 30 Volumen-Prozent eines inerten polaren organischen Lösungsmittels umfassen. Eine gewöhnliche Hybridisierungslösung verwendet etwa 50% Formamid, etwa 0,5 bis 1 M Natriumchlorid, etwa 0,05 bis 0,1 N Natriumcitrat, etwa 0,05 bis 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS), und geringe Mengen von EDTA, Ficoll (etwa 300–500 kdal), Polyvinylpyrrolidon (etwa 250–500 kdal) und Serumalbumin. In der Hybridisierungslösung kann ebenfalls etwa 0,5 bis 5 mg/ml ultraschallbehandelte, denaturierte DNA (z.B. Kalbsthymus oder Lachssperma) und gegebenenfalls 0,5 bis 2% Gew./Vol. Glycin eingeschlossen sein. Andere Zusatzstoffe können ebenfalls eingeschlossen sein, wie etwa Dextransulfat von etwa 100 bis 1.000 kdal und in einer Menge von etwa 8 bis 15 Gew.-Prozent der Hybridisierungslösung.
Die Menge der markierten DNA-Sonde variiert breit, je nach der Art der Markierung und ob sie vernünftigerweise an den Filter binden können, so wie die Stringenz der Hybridisierung. Im allgemeinen sollte ein substantieller Überschuß über die Stöchiometrie der Sonde verwendet werden, um die Bindungsrate der Sonde an die fixierte Proben-DNA zu verstärken.
Nach dem Spülen des Filters bei Raumtemperatur mit einer zweiten Lösung, die zu den in der Hybridisierungslösung bereitgestellten Konstellationen an Natriumchlorid, Natriumcitrat und SDS analog sind, kann der Filter nun auf das Vorliegen von Duplexes gemäß der Art der Markierung getestet werden. Wenn die Markierung radioaktiv ist, wird der Filter getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Wenn die Markierung Fluoreszenz ist, kann sie direkt unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops angesehen werden.
Die Sonde braucht keine perfekte Komplementarität zur Sequenz, mit der sie hybridisiert, aufzuweisen; es können 30% oder mehr Fehlpaarungen vorliegen. Bedingungen, die die Bildung von DNA-Hybriden beeinflussen, sind gut bekannt und im einzelnen durch Crosa et al., J. Bact. (1973), 115(3): 904–911 beschrieben.
BEISPIEL 6
Herstellung von Kaninchen-polyclonalem-Antikörper gegen H. pylori
Neuseeländische weiße Kaninchen werden zuerst mit 0,5 bis 1,0 mg H. pylori-Antigen in vollständigem Freund'schen Adjuvans durch intramuskuläre Injektion immunisiert und alle vier Wochen mit 0,5–1,0 mg des selben Antigens in unvollständigem Freund'schen Adjuvans verstärkt. Test-Blut-Entnahmen wurden nach der dritten Verstärkung zur Analyse entnommen. Sobald der Antikörper-Titer den gewünschten Grad von ungefähr 10⁶ erreichte, wurde die Blutentnahme zur Produktion veranlaßt.
Jede einzelne Blutentnahme wurde zuerst in PBS auf 1 × 10⁶ verdünnt. Ein Hundert (100) μl des verdünnten Kaninchenserums wurden dann zu H. pylori-antigenbeschichteten Vertiefungen (Wells) hinzugegeben. Nach einer Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die Platte 4 mal mit PBS gewaschen, und 100 μl Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat wurden zugegeben. Die Plat te wurde bei Raumtemperatur für 30 weitere Minuten inkubiert. Nach 4-maligem Waschen mit PBS wurden 100 μl Tetramethylbenzidin(TMB)-Substrat zu jeder Vertiefung (Wells) zur Farbentwicklung zugegeben, und die Farbintensität in jeder Vertiefung (Wells) wurde unter Verwendung eines Mikrotiter-Lesegeräts bei 450/650 nm gemessen. Die OD 450/650 muß größer als 1,0 sein, um zur Verwendung bei der Antikörperproduktion qualifizierbar zu sein.
BEISPIEL 7
Herstellung von Antikörper-HRP-Enzym-Konjugaten
Das Enzym Meerrettich-Peroxidase (HRP) wurde zur Konjugation an den Anti-H. pylori-Antikörper ausgewählt. Die Herstellung der Antikörper-HRP-Enzym-Konjugate basierte auf einer modifizierten Methode von Nakane (Nakane et al., 1978: In immunoflorescence and related staining techniques, Knapp et al., Hrg., S. 215–220, Elsivier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam).
Kurz gesagt wurde HRP zuerst einer Oxidationsbehandlung mit Natrium-m-Periodat unterzogen. Diese Oxidation erzeugt eine Aldehyd-Gruppe auf der Kohlenhydrat-Seitenkette. Der Antikörper und das oxidierte HRP können dann in alkalischem pH vermischt werden, so daß die Aminogruppe auf dem Antikörper mit der Aldehyd-Gruppe auf dem HRP zum Bilden einer Schiff'schen Base reagieren und zu einer kovalenten Bindung zwischen dem Antikörper und den HRP reduzieren gelassen wird. Das Antikörper HRP-Konjugat wurde dann durch Gel-Filtration mit einer Sephacryl-300-Säule gereinigt.
Das HRP kann an einen primären Antikörper wie einem Kaninchen-Antikörper gegen H. pylori oder an einen sekundären Antikörper wie einem Ziegen-Antikörper gegen Kaninchen-IgG konjugiert werden.
BEISPIEL 8
Gel-Elektrophorese- und Immunoblot-Analyse
Die Serumprobe kann mittels SDS-PAGE analysiert werden. Nach der Elektrophorese können Gele fixiert werden, und Proteine können durch die modifizierte Silberanfärbungsmethode von Oakley et al., Anal. Biochem. (1980), 105: 361–363 aufgelöst werden.
Alternativ können Proteine dann auf ein Nitrocellulose-Papier durch Elektroblotten für 1 Stunde bei 1 Amp übertragen werden. Nach dem Blockieren der unbelegten Bindungsstellen mit einem Blockierungsmittel wie Tween-20 und fettarmer Milch wird dann eine ausreichende Menge eines H. pylori-Antikörpers wie im Beispiel 6 (oben) beschrieben auf das Nitrocellulose-Papier gegeben. Das Nitrocellulose-Papier kann dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert werden. Schließlich können Alkali-Phosphatase-Konjugate eines sekundären Antikörpers gegen ein Immunglobulin der den Anti-H. pylori-Antikörper produzierenden Tierspezies (wie Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG) auf das Nitrocellulose-Papier gegeben werden. Die Reaktion kann, durch Zugabe von 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP)/Nitroblau-Tetrazolium (NBT) detektiert werden.
BEISPIEL 9
Herstellung von Serum-Helicobacter-pylori-Antigenen in freier Form
Die Serum-H. pylori-Antigene können sowohl in freier Form als auch als Immunkomplexe vorliegen. Die freie Form von H. pylori-Antigenen können ohne weiteres durch einen Immunoassay oder irgendwelche Antigen-Nachweismethoden nachgewiesen werden. Für solche Antigene, die mit H. pylori-Antikörpern im Serum immun komplexiert sind, können sie nur nachgewiesen werden, nachdem sie aus den Immunkomplexen dissoziiert wurden.
Der Beweis, daß die Serum-H. pylori-Antigene sowohl in freier Form als auch als Immunkomplexe existieren und daß die freie Form der H. pylori-Antigene durch den ELISA der vorliegenden Erfindung ohne weiteres nachgewiesen werden können, die Immunkomplexe jedoch durch dieselbe Methode nicht ohne weiteres nachgewiesen werden können, ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 ist eine Serum-H. pylori-Zuschuß-Studie. Keine der Testproben enthält H. pylori-Antigene. Trotz der Nicht-Anwesenheit von H. pylori-Antigenen im Serum könnte die Serumprobe jedoch H. pylori-Antikörper (d.h. die "Antikörper-positive Probe") enthalten, wahrscheinlich aufgrund einer vorangehenden Infektion, im Gegensatz zu einer solchen, die keinerlei H. pylori-Antikörper enthielt (d.h. die "Antikörper-negative Probe"). In der Zuschuß-Gruppe wurde eine bekannte Menge von H. pylori-Antigenen (1 × 10⁵ Bakterien/ml), entweder in ganzen bakteriellen Zellen oder im Zell-Lysat, sowohl zu "Antikörper-negativen" als auch "Antikörper-positiven" Serumproben hinzugefügt. In der "zuschuß-freien" Gruppe wurden keine H. pylori-Antigene zugegeben.
Die Ergebnisse von Tabelle 1 zeigen, daß in den "Antikörper-negativen" Proben die Zugabe von H. pylori-Antigenen sich in einer Erhöhung in den OD_450/650-Lesewerten wiederspiegelte. Im Gegensatz dazu erhöhte die Zugabe von H. pylori-Antigenen in den "Antikörper-positiven" Proben die OD_450/650-Lesewerte nicht auf dasselbe Niveau wie in den "Antikörper-negativen" Proben. Eine plausible Erklärung besteht darin, daß die zugegebenen H. pylori-Antigene Immunkomplexe mit den Serum-H. pylori-Antikörpern gebildet haben, die mit der ELISA-Messung interferieren.
Tabelle 1 Serum-H. pylori-Antigene-Zuschuß-Studie
Um die Immunkomplexe der Serum-H. pylori-Antigene zu dissoziieren, kann die Serumprobe mit einem Dissoziier-Reagens oder mit einer Probendissoziier-Bedingung behandelt werden. Es gibt vier (4) Hauptarten von Dissoziier-Reagenzien, die beim Dissoziieren der Immunkomplexe gut funktionieren. Das erste Dissoziier-Reagens ist eine Kochsalzlösung von NaCl oder KCl. Die bevorzugte hohe Salzkonzentration ist mindestens 1 M. Das bevorzugte Salz ist KCl. Das zweite Dissoziier-Reagens ist eine Lösung, die Detergenzien wie SDS, Tween 20, Octylglucosid, Deoxycholat und Triton X-100 enthält. Diese Detergenzien können einzeln oder in irgendeiner Kombination verwendet werden. Die bevorzugte Konzentration des Detergens ist größer als 1%. Das dritte Dissoziier-Reagens ist eine Lösung, die ein chaotropes Mittel wie Guanidin-HCl, Harnstoff und Kaliumthiocyanat (KSCN) enthält. Diese chaotropen Mittel sollten bei einer Konzentration von größer als 2 M liegen. Das vierte Dissoziier-Reagens ist eine Lösung, die ein organisches Lösungsmittel wie 10%-iges Dioxan und 40%-iges Ethylenglycol enthält.
Alternativ kann die Serumprobe bei einer Probendissoziier-Bedingung behandelt werden, die entweder ein hoher oder niedriger pH oder eine erhöhte Temperatur ist. Der bevorzugte hohe pH ist 9 oder höher. Der bevorzugte niedrige pH ist 3 oder niedriger. Die bevorzugte erhöhte Temperatur liegt bei mindestens 50°C.
Ferner kann die dissoziierbehandelte Serumprobe mit einem Protein basierten Reagens zur Minimierung der Kreuzreaktivität behandelt werden. Das bevorzugte Protein-basierte Reagens enthält mindestens eines der folgenden Proteine: fötales Rinderserum, Schweineserum, normales Ziegenserum, Pferdeserum, Kasein, Albumin, Gelatine und Rinderserumalbumin.
BEISPIEL 10
Affinitäts-Reinigung von Kaninchen-Anti-H. pylori-Antikörper
A. Herstellung der Affinitätssäule
Eins–fünf (1–5) Gramm einer H. pylori-Zellpaste wurde in 12,5 ml PBS-Puffer mit 0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl und pH 7,2, der Octylglucosid enthielt, suspendiert und für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wurde dann für 10 Minuten bei maximalem Energieausstoß in einem Eisbad ultraschallbehandelt unter Verwendung von 1-minütiger Unterbrechung für jede Minute der Ultrabeschallung. Nach der Ultrabeschallung wurden unlösliche Materialien durch Zentrifugieren bei 25.000 g für 30 Minuten entfernt. Der Überstand wurde gewonnen, und die Proteinkonzentration wurde mit PBS auf 1–3 mg/ml eingestellt. Dann wurden präequilibrierte Aminolink-Kupplungsgele (hergestellt durch Pierce) in PBS zu dem Überstand bei einem Verhältnis von 1–10 mg Proteine pro ml gepacktem Gel zugegeben, gefolgt von 10–40 μl von 5 M Natrium-Cyanborhydrid in Wasser für jeden ml des gepackten Gels. Die Reaktionsaufschlämmung wurde dann über Nacht (mindestens 6 Stunden) unter leichtem Vermischen bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Gel-Aufschlämmung in eine passende Größenchromatographie-Säule eingefüllt, und die überschüssige Flüssigkeit wurde abgelassen. Die Säule wurde dann mit zwei Säulenvolumina Kopplungspuffer eluiert, gefolgt von zwei Säulenvolumina von 1 M Tris HCl mit pH 7,4. Das gewaschene Gel wurde in einem Säulenvolumen des 1 M Tris-HCl/pH 7,4-Puffers re-suspendiert. Nach der Re-Suspendierung wurden 10–40 μl von 5 M Natrium-Cyanborhydrid pro ml gepacktem Gel zugegeben. Die resultierende Suspension wurde mit leichter Bewegung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Säule abgelassen, ausgiebig mit PBS zum Entfernen jeglicher nicht-konjugierter Antigene in der Säule gewaschen.
B. Reinigung des Antikörpers durch Affinitätssäule
Zum Reinigen des Kaninchen-Antikörpers wurde ein gleiches Volumen von gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung langsam zu einem gleichen Volumen von Kaninchenserum zum Fällen der H. pylori-Antikörper zugegeben. Nach dem Rühren für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Präzipitate mittels Zentrifugation für 30 Minuten gesammelt, in PBS wieder aufgelöst und gegen einen 100-fachen Überschuß an PBS dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung durch einen 0,2 μm-Filter filtriert und auf die Affinitätssäule geladen. Nach dem Laden wurde die Säule ausgiebig mit PBS gewaschen, bis das Eluat die Basislinie erreichte. Der Anti-H. pylori-spezifische Antikörper in der Säule wurde dann mit 3 M KSCN in Wasser eluiert. Fraktionen, die Immunglobuline enthielten, wurden gesammelt und gegen PBS mit einem Minimum von zwei Wechseln zum Entfernen von überschüssigem KSCN dialysiert. Der gereinigte Antikörper wurde dann auf etwa 1,0–2,0 mg/ml konzentriert und bei –20°C gelagert.
BEISPIEL 11
Serum-Antigen ELISA-Test
Serum wurde durch Standardmethoden von ganzem Blut getrennt. Die freie Form der Serumprobe wurde gemäß Beispiel 1 gesammelt. Der Affinitäts-gereinigte Antikörper wurde in Phosphatpuffer zwischen 20 μg/ml und 1,0 μg/ml in Reihe verdünnt. Ein 0,1 ml-Aliquot von jeder Verdünnung wurde auf eine Costar EIA Strip Plate zugegeben, bedeckt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde einmal mit PBS gewaschen und mit 1% BSA in PBS für 4 Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Nachdem die BSA-Lösung entfernt wurde, wurde 0,1 ml der Serumprobe in freier Form zu der Antikörper-beschichteten Mikrotiter-Strip-Platte hinzugefügt, bedeckt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Platte 5 mal mit einer PBS/Tween-Waschung gewaschen. Dann wurde ein Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Kaninchen-Anti-H. pylori zu jeder Mikrotitervertiefung zugegeben, bedeckt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde erneut 5 mal mit PBS/Tween-Waschung gewaschen und dann für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,1 ml Tetramethylbenzidin entwickelt. Die Farbentwicklung wurde bei 450 nm gemessen. Die Reaktion wurde mit 0,1 ml von 1 N H₂SO₄ gestoppt. Die Verdünnung, die die maximale optische Dichte und den niedrigsten Hintergrund ergab, wurde als die optimale Verdünnung gewählt.
Die Tabellen 2 und 3 stellen zwei Experimente dar, die zu unterschiedlichen Zeiten mit verschiedenen Patienten-Serumproben durchgeführt wurden. Diese Experimente zeigen die Ergebnisse des Serum-ELISA-Tests für H. pylori. Das erste Experiment (Tabelle 2) schließt 5 Subjekte ein. Das zweite Experiment (Tabelle 3) schließt 3 Subjekte ein. Die Ergebnisse sind als OD_450/650 ausgedrückt. Das Vorliegen und die Menge von H. pylori-Antigenen kann bei der Wellenlänge von 450 nm gemessen werden (650 nm stellt die Wellenlänge dar, die den Hintergrund [d.h. die Platte] detektiert). Die OD_450/650 spiegelt den Lesewert bei OD₄₅₀, subtrahiert durch den Lesewert bei OD₆₅₀, dar. Proben mit einem OD_450/650 ≤ 0,1 zeigen negative Ergebnisse (d.h. keine H. pylori-Infektion).
Tabelle 2 Serum-ELISA-Test (Experiment 1)
Tabelle 3 Serum-ELISA-Test (Experiment 2)
BEISPIEL 12
Vergleichsstudien zwischen der Verwendung von Affinitäts-gereinigten und DEAE-gereinigten H. pylori-Antikörpern im Immunoassay
Die Tabelle 4 zeigt eine Vergleichsstudie zwischen der Verwendung eines Affinitätssäulen-gereinigten H. pylori-Antikörpers und eines DEAE-Säulen-gereinigten H. pylori im ELISA.
Die Reinigung des H. pylori-Antikörpers durch Affinitätssäule ist im Beispiel 5 (oben) beschrieben. Die DEAE (Diethylaminoethyl-Zellulose)-Säule ist wie folgt beschrieben:
Eine DEAE-Säule wurde mit 0,0175 M Kaliumphosphat (pH 6,5) bei Raumtemperatur equilibriert. Der Überstand, der die H. pylori-Antikörper enthielt, wurde auf die Säule aufgebracht. Die Ausflußfraktionen wurden gesammelt. Eine Proteinkonzentration (OD₂₈₀) wurde bestimmt, und alle Fraktionen mit größer als 0,200 wurden gepoolt.
Sowohl die Affinitäts-gereinigten als auch die DEAE-gereinigten Antikörper wurden in Reihe in Phosphatpuffer zwischen 20 μg/ml und 2,0 μg/ml verdünnt. Ein 0,1 ml-Aliquot von jeder Verdünnung wurde zu einer Costar EIA Strip-Platte zugegeben, bedeckt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde einmal mit PBS gewaschen und mit 1% BSA in PBS für 4 Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Mehrere positive und negative Proben wurden 1:5 in einer Probenverdünnung (PBS-BSA) verdünnt. Jede Probe (0,1 ml) wurde zu einer Vertiefung eines DEAE-Antikörper-beschichteten Streifens oder einer Vertiefung eines Affinitäts-gereinigten, Antikörper-beschichteten Streifens (was als Kontrolle dient) zugegeben und gleichzeitig mit 0,1 ml des zuvor angenommenen DEAE und/oder des Affinitäts-gereinigten Kaninchen-Anti-H. pylori-Meerrettich-Enzym-Konjugats inkubiert (siehe Tabelle 4). Nach 60 Minuten der Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Probe gründlich gewaschen, um ungebundene Proben und Enzym-markierte Antikörper zu entfernen. Das Tetramethylbenzidinsubstrat wurde zugegeben und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Farbentwicklung wurde mit 0,1 ml 1 N Schwefelsäure gestoppt, und die Vertiefungen wurden bei OD 450/650 nm spectro-photometrisch zum Bestimmen der Reaktivität von jeder Probe gelesen.
Tabelle 4: Vergleich von DEAE- und Affinitäts-gereinigten Antikörpern
Tabelle 4 zeigt klar, daß der Affinitäts-gereinigte Antikörper und das Affinitäts-gereinigte Konjugat die besten Ergebnisse im Sinne von niedrigen Hintergrund-Ablesewerten und hohen (empfindlicheren) positiven Proben-Ablesewerten erzeugten. Der Affinitäts-gereinigte Antikörper wurde für beide Seiten der Platte und des Konjugats als Bezugsstandard (Assay 1) verwendet. Alle anderen Testergebnisse wurden mit dem Referenzstandard verglichen. Bei Vergleich mit dem Referenzstandard zeigten die DEAE-Platte und das DEAE-Konjugat ein falsch-positives Ergebnis aufgrund des erhöhten Hintergrunds (d.h. höherem OD für die negativen Proben), und der OD der positiven Proben nahm ab (Assay 3). Durch Ersetzen der DEAE-Platte durch die Affinitäts-Platte nahmen die positiven Signale zu, jedoch blieb der hohe Hintergrund, was falsch-positive Ergebnisse ergab (Assay 2). Durch Verringern der DEAE-Konjugat-Konzentration auf 50% des ursprünglichen wurde der Hintergrund verringert, jedoch verrin gerten sich auch die positiven Signale, was ein falsch-negatives Ergebnis zeigte (Assay 4).
BEISPIEL 13
Immunochromatographischer Assay
Eine immunochromatographische Testvorrichtung besaß eine äußere Plastikkassette mit zwei Fenstern: ein "Probenzugabefenster" und ein "Ergebnissichtfenster". Das "Probenzugabefenster", zu dem eine mobile Phase hinzugefügt wurde, enthielt auch eine "Markierungsfüllung" oder Reservoir, das den zweiten Antikörper enthielt, der mit Detektionsmitteln wie Immuno-Gold markiert war. Die Füllung wurden zwischen dem Probezugabepunkt und dem unteren Rand des "Ergebnissichtfensters" plaziert. Das "Ergebnissichtfenster" lag über der stationären Phase, es enthielt eine Testlinie, auf die ein erster primärer Antikörper aufgebracht war, und eine Kontrollinie, auf die ein Antikörper gegen einen zweiten primären Antikörper aufgebracht war. Die Testlinie lag zwischen dem Probenzugabefenster und der Kontrollinie.
Zum Ausführen des Tests wurden 4–6 Tropfen Serum zu der Probenfläche der Kassette zugegeben. Die Probe strömte durch eine Markierungsfüllung, die einen gereinigten H. pylori-Antikörper enthielt, der mit roter Farbe von Immuno-Gold oder einer anderen Markierung gekoppelt war. Die Probe, die nun markierte Antikörper enthielt, bewegte sich auf dem Teststreifen aufwärts, dabei zuerst die Testlinie und dann die Kontrollinie passierend. Sollte die Probe H. pylori-Antigene enthalten, würde der Antikörper an das Antigen, der mit dem roten Immuno-Gold gekoppelt war, binden, der seinerseits an einen H. pylori-Antikörper binden würde, der in Form einer Linie auf die Nitrocellulose-Membran aufgebracht (immobilisiert) war. Falls der H. pylori-Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex eingefangen würde, würde die rote Testlinie im Ergebnisfenster sichtbar (Membran-Antikörper:Antigen:Antikörper-rotes Immun-Gold). Auf die Kon trollinie wurde Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper aufgebracht. Die H. pylori-Immuno-Gold-Antikörper wurden durch die Ziegen-Anti-Kaninchen-Linie eingefangen, als die Probe hindurchströmte (falls ein monoklonaler Antikörper zur Kopplung von Farbteilchen verwendet wurde, sollte Ziegen-Anti-Maus auf die Kontrolllinie aufgebracht werden), um sicherzustellen, daß das Verfahren korrekt ausgeführt wurde.
Probenflüssigkeit, die zusätzliche mobile Phase enthalten könnte, würde vom unteren Teil zum oberen Teil wandern (chromatographischer Effekt), und die gesamte überschüssige Flüssigkeit würde durch ein Absorptionspolster, das oben aufgelegt ist, zum oberen Teil der Kassette hin gezogen. Falls in der Probe kein Antigen enthalten wäre, würde nur die Kontrollinie am Ende des Tests sichtbar sein. Falls Antigen vorläge, wäre die Testlinie sichtbar.
Mit der Beschreibung der Erfindung im einzelnen und durch Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsformen wird dem Fachmann klar, daß Modifikationen und Variationen möglich sind, ohne sich vom Umfang der Erfindung, wie in den folgenden angehängten Ansprüchen definiert, zu entfernen.

Claims

Verfahren zum Nachweisen von Helicobacter pylori (H. pylori), das das Nachweisen eines H. pylori-Antigens in Blut durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines zum Nachweisen von Helicobacter pylori spezifischen Primerpaars umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Blut Plasma ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Primerpaar eine Nucleotid-Konsensussequenz aus H. pylori-Stämmen der ATCC-Stämme 43504 und 43629 umfaßt.
Verfahren zum Nachweisen von Helicobacter pylori (H. pylori), das das Nachweisen eines H. pylori-Antigens in Blut durch die Ligase-Kettenreaktion (LCR) unter Verwendung eines ersten Satzes und eines zweiten Satzes von Oligonucleotiden, die spezifisch zum Nachweisen von H. pylori sind, umfaßt, wobei die Oligonucleotide des ersten Satzes zueinander fortlaufend sind, der zweite Satz mit dem ersten Satz komplementär ist, und die Oligonucleotide des zweiten Satzes zueinander fortlaufend sind.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die ersten und zweiten Sätze von Oligonucleotiden eine Nucleotid-Konsensussequenz aus H. pylori-Stämmen der ATCC-Stämme 43504 und 43629 umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die LCR unter Verwendung einer Pfu-DNA-Ligase ausgeführt wird.
Verfahren zum Nachweisen von Helicobacter pylori (H. pylori), das das Nachweisen eines H. pylori-Antigens in Blut mittels DNA-Hybridisierung unter Verwendung einer H. pylori-DNA-Sonde umfaßt, wobei die DNA-Sonde mit einem Radioisotop, einem Enzym oder mit Fluorosenz markiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Blut Gesamtblut, Serum und Plasma umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die DNA-Hybridisierung eine auf einem Nitrocellulose-Filter präparierte Punkt-DNA-Hybridisierung ist.
Verfahren zum Nachweisen von Helicobacter pylori (H. pylori), das das Nachweisen eines H. pylori-Antigens in Serum durch einen Antikörper gegen H. pylori unter Verwendung eines Immunoassays oder Immunoblotassays umfaßt, wobei der Antikörper gegen das H. pylori-Antigen ein Affinitäts-gereinigter Antikörper ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Immunoassay ein Basis-Sandwich-Assay, ein Triple-Sandwich-Assay oder ein immunochromatographischer Assay umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Serum mit einem Dissoziier-Reagens oder unter einer Probendissoziations-Bedingung behandelt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Dissoziier-Reagens umfaßt: – eine NaCl- oder KCl-Lösung mit einer Molarität von mindestens 1 M, oder – ein Detergens, welches mindestens eines umfaßt, das aus der aus SDS, Tween 20, Octylglucosid, Deoxycholat und Triton X-100 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder – ein organisches Lösungsmittel, welches mindestens eines umfaßt, das aus der aus Dioxan und Ethylenglycol bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder – ein chaotropes Mittel, das aus der aus Guanidin-HCl, Harnstoff und Kaliumthiocyanat bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder – mindestens ein Enzym, das aus der aus Protease und Lipase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Probendissoziationsbedingung einschließt: – eine Serum-pH-Einstellung auf nicht weniger als 9 oder nicht mehr als 3, oder – eine Serum-Temperatureinstellung auf nicht weniger als 50°C.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1, 4, 7 und 10, das als Verfahren zur Diagnose einer H. pylori-Infektion verwendet wird.
Verfahren zum Nachweisen von Helicobacter pylori-Antigen aus einer Serumprobe, umfassend: – Präparieren der Serumprobe; – Präparieren eines ersten Antikörpers gegen Helicobacter pylori, wobei der erste Antikörper durch eine Affinitätssäule gereinigt ist; – Kontaktieren der Serumprobe mit dem ersten Antikörper zum Bilden eines ersten Komplexes; – Präparieren eines zweiten Antikörpers gegen Helicobacter pylori; wobei der zweite Antikörper durch eine Affinitätssäule gereinigt ist; – Kontaktieren des ersten Komplexes mit dem zweiten Antikörper, zum Bilden eines zweiten Komplexes; und – Nachweisen der Gegenwart von Helicobacter pylori in der Serumprobe.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei einer der ersten und zweiten Antikörper an einem festen Träger gebunden ist, wobei der andere mit einem Detektionsmittel markiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei der feste Träger Polyethylen, Polystyrol, Polypropylen oder eine Nitrocellulose-Membran ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das Detektionsmittel mindestens eines umfaßt, das aus der aus einem Enzymmarker, einem fluoroszenten oder lumineszenten Mittel, einer radioaktiven Markierung oder einem Farbpartikel bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei der Enzymmarker eine Alkalische Phosphatase oder eine Meerrettich-Peroxidase umfaßt, und/oder wobei das fluoroszente oder lumineszente Mittel mindestens eines umfaßt, das aus der aus Fluorescein, Rhodamin, Europium, Luminol und Acridium bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und/oder wobei die Farbpartikel mindestens solche sind, die Gold, Silber, blauen Latex und Selen umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei der erste Antikörper an dem festen Träger gebunden ist und der zweite Antikörper mit einem Enzymmarker markiert ist, oder – wobei der erste Antikörper mit einem Farbpartikel markiert ist und der zweite Antikörper an dem festen Träger gebunden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, ferner mit einem Schritt des Behandelns der Serumprobe mit einem Dissoziiermittel oder einer Probendissoziationsbedingung.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei das Dissoziiermittel umfaßt: – eine NaCl- oder KCl-Lösung mit einer Molarität von mindestens 1 M, oder – ein Detergens, welches mindestens eines umfaßt, das aus der aus SDS, Tween 20, Octylglucosid, Deoxycholat und Triton X-100 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder – ein organisches Lösungsmittel, welches mindestens eines umfaßt, das aus der aus Dioxan und Ethylenglycol bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder – ein chaotropes Mittel, das aus der aus Guanidin-HCl, Harnstoff und Kaliumthiocyanat bestehenden Gruppe ausgewählt ist, oder – mindestens ein Enzym, das aus der aus Protease und Lipase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Probendissoziationsbedingung umfaßt: – Einstellen des Serum-pH auf nicht weniger als 9 oder nicht mehr als 3, oder – Erhöhen der Serum-Temperatur auf nicht weniger als 50°C.
Verfahren gemäß Anspruch 22, ferner umfassend eine Reaktion der Serumprobe mit einem Protein-basierten Reagens.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei das Protein-basierte Reagens mindestens eines umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus fötalem Rinderserum, Schweineserum, normalem Ziegenserum, Pferdeserum, Casein, Albimin, Gelatine und Rinderserumalbumin besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 16, ferner mit: Präparieren eines zweiten Antikörpers gegen eine Antikörper-produzierende Tierspezies für den zweiten Antikörper; und Kontaktieren des zweiten Komplexes mit dem zweiten Antikörper zum Bilden eines dritten Komplexes.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei der zweite Antikörper mit einem Detektionsmittel markiert ist, das mindestens eines aus der aus einem Enzymmarker, einem fluoroszenten oder lumineszenten Mittel, einer radioaktiven Markierung oder einem Farbpartikel bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Diagnostik-Kit zum Nachweisen von Helicobacter pylori aus einer Serumprobe, umfassend: einen ersten Antikörper gegen Helicobacter pylori, wobei der erste Antikörper mittels Affinitätssäule gereinigt ist, wobei der erste Antikörper an einen festen Träger gebunden ist; und ein Detektionsmittel, das mit einem zweiten Antikörper gegen Helicobacter pylori markiert ist, wobei der zweite Antikörper mittels Affinitätssäule gereinigt ist; und ein zum Nachweisen oder Verstärken des Detektionsmittels geeignetes Reagens.
Diagnostik-Kit gemäß Anspruch 29, ferner umfassend ein Protein-basiertes Reagens, welches mindestens eines umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus fötalem Rinderserum, Schweinserum, normalen Ziegenserum, Pferdeserum, Casein, Albumin, Gelatine und Rinderserumalbumin besteht.
Diagnostik-Kit gemäß Anspruch 29, ferner umfassend ein Dissoziiermittel, welches mindestens eines umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus mindestens 1 M NaCl, mindestens 1 M KCl, Guanidin-HCl, Harnstoff, Kaliumthiocyanat, SDS, Tween 20, Octylglucosid, Deoxycholat, Triton X-100, Dioxan, Ethylenglycol, Protease und Lipase besteht.
Diagnostik-Kit gemäß Anspruch 29, wobei das Reagens ein Tetramethylbenzidin-Substrat ist, wenn das Detektionsmittel eine Meerrettich-Peroxidase ist.
Diagnostik-Kit zum Nachweisen von Helicobacter pylori aus einer Serumprobe, umfassend: einen ersten Antikörper gegen Helicobacter pylori; einen zweiten Antikörper gegen Helicobacter pylori; einen Sekundärantikörper gegen das Immunglobulin der Spezies, die den zweiten Antikörper erzeugt, wobei der Sekundärantikörper mit einem Detektionsmittel markiert ist, das mindestens eines umfaßt, das aus der aus einem Enzymmarker, einem fluoroszenten oder luminszenten Mittel, einer radioaktiven Markierung und einem Farbpartikel bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und ein zum Nachweisen oder Verstärken des Detektionsmittels geeignetes Reagens, wobei der erste Antikörper und der zweite Antikörper mittels Affinitätssäule gereinigt sind.
Diagnostik-Kit gemäß Anspruch 33, wobei das Reagens eine Tetramethylbenzidin-Lösung ist, wenn das Detektionsmittel eine Meerrettich-Peroxidase ist.
Vorrichtung für einen immunochromatografischen Assay zum Nachweisen von Helicobacter pylori aus einer Serumprobe, mit: einem festen Träger mit einem Probenaufnahmebereich und einem Ergebnisanzeigebereich, wobei die Serumprobe zu dem Probenaufnahmebereich zugegeben wird; einem ersten Antikörper gegen Helicobacter pylori, wobei der erste Antikörper mit einem Farbpartikel markiert ist, wobei der erste Antikörper zwischen dem Probenaufnahmebereich und dem Ergebnisanzeigebereich verbunden ist; einem zweiten Antikörper gegen Helicobacter pylori, wobei der zweite Antikörper an dem chromatografischen Medium des Ergebnisanzeigebereichs gebunden ist; wobei der erste Antikörper und der zweite Antikörper mittels Affinitätssäule gereinigt sind.
Vorrichtung für einen immunochromatografischen Assay gemäß Anspruch 35, wobei der feste Träger eine Nitrocellulose-Membran, eine Polyester-Membran oder eine Nylon-Membran ist.
Vorrichtung für einen immunochromatografischen Assay gemäß Anspruch 35, wobei das Farbpartikel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gold, Silber, blauem Latex und Selen besteht.
Vorrichtung für einen immunochromatographischen Assay gemäß Anspruch 35, ferner mit einem Sekundärantikörper gegen das Immunoglobulin der Spezies, die den ersten Antikörper erzeugt, wobei der Sekundärantikörper an einen Rand des Ergebnisanzei gebereichs gebunden ist, der von dem Probenaufnahmebereich weiter entfernt liegt als der zweite Antikörper.