DE60029939T2

DE60029939T2 - Diagnoseverfahren für whipples krankheit

Info

Publication number: DE60029939T2
Application number: DE60029939T
Authority: DE
Inventors: Didier Raoult; Bernard La Scola; Marie-Laure Birg; Florence Fenollar
Original assignee: PROTISVALOR MEDITERRANEE
Current assignee: PROTISVALOR MEDITERRANEE
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2020-03-25
Also published as: DE60029939D1; WO2000058440A1; JP4885361B2; FR2791357B1; FR2791357A1; CA2367989C; US7410787B1; US20090191550A1; EP1165750A1; AU3564800A; JP2011160809A; EP1165750B1; JP2002539819A; US8378078B2; CA2367989A1; AU778454B2; ATE335806T1; ES2269115T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren für die serologische Diagnose der Whipple-Krankheit in vitro sowie eine Vorrichtung zur Ausführung dieses Verfahrens. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Kit für den in-vitro-Nachweis des für die Whipple-Krankheit verantwortlichen Bakteriums.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Gebiet von Techniken zur Detektion und/oder zur Amplifikation und Sequenzierung unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden oder -Primern und ihre Anwendung für die Untersuchung des Vorhandenseins oder zur Identifizierung von Bakterien der Spezies Tropheryma whippelii.
Die Whipple-Krankheit ist eine Krankheit, welche sich in verschiedenen Formen zeigt. Die klassischste Form ist diejenige eines Fiebers mit einer chronischen Diarrhöe, welche eine Abmagerung mit sich bringt, aber es handelt sich ebenfalls um eine Krankheit, die zur Hervorrufung von chronischen Gelenkleiden, Gehirnleiden mit Demenz und des Weiteren einem Herzleiden und insbesondere einer Endocarditis mit negativer Hämokultur fähig ist. Bereits in seiner Erstbeschreibung im Jahre 1907 legt Whipple angesichts der Beobachtung zahlreicher Mikroorganismen nach Silberfärbung eines mesenterischen Ganglions (Whipple, Bull. John Hopkins Hosp. 1907; 18: 328–391) die Existenz eines mit der "intestinalen Lipodystrophie" assoziierten Bakteriums nahe. Der Nachweis des positiven, für dieses Bakterium nicht spezifischen, PAS-Charakteristikums (vom Englischen "periodic acid ship") und danach elektronenmikroskopische Beobachtungen bestätigen das Vorhandensein einer intrazellulären Bakterienspezies mit grampositiver Struktur (Chears et al., Gastroenterology 1961; 41: 129–138). Das universelle molekulare Werkzeug 16S-rRNA hat die Bestätigung dieser Hypothese gestattet, wobei die phylogenetische Taxonomie dieser neuen Bakterienart präzisiert wurde, und ihr der vorläufige Name Tropheryma whipelii zugewiesen wurde, um die Vorstellung der intestinalen Malabsorption nahe zu legen und den Entdecker der Erkrankung zu ehren (Relman et al., N. Engl. J. Med. 1992; 327: 293–301). Die direkte Sequenzierung von 721 Basen eines Fragmentes, welches ausgehend von einer Biopsie des Dünndarms eines Patienten (Wilson et al., Lancet 1991, 338: 474–475) und danach ausgehend von einem Ganglion eines anderen Patienten (Wilson et al., ASM News 1992; 58: 318–321) erweitert wurde, bestätigt die Originalität der mit der Whipple-Krankheit assoziierten Bakterienart. Die Sequenzierung durch Relman et al. (siehe oben) von 1321 Basen, welche 90% des Gens repräsentieren, bei einer Probe, und eines Fragmentes von 284 Basen bei vier anderen Patienten hat es erlaubt, zu bestätigen, daß die mit der Whipple-Krankheit assoziierte Bakterienart eine neue Spezies repräsentiert, und ihre taxonomische Position im Stamm der Actinomyceten, d. h. Bakterien von grampositiver Struktur mit sehr hohem Guanosin- plus Cytosin-Gehalt, zu präzisieren, welche eine neue Abzweigung repräsentiert, die zwei in der Humanpathologie bekannten Spezies, Actinomyces pyogenes und Rothia dentocariosa, relativ nahe ist.
Die Diagnose der Krankheit erfolgt derzeit durch Beobachtung nach Färbung von durch Biopsie erhaltenen mikroskopischen Abstrichen oder durch Amplifizierung und Sequenzierung unter Verwendung des universellen Gens der 16S-rRNA (Relman et al., siehe oben).
Allerdings konnte bis heute das für die Whipple-Krankheit verantwortliche Bakterium nicht in einer solchen Weise isoliert und kultiviert werden, daß eine Serologie vorgenommen werden könnte.
Wider Erwarten hat die Anmelderin der Erfindung ein Verfahren für die Kultivierung des Bakteriums, das für die Whipple-Krankheit verantwortlich ist, bewerkstelligt.
Die Erfinder haben herausgefunden, daß die Zellkultur, welche die Isolierung und die Vermehrung des Bakteriums Tropheryma whippelii gestattet, gleichzeitig eine lange Lebensdauer sowie eine langsame Vermehrungszeit aufweisen. Sie haben in der Tat nachgewiesen, daß die Verdopplungszeit des Bakteriums sehr lang ist (18 Tage). Vorzugsweise muß die Primo-Kultur sogar direkt auf immortalisierten Zellen durchgeführt werden.
Frühere Arbeiten, durchgeführt an Primo-Kulturen von Monocyten aus dem menschlichen Blut (SHOEDON et al., "Journal of Infectious Diseases", Band 176, Nummer 3, 1997, Seiten 672–677) haben es nicht zugelassen, eine Grundlage zur Etablierung des Bakteriums Tropheryma whippelii in Kultur in einer Weise bereitzustellen, daß selbiges sich vermehrt, weil die mittlere Lebensdauer dieser Monocyten sich auf lediglich 30 Tage beläuft, was angesichts der Verdopplungszeit des Bakteriums nicht ausreichend ist.
Wenn sich die Zellen, verglichen mit der Wachstumszeit des Bakteriums, zu schnell vermehren, können diese weiterhin nicht kultiviert werden, weil sich ein Verdünnungseffekt einstellt, und es wird unmöglich, infizierte Zellen von nicht-infizierten Zellen abzutrennen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform haben die Erfinder Zellen von immortalisierten Fibroblasten verwendet. Diese Fibroblastenzellen breiten sich auf dem Boden des Kulturbehälters aus und hören dann auf sich zu vermehren, wenn sie den gesamte Zellrasen aufgefüllt haben, können aber unter diesen Bedingungen mehrere Monate lang am Leben gehalten werden.
Genauer gesagt umfaßt das Verfahren zur Isolierung und Kultivierung des Bakteriums, welches ausführlich in den Beispielen 1 und 2 nachstehend dargelegt wird, die Inokulation eines Herzklappen-Aufschlusses auf humanen Fibroblasten der HEL-Linie in einem MEM-Medium. Das für die Whipple-Krankheit verantwortliche Bakterium ist isoliert und in Kultur nach mindestens zwei Monate langer Inkubation etabliert worden, wobei das Kulturmedium regelmäßig ausgewechselt wurde. Unter "in Kultur etabliert" versteht man, daß das Bakterium in reproduzierbarer Weise erhalten wird und sich im Lauf der Zeit vermehrt, insbesondere durch aufeinander folgendes Umpflanzen auf Zellkultur.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit das Bakterium, welches derartig isoliert und etabliert wurde, in der Eigenschaft als Antigenquelle. Dieses Bakterium ist bei der CNCM (Paris, Frankreich) unter der Nr. I-2202 und der Identifizierungs-Bezeichnung 'TWIST-Marseille' hinterlegt worden.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls ein Antigen des Bakteriums gemäß der Erfindung zum Ziel. Genauer gesagt zielt die vorliegende Erfindung auf ein Antigen, welches ein Protein ist, gewählt unter den Proteinen mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10, 20, 35, 50, 60, 80, 100, 120, 150, 170 und 200 kD, bestimmt durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgel gemäß der SDS-PAGE-Technik und durch Western-Blot.
Die vorliegende Erfindung hat gleichermaßen einen spezifischen Antikörper zum Ziel, herangezogen gegen das Bakterium oder ein Antigen gemäß der Erfindung; genauer gesagt, einen polyklonalen Antikörper tierischen Ursprungs, insbesondere ein Maus- oder Kaninchen-Immunoglobulin, oder einen monoklonalen Antikörper, insbesondere einen monoklonalen Antikörper, der durch das Hybridoma erzeugt wird, das bei der CNCM des Institut Pasteur unter der Registrierungsnummer Nr. I-2411 und der Identifizierungs-Bezeichnung TW 17G2 hinterlegt ist.
Die vorliegende Erfindung zielt gleichermaßen auf die Detektion eines spezifischen Antikörpers eines Humanimmunoglobulins, welches das Bakterium erkennt, vorzugsweise IgG, IgM oder IgA, und im genaueren eines tierischen Immunoglobulins, insbesondere eines Ziege-Anti-Mensch-Immunoglobulins.
Die vorliegende Erfindung hat im noch Genaueren ein Antigen zum Ziel, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein von 200 kD handelt, welches mit einem monoklonalen Antikörper reagiert, erzeugt von den hier oben erwähnten Hybridomen gemäß der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung eines Bakteriums, eines Antigens des Bakteriums oder eines spezifischen Antikörpers gemäß der Erfindung in einem Verfahren zur in-vitro-Diagnose von Krankheiten, welche mit Infektionen durch das Bakterium Tropheryma whippelii zusammenhängen, sowie ein Verfahren für die serologische Diagnose der Infektion durch das Bakterium Tropheryma whippelii gemäß der Erfindung, welches das Kontaktieren von Serum oder einem anderen biologischen Fluid aus einem Patienten mit dem Bakterium und die Detektion einer immunologischen Reaktion umfaßt.
Genauer gesagt zielt die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur serologischen in-vitro-Diagnose von Infektionen durch Tropheryma whippelii, in welchem man das Bakterium gemäß der Erfindung, ein Antigen von dem Bakterium gemäß der Erfindung oder einen spezifischen Antikörper gemäß der Erfindung mit einer aus dem Patienten abgeleiteten Probe, bestehend aus einem Serum, einem biologischen Fluid oder einer menschlichen Probe, kontaktiert.
Das Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt einen Schritt, der im Wesentlichen besteht aus dem Detektieren einer immunologischen Reaktion zwischen einem für das Bakterium gemäß der Erfindung spezifischen Antikörper und einem Antigen des Bakteriums, oder zwischen einem Antikörper, spezifisch für ein Immunoglobulin gemäß der Erfindung, erkennend das Bakterium, und einem Humanimmunoglobulin, das das Bakterium erkennt.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren für die serologische in-vitro-Diagnose der Whipple-Krankheit, welches das Kontaktieren des Serums oder einem anderen biologischen Fluid aus einem Patienten mit dem Bakterium, wie obenstehend definiert, und das Detektieren der immunologischen Reaktion umfaßt.
In einer Ausführungsform umfaßt das Diagnoseverfahren gemäß der Erfindung:

– die Abscheidung in oder auf einen festen Träger von einer Lösung des Bakteriums gemäß der Erfindung, insbesondere von 0,5 bis 5 μl, bevorzugt 1 μl der Lösung, welche das Bakterium enthält;
– Einführung in oder auf den Träger des Serums oder des biologischen Fluids, das zu testen ist, und zwar vorzugsweise verdünnt;
– Einführung in oder auf den Träger von einer Lösung eines markierten Antikörpers, insbesondere eines Tier-Anti-Mensch-Immunoglobulins, spezifisch für das Humanimmunoglobulin, insbesondere vom Typ IgG, IgM oder IgA, welches das Bakterium erkennt;
– Beobachtung eines Inkubationszeitraums;
– letztendliches Spülen des festen Trägers, und
– die geeignete Detektion der immunologischen Reaktion, insbesondere zwischen einem Human-Antikörper, der das Bakterium erkennt, und dem Anti-Mensch-Immunoglobulin.

In vorteilhafter Weise stellt das Diagnoseverfahren der Erfindung eine immunenzymatische Dosierung vom ELISA-Typ oder eine Immunfluoreszenz-Dosierung bereit. Genauer gesagt umfaßt das Verfahren nach der Erfindung:

– die Abscheidung in oder auf einem festen Träger von einer Lösung des Bakteriums, isoliert und etabliert, wie hier oben angegeben;
– Einführung in oder auf den Träger des Serums oder des biologischen Fluids, das zu testen ist, in verdünnter Form;
– Einführung in oder auf den Träger von einer Lösung eines markierten Anti-Mensch-Immunoglobulins;
– Beobachtung eines Inkubationszeitraums;
– letztendliches Spülen des festen Trägers;
– geeignetes Detektieren der immunologischen Reaktion.

Als festen Träger kann man jedwede Vorrichtung verwenden, geeignet zum Umgang mit Zell- und Bakteriensuspensionen, und insbesondere Röhrchen, Träger bzw. Platten aus Glas, Bijoux-Röhrchen oder starre Mikrotiterplatten aus Polyethylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid, oder Nitrozellulose, welche Mikrovertiefungen umfassen, wobei Glasplatten bevorzugt werden.
Der detektierte Antikörper ist ein Immunoglobulin, insbesondere vom Typ G, M oder A, spezifisch für das Bakterien, welches für die Whipple-Krankheit verantwortlich ist. Als Typ der Markierung des Anti-Mensch-Immunoglobulins verwendet man eine enzymatische, radioaktive oder fluoreszierende Markierung, wobei der letztgenannte Markierungstyp bevorzugt ist.
Der Ausdruck "fluoreszierende Markierung" bedeutet, daß der Antikörper durch ein geeignetes fluoreszierendes Mittel fluoreszent gemacht worden ist, wie Fluoreszeiniso(thio)cyanat, verknüpft an ein Tier-Immunoglobulin, welches den humanen Antikörper erkennt.
Der Ausdruck "radioaktive Markierung" bedeutet, daß der Antikörper entweder auf einem Element seiner Struktur, beispielsweise konstitutiven Tyrosinresten, oder aber auf einem geeigneten Rest, welcher an ihn angeheftet wurde, ein radioaktives Isotop trägt, welches gestattet, ihn durch Zählung der Radioaktivität, welche an ihn gebunden ist, zu dosieren.
Der Ausdruck "enzymatische Markierung" bedeutet, daß der Antikörper an ein Enzym gekoppelt worden ist, das, verbunden mit der Verwendung geeigneter Reagenzien, eine quantitative Messung dieses spezifischen Antikörpers gestattet.
Das Substrat und die Reagenzien werden so gewählt, daß das Endprodukt der Reaktion oder der Abfolge von Reaktionen, hervorgerufen durch das Enzym und umsetzend diese Substanzen, folgende sind:

– entweder eine gefärbte oder fluoreszierende Substanz, welche sich im flüssigen Medium löst, das die Probe umgibt, welche getestet wird und welche das Ziel darstellt, entweder zur letztendlichen spektrophotometrischen bzw. fluorometrischen Messung oder aber für eine visuelle Auswertung, gegebenenfalls im Vergleich zu einer geeichten Farbton-Skala,
– oder eine unlösliche gefärbte Substanz, welche sich auf der Probe abscheidet, die getestet wird, und die das Ziel darstellen kann, sei es für eine photometrische Messung durch Reflexion, sei es zur visuellen Auswertung, gegebenenfalls im Vergleich zu einer geeichten Farbton-Skala.

Wenn man einen fluoreszierend gemachten Antikörper verwendet, wird die mit der getesteten Probe assoziierte Fluoreszenz direkt auf einem geeigneten Gerät abgelesen.
Wenn man eine radioaktive Sonde verwendet, wie zum Beispiel Jod 125, wird die mit der getesteten Probe assoziierte Radioaktivität in einem Gamma-Zähler gemäß einer beliebigen geeigneten Vorgehensweise und beispielsweise nach Solubilisieren der Zellen mittels einer alkalischen Lösung (zum Beispiel einer Soda-Lösung) und Wiedergewinnen der Lösung, enthaltend die Radioaktivität, mit Hilfe eines absorbierenden Puffers gezählt.
Wenn man ein Enzym auf dem spezifischen Antikörper verwendet, wird das Erscheinen eines gefärbten oder fluoreszierenden Produktes erzielt durch Zugeben einer Lösung, enthaltend das Substrat des Enzyms und ein oder mehrere Hilfs-Reagenzien, welche es gestatten, letztendlich als Reaktionsprodukt entweder ein im Medium lösliches gefärbtes Produkt oder ein unlösliches gefärbtes Produkt, oder ein fluoreszierendes lösliches Produkt, wie dies vorangehend erläutert worden ist, zu erhalten. Dann wird das von den so behandelten Proben stammende Lichtsignal mit Hilfe der für jeden Fall passenden Gerätschaft gemessen: Transmissions- oder Reflexions-Photometer bzw. Fluorometer. Alternativ dazu kann die erhaltene Färbung auch mit bloßem Auge ausgewertet werden, wobei man sich gegebenenfalls einer geeichten Skala von gefärbten Lösungen behilft.
Wenn alkalische Phosphatase als das Enzym verwendet wird, wird die Kopplung dieses Enzyms mit dem spezifischen Antikörper gemäß dem Verfahren bewirkt, welches von Boehringer Mannheim-Biochemica vorgeschlagen wird. Die bevorzugten Substrate dieses Enzyms sind Paranitrophenylphosphat für eine spektrophotometrische Endablesung oder Methyl-4-Umbelliferylphosphat für eine fluorometrische Ablesung oder Brom-5-Chlor-4-Indolyl-3-Phosphat zum Erhalten eines unlöslichen gefärbten Reaktionsprodukts. Ebenso kann man als Enzym die β-Galactosidase verwenden, deren bevorzugte Substrate Orthonitrophenyl-β-D-Galactopyranosid oder Methyl-4-Umbelliferyl-β-D-Galactopyranosid sind.
Vorzugsweise kann man die spezifischen Antikörper an Peroxidase koppeln. In diesem Fall ist das Kopplungsverfahren von demjenigen abgeleitet, welches von M. B. WILSON und P. K. NAKANE in Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Hrsg.: W. Knapp, K. Kolubar, G. Wicks, Elsevier/North Holland. Amsterdam 1978, S. 215–224, beschrieben wurde.
Die zum Nachweisen der an spezifische Antikörper konjugierten Peroxidase verwendeten Reagenzien enthalten oxygeniertes Wasser, Enzymsubstrat und ein geeignetes Chromogen, zum Beispiel Orthophenylendiamin oder Azino-2,2'-bis(Ethyl-3-Thiazolin-Sulfon-6-Säure), oder ABTS, zum Erhalten eines Reaktionsendproduktes, welches gefärbt und im Medium löslich ist, oder aber Diamino-3,3'-Benzidin oder Amino-3-Ethyl-9-Carbazol oder Chlor-4α-Naphtol zum Erhalten eines unlöslichen Reaktionsendproduktes, oder Parahydroxyphenylpropionsäure zum Erhalten eines fluoreszierenden Reaktionsproduktes, welches im Medium löslich ist.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von spezifischen Antikörpern, welche an Acetylcholinesterase gekoppelt sind.
Die Acetylcholinesterase wird an den Antikörper vorzugsweise unter Anwendung eines Verfahrens gekoppelt, abgeleitet von demjenigen, welches im französischen Patent Nr. 2 550 799 beschrieben wird, oder eines Verfahrens, welches schematisch die Herstellung von Fragmenten des Antikörpers durch eine bekannte Technik, die Modifikation des Enzyms durch Reaktion mit einem geeigneten heterobifunktionellen Mittel und schließlich die Kopplung der so erhaltenen Produkte umfaßt. Andere bekannte Verfahren zur Konstruktion von immunenzymatischen Konjugaten können in diesem Fall ebenfalls angewandt werden.
Der Nachweis der enzymatischen Aktivität, welche spezifisch an das Antigen, das von dem Acetylcholinesterase-Konjugat erkannt wird, gebunden ist, wird vorzugsweise gemäß der gut bekannten Technik, welche Acetylthiocholin als Substrat des Enzyms und das Ellman-Reagenz oder Dithio-5,5'-Nitro-2-Benzoesäure als Chromogen verwendet, gemäß einer beliebigen, an den untersuchten Fall angepaßten Variante durchgeführt, wie zum Beispiel derjenigen, welche von Pradelles et al. in Anal. Chem. 1985, 57: 1170–1173 beschrieben wird.
Die angegebenen Chromogene werden als solche oder in der Form von wasserlöslichen Salzen verwendet.
Das serologische Diagnoseverfahren der Erfindung ist angepaßt an eine Anwendung in biologischen und/oder anatomisch-pathologischen Laboratorien. Hierfür sieht man eine Vorrichtung für die Durchführung dieses Verfahrens vor, welche einen festen Träger umfaßt, auf oder in welchem man eine Lösung abscheidet, welche das Bakterium enthält, wie es vorangehend definiert wurde.
Die Erfindung betrifft gemäß einem anderen Aspekts auch ein Kit für den in-vitro-Nachweis des Bakteriums, das für die Whipple-Krankheit verantwortlich ist. Dieser Kit umfaßt als Bestandteile:

– eine Lösung, die das Bakterium oder ein Antigen gemäß der Erfindung enthält, und/oder
– eine Lösung, die wenigstens einen Antikörper gemäß der Erfindung enthält, und/oder
– eine Lösung, die wenigstens einen spezifischen Antikörper eines Humanimmunoglobulins enthält, der dieses erkennt.

Genauer gesagt umfaßt der Kit:

– eine Lösung, enthaltend das für die Whipple-Krankheit verantwortliche Bakterium, isoliert und etabliert wie hier oben beschrieben, als Positiv-Kontrolle;
– eine Lösung, welche einen markierten spezifischen Antikörper enthält;
– gegebenenfalls eine Waschlösung.

Der in dem Kit der Erfindung verwendete spezifische Antikörper ist vorteilhafter Weise durch eine radioaktive Sonde, ein Enzym oder ein fluoreszierendes Mittel markiert.
Wenn der spezifische Antikörper durch ein Enzym markiert ist, umfaßt der Kit unter anderem das Substrat des Enzyms und ein oder mehrere Reagenzien zur Sichtbarmachung der Aktivität des Enzyms.
Wenn der spezifische Antikörper durch ein fluoreszierendes Mittel markiert ist, verwendet man bevorzugt Fluoreszeiniso(thio)cyanat.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man als spezifischen Antikörper ein Immunoglobulin, insbesondere ein Maus-Immunoglobulin.
Die vorliegende Erfindung zielt gleichermaßen auf das Gen rpoB des Bakteriums Tropheryma whippelii gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Sequenz des Gens rpoB ist durch enzymatische Amplifizierung und automatische direkte Sequenzierung mit Konsensus-Primern unter einer großen Anzahl anderer Bakterien von unterschiedlichen Gattungen und Spezies bestimmt worden.
Das Gen rpoB codiert eine der Untereinheiten von bakterieller RNA-Polymerase und stellt einen genetischen Marker dar, welcher die spezifische Detektion des Bakteriums der Spezies Tropheryma whippelii gestattet.
Genauer gesagt zielt die vorliegende Erfindung auf ein Fragment des Gens rpoB, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 in der hier beigefügten Sequenzauflistung aufzeigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren spezifische Nukleinsäuresequenzen der Spezies Tropheryma whippelii, deren Nukleotidsequenz aus dem Gen rpoB des Bakteriums, und insbesondere dem hier oben angegebenen Fragment des Gens rpoB, abgeleitet ist.
Gemäß Lazcano et al. [J. Mol. Evol. (1988) 27: 365–376] werden die RNA-Polymerasen gemäß ihres Ursprungs in zwei Gruppen unterteilt, wobei die eine von den viralen RNA- oder DNA-abhängigen RNA-Polymerasen gebildet wird, und die andere von den DNA-abhängigen RNA-Polymerasen eukaryotischen oder prokaryotischen Ursprungs (Archaebakterien und Eubakterien) gebildet wird. Die eubakteriellen DNA-abhängigen RNA-Polymerasen sind durch einen einfachen und konservierten multimeren Aufbau charakterisiert, bezeichnet als "Core-Enzym", welches repräsentiert wird durch αββ', oder als "Holoenzym", welches repräsentiert wird durch αββ'σ [Yura und Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13: 59–97].
Zahlreiche Arbeiten haben die funktionelle Rolle der Untereinheit β von eubakterieller RNA-Polymerase innerhalb des multimeren Enzymkomplexes aufgedeckt. Die RNA-Polymerasen von Archaebakterien und Eukaryoten präsentieren ihrerseits eine komplexere Struktur, welche rund 10, wenn nicht 30 Untereinheiten erreichen kann [Pühler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 4569–4573].
Die Gene, welche die verschiedenen Untereinheiten αββ'σ der DNA-abhängigen RNA-Polymerase bei den Eubakterien codieren, bzw. die Gene rpoA, rpoB, rpoC und rpoD, werden in unterschiedliche Gruppen klassifiziert, umfassend die Gene, codierend für die konstitutiven Proteine der Ribosomen-Untereinheiten oder für Enzyme, welche in der Replikation und Reparatur des Genoms beteiligt sind [Yura und Yshihma, Ann. Rev. Genet. (1979) 13: 59–97]. Einige Autoren haben gezeigt, daß die Nukleinsequenzen der Gene rpoB und rpoC zum Aufstellen phylogenetischer Stammbäume verwendet werden können [Rowland et al., Biochem. Soc. Trans. (1992) 21: 40s], welche es gestatten, die verschiedenen Abzweigungen und Unter-Abzweigungen unter den Reichen des Lebens zu trennen.
Bevor dieser Aspekt der Erfindung in weiterer Ausführlichkeit aufgezeigt wird, werden verschiedene Ausdrücke, welche in der Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet werden, hierin nachstehend definiert:

– unter "Nukleinsäure, extrahiert aus Bakterien" versteht man sowohl Gesamt-Nukleinsäure als auch genomische DNA, ebenso wie mRNAs und auch DNA, welche durch reverse Transkription von mRNAs erhalten wird;
– ein "Nukleotidfragment" oder ein "Oligonukleotid" sind zwei synonyme Ausdrücke, welche eine Kette von Nukleotidmotiven bzw. Nukleotideinheiten bezeichnen, die gekennzeichnet ist durch eine informationelle Sequenz aus natürlichen (oder gegebenenfalls modifizierten) Nukleinsäuren, und in der Lage ist, wie die natürlichen Nukleinsäuren, mit einem komplementären oder im Wesentlichen komplementären Nukleotidfragment, unter vorgegebenen Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren. Die Kette kann Nukleotideinheiten von unterschiedlicher Struktur zu derjenigen von natürlichen Nukleinsäuren enthalten. Ein Nukleotidfragment (oder Oligonukleotid) kann zum Beispiel bis zu 100 Nukleotideinheiten enthalten. Es enthält im Allgemeinen wenigstens 10 und insbesondere wenigstens 12 Nukleotideinheiten und kann, ausgehend von einem natürlichen Nukleinsäuremolekül und/oder durch genetische Rekombination und/oder durch chemische Synthese erhalten werden,
– eine Nukleotideinheit ist von einem Monomer abgeleitet, welches ein natürliches Nukleotid von Nukleinsäure sein kann, dessen konstitiuierende Elemente ein Zucker, eine Phosphatgruppe und eine Stickstoff-Base, gewählt unter Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin, Thymin, sind; oder das Monomer ist ein Nukleotid, welches in mindestens einem der drei oben genannten konstitiuierenden Elemente modifiziert wurde: zum Beispiel kann die Modifikation entweder auf dem Niveau der Basen eingreifen, und zwar mit modifizierten Basen, wie Inosin, Methyl-5-Desoxycytidin, Desoxyuridin, Dimethylamino-5-Desoxyuridin oder jedweder anderen modifizierten Base, die zur Hybridisierung in der Lage ist, als auch auf dem Niveau des Zuckers, zum Beispiel durch Ersetzung mindestens einer Desoxyribose durch ein Polyamid [PE Nielsen et al., Science (1991) 254: 1497–1500], oder auch auf dem Niveau der Phosphatgruppe, beispielsweise durch Ersetzung durch Ester, welche insbesondere gewählt werden unter Diphosphaten, Alkyl- und Arylphosphonaten und Phosphorothioaten,
– unter "informationelle Sequenz" versteht man jegliche geordnete Folge von Einheiten vom Nukleotid-Typ, deren chemische Natur und Reihenfolge in einer Bezugsrichtung eine Information darstellt, analog zu derjenigen, welche von der Sequenz natürlicher Nukleinsäuren vorgesehen wird,
– unter "Hybridisierung" versteht man den Prozeß, während dem, unter geeigneten Bedingungen, zwei Nukleotidfragmente mit ausreichend komplementären Sequenzen in der Lage sind, sich durch stabile und spezifische Wasserstoffbindungen zur Bildung eines Doppelstrangs zu assoziieren. Die Hybridisierungsbedingungen werden bestimmt durch die "Stringenz", d. h. die Strenge der Verfahrensbedingungen. Die Hybridisierung ist umso spezifischer, je höher die Stringenz ist, bei welcher sie durchgeführt wird. Die Stringenz ist insbesondere eine Funktion der Basenzusammensetzung eines Doppelstranges aus Sonde/Ziel sowie des Fehlpaarungs-Grades zwischen zwei Nukleinsäuren. Die Stringenz kann gleichermaßen eine Funktion von Parametern der Hybridisierungsreaktion sein, wie der Konzentration und dem Typ der in der Hybridisierungslösung vorhandenen Ionenspezies, der Natur und der Konzentration von denaturierenden Mitteln und/oder der Hybridisierungstemperatur. Die Stringenz der Bedingungen, unter welchen eine Hybridisierungsreaktion durchzuführen ist, hängt insbesondere von den verwendeten Sonden ab. Alle diese Daten sind gut bekannt, und geeignete Bedingungen können gegebenenfalls in jedem Fall durch Routineexperimente bestimmt werden. Gemäß der Länge der verwendeten Sonden liegt die Temperatur für die Hybridisierungsreaktion im Allgemeinen zwischen ungefähr 20 und 65°C, insbesondere zwischen 35 und 65°C in einer Salzlösung mit einer Konzentration von ungefähr 0,8 bis 1 M,
– eine "Sonde" ist ein Nukleotidfragment, umfassend zum Beispiel 10 bis 100 Nukleotideinheiten, insbesondere 12 bis 35 Nukleotideinheiten, welche eine Hybridisierungsspezifität aufweist unter den Bedingungen, festgelegt für die Bildung eines Hybridisierungskomplexes mit einer Nukleinsäure, welche im vorliegenden Fall eine Nukleotidsequenz umfaßt, enthalten entweder in einer mRNA oder in einer DNA, erhalten durch reverse Transkription der mRNA, welche durch Transkription hergestellt wurde; eine Sonde kann zu diagnostischen Zwecken (insbesondere Einfangsonden oder Detektionssonden) oder zu therapeutischen Zwecken verwendet werden,
– eine "Einfangsonde" wird auf einem festen Träger immobilisiert oder ist darauf immobilisierbar durch jedwede geeignete Methode, zum Beispiel durch kovalente Bindung, durch Adsorption oder durch direkte Synthese auf einer Festphase. Beispiele für Träger umfassen Mikrotiterplatten und DNA-Chips,
– eine "Detektionssonde" kann mit Hilfe eines Markierungsmittels markiert sein, das zum Beispiel unter radioaktiven Isotopen, Enzymen, insbesondere Enzymen, welche auf ein chromogenes, fluorogenes oder lumineszentes Substrat wirken können (insbesondere eine Peroxidase oder eine alkalische Phosphatase), chromophoren chemischen Verbindungen, chromogenen, fluorogenen oder lumineszenten Verbindungen, Analogen von Nukleotidbasen und Liganden, wie Biotin, gewählt wird.
– eine "Spezies-Sonde" ist eine Sonde, welche die Identifizierung der Spezies eines Bakteriums gestattet,
– eine "Gattungs-Sonde" ist eine Sonde, welche die Identifizierung der Gattung eines Bakteriums gestattet,
– ein "Primer" ist eine Sonde, welche zum Beispiel 10 bis 100 Nukleotideinheiten umfaßt und eine Hybridisierungsspezifität unter den festgelegten Bedingungen zum Initiieren einer enzymatischen Polymerisation aufweist, zum Beispiel in einer Amplifikationstechnik, wie der PCR, in einem Sequenzierungsverfahren, in einem Verfahren zur Transkription, etc.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein einzelsträngiges Oligonukleotid, gewählt unter den Oligonukleotiden mit einer Sequenz von mindestens 12 aufeinander folgenden Nukleotideinheiten, die in einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 in der hier beigefügten Sequenzauflistung eingeschossen sind, und unter Oligonukleotiden, welche zu diesen Oligonukleotiden komplementär sind. Diese Oligonukleotide können Oligodesoxyribonukleotide (DNA) und Oligoribonukleotide (RNA), in welchen "T" durch "U" ersetzt ist, sein.
Insbesondere besitzt ein Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung mindestens 12 Einheiten, wie hier oben beschrieben, und höchstens 50 Einheiten. Genauer gesagt besitzt ein Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung 12 bis 35 Einheiten.
Ein bevorzugtes Oligonukleotid weist eine Sequenz, gewählt unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und 5, auf.
Inosin ist fähig, sich mit jedweder anderen Base zu paaren.
Die Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und 5 können durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei Techniken angewandt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind und die zum Beispiel in dem Artikel von Itakura, K., et al. [(1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323] beschrieben werden.
Eine erste Anwendung eines Oligonukleotids der Erfindung ist seine Verwendung als Sonde für die Detektion, in einer biologischen Probe, von Bakterien der Spezies Tropheryma whippelii, welche eine Nukleotidsequenz von mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nukleotideinheiten aufweist, eingeschlossen in einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5, und ihren komplementären Sequenzen. Im Verlauf der Beschreibung wird eine derartige Sonde der Erfindung als Spezies-Sonde bezeichnet werden.
Die Sonden gemäß der Erfindung können für diagnostische Zwecke, in der Untersuchung der Gegenwart oder Abwesenheit einer Ziel-Nukleinsäure in einer Probe, gemäß allen bekannten Hybridisierungstechniken und insbesondere Techniken zur punktuellen Abscheidung auf einem Filter, bezeichnet als "DOT-BLOT" [Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], in DNA-Transfertechniken, bezeichnet als "SOUTHERN BLOT" [Southern, E. M., J. Mol. Biol. (1975) 98: 503], in RNA-Transfertechniken, bezeichnet als "NORTHERN BLOT", oder in sogenannten "Sandwich"-Techniken [Dunn, A. R., Hassel J. A. (1977) Cell 12: 23] verwendet werden. Man verwendet insbesondere die "Sandwich"-Technik mit einer Einfangsonde und/oder einer Detektionssonde, wobei die Sonden in der Lage sind, mit zwei unterschiedlichen Regionen der Zielnukleinsäure zu hybridisieren, und wenigstens eine der Sonden (im Allgemeinen die Detektionssonde) fähig ist, mit einer Region des Ziels zu hybridisieren, welche spezifisch für die Spezies ist, wobei es sich versteht, daß die Einfangsonde und die Detektionssonde Nukleotidsequenzen aufweisen müssen, welche wenigstens teilweise unterschiedlich sind.
Die nachzuweisende Nukieinsäure (Ziel) kann DNA oder RNA sein (wobei das eine oder das andere gegebenenfalls nach PCR-Amplifikation erhalten wird). Im Fall der Detektion eines Ziels vom doppelsträngigen Nukleinsäuretyp, ist es zweckmäßig, die Denaturierung des Letztgenannten vor der Ausführung des Detektionsverfahrens vorzunehmen. Die Zielnukleinsäure kann erhalten werden durch Extraktion von Nukleinsäuren einer zu untersuchenden Probe gemäß bekannten Verfahren. Die Denaturierung einer doppelsträngigen Nukleinsäure kann durch bekannte Verfahren zur chemischen, physikalischen oder enzymatischen Denaturierung durchgeführt werden, und insbesondere durch Erwärmen auf eine geeignete Temperatur über 80°C.
Um die vorausgehend genannten Hybridisierungstechniken, und insbesondere die "Sandwich"-Techniken, auszuführen, wird eine erfindungsgemäße Sonde, bezeichnet als Einfangsonde, auf einem festen Träger immobilisiert, und eine andere Sonde der Erfindung, bezeichnet als Detektionssonde, wird mit einem Markierungsmittel markiert.
Beispiele für den Träger und das Markierungsmittel sind diejenigen, welche vorausgehend definiert wurden.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Bakteriums Tropheryma whippelii in einer Probe, enthaltend, oder vermutlich enthaltend, Nukleinsäuren von wenigstens einem derartigen Bakterium, umfassend die Schritte, bestehend aus dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit wenigstens einer Spezies-Sonde der Erfindung und danach dem Bestimmen, auf eine per se bekannte Weise, der Bildung oder der Abwesenheit der Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen der Sonde und der Nukleinsäure der Probe.
Beispiele zur Detektion der Bildung oder der Abwesenheit der Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen der Sonde und der Nukleinsäure umfassen die hier oben beschriebenen Techniken, insbesondere die "DOT-BLOT"-, "SOUTHERN-BLOT"- und "Sandwich"-Techniken.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens für die Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer Spezies Tropheryma whippelii verwendet man mehrere Spezies-Sonden der Erfindung, wobei es sich versteht, daß die Sonden in der Lage sind, mit nicht überlappenden Regionen einer Nukleinsäure, entsprechend dem Gen rpoB von Tropheryma whippelii, zu hybridisieren.
In vorteilhafter Weise wird die Spezies-Sonde auf einem festen Träger immobilisiert, und eine andere Spezies-Sonde wird mit einem Markierungsmittel markiert.
Eine weitere Anwendung eines Oligonukleotids der Erfindung ist seine Verwendung als Nukleotid-Primer, umfassend ein einzelstängiges Oligonukleotid, gewählt unter Oligonukleotiden mit einer Sequenz von mindestens 12 Nukleotideinheiten, eingeschlossen in einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und 5, welcher in der Synthese einer Nukleinsäure in Gegenwart einer Polymerase durch ein per se bekanntes Verfahren geeignet ist, insbesondere in Amplifikationsverfahren unter Anwendung einer derartigen Synthese in Gegenwart einer Polymerase (PCR, RT-PCR etc.). Im Besonderen kann ein Primer der Erfindung verwendet werden für die spezifische reverse Transkription einer mRNA-Sequenz von Tropheryma whippelii zum Erhalten einer entsprechenden komplementären DNA- bzw. cDNA-Sequenz. Eine solche reverse Transkription kann die erste Stufe der RT-PCR-Technik darstellen, wobei die anschließende Stufe die PCR-Amplifizierung der erhaltenen cDNA ist. Man kann des Weiteren die Primer der Erfindung für die spezifische Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion der gesamten DNA-Sequenz des Gens rpoB von Tropheryma whippelii verwenden.
In einem besonderen Fall umfaßt der Primer, welcher ein Oligonukleotid der Erfindung umfaßt, des Weiteren die Sinn- oder Antisinn-Sequenz von einem Promotor, der von einer RNA-Polymerase erkannt wird (zum Beispiel die T7-, T3-, SP6-Promotoren [Studier, F. W., B. A. Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189: 113]). Derartige Primer sind in Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation anwendbar, bei welchen ein Transkriptionsschritt verwendet wird, wie zum Beispiel die NASBA- oder 3SR-Techniken [Van Gemen, B., et al., Abstract MA 1091, 7^th International Conference on AIDS (1991) Florenz, Italien].
Ein anderes Ziel der Erfindung ist ein Nukleotidprimer, umfassend ein einzelsträngiges Oligonukleotid, gewählt unter den Oligonukleotiden mit einer Sequenz von mindestens 12 aufeinander folgenden Nukleotideinheiten, eingeschlossen in einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 4 bis SEQ ID Nr. 5, welcher für die vollständige oder teilweise Sequenzierung des Gens rpoB aus einem beliebigen Stamm von Tropheryma whippelii verwendbar ist. Insbesondere ist der Nukleotidprimer verwendbar für die Sequenzierung einer amplifizierten Nukleinsäure. Die Sequenzierung besteht in der Gewinnung der gesamten oder teilweisen Sequenz des Gens ropB durch ein per se bekanntes Vorgehen, Absorptions-Polymerisation unter Verwendung von Didesoxynukleotiden [Sanger, F., Coulson, A. R. (1975) J. Mol. Biol. 94: 441] oder mehreren Hybridisierungen unter Verwendung von DNA-Chips.
Vorzugsweise verwendet man in einer Anwendung als Primer oder für die Sequenzierung von rpoB-Genen die Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und 5.
Schließlich ist ein letztes Ziel der Erfindung eine Sonde zur Gentherapie zum Behandeln von Infektionen, welche von einem Stamm von Tropheryma whippelii hervorgerufen werden, wobei die Sonde ein Oligonukleotid umfaßt, wie vorangehend definiert. Diese Gentherapie-Sonde, fähig zur Hybridisierung auf mRNA und/oder auf genomischer DNA der Bakterien, kann die Phänomene der Translation und/oder Transkription und/oder Replikation blockieren.
Das Prinzip von Verfahren zur Gentherapie ist bekannt und beruht insbesondere auf der Verwendung einer Sonde, welche einem Antisinn-Strang entspricht: Die Bildung eines Hybrids zwischen der Sonde und dem Sinn-Strang kann wenigstens einen der Schritte der Entzifferung der genetischen Information beeinträchtigen. Die Gentherapie-Sonden sind daher als antibakterielle Medikamente verwendbar, wobei sie die Bekämpfung von Infektionen, welche durch Spirochäten verursacht werden, gestatten.
Die Erfindung wird mit Hilfe der hier nachstehenden Beschreibung besser verständlich, welche in Beispiele unterteilt ist, die Experimente betreffen, welche mit dem Ziel der Ausführung der Erfindung durchgeführt wurden, und die lediglich zu veranschaulichenden Zwecken angegeben werden.
Die 1 bis 4 sind Fotografien von Elektrophorese-Gel.
Die 1 zeigt das Protein-Profil auf einer SDS-PAGE von Tropheryma whippelii.
Die 2 zeigt das Antigen-Profil von Tropheryma whippelii, welches durch Western-Blot erhalten wird.
Spur 1 = Serum aus immunisierter Maus.
Spur 2 = Serum aus immunisiertem Kaninchen.
Spur 3 = Serum aus einem Patienten (IgG + IgM).
Spur 4 = monoklonaler Antikörper 1.
Spur 5 = monoklonaler Antikörper 2.
Spur 6 = monoklonaler Antikörper 3.
Spur 7 = monoklonaler Antikörper 4.
Die 3 repräsentiert einen Western-Blot, ausgeführt an dem Stamm TWIST Nr. I-2202 mit einem Serum eines Patienten, der an der Whipple-Krankheit leidet, mit Detektion von IgM.
Die 4 repräsentiert die Visualisierung des Amplifikationsproduktes des rpoB-Gens von Tropheryma whippelii mit den Primern SEQ ID Nr. 1 und 2 nach Färben durch Ethidiumbromid.
Spur 1: Tropheryma whippelii
Spur 2: Nocardia otitidiscaviarum
Spur 3: Mycobacterium tuberculosis
Spur 4: Staphylococcus epidermidis
Spur 5: Corynebacterium amycolatum
Spur 6: Mycobacterium avium
Spur 7: Escherichia coli
Spur 8: H2O
Spur 9: H2O
Beispiel 1: Erstisolierung des Bakteriums
Die Erstisolierung ist durch eine Zentrifugationstechnik in Bijoux-Röhrchen ausgeführt worden, welche mit einer menschlichen HEL-Fibroblastenlinie, die bei der ATCC verfügbar ist, inokuliert worden waren. Die HEL-Zellen werden auf MEM-Medium (Gibco) kultiviert, welches mit 10% fötalem Kälberserum (Gibco) und mit 2 mM L-Glutamin (Gibco) ergänzt war. Die Bijoux-Röhrchen (Sterilin-Felthan-England, 3,7 ml), die eine Trägerlamelle von 12 mm Durchmesser umfassten, werden mit 1 ml Kulturmedium, enthaltend ungefähr 50000 Zellen, inokuliert und werden 3 Tage lang bei 37°C unter 5% CO₂ auf derartige Weise inkubiert, daß man einen Rasen von konfluenten Zellen erhält. Die untersuchte Herzklappe ist in MEM-Medium zerkleinert worden, und die Suspension wurde zum Inokulieren der 3 Bijoux-Röhrchen verwendet. Diese Röhrchen werden anschließend bei 700 g während 1 Stunde bei 22°C zentrifugiert. Der Überstand wird anschließend abgezogen, die Rasenschichten wurden zweimal mit sterilem PBS-Puffer gewaschen, danach mit 1 ml Medium bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Die Überwachung der Kulturen wurde durch Cytozentrifugation von 100 μl Überstand aus den Bijoux-Röhrchen und Gimenez-Färbung durchgeführt. Dieses Vorgehen wird bei 10, 20 und 30 Tagen wiederholt. Nach 30 Tagen wurden der Überstand und der Zellen-Rasen der Bijoux-Röhrchen abgeerntet und auf einen konfluenten Zellrasen in einem 25 cm² großen Kulturbehälter (Behälter 1) mit 15 ml Kulturmedium umgepflanzt und bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Jede Woche, während der 6 nachfolgenden Wochen (J72) wurde der Zellrasen mit Hilfe eines inversen Mikroskops zur Ermittlung eines cytopathogenen Effektes untersucht, und das Kulturmedium wurde mit frischem Medium ersetzt. Vor dem Auswechseln des Mediums wurden 200 μl Überstand verwendet, um eine Cytozentrifugation, gefärbt mittels einer Gimenez-Färbung, durchzuführen.
Es ist keinerlei cytopathogener Effekt vor dem 65. Tag nachgewiesen worden. Am 72. Tag hat die Untersuchung des Zellrasens durch inverse Mikroskopie ermöglicht, kleine dunkle Einschlüsse und Unregelmäßigkeiten in den HEL-Zellen nachzuweisen. Auf der Gimenez-Färbung der Cytozentrifugation des Überstandes des Behälters 1 sind mehrere feine Bazillen detektiert worden, der Großteil in intrazellulärer Lokalisierung, wo sie kleiner als die extrazellulären erschienen. Nichtsdestotrotz war der Großteil mittels der Gimenez-Färbung schlecht oder nicht gefärbt und erschien in blassem Blau. Bei der Gram-Färbung wurden ebenfalls zahlreiche Bazillen nachgewiesen. Der Großteil erschien grampositiv, aber mehrere waren nur teilweise violett oder erschienen gramnegativ. Bei der Ziehl-Färbung sind diese Bazillen nicht Säure-Alkohol-resistent. Bei der Färbung mittels PAS, erschienen die PAS-positiven Bazillen zahlreicher als auf den vorangehenden Färbungen. Der Großteil der langen, feinen Bazillen kann in extrazellulärer Lokalisierung beobachtet werden. Die HEL-Zellen schienen von PAS-positiven Konglomeraten und von PAS-positiven kurzen und feinen Bazillen angefüllt zu sein.
Beispiel 2: Vermehrung des Isolats
Das gesamte Verfahren zur Vermehrung wurde auf HEL-Zellen ausgeführt, welche auf MEM-Medium kultiviert wurden, dem 10% fötales Kälberserum und 2 mM L-Glutamin zugesetzt waren, und welche bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert wurden. Am 75. Tag wurden 3 ml des Überstands aus dem Behälter I verwendet zum Inokulieren von 10 Bijoux-Röhrchen durch das vorausgehend beschriebene Verfahren, und 2 ml Überstand wurden verwendet, um einen konfluenten Zellrasen in einem Kulturbehälter von 25 cm² (Behälter A) mit 15 ml Medium zu inokulieren. Die Zellen des Behälters 1 sowie der Rest des Überstands wurden geerntet, was gestattete, 10 ml an Suspension zu erhalten. Diese Suspension ist anschließend in 5 Aliquots von 2 ml unterteilt worden. Eines der Aliquots ist in flüssigen Stückstoff eingefroren worden. Ein Aliquot ist auf einen konfluenten Zellrasen inokuliert worden in einem Kulturbehälter von 25 cm² (Behälter B) mit 15 ml Medium. Die Zellen eines Aliquots wurden durch 4 Einfrier-Auftau-Zyklen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff und warmen Wasser (55°C) lysiert, dann auf einen konfluenten Zellrasen in einem Kulturbehälter von 25 cm² (Behälter C) mit 15 ml Medium inokuliert. Ein Aliquot wurde in einen Kulturbehälter ohne Zellrasen von 25 cm² (Behälter D) mit 15 ml Medium inokuliert. Am 85. Tag wurde das Medium aller Behälter und Bijoux-Röhrchen durch frisches Medium ersetzt. Die Zellen wurden geerntet und in einen Kulturbehälter von 75 cm² (Behälter D2) mit 30 ml Medium inokuliert. Vor dem Wechseln des Mediums wurden 200 μl des Überstandes verwendet, um eine Cytozentrifugation, gefärbt mit einer Färbung durch PAS, durchzuführen, und der Rest des Überstandes wurde in Hinsicht auf eine Verwendung als Antigen für die Serologie eingefroren. An den 95. und 105. Tagen wurde das Medium aller Behälter und der Bijoux-Röhrchen ausgewechselt, wie vorausgehend beschrieben. Kleine Bereiche des Zellrasens wurden abgeschabt, um Zell-Abstriche mit der Absicht einer Färbung durch PAS zu realisieren. Die Effektivität der Vermehrung des Stamms wurde durch eine semiquantitative Auswertung ermittelt. Das Vorhandensein von PAS-positiven Bazillen wurde mikroskopisch unter Verwendung einer 1000-fachen Vergrößerung auf die folgende Weise gewertet: 0, abwesend; +, vorhanden, aber schwierig aufzufinden; ++, leicht aufzufinden, aber nicht in allen Feldern vorhanden; +++, in allen Feldern vorhanden. Diese Bewertungen sind im Blindversuch durchgeführt worden.
Alle Verfahren zur Vermehrung erwiesen sich als wirksam, da alle es ermöglicht haben, das Isolat nach 30 Tagen Unter-Kultur zurück zu gewinnen (Tabelle 1). Die semiquantitative Bewertung hat es gestattet, zu beobachten, daß die wirkungsvollsten Vorgehensweisen das Umpflanzen in Bijoux-Röhrchen, die Unter-Kultur des Überstands (Behälter A) und das Umpflanzen der Zellen (Behälter D, D2) waren. Tabelle 1

NF:: nicht durchgeführt

Beispiel 3: Detektion durch Immunfluoreszenz
Die Detektion von intrazellulären Bakterien ist am 105. Tag direkt in einem Bijoux-Röhrchen durch Immunfluoreszenz durchgeführt worden. Nach Fixierung mittels Aceton wurde das Röhrchen zweimal mit PBS gespült. 100 μl Patientenserum, welches 1:50 mit PBS mit 3% Magermilchpulver verdünnt war, wurden zugegeben, und das Röhrchen wurde in einer feuchten Kammer bei 37°C während 30 Minuten inkubiert. Nach 3 Spülungen mit PBS wurde das Röhrchen während 30 Minuten bei 37°C mit 100 μl Ziege-Anti-Mensch-Immunoglobulin, markiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (Fluoline H, Biomerieux, Marcy l'Etoile, Frankreich), inkubiert, welches 1:200 mit PBS, versetzt mit 0,2% Evans-Blau, verdünnt worden war. Nach 3 Spülungen mit PBS wurde die Lamelle (Zellen nach unten) in gepuffertes Glycerin (pH 8) eingebettet bzw. montiert und bei einer 400-fachen Vergrößerung mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops von Zeiss und eines konfokalen Mikroskops (LEICA DMIRBE), welches mit einem 100×-Objektiv (NA = 1,4) zur Immersion ausgerüstet war, untersucht.
Die Immunfluoreszenz-Untersuchung zeigt, daß die Färbung durch PAS sowie die anderen Färbungen die zelluläre Infektion unterbewerteten. Auf der Lamelle sind, nach 30 Tagen Unter-Kultur, alle Zellen mit dem bakteriellen Antigen angefüllt. Die Untersuchung mittels konfokaler Mikroskopie bestätigt die intrazelluläre Lokalisierung des Bakteriums. Mehrere Bakterien wurden isoliert in Formen von feinen Bazillen nachgewiesen, welche jenen ähneln, die mittels der PAS-Färbung beobachtet worden waren. Nichtsdestoweniger entspricht der Großteil des immunpositiven Materials größeren Einschlüssen, bei welchen es unmöglich ist, Bakterien zu vereinzeln bzw. zu individualisieren bzw. einzeln wahrzunehmen. Immunpositives Material wurde nicht im Zellkern der Zellen detektiert.
Beispiel 4: Elektronenmikroskopie
Am 105. Tag wurden 300 μl einer Lösung, enthaltend die Zellen, geerntet im Behälter D2, für eine Untersuchung durch Elektronenmikroskopie präpariert. Die Zellen wurden in einer Lösung von 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylat-Puffer, enthaltend 0,1 M Saccharose, während 1 h bei 4°C fixiert. Die Zellen wurden eine Nacht im gleichen Puffer gespült, dann 1 h lang bei Umgebungstemperatur in Osmiumtetraoxid in 0,1 M Cacodylat-Puffer fixiert. Die Dehydrierung wurde durch aufeinander folgende Spülungen in Ethanol-Lösungen mit steigenden Konzentrationen durchgeführt. Die Zellen wurden anschließend in Epon 812-Blöcke eingeschlossen. Anschließend wurden Feinschnitte, ausgehend von den Blöcken mit Hilfe eines Mikrotoms LKB Ultratome 111 geschnitten, und dann mittels einer gesättigten Lösung von Uranylacetat in Methanol und einer wässrigen Lösung von Bleicitrat gefärbt, vor der Untersuchung auf einem Elektronenmikroskop Jeol JEM 1200 EX.
Die elektronenmikroskopische Untersuchung bestätigt, daß die PAS-positiven Einschlüsse und das immunpositive Material intakten oder im Abbau befindlichen Bakterien entsprechen. Die cytoplasmatische Membran dieser Bakterien ist aus zwei elektronendichten Lagen aufgebaut. Die feine bakterielle Wand ist manchmal von einer externen Pseudomembran umhüllt, welche ein trilamellares Aussehen ergibt. Bakterien, welche in der Teilung begriffen sind, werden beobachtet.
Beispiel 5: Herstellung von polyklonalen Antikörpern in der Maus gegen das für die Whipple-Krankheit verantwortliche Bakterium
Eine Maus des Balb C-Stamms erhielt intraperitoneal eine Injektion mit 0,5 ml Überstand, welcher 10⁴ Bakterien, welche für die Whipple-Krankheit verantwortlich sind, enthielt. Die Maus erhielt anschließend erneute Injektionen 1, 2 und 3 Wochen später, mit 0,5 ml der gleichen Suspension. Eine Woche nach dieser letzten Impfung wurde Blut aus der Maus gewonnen. Das Serum wurde einerseits gegenüber dem für die Whipple-Krankheit verantwortlichen Bakterium in Kultur und andererseits auf der Herzklappe eines an der Whipple-Krankheit erkrankten Patienten getestet, einmal mittels Immunfluoreszenz und einmal mittels Immunperoxidase. Die Nachweis-Antikörper waren Anti-Maus-Antikörper, markiert mit Fluoreszein oder markiert mit Immunperoxidase (bezogen von der Firma Immunotech).
Die Bakterien konnten im Inneren der Zellen sichtbar gemacht werden. Die vorliegende Anmeldung betrifft daher auch die direkte Detektion des für die Whipple-Krankheit verantwortlichen Bakteriums in Biopsien und in verschiedenen Proben, zum Beispiel: Herzklappe, Verdauungstrakt-Biopsie oder Biopsie eines beliebigen anderen Organs, von welchem vermutet wird, von dem für die Whipple-Krankheit verantwortlichen Bakterium infiziert zu sein.
Beispiel 6: Herstellung und Anwendung von monoklonalen Antikörpern in Produkten gegen Tropheryma whippelii-Stamm Twist-Marseille, und Bestimmung von Antigenen.
Material und Methoden
Tropheryma whippelii-Stamm. Der Stamm von Tropheryma whippelii, der zum Herstellen und Screenen von Hybridomen und zum Testen der Spezifität von monoklonalen Antikörpern (Mabs) verwendet wurde, ist der Stamm TWIST-Marseille, hinterlegt bei der CNCM Nr. 1-2202. Tropheryma whippelii wurde auf humanen embryonalen Fibroblasten (HEL) unter früher beschriebenen Kulturbedingungen kultiviert. Am 75. Tag wurden infizierte Zellen aus einer Kulturflasche als Probe entnommen, durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 4000 g. Das Pellet der Zentrifugation wurde anschließend in 5 ml PBS resuspendiert. 0,5 ml dieser Suspension wurden in jede Maus eingeimpft. Die Bakterien wurden ebenfalls durch Renograffin-Gradienten gereinigt und in entionisiertem Wasser für die SDS-PAGE oder in PBS für die Mikro-Immunfluoreszenz (MIF) resuspendiert.
Herstellung monoklonaler Antikörper (Mabs). Sechs Wochen alte weibliche BALB/C-Mäuse wurden dreimal in 7-Tage-Intervallen durch intraperitoneale Injektion mit 0,5 ml Suspension von Tropheryma whippelii TWIST-Marseille Nr. 1-2202 in PBS geimpft. Eine Woche nach der letzten der 3 Injektionen, erhielten die Mäuse intravenös eine Auffrischungsdosis von 0,1 ml Tropheryma whippelii, suspendiert in PBS. Drei Tage später wurde die Milz der immunisierten Mäuse entnommen, und die Splenocyten wurden mit Myelomatose-Zellen SP2/0-Ag14 (10:1) fusioniert, wobei 50%iges Polyethylenglycol verwendet wurde (Molekulargewicht: 1300–1600; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Die fusionierten Zellen wurden in einem Kulturmedium für Hybridome (Seromed. Berlin, Deutschland), welches mit 20% fötalem Kälberserum (Gibco BRL) und Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (Sigma Chemical CO., St. Louis, Mo) ergänzt worden war, bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre, angereichert mit 5% CO₂, kultiviert.
Die Gegenwart des Anti-T. whippelii-Antikörpers im Überstand wurde mittels MIF nachgewiesen. Positive Hybridome wurden für die Produktion von Aszitesflüssigkeit subkultiviert. Die Isotypen der Mabs sind mit Hilfe des Kits "Immuno Type Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit" (SIGMA) bestimmt worden, welches Antiseren von Maus-IgM, -IgA, -IgG1, -IgG2a, -IgG2b und -IgG3 enthielt (SIGMA). Die Spezifität der Mabs wurde durch Western-Blot getestet. Eine Woche nach der intraperitonealen Injektion von 0,5 ml Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan; Sigma) in die Mäuse, wurden Antikörper in Aszitesflüssigkeit durch intraperitoneale Injektion von 3 × 10⁶ Hybridomen, in Suspension in 0,5 ml PBS, produziert.
Mikro-Immunfluoreszenz (MIF). Die MIF wurde verwendet für das Screening von Hybridomen und zur Bestimmung der Spezifität der Mabs. Die Antigene, welche durch die Kulturen von Tropheryma whippelii konstituiert werden, wurden mit Hilfe einer Feder auf 24-Vertiefungs-Platten abgeschieden. Nach Fixieren in Methanol während 10 Minuten bei Umgebungstemperatur, wurden die Mabs aufgetragen und in einer feuchten Kammer bei 37°C während 30 Minuten inkubiert. Die Platten wurden anschließend zweimal 5 Minuten lang mit PBS und dann mit destilliertem Wasser gespült, an der Luft getrocknet, und dann während 30 Minuten während 37°C mit Hilfe von Anti-Maus-IgM- und Anti-Maus-IgG-Ziegenantikörpern, konjugiert an Fluorescein, verdünnt 1/200 in PBS mit 0,2% Evans-Blau (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich), inkubiert. Nach dem Spülen wurden die Platten mit Hilfe von Fluorep (BioMérieux) montiert und dann bei 400-facher Vergrößerung in einem Fluoreszenzmikroskop (Axioskop 20; Carl Zeiss, Göttingen, Deutschland) abgelesen. Die Seren der immunisierten Mäuse wurden als Positivkontrolle verwendet, und die Seren aus gesunden Mäusen wurden als Negativkontrolle verwendet.
Um die Anti-Tropheryma whippelii-Antikörper im Serum von Patienten, welche an der Whipple-Krankheit erkrankt waren, zu detektieren, wurde eine MIF auf Labtech-Platten [Raoult, D., et al., N. Eng. J. Med., 2000] durchgeführt. Die Seren wurden 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 und 1:800 verdünnt.
SDS-PAGE und Western-Blot. Die SDS-PAGE und der Western-Blot wurden gemäß dem Verfahren von Laemmli durchgeführt, modifiziert durch Verwenden eines Trenngels aus 12% Polyacrylamid und eines Transfergels von 5%. Eine Suspension von Tropheryma whippelii, enthaltend 4 mg Protein/ml in Puffer (0,0625 M Tris-Hydrochlorid [pH 8,0], 2% SDS, 5% 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerol, 0,02% Bromphenolblau) wurde während 5 Minuten bei 100°C erhitzt. Die gelösten Antigene wurden durch Elektrophorese im Gel mit einer konstanten Intensität von 8 bis 10 mA während 3 bis 4 Stunden in einer Elektrophorese-Vorrichtung getrennt (Mini Protein II: Bio Rad, Richmond, Calif) (Laufpuffer: 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS). Die Größe der Proteine wurde durch Vergleich mit einem Peptidgewicht-Marker (Low Range: Bio Rad) bestimmt. Die derartig aufgetrennten Antigene wurden mit Hilfe eines Transferpuffers (2,5 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol) bei einem Strom von 50 V während 1 Stunde bei +4°C in einer Western-Blot-Vorrichtung (Mini Trans-Blots; Bio Rad) auf eine Nitrozellulose-Membran (Poren von 0,45 μm) überführt. Nach dem Transfer wurden die Nitrozellulose-Membranen über Nacht mit einer 5%igen Magermilchlösung inkubiert, um nicht-spezifische Anheftungsstellen zu blockieren. Die Membranen wurden danach dreimal mit PBS gewaschen und dann an Luft getrocknet. Sie wurden anschließend mit dem Überstand von Hybridomen, verdünnt 1:4, oder dem Serum von Patienten, verdünnt 1:100 in PBS, das mit 3% Milch versetzt war, bei Umgebungstemperatur während 1 Stunde inkubiert und dann, wie hier oben beschrieben, gewaschen. Die Membranen wurden anschließend während einer Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert mit einem F(ab')₂-Fragment eines Anti-Maus-IgG-Ziegenantikörpers, konjugiert an Peroxidase (Schwer- und Leichtketten: AffiniPure; Jackson ImmunoResearch), welcher 1:500 in PBS, versetzt mit 3% Magermilch, verdünnt war, und danach in PBS gewaschen. Die Gegenwart spezifischer Antikörper wurde das Vorhandensein einer Peroxidase-Aktivität mit Hilfe des Substrats 4-Chlor-1-Naphtol nachgewiesen.
Blindversuche mit Mabs. Die Spezifität der monoklonalen Antikörper wurde im Blindversuch auf 19 Bakterien mittels MIF ausgewertet: 12 Spezies von Bartonella: 5 B. quintana, B. henselae Marseille, B. henselae Houston, B. Vinsonii Baker, B. elizabethae, B. grahamii, B. doshiae, B. taylorii, Coxiella burnetii Nine Mile, und 6 verschiedenen Stämmen, welche in unserem Laboratorium aus klinischen Proben isoliert worden waren, darunter Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus bovis, Mycobacterium avium, Corynebacterium ANF-Gruppe, Actinomyces mayerii. Nach Suspension in PBS und Abscheidung auf Vertiefungsplatten wurde die Reaktivität der Mabs mit den Bakterien durch MIF, wie hier oben beschrieben, mit 1:100 verdünnter Aszitesflüssigkeit abgeschätzt.
Patienten. Es wurden 15 Patienten getestet: 8 Patienten mit Whipple-Krankheit mit ausschließlicher Lokalisierung im Verdauungstrakt, deren Diagnose durch Histologie und/oder durch Amplifikation von T. whippelii mittels PCR in Verdauungstrakt-Biopsien erstellt worden war; 7 Patienten, welche an T. whippelii-Endocarditis erkrankt waren, [diagnostiziert] mittels PCR in Herzklappen-Biopsien.
Mäuse und Kaninchen. 5 Mäuse und 1 Kaninchen wurden mit einer Suspension von T. whippelii geimpft, um zu bestimmen, welches die von der Antikörperantwort erkannten Antigene sind.
Ergebnisse
SDS-PAGE-Profile (1). Die SDS-PAGE von T. whippelii hat insbesondere 7 Hauptbanden enthüllt, und zwar bei: 10, 20, 80, 120, 150, 170, 200 kD.
Herstellung von Mabs. Der Überstand von 4 Hybridomen wurde mittels MIF getestet. Vier Hybridome zeigten sich spezifisch hinsichtlich T. whippelii. Ein Hybridom wurde bei der CNCM des Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, PARIS, 75724, unter der Nr. I-2411 und der Identifizierungs-Bezeichnung TW 17G2 hinterlegt.
Serologische Test, durchgeführt an Patienten. 13 von 15 getesteten Patienten (86,7%) präsentierten eine positive Serologie mit einem Anteil von IgM ≥ 1:100. Das im Western-Blot beobachtete Antigen-Profil hat eine Reaktivität mit mehreren Banden enthüllt, darunter eine Hauptbande von 200 kD mit IgG (Figur #2). Mit IgM werden mehrere Proteinprofile gefunden, darunter eine Reaktivität gegen Proteine von 100, 60, 50 und 35 kD (Figur #3).
Serologische Tests, welche an immunisierten Mäusen und Kaninchen durchgeführt wurden. Die immunisierten Mäuse und das immunisierte Kaninchen haben eine positive Serologie mit einem IgM-Anteil > 1:100 gezeigt. Das im Western-Blot beobachtete Antigen-Profil hat eine unterschiedliche Reaktivität zwischen Mäusen und Kaninchen, und unterschiedlich zu derjenigen, welche bei den Patienten beobachtet wurde, offenbart. Hingegen wurde eine größere Reaktivität mit einer Bande von 200 kD beobachtet.
Charakterisierung der Mabs (2). Die 4 Mabs haben eine spezifische Reaktivität für ein Antigen von 200 kD aufgezeigt, welche bereits auf den Western-Blots aus Patienten, Mäusen und dem Kaninchen bewiesen wurde. Alle sind als IgM identifiziert worden. Das erkannte Antigen wurde durch die Wirkung von Proteinase K zerstört, was zeigt, daß es sich bei ihm um ein Protein handelt.
Tests der Mabs im Blindversuch. Aszitesflüssigkeit der 4 Hybridome hat ausschließlich mit T. whippelii reagiert.
Beispiel 7: Sequenz des rpoB-Gens von Tropheryma whippelii.
Die Sequenz des Gens rpoB von Tropheryma whippelii ist durch enzymatische Amplifikation und direkte automatische Sequenzierung unter Verwendung von Konsensus-Primern bestimmt worden.
Die verwendeten Konsensus-Primer hatten folgende Sequenz
DNA, welche aus dem Stamm Tropheryma whippelii TWIST-Marseille CNCM I 2202 durch mechanische und chemische Lysis extrahiert worden war (Fast-Prep Bio 101), wurde unter den folgenden experimentellen Bedingungen unterworfen: 35 Zyklen Amplifikation, wobei jeder Zyklus eine DNA-Denaturierung bei 94°C während 30 sec., eine Anfangs-Hybridisierung der Primer bei 50°C während 30 sec., umfassend ein "Ramping", welches um 0,1°C je Zyklus abnahm, und danach eine Elongation bei 72°C während 60 sec. umfaßte.
Die Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 sind bestimmt worden durch Alignierung von Peptidsequenzen, die in GenBank unter den folgenden Zugangsnummern für die folgenden Bakterien hinterlegt sind: Bacillus subtilis, L43593, Bartonella henselae, AF171070, Borrelia burgdorferi, AE001144, Buchnera aphidicola, Z11913, Chlamydia pneumoniae, AE001593, Chlamydia trachomatis, AE001304, Coxiella burnetti, U86688, Escherichia coli, U76222, Haemophilus influenzae, U32733, Helicobacter pylori, E000625, Legionella pneumophila, AF087812, Mycobacterium leprae, Z14314, Mycobacterium smegmatis, U24494, Mycobacterium tuberculosis, L27989, Mycoplasma gallisepticum, L38402, Mycoplasma genitalium, U39715, Mycoplasma pneumoniae, AE000030, Neisseria meningitidis, Z54353, Pseudomonas putida, X 15849, Rickettsia prowazekii, AF034531, Rickettsia typhi, P77941, Salmonella enterica Typhimurium, X04642, Spiroplasma citri, U25815, Staphylococcus aureus. U970062, Synechocystis spp., D90905, Thermotoga maritima, X72695, Treponema pallidum, AE001205, und Human Granulocytic Ehrlichiosis Agent, AF237414.
Die Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und 2 wurden ausgewählt, indem man diejenigen selektierte, welche am stärksten konserviert waren, wobei man sich an die Hypothese hielt, daß sie auch in Tropheryma whippelii vorhanden wären.
Die partielle Sequenz des rpoB-Gens von Tropheryma whippelii (GenBank-Zugangsnummer AF 243072), welche der SEQ ID Nr. 3 entspricht, erhalten mit Hilfe der Primer SEQ ID Nr. 1 und Nr. 2, ist die folgende:
Beispiel 8: Spezifische Detektion des rpoB-Gens von Tropheryma whippelii.
Die folgenden für Tropheryma whippelii spezifischen Sequenzen werden in dem Fragment SEQ ID Nr. 3 ausgewählt:
Sie wurden gewählt, da sie für Tropheryma whippelii spezifisch waren im Vergleich mit den bekannten Sequenzen des rpoB-Gens von 28 Bakterien, welche in der hier oben erwähnten Gen Bank registriert sind.
Beispiel 9: Spezifische Amplifikation des rpoB-Gens von Tropherma whippelii.
Das rpoB-Gen von Tropheryma whippelii ist durch die PCR-Technik unter Verwendung von 35 Amplifikationszyklen amplifiziert worden, wobei jeder eine Denaturierungsphase von 94°C während 30 Sekunden, eine Phase der Hybridisierung der Primer SEQ ID Nr. 4 und 5 bei 52°C während 30 Sekunden und eine Elongationsphase bei 72°C während 90 Sekunden umfaßte. Das Produkt der Amplifikation wird nach Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht (4).
Die Kontrollbakterien, d. h. Mycobacterium avium, Microbacterium tuberculosis, Nocardia otitidiscaviarum, Escherichia coli, Staphylococus eperdimilis [epidermidis], Corynebacterium amycolatum, wurden nicht detektiert, was die Spezifität der getesteten Primer demonstriert.
Die rpoB-Sequenzen dieser Kontrollspezies, die bei GenBank unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt sind: Mycobacterium avium ATCC 25291, AF060336 Microbacterium tuberculosis U12205, Escherichia Coli K-12, U77436, wurden wegen ihrer genetischen Nähe zu Tropheryma whippelii oder wegen ihres Vorkommens als mögliche Kontamination von klinischen Proben, welche einer Detektion von Tropheryma whippelii unterzogen werden, ausgewählt.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Tropheryma whippelii-Bakterium, verantwortlich für die Whipple-Krankheit, isoliert oder als Kultur etabliert.
Bakterium nach Anspruch 1, erhalten aus einer humanen Fibroblastenzellkultur nach wenigstens zwei Monaten Inkubation in einem Kulturmedium auf Basis von MEM.
Bakterium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es bei der CNCM des Institut Pasteur unter der Nummer I-2202 hinterlegt ist.
Spezifisches Antigen eines Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Antigen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein handelt, das gewählt ist unter den Proteinen mit einem Molekulargewicht von etwa 100 bis 200 kD, bestimmt in den 2 und 3 durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgel gemäß der Western Blot Technik.
Spezifisch gegen das Bakterium gezogener Antikörper oder ein Antigen des Bakteriums gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen polyklonalen Antikörper tierischen Ursprungs, vorzugsweise ein Mausimmunoglobulin handelt.
Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Antikörper nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt, der durch ein Hybridoma erzeugt ist, das hinterlegt ist bei der CNCM des Institut Pasteur unter der Registrierungsnummer I-2411.
Antigen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein von 200 kD handelt, das mit einem Antikörper nach Anspruch 9 reagiert.
Verwendung eines Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Antigens nach den Ansprüchen 4, 5 oder 10 für die In-vitro-Diagnostik von Krankheiten, die verbunden sind mit Infektionen durch das Bakterium Tropheryma whippelii.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 6 bis 9 für die In-vitro-Diagnostik der Krankheit, die verbunden ist mit Infektionen durch Tropheryma-whippelii-Bakterien.
Verfahren für die diagnostische In-vitro-Serologie der Whipple-Krankheit, welches die Stufen umfaßt, die im wesentlichen darin bestehen, eine immunologische Reaktion zwischen einem spezifischen Antikörper des Bakteriums gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 und einem Antigen des Bakteriums gemäß einem der Ansprüche 4, 5 und 10 zu detektieren.
Verfahren für die serologische In-vitro-Diagnostik gemäß der Whipple-Krankheit, welches die Stufe umfaßt, die im wesentlichen darin besteht, eine immunologische Reaktion zwischen einem spezifischen Antikörper eines Humanimmunoglobulins, das das Bakterium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 erkennt, und einem genannten Humanimmunoglobulin, das das Bakterium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 erkennt, zu detektieren.
Diagnostisches serologisches Verfahren nach Anspruch 14, das die folgenden Stufen umfaßt: – die Abscheidung in oder auf einen festen Träger von einer Lösung, die das Bakterium wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält, – Einführung in oder auf den Träger des Serums oder des biologischen Fluids, das zu testen ist, – Einführung in oder auf den Träger von einer Lösung eines spezifischen markierten Antikörpers eines Humanimmunoglobulins, das das Bakterium erkennt, – Beobachtung eines Inkubationszeitraums, – Spülen des festen Trägers, und – Detektion der immunologischen Reaktion.
Kit für die In-vitro-Detektion der Whipple-Krankheit nach dem Verfahren von einem der Ansprüche 13 bis 15, im wesentlichen als Bestandteile umfassend: – eine Lösung, die das Bakterium oder ein Antigen wie in den Ansprüche 1 bis 5 und 10 definiert enthält, und/oder – eine Lösung, die wenigstens einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 enthält.
Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin eine Lösung enthält, die wenigstens einen spezifischen Antikörper eines Humanimmunoglobulins enthält, der das Bakterium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 erkennt.
Kit nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens einen spezifischen markierten Antikörper umfaßt.
Fragment des Gens rpoB des Bakteriums Tropheryma whippelii gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 umfaßt.
Oligonukleotid, umfassend eine spezifische Sequenz des Gens rpoB des Bakteriums Tropheryma whippelii nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die spezifische Sequenz wenigstens 12 aufeinanderfolgende Nukleotidmotive umfaßt, die in der Sequenz SEQ ID Nr. 3 eingeschlossen sind.
Einzelsträngiges Oligonukleotid nach Anspruch 20, gewählt unter den Oligonukleotiden mit einer Sequenz von wenigstens 12 aufeinanderfolgenden Nukleotidmotiven eingeschlossen in einer der Sequenzen mit SEQ ID Nr. 4 und 5 und unter den komplementären Oligonukleotiden dieser Oligonukleotide.
Oligonukleotid nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß es aus den Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und 5 besteht.
Sonde zur Detektion in einer biologischen Probe von Tropheryma whippelii-Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Sequenz nach Anspruch 19 oder ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 20 bis 22 umfaßt.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit eines Tropheryma whippelii-Bakteriums in einer Probe, die enthält oder geeignet ist zu enthalten Nukleinsäuren wenigstens eines solchen Bakteriums, dadurch gekennzeichnet, daß man die Proben mit wenigstens einer Sonde des Anspruchs 23 kontaktiert und man dann die Bildung oder Abwesenheit einer Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen der Sonde und der Nukleinsäure der Probe bestimmt.
Nukleotidprimer, verwendbar für die Synthese des rpoB-Gens von Tropheryma whippelii in Gegenwart einer Polymerase, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 20 bis 22, vorzugsweise ein Oligonukleotid umfaßt, das eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 umfaßt.