DE69838214T2 - Zubereitungen von mehreren antichlamydialen mitteln zur diagnose und behandlung von durch chlamydia verursachten infektionen - Google Patents

Zubereitungen von mehreren antichlamydialen mitteln zur diagnose und behandlung von durch chlamydia verursachten infektionen Download PDF

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Description

  • Chlamydien sind obligate intrazelluläre Mikroorganismen, die in eukaryotischen Zellen parasitieren und allgegenwärtig im Tierreich vorkommen. Die Mitglieder der Gattung von Chlamydia werden als Bakterien mit einem einzigartigen biphasischen Entwicklungszyklus angesehen, der unterschiedliche morphologische und funktionelle Formen aufweist. Dieser entwicklungsgemäße Wachstumszyklus wechselt zwischen 1) intrazellulären Lebensformen, von denen zwei gegenwärtig bekannt sind, einem metabolisch aktiven, sich replizierenden Organismus, der als das Retikularkörperchen (RB) bekannt ist und einem persistierenden, sich nicht replizierenden Organismus, der als die kryptische Phase bekannt ist, und 2) einer extrazellulären Lebensform, die eine infektiöse, metabolisch inaktive Form ist, die als das elementare bzw. Elementarkörperchen (EB) bekannt ist.
  • EBs sind kleine (300–400 nm), infektiöse, Sporen ähnelnde Formen, die metabolisch inaktiv, nicht replizierend sind und sehr häufig in dem azellulären Milieu aufgefunden werden. EBs sind gegenüber verschiedenen physikalischen Insulten bzw. Angriffen wie beispielsweise Enzymabbau, Ultraschallbehandlung und osmotischem Druck resistent. Es wird angenommen, dass diese physikalische Stabilität ein Ergebnis der umfangreichen Disulfidvernetzung des Cystein-reichen Hauptproteins der äußeren Membran (MOMP) (Bavoil et al., Infection and Immunity, 44: 479–485 (1984); Hackstadt et al., Journal of Bacteriology, 161: 25–31 (1985); Hatch et al., Journal of Bacteriology, 165: 379–385 (1986); Peeling et al., Infection and Immunity, 57: 3338–3344 (1989); J.C.A. Bardwell, Molecular Microbiology, 14: 199–205 (1994); und T.P. Hatch, Journal of Bacteriology, 178: 1–5 (1993)) ist. Unter oxidierenden Bedingungen in dem azellulären Milieu des Wirts ist die äußere Membran von EBs sowohl relativ undurchdringlich als auch gegenüber einer Inaktivierung resistent. EBs sind folglich gut geeignet lange genug außerhalb derer Wirte zu überleben, um auf einen neuen Wirt in der Form eines Kondensationskerns bzw. Tröpfchenkerns (Theunissen et al., Applied Environmental Microbiology, 59: 2589–2593 (1993)) oder einer Fomite (Fasley et al., The Journal of Infectious Diseases, 168: 493–496 (1993)) übertragen zu werden.
  • Infektionen durch Mitglieder der Gattung Chlamydiae induzieren auf zellulärer Ebene eine signifikante Entzündungsreaktion. Geschlechtsteilverletzungen, die beispielsweise durch Chlamydia trachomatis erzeugt wurden, rufen häufig einen starken Einstrom von Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen hervor, was die Entwicklung einer humoralen und zellulären Immunität nahe legt. Die anfängliche Infektion kann jedoch in der Symptomatologie häufig verschieden und sogar asymptomatisch ausfallen. Sobald sich die Chlamydien vollständig festgesetzt bzw. eingerichtet haben, sind sie häufig mit einem Rückfall nach der Antibiotika-Therapie schwer auszurotten. Hinweise zeigen ebenfalls, dass die Chlamydien in den Ruhezustand übergehen können und dann in Mengen abgestoßen werden, die zu gering sind, um zuverlässig durch Kultur festgestellt werden zu können.
  • Chlamydia pneumoniae (hier "C. pneumoniae") ist der letzte Hinzufügung zu der Gattung Chlamydiae und wurde vom Menschen isoliert, wobei sie anerkanntermaßen 10 Prozent der in der Gesellschaft erworbenen Fälle einer Pneumonie (Grayston et al., J. Inf. Dis. 161: (1990), 618–625) verursacht. Dieses neu erkannte Pathogen infiziert gewöhnlich die oberen und unteren Atemwege, wobei nun festgestellt wurde, dass es beim Menschen allgegenwärtig vorkommt. C. pneumoniae ist als ein menschliches Pathogen wohl anerkannt, das durch eine standardisierte Antibiotika-Therapie (Hammerschlag et al., Clin. Infect. Dis. 14: 178–182 (1992)) schwer auszurotten ist. Es ist bekannt, dass C. pneumoniae als ein stilles oder schwach symptomatisches Pathogen persistiert, was zu einer chronischen, persistierenden Infektion (J. Schacter, In: Baun AL, e.g. Microbiology of Chlamydia, Boca Raton, FL, CRC Press, 1988, pp. 153–165) führt.
  • Die gegenwärtige Therapie für eine mutmaßliche/bestätigte Infektion mit C. pneumoniae besteht in einem kurzen Verlauf (bspw. 2–3 Wochen) eines einzelnen Antibiotikums. C. pneumoniae ist in vitro gegenüber Tetracyclin, Erythromycin, Clarithromycin und Fluorquinolonen, wie beispielsweise Ofloxacin und Sparflorxacin (Kuo et al., Antimicrob Agents Chemother 32: 257–258 (1988); Welsh et al., Antimicrob Agents Chemother 36: 291–294 (1992); Chirgwin et al., Antimicrob Agents Chemother 33: 1634–1635 (1989); Hammerschlag et al., Antimicrob Agents Chemother 36: 682–683 (1992); Hammerschlag et al., Antimicrob Agents Chemother 36: 1573–1574); M.R. Hammerschlag, Antimicrob Agents Chemother 38: 1873–1878 (1994); M.R. Hammerschlag, Infect. Med. pp. 64-71 (1994)) empfindlich. Trotz dieser Darstellung einer Empfindlichkeit in vitro kann die Infektion mit C. pneumoniae folgend auf eine Antibiotika-Therapie mit diesen Mitteln zu einem Rückfall führen. In vitro Untersuchungen über die Persistenz von Chlamydia trotz einer spezifischen und geeigneten Antibiotika-Therapie, legten nahe, dass die Anwesenheit von Antibiotika die Bildung eines intrazellulären, nicht replizierenden Zustands (Beatty et al., Microbiol. Rev. 58: 686–699 (1994)) fördert, der gewöhnlich als die latente oder kryptische Phase bezeichnet wird. Diese Änderung kann als eine strikte Antwort angesehen werden, die ebenfalls bei Nährstoffmangel und einer Belastung durch γ-Interferon gesehen wird. Entfernung des belastenden Einflusses gestattet dem Organismus die Replikation wieder aufzunehmen. Folglich kann der Organismus auf diese Weise, der in der klinischen Praxis verwendeten gegenwärtigen Antibiotika-Therapie, entkommen.
  • In Anbetracht der chronischen und persistierenden Art der Infektionen mit Chlamydien, besteht ein Bedarf für zuverlässige, genaue Verfahren zur Diagnose einer pathogenen Infektion als auch von therapeutischen Ansätzen, um die Infektion zu handhaben. Aufgrund der hoch infektiösen Art der EBs von Chlamydien und deren Befähigung Zellen erneut zu infizieren, besteht ebenfalls ein Bedarf für eine Anti-Chlamydien-Therapie, die dieses Pathogen vollständig ausrottet, wodurch die langfristigen Spätkomplikationen derartiger chronischer Infektionen verhindert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen einzigartigen Ansatz für die Diagnose und die Handhabung einer Infektion mit Chlamydien-Spezies, insbesondere C. pneumoniae bereit. Die Erfindung basiert auf der Feststellung, dass eine Kombination von Mitteln, die gegen zahlreiche verschiedene Stadien des Lebenszyklus von Chlamydien gerichtet sind, eine Infektion erfolgreich handhaben können und schließlich eine Reaktivierung/Neuinfektion des Pathogens verhindert. Demgemäß betrifft eine Ausführungsform der Erfindung die Verwendung einer Kombination von Anti-Chlamydien-Mitteln, die mindestens zwei Mittel umfassen, wobei jedes von denen gegen eine unterschiedliche Phase des Lebenszyklus von Chlamydien gerichtet ist, worin eines der Mittel bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Infektion durch Chlamydien-Spezies Rifamycin ist. Beispielsweise können die Mittel unter den folgenden Gruppen ausgewählt werden: a) mindestens ein Mittel ist gegen die Elementarkörperchen-Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet, b) mindestens ein Mittel ist gegen die replizierende Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet, und 3) mindestens ein Mittel ist gegen eine kryptische Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet. Das Chlamydien-Pathogen kann schneller beseitigt werden, wenn eine Kombination verabreicht wird, die Mittel umfasst, die gegen jede Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet sind.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls neue Kombinationen von Anti-Chlamydien-Mitteln und neue pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens zwei Anti-Chlamydien-Mittel umfassen, wobei jedes von denen gegen eine unterschiedliche Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet ist, worin eines der Mittel Rifamycin ist und worin die Mittel ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: a) Mittel, die gegen die Elementarkörperchen-Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet sind, b) Mittel, die gegen die replizierende Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet sind, und c) Mittel, die gegen eine kryptische Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet sind. Diese Zusammensetzungen und Kombinationen von Mitteln können weiterhin ein oder eine Kombination von Zusatzverbindungen umfassen, die anti-entzündliche Mittel, die Immunität unterdrückende Mittel und Anti-Prophyrin- bzw. prophyriale Mittel, einschließen. Die Verwendung der Kombination von Anti-Chlamydien-Mitteln oder Zusammensetzungen davon für die Herstellung eines Medikaments für die Handhabung einer Infektion mit Chlamydien wird ebenfalls beschrieben. In einer besonderen Ausführungsform können die Mittel einzeln angeordnet, vermischt oder anweisungsgemäß angeordnet sein.
  • Die Erfindung stellt die Basis für eine neue Therapie bereit, die ein spezifisches gegen die Phase der Elementarkörperchen des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtetes Mittel umfasst, dass, falls es für eine ausreichende Zeitdauer angewendet wird, ermöglicht, dass die aktive Infektion ohne die Erzeugung von infektiösen EBs beendet werden kann.
  • Um eine Patientenzustimmung während eines Therapie-Verlaufs zu fördern, stellt die Erfindung eine Basis zur Verpackung, der zur Handhabung einer Chlamydien-Infektion hier beschriebenen Therapeutika, bereit. Beispielsweise kann eine Packung mindestens zwei unterschiedliche Mittel umfassen, wobei jedes von denen gegen eine unterschiedliche Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet ist, worin eines der Mittel Rifamycin ist. Diese Mittel können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus: a) mindestens einem Mittel, das gegen die Phase der Elementarkörperchen des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet ist, b) mindestens einem Mittel, das gegen die replizierende Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet ist, und c) mindestens einem Mittel, das gegen eine kryptische Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet ist. Wahlweise können, wie vorstehend erwähnt, Zusatzverbindungen gleichermaßen in der Packung vorhanden sein. Eine bevorzugte Packung wird mehrere Mittel umfassen, die gegen zwei, jedoch vorzugsweise, gegen alle die Stadien des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet sind. Die Packung kann eine Einheitendosierung der Mittel bereitstellen oder kann mehrere Einheitendosierungen umfassen, und kann mit Information, wie beispielsweise, dem Modus und der Verabreichungsanweisung (beispielsweise getrennt, gleichzeitig oder sequentiell) von jeder darin beinhalteten Komponente gekennzeichnet sein.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls die Basis für ein Verfahren zur Beurteilung des Infektions-Stadiums eines Individuums und/oder des Verlaufs einer Therapie in einem Individuum, das sich einer Therapie für eine durch Chlamydien bedingten Infektion unterzieht. Das Verfahren umfasst ein Quantifizieren des Antikörper-Titers oder einer anderen Maßnahme bzw. Erfassung gegenüber dem Pathogen und ein Vergleichen der Maßnahme mit der Antikörper-Erfassung, die zu einem früheren Zeitpunkt in der Therapie quantifiziert wurde, wobei der Unterschied zwischen den Erfassungen den Verlauf der Therapie anzeigt. Die Erfindung stellt ebenfalls die Basis für ein Verfahren zur Überwachung des Therapieverlaufs zur Behandlung einer Infektion durch Chlamydien, umfassend, ein Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Chlamydien in einem infizierten Individuum in Zeitintervallen während des Therapieverlaufs. In einer besonderen Ausführungsform wird dies durch einen PCR-Test für Pathogen-DNA oder einem Antigen-Einfang-Test für das Pathogen bestimmt.
  • Eine Detektion der Anwesenheit von Chlamydien in einer Probe biologischen Materials, das von einem Individuum entnommen wurde, von dem angenommen wurde, dass es damit infiziert ist, ist bei der Bestimmung des Therapieverlaufs und der zu verwendenden Mittel entscheidend. Dies kann durch Detektieren der Anwesenheit von DNA erreicht werden, die MOMP von Chlamydia oder von anderen Genen von Chlamydien in dem Individuum kodieren. Erkrankungen, die mit einer Chlamydien-Infektion assoziiert sind, wie beispielsweise entzündliche Erkrankungen, autoimmune Erkrankungen und Erkrankungen, bei denen das Individuum ein geschwächtes Immunsystem aufweist, können durch Handhabung (das heißt signifikante Verringerung der Infektion oder Ausrottung) der Chlamydien-Infektion, unter Verwendung des hier beschriebenen neuen Ansatzes, behandelt werden. Es konnten sowohl Klinische als auch serologische Verbesserungen/Rückgänge im Patienten-Status gezeigt werden.
  • Der Empfindlichkeits-Test zur Identifizierung eines/von Mittel(n), das/die eine Chlamydien-Infektion signifikant verringern/beseitigen können, wird zu Erläuterungszwecken hier beschrieben. Das Verfahren umfasst ein Herstellen einer Gewebekultur von Zelllinien, Beimpfen dieser Zellen mit Chlamydien in der Abwesenheit von Cycloheximid, den Chlamydien gestatten diese Zellen für mehrere Tage zu infizieren, Zugeben von einem/von zu testendem(n) Mittel(n), wobei das/die Mittel, wie erforderlich, für die Dauer einer Inkubation ersetzt wird/werden, Isolieren von Nukleinsäure von Chlamydien aus den Zellen und Beurteilen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Chlamydien-DNA unter Verwendung eines geeigneten Amplifikations-Tests, wie beispielsweise, einer PCR. Vorzugsweise wird die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals für die amplifizierte MOMP-DNA von Chlamydia oder einer anderen ein Chlamydien-Protein kodierenden DNA bestimmt. Die Abwesenheit eines Signals zeigt eine Verringerung unter den Grad einer Infektion an, der durch ein Amplifikationsverfahren von Nukleinsäure detektiert wird und legt eine Ausrottung des Mikroorganismus stark nahe. Die hier beschriebenen Empfindlichkeits-Tests sind als Arzneimittel-Durchsuchungswerkzeug zur Beurteilung der Aktivität von einzelnen Mitteln oder Kombinationen von Mitteln gegen eine Infektion mit Chlamydia besonders nützlich.
  • Der einzigartige und neue Gesichtspunkt des hier beschriebenen Empfindlichkeits-Tests besteht darin, dass er die Anwesenheit oder Abwesenheit von DNA von Chlamydien erfasst und folglich kryptische Formen und/oder Elementarkörperchen erfasst, die beide variabel sind, sich jedoch nicht replizieren.
  • In einer Ausführungsform, der einen geeigneten Nukleotid-Test zur Identifizierung von Mitteln umfasst, die gegen eine kryptische Form von Chlamydia wirksam sind, wird in der Anwesenheit eines/von zu testenden Mittel(n) ausgeführt, indem kultivierte Zellen einem Protease/reduzierenden Mittel (beispielsweise Dithiothreitol (DTT)) und einem Protease-Verdau oder Guanidin-Isothiocyanat (ebenfalls als Guanidin-Thiocyanat bekannt) für eine bestimmte Zeitdauer ausgesetzt werden, DNA von der behandelten Lösung extrahiert wird, DNA einer geeigneten Polymerase, dNTPs und Primern für eine Amplifikation von MOMP oder einem anderen Protein der Chlamydien-Spezies ausgesetzt wird, und Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer amplifizierten DNA durch Sichtbarmachung des, beispielsweise, durch Gelelektrophorese behandelten, DNA-Produkts mit Ethidiumbromid. In besonderen Ausführungsformen ist die Chlamydien-Spezies C. pneumoniae und die geeigneten Primer sind CHLMOMPDB2 und CHLMOMPCB2.
  • Weiterhin wird hier durch ein Amplifikationsverfahren der Nukleinsäure (beispielsweise PCR) ein Verfahren zum Identifizieren von Zellen beschrieben, die eine kryptische Form einer Chlamydien-Spezies beinhalten, das ein Unterziehen von kultivierten Zellen einem Protease-Verdau umfasst, Stoppen der Proteaseaktivität, Aussetzen der Zellen einer geeigneten Hitze-stabilen DNA-Polymerase, dNTPs und markierten Primern (beispielsweise 3'-Biotin markiert, 5'-Biotin markiert), um DNA, die MOMP von Chlamydien-Spezies kodiert, zu amplifizieren, Waschen der Zellen, Aussetzen der Zellen einem Reporter-Molekül (beispielsweise mit Streptavidin konjugiertes Signal-Enzym), Aussetzen der Zellen einem geeigneten Substrat für das Reporter-Molekül (beispielsweise konjugiertes Enzym) und Sichtbarmachen der amplifizierten DNA, die MOMP kodiert, indem das Reaktionsprodukt sichtbar gemacht wird.
  • Ein Verfahren zum Identifizieren von Zellen, die eine kryptische Form von Chlamydia beinhalten, umfasst, Behandeln kultivierter Zellen von denen angenommen wird, dass sie mit Chlamydien infiziert sind, mit einem Disulfid reduzierenden Mittel, Unterziehen der kultivierten Zellen einem Protease-Verdau, Aussetzen der Zellen einer geeigneten Polymerase, dNTPs und Primern für eine DNA-Amplifikation von Nukleinsäure, die ein Chlamydien-Protein kodiert, Aussetzen der Zellen einem Reporter-Molekül-Enzym, Aussetzen der Zellen einem geeigneten Substrat für das Reporterenzym und Bestimmen der Anwesenheit einer kryptischen Form von Chlamydien durch Sichtbarmachen der amplifizierten DNA, die ein Chlamydien-Protein kodiert. Vorzugsweise ist das Amplifikationsverfahren PCR und die Primer sind CHLMOMPDB2 and CHLMOMPCB2 von Chlamydia pneumoniae.
  • Ein ähnliches Verfahren kann als ein Assay zur Identifizierung eines Mittels verwendet werden, das gegen eine kryptische Form von Chlamydien wirksam ist. Demgemäß umfasst das Verfahren, Behandeln von kultivierten Zellen, die in der Abwesenheit von Cycloheximid gezüchtet wurden, von denen angenommen wird, dass sie mit Chlamydien infiziert sind, mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel, Gestatten den Chlamydien sich zu replizieren, Zugeben eines Test-Mittels, Unterziehen der kultivierten Zellen einem Protease-Verdau, Aussetzen der Zellen einer geeigneten Polymerase, dNTPs und Primern für eine DNA-Amplifikation eines Chlamydien-Proteins, Aussetzen der Zellen einem Reporter-Enzym-Molekül, Aussetzen der Zellen einem geeigneten Substrat für das Reporter-Enzym und Bestimmen der Anwesenheit einer kryptischen Form von Chlamydia durch Sichtbarmachen der amplifizierten DNA, die ein Chlamydien-Protein, wie beispielsweise MOMP, kodiert.
  • Es wird ebenfalls ein Verfahren zum Detektieren von Elementarkörperchen von Chlamydien in einer Probe beschrieben, umfassend, Inkontaktbringen der Probe mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel bevor ein DNA-Amplifikationsverfahren verwendet wird, um Chlamydien-DNA an der Probe zu detektieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ex vivo Verfahren zum Klären von biologischem Material, dass mit Chlamydien infiziert ist. Gemäß dem Verfahren wird ein biologisches Material von einer Chlamydien-Infektion geklärt, indem das biologische Material mit mindestens zwei Mitteln, jedoch vorzugsweise drei Mitteln, in Kontakt gebracht wird, von denen jedes gegen eine unterschiedliche Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet ist, worin eines der Mittel Rifamycin ist, bis das biologische Material nicht länger positiv auf Chlamydien getestet wird. Die Mittel können ausgewählt sein unter der Gruppen bestehend aus: a) Mitteln, die gegen eine kryptische Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet sind, b) Mittel, die gegen die Phase der Elementarkörperchen des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet sind und c) Mittel, die gegen die replizierende Phase des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet sind. In einer Ausführungsform ist das Mittel, das gegen die Elementarkörperchen-Phase gerichtet ist ein reduzierendes Disulfid-Mittel. In einer anderen Ausführungsform ist das gegen eine kryptische Phase gerichtete Mittel eine nitroaromatische Verbindung, wie beispielsweise Nitroimidazole, Nitrofluane bzw. Nitrofurane, Analoge, Derivate und Kombinationen davon.
  • Für Erläuterungszwecke kann das biologische Material, das von einer Infektion mit Chlamydien geklärt wurde, eine kontinuierliche bzw. beständige Zelllinie, wie beispielsweise HeLa-CF, HL-CF, H-292-CF, HuEVEC-CF und McCoy-CF sein, wobei "CF" ein Kurzschriftvermerk für "Chlamydien-frei" darstellt. Alternativ kann das biologische Material ein Tier, wie beispielsweise eine Maus, ein Kaninchen oder ein anderes Tiermodel sein, das für Chlamydien negativ ist.
  • Die Erfindung stellt eine Basis für Verfahren zum Aufrechterhalten eines Chlamydien-freien Zustands in Tieren und Zelllinien bereit, die von einer Infektion mit Chlamydien durch die Verfahren dieser Erfindung geklärt wurden, oder, wie deren Chlamydien-freien Nachkommen oder Sprösslingen, niemals infiziert wurden. Die Zellen oder Tiere können als Chlamydien-frei aufrechterhalten werden, indem sie auf Antibiotika gehalten und/oder deren Nährstoffe und Umgebung behandelt werden, um zu gewährleisten, dass sie Chlamydien-frei sind. Insbesondere, kann eine an Chlamydien-freie Zellen oder Tiere zu verabreichende Quelle von Nährstoffen so behandelt werden, dass irgendwelche Elementarkörperchen von Chlamydien davon inaktiviert oder entfernt werden. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die Nährstoffe für eine Zeitdauer und einen Expositionsgrad einer Gamma-Bestrahlung ausgesetzt werden, die geeignet ist die Elementarkörperchen zu inaktivieren. Außerdem oder alternativ kann eine Quelle von Nährstoffen durch ein Filtrationssystem durchgeführt werden, um die Elementarkörperchen der Chlamydien davon physikalisch zu entfernen.
  • Wahlweise kann die Quelle der Nährstoffe zuerst mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel, wie beispielsweise Dithiothreitol, behandelt werden, bevor der Filtrationsschritt ausgeführt wird. Der Filter sollte eine geeignete Größe aufweisen, so dass Gegenstände, die größer als 0,5 Mikrometer sind am Hindurch-Passieren gehindert werden.
  • Für Erläuterungszwecke wird hier ein Verfahren zum Detektieren lebensfähiger Chlamydien in einem biologischen Material beschrieben, von dem angenommen wird, dass es damit verunreinigt ist, umfassend, Kultivieren von Chlamydien-freien Zellen oder Tieren in der Anwesenheit von biologischem Material und anschließendem Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von lebensfähigen Chlamydien in der Kultur.
  • Hier wird lediglich für Erläuterungszwecke ein Verfahren zum Differenzieren einer Porphyrie, die durch Chlamydien-Spezies bedingt ist von einer Porphyrie, die durch eine genetische Fehlsteuerung bzw. Erkrankung bedingt ist, beschrieben. Das Verfahren umfasst, ein Erfassen der peripheren Enzyme der roten Blutkörperchen und/oder ein Ausführen einer fäkalen und/oder Harn-Prophyrin-Durchmusterung, wobei, falls die Enzyme der peripheren roten Blutkörperchen normal oder erhöht sind und die fäkale/Harn-Durchmusterung in einer oder mehrerer Komponenten des Häm-Weges erhöht sind, dann wird die Porphyrie nicht durch eine genetische Fehlsteuerung bedingt und kann durch Chlamydien verursacht sein. Ein Verfahren zur Diagnose einer sekundären Porphyrie, die in einem Individuum durch Chlamydien bedingt wird, das Symptome aufweist, die damit assoziiert sind, umfasst, ein Bestimmen der Anwesenheit oder Menge von obligatorischen Enzymen in der Häm-Biosynthese in den roten Blutkörperchen des Individuums und ein Bestimmen der Anwesenheit von Chlamydien in dem Individuum. Weiterhin, umfasst ein Verfahren zum Differenzieren einer durch Chlamydien bedingten sekundären Porphyrie, von der, die durch eine genetische Fehlsteuerung in einem Individuum verursacht wird, ein Behandeln der Chlamydien-Infektion mit zahlreichen Stadien deren Lebenszyklus und anschließendem Beurteilen, ob Porphyrine vermindert wurden, wobei eine Abnahme in dem Porphyrinspiegel anzeigt, dass die Porphyrie sekundär ist und durch Chlamydien bedingt wird.
  • Für Erläuterungszwecke umfasst ein Verfahren zur Behandlung einer Porphyrie, die durch Chlamydien in einem Individuum bedingt ist, das dieses benötigt, umfasst, Vermindern der Spiegel von aktiven Stadien, latenten Stadien und Elementarkörperchen des Pathogens von dem Individuum und Verabreichen einer oder mehrerer Verbindungen, die ungünstige Wirkungen vermindern, die mit einer sekundären Porphyrie assoziiert sind. Das Verfahren kann zusätzlich ein Verabreichen einer Verbindung umfassen, die die ungünstigen Wirkungen einer mit Porphyrinen assoziierten Porphyrie vermindert. Die Verbindung kann Cimetidin sein. Dieses Verfahren kann ebenfalls auf wertvolle Art und Weise mit zusätzlichen Schritten kombiniert werden, einschließlich mindestens einen eines Verabreichens von Antioxidantien, orales Verabreichen aktiver Aktivkohle, Verabreichen eines Regimen mit hoher Kohlenhydrat-Diät, Verabreichen von Hydroxychloroquin, Verabreichen von Benzodiazepin-Arzneimitteln, Ausführen einer Blutwäsche, Ausführen einer Plasmapherese und Verabreichen von chelatbildenden Mitteln und intravenöses Verabreichen von Hämatin.
  • Für Erläuterungszwecke können erhöhte Porphyrinspiegel in einem Individuum dadurch detektiert werden, indem das Individuum auf Antikörper gegen Porphyrin getestet wird, wobei ein Mangel durch Detektieren von Antikörpern gegen B-12 diagnostiziert werden kann. Monoklonale und polyklonale Antikörper gegen Porphyrine und/oder Vitamin B12 können hergestellt werden.
  • Für Erläuterungszwecke kann die Erfindung eine Basis für ein Verfahren bereitstellen, das unter Verwendung eines computerisierten Systems, beispielsweise, um eine Arzneimittel-Therapie zur Handhabung einer durch Chlamydien verursachten Infektion zu formulieren, automatisiert werden kann. Das Verfahren umfasst, Bestimmen von Zielen bzw. Targets innerhalb des Lebenszyklus von Chlamydien für jedes bestimmte Ziel, Identifizieren von Mitteln, die aktiv gegen das Ziel sind, und Kombinieren mindestens einer Untermenge von identifizierten Mitteln, um zur Handhabung einer durch Chlamydien verursachten Infektion eine Kombinations-Therapie bereitzustellen, wobei die Mittel in der Untermenge einzeln gegen unterschiedliche Ziele in dem Lebenszyklus von Chlamydien aktiv sind. Die Ziele umfassen, Identifizieren von Phasen des Lebenszyklus der Chlamydien, wobei für jede identifizierte Lebenszyklus-Phase mindestens ein angreifbarer bzw. verwundbarer Aspekt des Organismus, während dieser Lebenszyklus-Phase, bestimmt wird, wobei jeder bestimmte verwundbare Aspekt ein Ziel innerhalb des Lebenszyklus der Chlamydien festlegt. Mittel, die durch das Verfahren identifiziert wurden, werden anschließend unter Verwendung des hier beschriebenen Empfindlichkeits-Testverfahrens getestet, wobei anfängliche Dosierungen für Kombinationsmittel, basierend auf der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik für die einzeln verschriebenen bzw. bestimmten Mittel eingestellt, wobei ein Einstellen einer anfänglichen Dosierung ein Modifizieren der Kombinationsdosierung gemäß den Ergebnissen des Empfindlichkeits-Tests und einer in vivo Wirksamkeit umfasst.
  • Zu Erläuterungszwecken wird hier ein Verfahren zum Reinigen einer Blutprobe beschrieben, welches umfasst, Unterziehen der Blutprobe einer Blutwäsche oder Plasmapherese, wobei insbesondere die Plasmapherese unter Verwendung eines Plasmapheresegerätes ausgeführt wird, das einen Sulfon-haltigen Filter oder einen Aktivkohle-haltigen Filter verwendet. Die Blutprobe kann von einer Blutbank oder einem Lager erhalten werden.
  • 1A und 1B zeigen einen Sequenzabgleich verschiedener MOMPs von Chlamydien.
  • 2 zeigt das exprimierte Thioredoxin-Fusionsprotein, das eine Polyhistidin-Affinitätschromatographie-Stelle beinhaltet, eine Enterokinase-Stelle, und das Voll-Längen MOMP-Protein mit einer Alanin-Insertion nach aal. Amino zu Carboxyl wird von links nach rechts gelesen. Der gesamte Aminosäuregehalt in dem exprimierten Protein besteht aus 530 Resten.
  • 3 stellt die konstante und die variable Domäne (VD) von verschiedenen Chlamydien-Spezies dar.
  • 4 stellt die Peptid-Aminosäure-Sequenz dar, die für die Konstruktion von auf Peptid basierenden ELISAs mit einer Speziesspezifität für VDI verwendet werden.
  • 5 stellt die Peptide für VD2 dar, die ähnlich zu den VDI-Sequenzen verwendet werden.
  • Diese Erfindung beschreibt spezifische Anti-Chlamydien-Mittel, die in Kombination verwendet werden, um mehr als eine der unterschiedlichen Phasen des Lebenszyklus von Chlamydien-Spezies zu beeinträchtigen. Diese Chlamydien-Phasen umfassen die intrazelluläre metabolisierende/replizierende Phase, die intrazellulären "kryptischen" Phasen und die extrazelluläre EB-Phase. Gegenwärtige Konzepte eines Empfindlichkeits-Testens auf Chlamydien und einer Anti-Chlamydien-Therapie für deren assoziierten Infektionen sprechen lediglich eine Phase an, die replizierende Phase. Wenn nicht mehrere Phasen des Lebenszyklus durch eine Anti-Chlamydien-Therapie angesprochen werden, ist es wahrscheinlich, dass das Pathogen den erwünschten Wirkungen des/der verwendeten anti-mikrobiellen Mittels(n) entkommt und nach Reaktivierung aus der Latenz zu einer wiederkehrenden Infektion führt. Für die Zwecke dieser Erfindung umfasst "kryptische Phase" eine beliebige nicht replizierende, intrazelluläre Form, von der eine Anzahl distinkter Stadien vorkommen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf intrazelluläre EBs, EBs, die in RBs transformieren und umgekehrt, Miniatur-RBs, nicht replizierende RBs und dergleichen.
  • Es werden Diagnose- und Therapie-Verfahren für die Handhabung von Chlamydien-Infektionen nachfolgend ausführlich beschrieben. Für die Zwecke dieser Erfindung wird "Handhabung bzw. Management einer Chlamydien-Infektion" als eine wesentliche Verringerung in der Anwesenheit von allen Phasen/Formen von Chlamydien in dem infizierten Wirt definiert, indem der Wirt in einer derartigen Weise behandelt wird, dass Spätkomplikationen der Infektion minimiert werden. Chlamydien-Infektionen können folglich durch einen einzigartigen Ansatz gehandhabt werden, der hier als "Kombinations-Therapie" bezeichnet wird, die für den Zweck dieser Anwendung als die Verabreichung von mehreren Mitteln definiert ist, die zusammen auf mindestens zwei, vorzugsweise mehrere der zahlreichen Phasen des Lebenszyklus der Chlamydien, gerichtet sind, wobei jedes Mittel einzeln, gleichzeitig oder sequentiell über den Verlauf der Therapie genommen werden kann. Werden sie allein verwendet, dann können diese Mittel eine Chlamydien-Infektion nicht beseitigen oder nicht handhaben. Die nachfolgend beschriebenen Diagnose-Verfahren und die Kombinations-Therapien sind allgemein auf Infektionen anwendbar, die durch eine beliebige Chlamydien-Spezies bedingt wird, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf C. pneumoniae, C. trachomatis, C. psittaci und C. pecorum. Infektionen, bei denen das verursachende Agens C. pneumoniae ist, werden bevorzugt.
  • Die Anti-Chlamydien-Mittel, die durch die hier beschriebenen Empfindlichkeits-Test-Verfahren als wirksam gegen Chlamydien identifiziert wurden, können einzeln verwendet werden, um Chlamydien in einem einzelnen Stadium deren Lebenszyklus zu beeinflussen oder als Teil einer Kombinations-Therapie eine Chlamydien-Infektion zu handhaben. Beispielsweise können Verbindungen, die als Anti-kryptische Phasen-Arzneimittel, Anti-EB Phasen-Arzneimittel, Anti-DNA-abhängige RNA-Polymerase Arzneimittel und Nikotinsäure-Kogener-Arzneimittel identifiziert wurden, können alleine oder in Kombination verwendet werden, um eine oder mehrere der distinkten Phasen des Lebenszyklus der Chlamydien zu beseitigen, zu verringern oder zu verhindern. Für bestimmte dieser Verbindungen wurde bisher keine Anti-Chlamydien-Aktivität aufgezeigt.
  • Diagnose einer Chlamydien-Infektion
  • Die Erfindung stellt eine Basis für Verfahren zu Diagnose der Anwesenheit von Chlamydien in einem biologischen Material bereit, als auch die Verwendung dieser Verfahren zum Beurteilen des serologischen Zustands eines Individuums, das sich einer Anti-Chlamydien-Kombinations-Therapie unterzieht. Für die Zwecke dieser Anmeldung umfasst "biologisches Material", ist jedoch nicht beschränkt auf Körper-Sekrete, Körper-Fluide bzw. Flüssigkeiten und Gewebeproben. Beispiele von Körpersekreten umfassen zervikale Sekrete, trachealbronchiale Sekrete und pharyngeale Sekrete. Geeignete Körper-Flüssigkeiten umfassen Blut, Schweiß, Tränen, Flüssigkeit des Zerebrospinal-Systems, Serum, Sputum, Ohrenwachs, Urin, synoviale Flüssigkeit und Speichel. Tiere, Zellen und Gewebeproben, wie beispielsweise von zahlreichen Biopsien werden durch diesen Begriff umfasst.
  • Es werden auf Peptid basierende Tests für die Detektion von einem oder mehreren Immunglobulinen, wie beispielsweise IgG, IgM, IgA und IgE offenbart, die gegen Antigen-Determinanten innerhalb der rekombinanten Voll-Längen MOMPs verschiedener Chlamydien-Spezies gerichtet sind. Eine Detektion von IgG und/oder IgM gegen Antigen-Determinanten innerhalb des rekombinanten Voll-Längen MOMP von C. pneumoniae wird bevorzugt. IgA-Determinanten sind bei der Analyse von humoralen Antworten gegen Chlamydien in Sekreten von mukosalen Oberflächen (beispielsweise Lunge, Gastro- Intestinal-Trakt, Gerontourin-Trakt, etc.) nützlich. Auf ähnliche Weise sind IgE-Determinanten bei der Analyse allergischer Manifestationen von Erkrankungen nützlich. Tabelle 1 unten stellt die Zugangsnummern der Gen-Bank von verschiedenen MOMPs von Chlamydien-Spezies bereit. Tabelle 1
    Spezies Stamm ID Gen-Bank Zugangsnr.
    C. trachomatis A CTL/A M33636
    C. trachomatis A CTL/A M58938 M33535
    C. trachomatis A CTL/A J03813
    C. trachomatis B CTL/B M33636
    C. trachomatis C CTL/L M17343 M19128
    C. trachomatis D CTL/D A27838
    C. trachomatis E CTL/E X52557
    C. trachomatis F CTL/F X52080 M30501
    C. trachomatis H CTL/H X16007
    C. trachomatis L1 CTL/L1 M36533
    C. trachomatis L2 CTL/L2 M14738 M19126
    C. trachomatis L3 CTL/L3 X55700
    C. trachomatis Maus Pneumo CPC/MP X60678
    C. pecorum Schaf Polyarthritis CPC/OP Z18756
    C. psittaci Stamm 6BC CPS/FB X56980
    C. psittaci Katze CPS/F X61096
    C. trachomatis Da CTL/DA X62921 S45921
    C. pneumoniae TWAR CPN/HU1 M64064 M34922 M64063
    C. pneumoniae (? C. pecorum) Pferd CPN/EQ2 L04982
    C. pneumoniae TWAR CPN//MS nicht zugeordnet
    C. psittaci Pferd CPS/EQ1 L04982
  • Beispielsweise kann ein biologisches Material, beispielsweise eine Probe eines Gewebes und/oder einer Flüssigkeit von einem Individuum erhalten werden, wobei ein geeigneter Test verwendet werden kann, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nukleinsäure von Chlamydien oder daraus kodierter Proteine zu beurteilen. Geeignete Tests umfassen immunologische Verfahren, wie beispielsweise Enzymimmuntests (ELISA), einschließlich Lumineszenz-Tests (beispielsweise Fluoreszenz und Chemilumineszenz), Radioimmun-Test und Immunhistologie. Allgemein werden eine Probe und ein Antikörper unter Bedingungen kombiniert, die für die Bildung eines Antikörper-Protein-Komplexes geeignet sind, wobei die Bildung eines Antikörper-Protein-Komplexes (direkt oder indirekt) beurteilt wird. In allen hier beschriebenen Diagnose-Verfahren können die Antikörper mit einem Enzym, Fluorophor, Radioisotop oder Lumineszenzmittel bzw. Luminescer direkt markiert werden. Alternativ, können Antikörper mit einem spezifischen Radikalfänger, wie beispielsweise Biotin kovalent verbunden sein. Eine nachfolgende Detektion erfolgt durch eine Bindung von Avidin oder Streptavidin, das mit einem Anzeige-Enzym, Fluorophor, Radioisotop oder Luminescer markiert ist. Diesbezüglich würde der Schritt einer Detektion durch eine Enzymreaktion, Fluoreszenz, Radioaktivität beziehungsweise Lumineszenz-Emission erfolgen.
  • Der Antikörper kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, wie beispielsweise ein monoklonales Anti-Mensch IgG oder ein monoklonales Anti-Mensch IgM sein. Beispiele nützlicher Antikörper umfassen monoklonale Maus-Anti-Mensch IgG, die nicht mit anderen Immunglobulinen (Pharmingen, Clone G18-145, Katalog-Nr. 34162D) kreuzreagieren, monoklonale Maus-Anti-Mensch IgM, die mit anderen Immunglobulinen (Pharmingen, Clone G20-127, Katalog-Nr. 34152D) nicht kreuzreagieren. Es können auf Peptid basierende Immuntests unter Verwendung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, die nicht mit Antigen-Determinanten auf MOMP einer Chlamydien-Spezies von Interesse kreuzreagieren, entwickelt werden, die spezifisch für Chlamydien sind oder eine Speziesspezifität, jedoch nicht notwendiger Weise eine Stammspezifität innerhalb einer Spezies bereitstellen.
  • Es wurden auf Rekombination basierende immunologische Tests entwickelt, um die Anwesenheit von Immunglobulinen gegen Chlamydien-Spezies zu quantifizieren.
  • Rekombinantes Voll-Längen Chlamydien MOMP kann unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems, beispielsweise in E. coli oder Baculovirus, synthetisiert werden. Das exprimierte Protein dient folglich als das Antigen, das für vorstehend ausgeführte immunologische Verfahren geeignet ist. Auf Protein basierende immunologische Verfahren können entwickelt werden, die Spezies- und Stamm-Spezifisch für verschiedene Chlamydien sind.
  • Die Diagnose einer Infektion mit Chlamydien kann nun mit einem verbesserten IgM/IgG C. pneumoniae Quantifizierungs-Verfahren unter Verwendung von ELISA-Verfahren, einem Western-Blot, der die Spezifität des ELISA bestätigt und der Detektion des MOMP-Gens von C. pneumoniae in Serum unter Verwendung spezifischer Amplifikations-Primer ausgeführt werden, die die Isolation des gesamten Gens für eine Analyse von erwarteten Stamm-spezifischen Unterschieden gestattet.
  • Beliebige bekannte Verfahren für eine Amplifikation einer Nukleinsäure (beispielsweise DNA und RNA) können, mit den hier beschriebenen Tests, verwendet werden. Bevorzugte Amplifikationsverfahren sind die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)-Verfahren, die eine Lösungs-PCR und eine in situ PCR umfassen, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einzigartiger Gene von Chlamydien zu detektieren. Spezies-spezifische Tests zur Detektion von Chlamydien können basierend auf den gewählten Primern entwickelt werden. Beispiele geeigneter Primer einer PCR-Amplifikation sind nachfolgend in Tabelle 2 dargestellt. Beispiele bevorzugter Primer sind in Tabelle 3 dargestellt.
  • Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Eine Ligase-Ketten-Reaktion kann ebenfalls durch die Verfahren dieser Erfindung ausgeführt werden, weshalb folglich unter Verwendung gewöhnlichen Könnens Primer/Sonden konstruiert werden können. Eine Amplifikation des gesamten MOMP-Gens ist für eine Mutations-Analyse und die Herstellung von rekombinantem MOMP nützlich. Für eine spezifische Amplifikation des größten Teils des MOMP-Genoms können mit einer Modifikation des Amplifikations-Protokolls kürzere Primer verwendet werden. Beispielsweise kann ein 22 Bp umfassender Primer für den Negativ-Strang mit der Sequenz 5'-CAGATACGTG AGCAGCTCTCTC-3' (CPNMOMPC; SEQ ID NO. 39) mit einem berechneten Tm = 55°C plus einen 25 Bp umfassenden Primer für den Positiv-Strang mit der Sequenz 5'-CTCTTAAAGT CGGCGTTATT ATCCG-3' (CPNMOMPD; SEQ ID NO. 40) mit einem berechneten Tm = 53,9°C als ein Primerpaar verwendet werden, indem der Hybridisierungsschritt in dem Amplifikations-Protokoll (Tabelle 2) von 58°C auf bzw. bis 50°C angepasst wurde. In ähnlicher Weise können kleinere Regionen von MOMP durch eine große Vielfalt von Primerpaaren für diagnostische Zwecke amplifiziert werden, obwohl der Nutzen einer Stamm-Identifikation verringert ist und eine Amplifikation geblockt sein kann, falls einer oder beide Primerpaare mit einer Region hybridisieren, die mutiert wurde. Umfangreiche Praxis mit der Voll-Längen MOMP PCR-Amplifikation zeigt, dass Mutationsereignisse in den Hybridisierungsstellen CHLMOMPDB2 and CHLMOMPCB2 selten oder nicht existent sind.
  • Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation können verwendet werden, um den Verlauf einer Anti-Chlamydien-Therapie zu beurteilen. Die beständige Abwesenheit detektierbarer Chlamydien-DNA, die MOMP als eine Funktion einer Anti-Chlamydien-Therapie kodiert, zeigt die Klinische Handhabung der Chlamydien-Infektion an. Eine Serologische Verbesserung kann auf den gegenwärtigen serologischen Kriterien für eine Ausrottung chronischer Chlamydien basieren, die nachfolgend in Tabelle 4 berichtet werden. Tabelle 4 Serologische Kriterien zur Ausrottung einer chronischen Infektion mit Chlamydia pneumoniae
    IgM ≤ 1:25
    IgG Stabiler Titer 1:100
    PCR Negativ
  • Bevorzugte PCR-Verfahren werden nachfolgend in dem Beispielabschnitt ausgeführt. Allgemein wird eine Lösungs-PCR an einem biologischen Material ausgeführt, wobei zuerst das Material in einem geeigneten reduzierenden Mittel vorinkubiert wird, das die Disulfidbindungen reduzieren kann, die die Integrität des MOMP und anderer Oberflächenproteine der Elementarkörperchen von Chlamydien aufrechterhalten, wodurch die äußere Proteinhülle der EBs beeinträchtigt und eine Proteasedurchdringung ermöglicht wird. Geeignete reduzierende Disulfid-Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Dithiothreitol, Succimer, Glutathion, DL-Penicillamin, D-Penicillamin-Disulfid, 2,2'-Dimercaptoadipinsäure, 2,3-Dimercapto-1-propon-sulfidsäure. Geeignete Konzentrationen dieser reduzierenden Mittel können durch den Fachmann ohne unangemessenes Experimentieren unter Verwendung einer 10 μM Konzentration von Dithiothreitol (das bevorzugte reduzierende Mittel) als einer Richtschnur einfach bestimmt werden. Wird unterlassen, dass ein reduzierendes Mittel zu dem anfänglichen Schritt eingeschlossen wird, dann kann verhindert werden, dass in dem nachfolgenden Schritt DNA von EBs isoliert wird. Daten, die in Beispiel 1 dargestellt werden, zeigen die Wirkungen verschiedener reduzierender Mittel auf die Empfindlichkeit von EBs gegenüber einem Proteinase K Verdau. Die in vitro Daten zeigen, dass Dithiothreitol beim Öffnen von EBs für einen Protease-Verdau äußerst wirksam ist.
  • Sobald die äußere Hülle der EBs abgelöst bzw. abgebaut wurde, wird das vorinkubierte Material einem Proteinverdau unter Verwendung einer Protease (beispielsweise Proteinase K), oder einem funktionell äquivalenten Enzym, unterworfen. Die DNA wird extrahiert und einem Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation, beispielsweise einer PCR, unterworfen. Das gesamte Gen oder ein Teilbereich davon, der ein einzigartiges/einzigartige Antigen- Determinante(n) beinhaltet, die MOMP oder ein anderes geeignetes Gen kodieren, können anschließend unter Verwendung geeigneter, das Gen flankierender, Primer amplifiziert werden. Beispielsweise kann das Gen oder ein Teilbereich davon das Gen sein das MOMP, OMP-B, GRO-ES, GRO-EL, DNAK, 16S RNA, 23S RNA, das Gen kodierend Ribonuklease-P, ein 76 kd Anfüg-Protein oder ein KDO-Transferase-Gen kodiert. In einem alternativen Verfahren kann Guanidin-Thiocyanat mit einer bevorzugten Konzentration von 4M, oder ein funktionell äquivalentes reduzierendes Denaturierungsmittel für die Disulfid-Reduktion/Protease-Schritte ersetzt werden.
  • Die amplifizierte DNA wird dann getrennt und durch standardisierte Elektrophorese-Verfahren identifiziert. Die DNA-Banden werden unter Verwendung von einer Färbung mit Ethidiumbromid und einer Detektion mit UV-Licht identifiziert. PCR-Primer können gestaltet werden, um MOMP kodierende DNA von einer bestimmten Chlamydien-Spezies, beispielsweise das MOMP von C. pneumoniae, C. pecorum, C. trachomatis, C. psittaci (Siehe 1) selektiv zu amplifizieren. Es können Primer für diesen Zweck gestaltet werden, die von ungefähr 15-mer bis ungefähr 40-mer sein können.
  • Für eine in situ PCR werden die Amplifikations-Primer mit einem Reportermolekül gestaltet, das an den 5'-Terminus konjugiert wird. Geeignete Reportermoleküle sind wohl bekannt und können hier verwendet werden. Es werden jedoch mit Biotin markierte Primer bevorzugt. Für das MOMP-Gen wurden den Primer CHLMOMPDB2 and CHLMOMPCB2 ein Biotin an den 5'-Terminus eingebaut. Bei einer in situ PCR, bei der Biotinmarkierungen verwendet werden, die an dem 5'-Terminus der Amplifikations-Primer eingebaut sind, führt jede Amplifikation der DNA-Kette dazu, dass jeder DNA-Doppelstrang 2 Moleküle Biotin beinhaltet. Alternativ können andere spezifische DNA-Sequenzen verwendet werden, obwohl die vorstehend beschriebene Sequenz die bevorzugte Ausführungsform darstellt, da das erzeugte große Produkt (1,2 Kb) eine Diffusion verhindert, der man mit kleinen DNA-Amplifikationen begegnen kann. In ähnlicher Weise können andere Detektionsmarkierungen an das 5'-Ende eingebaut werden (d.h. beispielsweise Fluorescein) oder es kann Digoxigenin-dUTP (Ersetzung für dTTP) in die amplifizierte DNA eingebaut werden. Alternativ zur Markierung des Produkts können spezifische Hybridisierungssonden zu konstanten Regionen der amplifizierten DNA verwendet werden, um ein amplifiziertes Produkt zu identifizieren. Dieses letztere Verfahren weist eine besondere Nützlichkeit für die Konstruktion von automatischem Laborgerät für eine Lösungsbasierete PCR auf. Beispielsweise können mit Streptavidin beschichtete ELISA-Platten verwendet werden, um einen oder beide Stränge einer mit Biotin 5'-markierten DNA einzufangen, wobei eine Detektion durch Fluoreszenz eines Fluoresceins oder einer anderen eingebauten Fluorophor-Detektionsonde erfolgt.
  • Klären und Aufrechterhalten von Chlamydien-freien Organismen
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Basis für einen einzigartigen Ansatz zur Erzeugung und Aufrechterhalten von Tieren und Zelllinien bereit, die frei von Infektionen mit Chlamydien sind. Ebenfalls werden hier Verfahren zum Erzeugen von Nährstoffen und Kulturmedien beschrieben, die zur Verwendung mit Tieren und Zelllinien geeignet sind, die von einer Infektion mit Chlamydien geklärt wurden.
  • Versuche Isolate von C. pneumoniae aus dem Blut und der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) zu kultivieren, führten zu der Feststellung, das die beständigen Zelllinien, die routinemäßig verwendet wurden, um C. pneumoniae zu kultivieren, mit C. pneumoniae kryptisch infiziert waren. Diese schlossen nicht nur betriebsinterne Stammkulturen von HeLa, HL, H-292, HuEVEC und McCoy-Zellen ein, sondern ebenfalls Stammkulturen von der American Type Culture Collection (ATCC), der Forschungsstiftung der Universität von Washington für HL-Zellen, als auch gewerblicher Anbieter (Bartells) von H-292 und McCoy-Zellen für die Klinische Kultur von Chlamydien. Die Anwesenheit einer kryptischen Form von C. pneumoniae in diesen Zellen wurde durch eine das MOMP amplifizierende Lösungs-PCR wiederholt dargestellt. Eine in situ PCR in HeLa-Zellen gegen das MOMP zeigte, dass die MOMP-Gene in 100 % der Zellen vorhanden sind. Nichtsdestotrotz führten mit Fluorescein markierte mAb gegen LPS in McCoy-Zellen zu keiner Anzeige von Chlamydien (d.h. reaktiv gegen alle Chlamydien), während mit Fluorescein markierte mAb gegen C. pneumoniae eine generelle Fluoreszenz durch das Zytoplasma erzeugten, die mit einer nicht spezifischen Autofluoreszenz verwechselt werden kann. Eine Infektion mit Chlamydia trachomatis (Bartells Lieferung/Versorgung) führt zu der typischen Färbung von Einschlusskörperchen mit dem LPS mAb (d.h. kreuzreaktiv mit allen Spezies von Chlamydia), wobei keine Änderung in dem zytoplasmatischen Signal mit dem Anti-MOMP mAb gegen C. pneumoniae auftritt. Diese Ergebnisse (Lösungs-PCR, in situ PCR, mAb Reaktivität) werden mit einer kryptischen (nicht replizierenden) Infektion von Zellen durch C. pneumoniae, die gewöhnlich zur Kultivierung des Organismus verwendet wurden, als konsistent betrachtet. Weiterhin weisen nahezu alle bis heute getesteten unbehandelten Kaninchen und Mäuse PCR-Signale für das C. pneumoniae MOMP-Gen auf.
  • Dies erzeugt ein gegenwärtig nicht erkanntes Problem von größter Wichtigkeit für jene Klinischen Labore, die Kulturdienstleistungen an C. pneumoniae bereitstellen als auch für Forscher, die nun nicht wissen, ob deren Ergebnisse in Tieren oder in der Zellkultur durch eine Verunreinigung mit kryptischen Chlamydien beeinflusst werden. Klinische und Forschungslabore haben gegenwärtig keine Chance zu bestimmen, ob ein Organismus tatsächlich frei von Chlamydien ist.
  • Für Erläuterungszwecke wird hier ein Verfahren zum Klären von Zellen und Tieren von C. pneumoniae und deren Unbelastet-Halten, beschrieben. Ein Klären von ihnen bedingt, das die infizierten Organismen mit Mitteln in Kontakt gebracht werden, die einzeln oder in Kombination verwendet werden, um mehr als eine der unterschiedlichen Phasen des Lebenszyklus der Chlamydien-Spezies zu beseitigen oder damit störend einzugreifen. Ein Unbelastet-Halten bedingt sowohl deren Haltung auf Antibiotika und/oder Behandlung deren Nährstoffe und Umgebung, um zu gewährleisten, dass sie Chlamydien-frei sind. Die Haltungsbedingungen können eine Kombination von Isoniazid (INH) (1 μg/ml), Metronidazol (1 μg/ml) und Dithiothreitol (10 μM) in dem Kulturmedium umfassen. Medienwechsel werden alle 3 Tagen oder zweimal die Woche durchgeführt. Die Zellen können zwischen 1 bis 7 Tage bevor sie zur Kultur oder anderen Zwecken verwendet werden von der Schutzlösung entfernt werden.
  • Diese Verfahren ermöglichen nun verschiedene Chlamydien-freie (CF) Organismen, einschließlich der beständigen Zelllinien, genannt HeLa-CF, HL-CF, H-292-CF, HuEVEC-CF, McCoy-CF, Afrikanische Grün-Affen und andere Zelllinien zu erzeugen, die ein Wachstum von Chlamydien unterstützen können. Es können verschiedene CF-Stämme von Mäusen, Kaninchen und anderen Tiermodellen für die Forschung hergestellt werden.
  • Da Chlamydien hoch infektiös sind, müssen Organismen, die von extrazellulären, replizierenden und kryptischen Infektionen geklärt wurden, vor einer Exposition gegenüber lebensfähigen EBs geschützt werden, falls die Organismen unbelastet bleiben sollen. Die Erfinder haben festgestellt, dass zahlreiche der Nährstoffe und anderer Materialien, die verwendet werden, um beständige Zelllinien zu halten, mit lebensfähigen Chlamydien-EBs verunreinigt waren. Beispielsweise wurde jede Charge von fötalem Kälberserum positiv für das MOMP-Gen von Chlamydien getestet. Da ein umfangreicher Verdau für eine Isolation der DNA erforderlich ist, wurde geschlossen, dass sie in EBs gebunden ist. C. pneumoniae kann ebenfalls unmittelbar aus fötalem Kälberserum kultiviert werden. Folglich ist es erforderlich die in jenen Materialien befindlichen EBs zu inaktivieren, die wie beispielsweise Kulturmedien und Nährstoffe zum Halten des Organismus in einem Chlamydien-freien Zustand verwendet werden. Gemeinsam werden jene Materialien hier als "Haltungsmaterialien" bezeichnet. In einer Ausführungsform werden Nährstoffe und Kulturmedien einer Gamma-Bestrahlung ausgesetzt, um darin befindliche Chlamydien zu inaktivieren. Vorzugsweise sollte das Material für eine ausreichende Zeitdauer bestrahlt werden, um das Material mindestens 10.000 rad Gamma-Strahlung auszusetzen. Für das Material ist es bedeutend, dass es in Gefäßen aufbewahrt wird, die hochemergetische Strahlung nicht absorbieren. Das bevorzugte Gefäß ist Kunststoff. In einer anderen Ausführungsform werden die Erhaltungs-Materialien mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel (beispielsweise (10 μM) Dithiothreitol für ungefähr 30 Minuten) behandelt, wobei anschließend die Erhaltungs-Materialien durch ein standardisiertes Submikrometer (beispielsweise ungefähr 0,45 Mikron) Filtrationssystem geführt werden. Das reduzierende Mittel bewirkt, dass sich jegliche EBs auf eine Größe ausdehnen, bei der ein 0,45 Mikrometer-Filter deren Passage blockieren wird. Beispiele für geeignete reduzierende Disulfid-Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Dithiothreitol, Succimer, Glutathion, DL-Penicillamin, D-Penicillamin-Disulfid, 2,2'Dimercaptoadipinsäure, 2,3-Dimercapto-1-Proponsulfidsäure. In noch einer anderen Ausführungsform werden die Erhaltungs-Materialien mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel behandelt, vorzugsweise Dithiothreitol (beispielsweise ungefähr 10 μM Konzen tration), bevor die Materialien durch ein Filtrationssystem geführt werden, um davon Chlamydien zu entfernen.
  • Um zu gewährleisten, dass Forschungswerkzeuge, wie beispielsweise Zelllinien und Tiere Chlamydien-frei beleiben, wurde ein Test zum Beurteilen entwickelt, ob ein Organismus Chlamydien-frei ist. Das Verfahren umfasst, Erhalten einer Probe von Zellen oder einer Gewebekultur, wahlweise Kultivieren der Zellen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Cycloheximid, und Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nukleinsäure von Chlamydien durch ein geeignetes Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise PCR. Die Abwesenheit eines Amplifikationssignals für Nukleinsäure zeigt an, dass der Zustand des Organismus Chlamydien-frei ist.
  • Empfindlichkeits-Test zur Beurteilung aktiver Mittel gegen verschiedene Formen von Chlamydien
  • Diese Erfindung stellt eine Basis für neue Ansätze für das Empfindlichkeits-Testen von Chlamydien-Spezies bereit, die durch den komplexen Lebenszyklus des Chlamydien-Pathogens erfordert wird, als auch durch dessen diverse, umfangreiche und hiervor nicht gewürdigte bzw. verstandene Fähigkeit chronische, kryptische und persistierende systemische Infektionen zu bewirken, die gegenüber einer kurzeitigen Therapie mit herkömmlichen Einzel-Mitteln refraktär sind. Die Erfinder haben festgestellt, dass eine erfolgreiche Handhabung oder Ausrottung von chronischen/systemischen Chlamydien-Infektionen unter Verwendung der beschriebenen einzigartigen Verfahren für in vitro und in vivo Empfindlichkeits-Tests vorhergesagt werden kann.
  • Die Erfindung basiert auf der Feststellung, dass gegenwärtige Empfindlichkeits-Test-Verfahren für Chlamydien die Fähigkeit von anti-mikrobiellen Mitteln nicht genau vorhersagen, dass sie chronische Chlamydien-Infektionen erfolgreich oder vollständig ausrotten. Die beruht darauf, dass die gegenwärtigen Empfindlichkeits-Test-Verfahren lediglich die Replikation von Chlamydien erfassen und die wohl bekannte "kryptische Phase" ignorieren, in der intrazelluläre Chlamydien nicht aktiv replizieren. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass die so genannte "kryptische Phase" von Chlamydien mehrere und verschiedene Unterphasen umfasst. Die folgenden sind einige der Phasen des Lebenszyklus der Chlamydien, in denen die intrazellulären Chlamydien nicht replizieren: eine initiale intra-nukleäre Phase, in der Elementarkörperchen (EBs) sich zu Retikularkörperchen (RBs) wandeln, eine intrazytoplasmatische Phase, in der eine Wandlung des RB-Phänotyps zu dem EB-Phänotyp auftritt, eine intrazytoplasmatische Phase mit nicht replizierenden, jedoch metabolisierenden RB und intrazellulären/extrazellulären EB-Phasen, einschließlich endozytotischen und exozytotischen Phasen, in denen weder eine Replikation noch ein Metabolismus auftritt. Um die kumulative und langzeitige Wirkung einer anti-mikrobiellen Therapie auf diese zahlreichen Lebensphasen zu beurteilen, wurden einzigartige in vitro und in vivo Empfindlichkeits-Test-Verfahren entwickelt und werden hier beschrieben.
  • Der wie hier verwendete Ausdruck "Empfindlichkeit" ist vorgesehen eine physiologische Antwort eines Organismus auf einen Umgebungs- oder chemischen Stimulus zu bedeuten. Die erwünschte physiologische Antwort auf Stimuli besteht darin, dass sie die Lebensfähigkeit des replizierenden oder in der Wirtszelle aufzuhaltenden Pathogens nachteilig bzw. ungünstig beeinflusst und idealer Weise zu der Verringerung oder vollständigen Ausrottung (d.h. Tod) des Pathogens führt.
  • A. In Vitro Methodologie
  • Hier werden Verfahren zur Beurteilung der Empfindlichkeit der verschiedenen Phasen und Stadien des Lebenszyklus von Chlamydien, insbesondere die kryptische Phase, gegenüber einem bestimmten Mittel(n) beschrieben, da hier zuvor Verfahren des Stands der Technik versäumten die Notwendigkeit von Arzneimitteln zu würdigen, die infizierte Zellen von kryptischen Chlamydien klären können. Ein Arzneimittel-Durchmusterungs-Verfahren, welches das diese Aufgabe löste, verwendet Gewebekulturzellen, die in der Abwesenheit von Cycloheximid gehalten werden, um eine kryptische Infektion zu unterstützen. Eine kryptische Infektion ist in Zellen ungewöhnlich, die in standardisierten Zellkultur-Empfindlichkeits-Tests verwendet werden, da Chlamydien in mit Cycloheximid paralysierten Zellen nicht mit der Wirtszelle um Metabolite zu konkurrieren brauchen und folglich unterstützt werden zu replizieren.
  • Das in vitro Verfahren verwendet standardisierte Gewebekulturzellen jedoch ohne die Zugabe von Cycloheximid. Außerdem wird den Chlamydien gestattet für mehrere Tage vor der Zugabe von einem oder mehreren Testmitteln zu replizieren. Ein "Test-Mittel" kann eine beliebige Verbindung oder Kombination von Verbindungen sein, die als ein Anti-Chlamydien-Mittel für deren Fähigkeit, die Anwesenheit von Chlamydien in lebenden Zellen signifikant zu verringern, beurteilt werden soll. Ein Test-Mittel kann beispielsweise Antibiotika, antimikrobielle Mittel, anti-parasitische Mittel, Anti-Malaria-Mittel, reduzierende Disulfid-Mittel und Anti-Mycobakterien-Mittel umfassen, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Den replizierenden Zellen wird/werden dann ein antimikrobielles/antimikrobielle Mittel zugegeben. Die antimikrobiellen Mittel/Wachstumsmedium werden für die Dauer der Inkubationszeit periodisch ersetzt, die vorzugsweise vielmehr Wochen als Tage beträgt. Das/Die Testmittel wird/werden ersetzt, wenn es für die Dauer der Inkubationszeit (Tage bis Wochen) erforderlich ist, um zu gewährleisten, dass das Testmittel vorhanden ist und nicht anderweitig abgebaut wurde. Der Endpunkt schließlich nach der verlängerten Inkubationszeit ist die vollständige Abwesenheit von Chlamydien-DNA, wie sie durch ein Amplifikationsverfahren einer Nukleinsäure, beispielsweise der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Methodologie bestimmt wird. Standardisierte Amplifikationsverfahren (PCR) für eine Nukleinsäure werden verwendet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Signal für Chlamydien-DNA zu ermitteln, die MOMP oder ein anderes einzigartiges Chlamydien-Gen kodiert, um zu bestimmen, ob das Testmittel oder die Kombination von Mitteln bei der Verringerung einer Chlamydien-Infektion wirksam ist. Der Verlust von Signal (d.h. unter das nachweisbare Niveau des Amplifikationsverfahrens für Nukleinsäure) in Zellen mit Antibiotikum/Antibiotika gegenüber dessen Anwesenheit in Kontrollen stellt einen Hinweis auf eine Wirksamkeit des Mittels oder einer Kombination von Mitteln gegen Chlamydien dar.
  • Dementsprechend kann der Empfindlichkeits-Test verwendet werden, um ein Mittel oder Mittel zu identifizieren, die gegen irgendeine bestimmte Spezies von Chlamydien gerichtet ist/sind und können verwendet werden, um ein Mittel/um Mittel zu identifizieren, das/die gegen die kryptische Form des Pathogens gerichtet ist/sind, d.h. die die kryptische Form des Pathogens hemmen oder beseitigen können. Dies kann durch Ausführen des Empfindlichkeits-Tests erreicht werden, indem die Zellen unter stringenten Umgebungsbedingungen angeordnet werden, von denen bekannt ist, dass sie Chlamydien dazu induzieren in eine kryptische Phase einzutreten. Mittel, die, wie durch die hier beschriebenen Empfindlichkeits-Test-Protokolle ermittelt, gegen Chlamydien wirksam sind, können als Teil einer Therapie zur Handhabung von Infektionen mit Chlamydien verwendet werden. Geeignete Therapie-Protokolle werden nachfolgend ausführlich beschrieben, wobei ein besonderer Fokus auf ein Ziel ausgerichtete Mittel bzw. gerichteten Mitteln gegen spezifische Stadien des Lebenszyklus der Chlamydien besteht.
  • Die hier beschriebenen Verfahren sind einzigartig, da sie die Aktivität von antimikrobiellen Mitteln in der Abwesenheit von Cycloheximid beurteilen, was ein Klinisch mehr relevantes intrazelluläres Milieu bereitstellt. Beispielsweise werden beliebige normal arbeitende, energieabhängige Membranpumpen von Wirtszellen, die antimikrobielle Mittel in die oder aus den Zellen bewegen können durch die Verwendung von Cycloheximid inaktiviert. Die hier beschriebenen Verfahren sind einzigartig, da in ihnen Kulturmedium verwendet wird, das vorher inaktiviert wurde. Die Verfahren sind ebenfalls einzigartig, da sie die Wirkung einer verlängerten Dauer einer Exposition des/der antimikrobiellen Mittels/Mittel erfassen, nachdem eine intrazelluläre Infektion durch Chlamydien eingeführt bzw. erzeugt wurde. Schließlich ist das Verfahren einzigartig, da es die Anwesenheit/Abwesenheit von Chlamydien-DNA, beispielsweise durch Erfassen eines PCR-Signals, als den Endpunkt erfasst. Wird eine vollständige Ausrottung der Chlamydien-DNA als ein Endpunkt verwendet, dann bestätigt der Empfindlichkeits-Test, im Gegensatz zu lediglich einem zeitweiligen Anhalten der Replikation, dass alle Phasen von Chlamydien ausgerottet wurden.
  • Wird ein Amplifikationsverfahren für eine Nukleinsäure, wie beispielsweise PCR, verwendet, um den Testendpunkt zu beurteilen, dann kann das Nukleinsäuretest (beispielsweise PCR)-Verfahren durch die einzigartige Anwendung eines reduzierenden Mittels, wie beispielsweise Dithiothreitol (DTT), verbessert werden, um die Hülle von Chlamydien-EBs zu stören und wobei folglich DNA durch die Wirkung einer ein Protein verdauenden Verbindung, wie beispielsweise Proteinase K, ausgesetzt werden kann. Mit anderen Worten, das reduzierende Mittel erlaubt die EB-Hülle aufzubrechen. Durch die Verwendung eines Testes für DNA, bei dem EBs spezifisch enthüllt werden, beurteilt der Endpunkt des Empfindlichkeits-Tests die Anwesenheit oder Abwesenheit von EBs als auch die Anwesenheit oder Abwesenheit von sowohl replizierenden und nicht replizierenden RBs. Folglich ermöglicht dieser Ansatz für einen Empfindlichkeits-Test von Chlamydien quantitative antimikrobielle Empfindlichkeits-Tests von einzelnen und Kombinationen von Mitteln, bei denen die kumulative Wirkung des/der Mittel(s) auf die vollständige Ausrottung von allen Lebensphasen erfasst wird. Ergebnisse, die beispielhaft in diesem Verfahren in vitro erhalten wurden, werden nachfolgend beschrieben.
  • In einer Ausführungsform umfasst ein geeigneter Nukleinsäure-Test zum Identifizieren von Mitteln, die wirksam gegen die kryptische Form von Chlamydien sind, in der Anwesenheit von einem zu testenden Mittel(n), Unterziehen von kultivierten Zellen einem reduzierenden Mittel (beispielsweise Dithiothreitol) und einem Protease-Verdau oder Guanidin-Isothiocyanat (ebenfalls als Guanidin-Thiocyanat bekannt) für eine bestimmte Zeitdauer, Extrahieren von DNA von der behandelten Lösung, Aussetzen der DNA einer geeigneten Polymerase, dNTPs und Primern für eine DNA-Amplifikation von MOMP oder einem anderen Protein der Chlamydien-Spezies, und Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von amplifizierter DNA durch Sichtbarmachung des mit Ethidiumbromid behandelten DNA-Produkts durch Gelelektrophorese, beispielsweise, oder alternativ durch Southern Blot. In besonderen Ausführungsformen ist die Chlamydien-Spezies C. pneumoniae und die geeigneten Primer sind CHLMOMPDB2 und CHLMOMPCB2.
  • Weiterhin wird hier ein Verfahren zum Identifizieren von Zellen beschrieben, die eine nicht-EB kryptische Form von Chlamydien-Spezies beinhalten, indem ein Amplifikationsverfahren (beispielsweise PCR) einer Nukleinsäure, umfasst, Unterziehen von kultivierten Zellen einem Protease-Verdau, Stoppen des Proteaseaktivität, Aussetzen der Zellen einer geeigneten Hitzestabilen DNA Polymerase, dNTPs und markierten Primern (beispielsweise 3'-Biotin markiert, 5'-Biotin markiert), um DNA zu amplifizieren, die MOMP der Chlamydien-Spezies kodiert, Waschen der Zellen, Aussetzen der Zellen einem Reportermolekül (beispielsweise ein mit Streptavidin konjugiertes Signalenzym), Aussetzen der Zellen einem geeigneten Substrat für das Reportermolekül (beispielsweise konjugiertem Enzym) und Sichtbarmachen der MOMP kodierenden amplifizierten DNA durch Sichtbarmachen des Produktes der Reaktion.
  • Hier wird ein Verfahren zum Identifizieren einer kryptischen Form von Chlamydia beschrieben. Das Verfahren umfasst ein Behandeln von kultivierten Zellen, von denen angenommen wird, dass sie mit Chlamydien infiziert sind, mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel, Unterziehen von kultivierten Zellen einem Protease-Verdau, Aussetzen der Zellen einer geeigneten Polymerase, dNTPs und Primern für eine DNA-Amplifikation von Nukleinsaure, die ein Chlamydien-Protein kodiert, Aussetzen der Zellen einem Reporter-Molekül-Enzym, Aussetzen der Zellen einem geeigneten Substrat für das Reporter-Enzym und Bestimmen der Anwesenheit einer kryptischen Form von Chlamydia durch Sichtbarmachung der amplifizierten DNA, die ein Chlamydien-Protein kodiert. Das Amplifikationsverfahren kann PCR sein, wobei die Primer CHLMOMPDB2 und CHLMOMPCB2 von Chlamydia pneumoniae sein können.
  • Ein ähnliches Verfahren kann als ein Test zur Identifizierung eines Mittels verwendet werden, das gegen eine kryptische Form von Chlamydien wirksam ist. Dementsprechend umfasst das Verfahren, Behandeln kultivierter Zellen, von denen angenommen wird, dass sie mit Chlamydien infiziert sind, in der Abwesenheit von Cycloheximid mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel, Gestatten den Chlamydien zu replizieren, Zugaben eines Test-Mittels, Unterziehen der kultivierten Zellen einem Protease-Verdau, Aussetzen der Zellen einer geeigneten Polymerase, dNTPs und Primern für eine DNA-Amplifikation eines Gens, das ein Chlamydien-Protein kodiert, Aussetzen der Zellen einem Reporter-Molekül-Enzym, Aussetzen der Zellen einem geeigneten Substrat für das Reporter-Enzym und Bestimmen der Anwesenheit einer kryptischen Form von Chlamydien durch Sichtbarmachen der amplifizierten DNA, die ein Chlamydien-Protein, wie beispielsweise MOMP, kodiert.
  • B. In Vivo Methodologie
  • Zu Erläuterungszwecken kann der hier beschriebene Empfindlichkeits-Test verwendet werden, um den Zustand eines Menschen oder eines Tieres zu beurteilen, der/das einer Therapie zur Handhabung einer Infektion mit Chlamydien unterzogen wird. Beispielsweise wird ein biologisches Material von dem Menschen oder dem Tier, das einer Kombinations-Therapie unterzogen wird, isoliert. Das biologische Material wird derart behandelt, dass die Chlamydien davon isoliert werden. Dieses Chlamydien-Isolat gestattet von Chlamydien freie Zellen zu infizieren. Diese infizierten Zellen werden anschließend der Kombination von Mitteln ausgesetzt, die in dem Individuum verwendet werden, das einer Kombinations-Therapie unterzogen wird. Alternativ kann das Serum des Individuums, das die antimikrobiellen Mittel beinhaltet zu den infizierten Zellen als ein "bakterizider Serum-Test" für eine intrazelluläre Chlamydien-Infektion zugegeben werden. Die Anwesenheit von Chlamydien-DNA wird anschließend erfasst.
  • In dem in vivo Verfahren wird das Mausmodel verwendet, obwohl andere Tiere, wie beispielsweise Ratten oder Kaninchen verwendet werden können. In diesem Verfahren werden Mause (oder beliebig andere Tiere) intranasal mit 2 × 105 Chlamydien-EBs pro ml inokuliert. Die Erfinder bestätigten die Arbeit von Young und Kollegen (J. Infect. Dis. 171 (1995), 736–738), bei der eine intranasale Inokulation von Chlamydien-EBs zu einer systemischen Ausbreitung führte und insbesondere eine Infektion der Milz bedingte. Die Erfinder stellten fest, dass diese systemische Ausbreitung ebenfalls zu der Anwesenheit von EBs im Blut der Mause führt. Folglich kann die Infektiosität durch eine Blutkultur oder durch eine Serum/Gesamt-Blut-PCR für DNA von Chlamydien erfasst werden. Eine systemische Infektion kann ebenfalls durch die Anwesenheit erhöhter Antikörpertiter von IgM und IgG bestätigt und überwacht werden. Nachdem die systemische Infektion einer Maus hergestellt war, wurden der Maus antimikrobielle Mittel gegeben. Dies wird am einfachsten durch eine Zugabe der Antibiotika zu dem Trinkwasser ausgeführt. Die Wirkung einer Anti-Chlamydien-Therapie wird durch eine PCR vom Serum/Gesamt-Blut überwacht. Legt der Serum/PCR-Test eine Ausrottung von Chlamydien von dem Blutstrom nahe, dann werden die Mause geopfert und es wird eine PCR für Chlamydien-DNA an Homogensten der Lunge, des Herzens, der Leber und der Milz ausgeführt. Dieses Verfahren ist einzigartig, da es die vollständige Ausrottung von allen Lebenszyklen von Chlamydien in bekannten Zielorganen der Maus für eine Chlamydien-Infektion erfasst. Dieses in vivo Empfindlichkeits-Verfahren zeigte, beispielsweise, dass eine antimikrobielle Therapie mit den Dreifach-Mitteln, INH, Metronidazol und Penicillamin C. pneumoniae von infizierten Mäusen in vier Monaten vollständig ausrotten kann. Außerdem erwies sich, dass folgend auf eine vollständige Ausrottung von Chlamydien mehrere Versuche diese geheilten Mause über eine intranasale Inokulation erneut zu infizieren, nicht erfolgreich waren. Dies legt nahe, dass eine wirksame Handhabung und vollständige Ausrottung zu der Entwicklung einer schützenden Immunität führt, und dass jene wirksame Handhabung folglich einen Weg darstellt eine wirksame Immunität zu erzeugen.
  • Das Ausführen einer PCR für Chlamydien-DNA an Homogensten von anderen Organsystemen kann dazu verwendet werden, um die Wirksamkeit bestimmter Antibiotika-Kombinationen beim Ausrotten einer Infektion von Chlamydien in solchen Organsystemen zu bestimmen. Eine Ermittlung einer vorherigen Chlamydien-Infektion kann von solchen Systemen entweder durch eine Biopsie oder ein mit Antikörper verstärktes radiologisches Imaging ausgeführt werden. Alternativ kann eine vorherige Infektion durch Ausführen einer PCR für Chlamydien-DNA an Homogensten der gleichen Organsysteme in einer ähnlich inokulierten, jedoch unbehandelten Kontroll-Population statistisch bestimmt werden. Die organspezifische Empfindlichkeit wird durch Vergleichen der Raten positiver PCR-Tests in Kontroll- und Behandelten-Populationen bestimmt.
  • Ein alternatives oder komplementäres Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von kryptischen Chlamydien-Infektionen in einem Tier oder einer Zellkultur besteht darin die Kultur Verbindungen auszusetzen, die Chlamydien stimulieren. Derartige Verbindungen umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Cycloheximid, Corticosteroide (beispielsweise Prednison) und andere Verbindungen, die bekannt sind eine Reaktivierung von kryptischen intrazellulären Infektionen zu stimulieren und reduzierende Disulfid-Mittel (wie beispielsweise Dithiothreitol) und andere Chemikalien, die bewirken, dass sich EBs in RBs umwandeln. Sobald die kryptischen Formen in eine mehr aktive Phase eingetreten sind, können sie unter Verwendung standardisierter Detektionsverfahren, wie beispielsweise visueller Detektion von Einschlusskörperchen, immunchemischer Detektion von Chlamydien-Antigen oder Reverser-Transkriptase-PCR detektiert werden.
  • Anti-Chlamydien Therapie, die gegen die initialen Stadien einer Infektion mit Chlamydien gerichtet ist
  • Es wurde eine Anzahl wirksamer Mittel, die spezifisch gegen die initiale Phase einer Chlamydien-Infektion (d.h. Transition der Chlamydien-EB zu einem RB) gerichtet sind, identifiziert. Diese "kryptische" Wachstumsphase, im Unterschied zu der der replizierenden Chlamydien-Mikroorganismen, die die Wirtzellenergie verwenden, involviert Elektronen und Elektron-Transfer-Proteine als auch Nitroreduktasen. Darauf basierend wurde festgestellt, dass die initiale Phase einer Infektion mit Chlamydien gegenüber den antimikrobiellen Wirkungen von Nitroimidazolen, Nitrofuranen oder anderen Mitteln empfindlich ist, die gegen anaeroben Metabolismus in Bakterien gerichtet sind.
  • Nitroimidazole und Nitrofurane sind synthetische antimikrobielle Mittel, die gemeinsam eingruppiert sind, da sie beide Nitro (NO2-) beinhaltende beringte Strukturen sind und ähnliche antimikrobielle Wirkungen aufweisen. Diese Wirkungen erfordern einen Abbau des Mittels innerhalb der mikrobiellen Zelle, so dass elektrophile Radikale gebildet werden. Diese reaktiven elektrophilen Zwischenprodukte schädigen dann nukleophile Proteinstellen, einschließlich der Ribosomen, DNA und RNA. Nitroimidazole und Nitrofurane werden gegenwärtig so betrachtet, dass sie keine antimikrobielle Aktivität gegen Mitglieder der Chlamydien-Spezies aufweisen. Dieser Mangel an antimikrobieller Aktivität beruht jedoch auf der Tatsache, dass herkömmliche Verfahren eines Empfindlichkeits-Tests lediglich eine Wirkung auf die replizierende Form von Chlamydien-Spezies testen.
  • Beispiele geeigneter Nitroimidazole umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Metronidazol, Tinidazol, Bamnidazol, Benznidazol, Flunidazol, Ipronidazole, Misonidazol, Moxnidazol, Ronidazol, Sulnidazol und deren Metabolite, Analoge und Derivate davon. Metronidazol wird am meisten bevorzugt. Beispiele von Nitrofuranen, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Nitrofurantoin, Nitrofurazon, Nifurtimox, Nifuratel, Nifuraden, Nifurdazil, Nifurpirinol, Nifuratron, Furazolidon und deren Metabolite, Analoge und Derivate davon. Nitrofurantoin wird in der Klasse von Nitrofuranen bevorzugt.
  • Durchgehend durch diese Anmeldung und für Zwecke dieser Erfindung ist vorgesehen, dass "Metabolite", Produkte eines zellulären Metabolismus eines Arzneimittels in dem Wirt (beispielsweise Mensch oder Tier) einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die aktivierten Formen von Pro-Pharmakons, umfasst. Die Ausdrücke "Analoge" und "Derivate" sind vorgesehen Isomere, optisch aktive Verbindungen und irgendwelche chemischen oder physikalischen Modifikationen eines Mittel zu umfassen, so dass die Modifikation zu einem Mittel führt, das ähnliche oder erhöhte, jedoch verglichen zu der Wirksamkeit des Elternmittels keine signifikante verminderte Wirksamkeit gegenüber Chlamydien aufweist, von dem das Analog oder Derivat erhalten wurde. Dieser Vergleich kann unter Verwendung des hier beschriebenen Empfindlichkeits-Tests ermittelt werden.
  • Zu behandelnde Zellen können bereits kryptisch infiziert sein oder sie können stringenten metabolischen oder Umgebungsbedingungen unterworfen werden, die die replizierende Phase bedingen oder induzieren in die kryptische Phase einzutreten. Derartige stringente Bedingungen können eine Änderung von Umgebungs-/Kulturbedingungen in dem Fall umfassen, in dem die infizierten Zellen γ-Interferon ausgesetzt werden, oder die Zellen herkömmlichen antimikrobiellen Mitteln (beispielsweise Makroliden und Tetrazyklinen) ausgesetzt werden, die diese kryptische Phase einer Chlamydien-Infektion in menschlichen Wirtszellen induzieren.
  • Neue Anti-Chlamydien-Therapie, die gegen die replizierenden und kryptisch stationären Phasen einer Chlamydien-Infektion gerichtet ist
  • Eine einzigartige Klasse von Anti-Chlamydien-Mitteln, die gegen die replizierenden und kryptisch stationären Phasen von Chlamydien (und möglicher Weise gegen mehrere andere Stadien der kryptischen Phase) wirksam sind, wurden, unter Verwendung des hier beschriebenen Empfindlichkeits-Tests, identifiziert. Diese neu Klasse umfasst Isoniazid (INH), Isonicotinsäure (ebenfalls als Niacin bekannt), Nicotinsäure, Pyrazinamid, Ethionamid und Aconiazid, worin INH am meisten bevorzugt wird. Obwohl diese gegenwärtig lediglich gegen mycobakterielle Infektionen als wirksam betrachtet werden, teilweise aufgrund gegenwärtig verfügbarer Empfindlichkeits-Testverfahren, wurde festgestellt, dass diese Mittel in Kombination mit anderen Antibiotika besonders gegen Chlamydien wirksam sind. Es wird angenommen, dass die Isonicotinsäure-Kongener bzw. -Artverwandte auf die konstitutive Produktion von Katalase und Peroxidase gerichtet sind, was für eine Eigenschaft von Mikroorganismen, wie beispielsweise den Mycobakterien, charakteristisch ist, die Monozoten und Makrophagen infizieren. Chlamydien können ebenfalls erfolgreich Monozoten und Makrophagen infizieren.
  • Wird INH verwendet, um Chlamydien von Makrophagen und Monozoten auszurotten, unterstützt dies nachträglich diese Zellen in deren Rolle die Infektion zu bekämpfen. Diese Mittel scheinen jedoch gegen die kryptische Phase in vitro weniger wirksam zu sein. Folglich sollten Ethambutol, INH und andere Isonicotinsäure-Kongener idealer Weise in Kombination mit Mitteln verwendet werden, die auf andere Phasen des Lebenszyklus der Chlamydien gerichtet sind. Diese Isonicotinsäure-Kongener stellen trotzdem allgemein hervorragende Mittel für die Langzeittherapie einer chronischen/systemischen Infektion von Chlamydien, und insbesondere gegenüber einer Infektion von Chlamydien von Endothel- und glatten Muskelzellen in Blutgefäßen des Menschen dar.
  • INH und dessen Kongener können verwendet werden, um eine Infektion von Monozoten und/oder Makrophagen zu klären. Werden Monozoten und Makrophagen durch Chlamydien infiziert, dann werden sie geschwächt und können die Infektion nicht passend oder wirksam bekämpfen. Es wird angenommen, dass, falls die Chlamydien-Infektion per se von diesen Zellen geklärt wird, dann die Monozoten und Makrophagen deren entscheidenden Rollen bei der Bekämpfung einer/von Chlamydien- oder anderen Infektion(en) wiederaufnehmen. Folglich kann einer Patientenantwort auf die Kombinationstherapie durch Aufnahme von Isonicotinsäure-Kongenern optimiert werden. Dementsprechend stellt eine Ausführungsform der Erfindung ein spezifisches Verfahren zum Wiederbefähigen von Monozoten oder Makrophagen bereit, die durch eine Infektion mit Chlamydien beeinträchtigt wurden und wiederum ein Behandeln der Infektion an anderen Stellen umfasst. Derartige beeinträchtigte Makrophagen oder Monozyten können durch Behandeln der Chlamydien-Infektion durch Inkontaktbringen der infizierten Makrophagen und/oder Monozyten mit einem Anti-Chlamydien-Mittel aktiviert werden.
  • Therapie, die gegen Elementarkörperchen von Chlamydien gerichtet ist
  • Wie vorstehend ausgeführt wurde festgestellt, dass ungünstige Bedingungen, wie beispielsweise, begrenzte Nährstoffe, antimikrobielle Mittel und Immunantwort des Wirtes in Chlamydien stringente Antworten erzeugen. Derartige ungünstige Bedingungen sind bekannt in anderen Mikroorganismen (C.W. Stratton, In: Antibiotics in Laboratory Medicine, Fourth Edition. Lorian V (ed) Williams & Wilkins, Baltimore, pp 579-603 (1996)) stringente Antworten hervorzurufen und nicht überraschender Weise eine stringente Antwort in Chlamydien induzieren. Diese stringente Antwort in Chlamydien ändert den morphologischen Zustand des intrazellulären Mikroorganismus und erzeugt ruhende Formen, einschließlich der intrazellulären EB, die dann kryptisch persistieren können bis deren Entwicklungszyklus reaktiviert wird. Umgekehrt kann die Wirtszelle lysiert werden, was den EBs ermöglich das extrazelluläre Milieu zu erreichen. Folglich ist es erforderlich eine Kombination von Mitteln zu verwenden, die gegen verschiedene Lebensstadien von Chlamydien und insbesondere für eine erfolgreich Handhabung einer Infektion gegen das Elementarkörperchen gerichtet sind.
  • Während des einzigartigen Lebenszyklus der Chlamydien ist bekannt, dass metabolisch inaktive Sporen-ähnliche EBs in das extrazelluläre Milieu entlassen werden. Obwohl diese freigesetzten EBs infektiös sind, können sie benachbarte empfindliche Wirtszellen nicht unmittelbar infizieren, wenn nicht geeignete Bedingungen für eine EBs-Infektiosität vorhanden sind. Das Ergebnis einer solchen Verzögerung bei der Infektion besteht in der extrazellulären Akkumulation metabolisch inaktiver, noch immer infektiöser EBs. Dies erzeugt einen zweiten Typ einer Chlamydien-Persistenz, die hier als EB-"Gewebe/Blut-Belastung" bezeichnet wird. Dieser Ausdruck ist dem Konzept einer HIV-Belastung ähnlich und wird hier als die Anzahl von infektiösen EBs definiert, die sich in dem extrazellulären Milieu befinden. Direkte mikroskopische Sichtbarmachungs-Verfahren, Gewebezellkulturen und Testverfahren der Polymerase-Ketten-Reaktion zeigten, dass infektiöse EBs häufig im Blut von scheinbar gesunden Menschen und Tieren aufgefunden werden. Dieses Phänomen besitzt offenkundig große Klinische Wichtigkeit bei Chlamydien-Infektionen, da diese metabolisch inaktiven EBs der Wirkung einer gegenwärtigen Anti-Chlamydien-Therapie entkommen, die lediglich gegen die replizierenden intrazellulären Formen von Chlamydien gerichtet sind. Die Anwesenheit von infektiösen extrazellulären EBs nach Beendigung einer kurzzeitigen, Anti-Replizierenden Phase Therapie gegen Infektionen mit Chlamydien zeigte, dass sie zu einem Rückfall einer intrazellulären Infektion führt. Folglich wird die Dauer und Beschaffenheit einer Anti-Chlamydien-Therapie, die zur Handhabung von Chlamydien-Infektionen erforderlich ist, teilweise durch die extrazelluläre Belastung von EBs diktiert. Für Zwecke dieser Erfindung kann eine Kurzzeit-Therapie ungefähr zwei bis drei Wochen umfassen, eine Langzeit-Therapie dagegen mehrere Monate.
  • Wie in vorherigen Abschnitten beschrieben wird ebenfalls angenommen, dass die Persistenz von Chlamydien-Infektionen teilweise auf der Anwesenheit von kryptischen Formen von Chlamydien in den Zellen beruhen kann. Diese kryptische intrazelluläre Chlamydienform kann offenbar durch bestimmte Wirtsfaktoren, wie beispielsweise Cortison (Yang et al., Infection and Immunity, 39 (1983), 655–658, und Malinverni et al., The Journal of Infectious Diseases, 172 (1995), 593–594) aktiviert werden. Eine Anti-Chlamydien-Therapie für chronische Chlamydien-Infektionen muss fortgesetzt werden bis jegliche intrazellulären EBs oder andere intrazellulären kryptischen Formen aktiviert wurden und extrazelluläre EBs Wirtszellen infiziert haben. Diese Reaktivierung/Reinfektion durch Chlamydien-EBs ist eindeutig nicht erwünscht, da es die Therapie von Chlamydien-Infektionen verlängert als auch die Möglichkeit erhöht, dass eine antimikrobielle Resistenz auftritt.
  • Es wurden biochemische Mittel identifiziert, die Chlamydien-EBs in den entsprechenden Wirten durch Reduzieren von Disulfidbindungen, die die Integrität der Proteine der äußeren Membran der EB aufrechterhalten, inaktivieren können. Bei Chlamydien initiiert die Zerstörung der äußeren Membranproteine von EBs die Transition von der EB-Form zu der RB-Form. Ereignet sich dies in dem azellulären Milieu, wo es keine verfügbare Energiequelle gibt geht das im Entstehen begriffene RB zugrunde oder wird Opfer des Immunsystems. Folglich sind reduzierende Disulfid-Mittel, die diesen Prozess beeinträchtigen können, als Verbindungen für die Beseitigung von EBs geeignet.
  • Eine derartige Klasse von reduzierenden Disulfid-Mitteln sind Thio-Disulfid-Austauschmittel. Beispiele von diesen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf 2,3-Dimercaptosuccinsäure (DMSA; ebenfalls hier als "Succimer" bezeichnet); D,L,-β,β-Dimethylcystein (ebenfalls als Penicillamin bekannt); p-Lactam-Mittel (beispielsweise Penicilline, Penicillin G, Ampicillin und Amoxicillin, die Penicillamin als ein Abbauprodukt erzeugen), Cycloserin, Dithiotreitol, Mercaptoethylamin (beispielsweise Mesna, Cysteiamin, Dimercaptol), N-Acetylcystein, Tiopronin bzw. Thiopronin und Glutathion. Ein besonders wirksames extrazelluläres Anti-Chlamydien-Mittel innerhalb dieser Klasse ist DMSA, das ein chelatbildendes Mittel ist, das vier ionisierbare Wasserstoffe und zwei hoch geladene Carboxylgruppen aufweist, die eine relative Passage bzw. ein Durchtreten durch die menschlichen Zellmembranen verhindern. DMSA verbleibt folglich in der extrazellulären Flüssigkeit, wo es extrazellulären EBs einfach begegnen kann. Die zwei Thiol (Sulfhydryl)-Gruppen an dem Succimermolekül (DMSA) können Disulfidbindungen in dem MOMP von EBs, die in dem extrazellulären Milieu angeordnet sind, reduzieren.
  • Penicillamin kann ebenfalls als reduzierendes Disulfid-Mittel verwendet werden, um Chlamydien-EBs zu beseitigen. Die Verwendung von Penicillamin kann jedoch unerwünschte Nebenwirkungen bedingen. Folglich können als eine Alternative, solche β-Lactam-Mittel, die metabolisiert oder anderweitig zu Penicillamin ähnlichen Mitteln in vivo (d. h. diese Mittel weisen eine reduzierende Gruppe auf) umgesetzt werden, dem Menschen oder Tier oral verabreicht werden, die unter physiologischen Bedingungen als ein Mittel einer gesteuerten Freisetzung von derivatisiertem Penicillamin durch nicht enzymatische Säurehydrolyse von Penicillin, bereitgestellt werden. Clavulon- bzw. Clavulansäure ist für diese Hydrolyse oder zur Verwendung von β-Lactam-Mitteln, um Penicillamin in vivo zu erzeugen nicht erforderlich.
  • Gegenwärtig anerkannte Mittel, die gegen eine Chlamydien-Replikation aktiv sind Da Chlamydien-RBs in EBs transformieren, beginnen sie eine aktive Transkription von Chlamydien-DNA und eine Translation der erhaltenen mRNA zu verwenden. Als solche sind diese Formen von Chlamydien gegenüber gegenwärtig verwendeten Anti-Chlamydien-Mitteln empfindlich. Die Anti-Chlamydien-Wirksamkeit dieser Mittel kann durch deren Verwendung in Kombination mit anderen Mitteln verbessert werden, die gegen unterschiedliche Stadien von Lebenszyklen von Chlamydien, wie hier ausgeführt, gerichtet sind.
  • Klassen geeigneter Anti-Chlamydien-Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Rifamycine (ebenfalls als Ansamacrolide bekannt), Quinolone, Fluoroquinolone, Chloramphenicol, Sulfonamide/Sulfide, Azalide, Cycloserine, Macrolide und Tetracycline. Beispiele von diesen Mitteln, die Mitglieder dieser Klassen sind, als auch solchen, die bevorzugt sind, werden nachfolgend in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Mittel, die gegen die replizierende Phase von Chlamydien wirksam sind
    Arzneimittelklasse Beispiele Bevorzugt
    Quinolone/Fluoroquinolone Ofloxacin Levofloxacin Trovafloxacin Sparfloxacin Norfloxacin Lomefloxacin Cinoxacin Enoxacin Nalidixinsäure Fleroxacin Ciprofloxacin Levofloxacin
    Sulfonamide Sulfamethoxazol Sulfamethoxazol/Trimethoprim
    Azalide Azithromycin Azithromycin
    Macrolide Erythromycin Clarithromycin Clarithromycin
    Lincosamide Lincomycin Clindamycin
    Tetracycline Tetracyclin Doxycyclin Minocyclin Methacyclin Oxytetracylin Minocyclin
    Rifamycine (Ansamacrolide.) Rifampin Rifabutin Rifampin
  • Es wird angenommen, dass alle Mitglieder der Chlamydien-Spezies, einschließlich C. pneumoniae durch die Verwendung eines einzelnen Mittels, das von gegenwärtig verwendeten Antimikrobiellen Mitteln, wie beispielsweise solchen hier beschriebenen, ausgewählt wird, gehemmt und mehrere getötet werden. Unter Verwendung des neuen Empfindlichkeits-Tests haben die Erfinder jedoch festgestellt, dass eine vollständige Ausrottung von Chlamydien nicht durch ein beliebiges eines von diesen Mitteln alleine erreicht werden kann, da keines gegen alle Phasen des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam ist und scheinbar eine stringente Antwort in Chlamydien induziert, wodurch eine Transformation der replizierenden Phase in die kryptische Phase bedingt wird. Dies führt zu einer persistenten Infektion in vivo oder in vitro, die durch PCR-Verfahren dargestellt werden kann, die die Anwesenheit oder Abwesenheit von Chlamydien-DNA beurteilt. Trotzdem sollte eines oder mehrere von diesen gegenwärtig verwendeten Mitteln, oder ein neues Mittel, das gegen die replizierende Phase von Chlamydien gerichtet ist, als eines der Chlamydien-Mittel in einer Kombinationstherapie eingeschlossen sein, um die Transition der EB zu den RB zu verlangsamen oder anzuhalten, als auch, um die Chlamydien-Replikation zu hemmen.
  • Methodologie zum Auswählen möglicher Mittel-Kombinationen
  • Bei dem Versuch eine systemische Infektion zu handhaben oder auszurotten, ist es entscheidend auf mehrere Phasen in dem Lebenszyklus von Chlamydien zu zielen, während anderweitig lebensfähige Chlamydien in den nicht-gerichteten Phasen nach der Therapie verbleiben werden, was zu einer fortgesetzten, chronischen Infektion führt. Diese fundamentale Einsicht ist der Kern dieser Erfindung.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Auswählen einer geeigneten Kombination von Mitteln, die die Erfordernisse dieser Strategie erfüllen, umfasst, wie folgt, mehrere Schritte:
    • 1. Identifizieren der Phasen des Lebenszyklus der Chlamydien. Beispielsweise sind die folgenden Phasen gegenwärtig bekannt: a. Elementarkörperchen ("EB")-extrazellulär oder intrazellulär. Intrazelluläre EBs können einen Typ einer "kryptischen Phase" darstellen. b. EB Transitionsphase in Retikularkörperchen ("RB"). c. Stationäre RB-Phase. Dies stellt jene dar, was gewöhnlich als die "kryptische Phase" angesehen wird. d. Replizierende RB-Phase. e. RB zu EB Transitionsphase (ebenfalls als "Kondensation" bezeichnet).
    • 2. Beurteilen der relativen Wichtigkeit eines Abzielens auf jede besondere Phase beim Ausrotten von Reservoirs vom Chlamydien aus dem Wirtsorganismus. Beispielsweise können den in Schritt 1 aufgelisteten Lebenszyklus-Stadien, basierend auf den folgenden Annahmen, Vorrang gegeben werden: a. In dem Wirt stellen extrazelluläre und intrazelluläre EBs ein sehr bedeutendes Reservoire von infektiösen Mitteln bereit, die zu einer chronischen und persistenten Infektion führen. b. Die meisten intrazellulären RBs bei einer chronischen Infektion sind nicht replizierend. Der 3–4-Tage Replikationszyklus, der in mit Cycloheximid behandelten eukaryotischen Zellen gesehen wird, ist ein Artefakt einer atypischen Zellkulturumgebung, die hauptsächlich entwickelt wurde, um Chlamydien zu vermehren. c. Die Transitionsphasen stellen lediglich einen kleinen Anteil bei chronischen Infektionen von Chlamydien dar.
    • 3. Identifizieren von "Zielen bzw. Targets" für jede Phase der ausgewählten Lebenszyklus-Phasen. Ein Ziel ist eine Eigenschaft von Chlamydien, die während einer bestimmten Lebenszyklus-Phase verletzlich ist. Beispielsweise stellen die Disulfidbindungen im MOMP ein Ziel während der EB-Phase dar.
    • 4. Identifizieren von Mitteln mit einem bekannten oder theoretischen Wirkungsmechanismus(en) gegen solche Ziele.
    • 5. Beurteilen, ob solche Mittel lediglich hemmen oder, vorzugsweise durch ein Verständnis deren Wirkmechanismus abtötend sind.
    • 6. Bestätigen der Beurteilung durch Verwendung der folgenden Ansätze: a. In dem Fall von Anti-EB-Mitteln, Behandeln von EBs mit dem Mittel, anschließend versuchen Zellen mit den behandelten EBs zu infizieren. Falls die Zellen nicht infiziert werden, dann ist das Mittel EB-tötend. b. In dem Fall anderer Mittel werden die Empfindlichkeits-Tests verwendet, die hier an anderer Stelle offenbart sind, um zu bestimmen, ob das Mittel entweder alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln Chlamydien tötend ist.
    • 7. Auswählen einer Kombination von Mitteln, die durch deren individuellen Wirkungen eine Aktivität gegenüber von Zielen für die wichtigsten Phasen in dem Lebenszyklus der Chlamydien bereitstellen. Vorzugsweise sollte eine Kombination auf so viele Phasen des Lebenszyklus wie möglich abzielen, um zu versuchen die Gesamtheit der relativ wichtigen Punktbewertungen bzw. Scores von darauf abgezielten Phasen zu maximieren, während die Anzahl der beteiligten Arzneimittel minimiert wird.
    • 8. Testen der Kombination unter Verwendung der an anderer Stelle beschriebenen Empfindlichkeits-Testverfahren. Dieser Schritt ist erforderlich, da die ausgewählte Kombination aus verschieden Gründen, wie beispielsweise intrazelluläres Durchdringen und/oder Efflux, Chlamydien tötend sein kann oder nicht.
    • 9. Einstellen initialer Dosierungen, basierend auf Klinischen Standards, die die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik für die individuell beschriebenen Arzneimittel berücksichtigt, wobei, falls erforderlich, Modifikationen auf Ergebnissen des Empfindlichkeits-Tests und einer in vivo Wirksamkeit basieren.
  • Tabelle 6 stellt ein Beispiel dafür bereit, wie die vorstehende Methodologie verwendet werden kann. Die bevorzugte Ausführungsform umfasst Mittel, die:
    • a) Abzielen auf Disulfidbindungen in den EB und Kondensations-Phasen,
    • b) Abzielen auf nicht oxidativen Metabolismus in der stationären/kryptischen Phase;
    • c) Abzielen auf eine konstitutive Produktion von Peroxidasen und Katalasen in den stationären und replikativen Phasen;
    • d) In den beiden letzten Fällen, Arbeiten durch biochemisches Zerstören des Organismus durch freie Radikale, für die der Organismus sehr schwer eine Resistenz entwickeln kann; und
    • e) Wahlweise Zugeben eines Mittels, um auf DNA-abhängige RNA-Polymerase in der EB → RB-Phase abzuzielen.
  • Die vorstehende Methodologie zum Auswählen von Kombinationstherapien kann bei einem oder einer Kombination von vorstehend beschriebenen Schritten automatisiert (beispielsweise durch ein Computersystem) werden. Diese Methodologie ist sogar nach einem besseren Verständnis des Lebenszyklus von Chlamydien anwendbar, was zu einer Re-Priorisierung oder sogar einer Unterteilung der Lebenszyklus-Phasen führt, wobei, neue theoretische Ziele innerhalb der Chlamydien identifiziert werden, oder neue Arzneimittel entwickelt werden, die gegenwärtig bekannte oder neue Ziele in Chlamydien angreifen. Beispielsweise können die Phasen des Lebenszyklus weiter basierend auf dem Wirtszelltyp, in dem sich die Phase befindet, unterklassifiziert werden. Folglich könnten die stationären Phase RBs in Makrophagen als eine von den stationären Phase RBs in Hepatozyten getrennte Phase betrachtet werden. Dies gestattet der zu verwendenden Methodologie eine einzelne oder eine mehrfach Gewebe-spezifische Kombination von Mitteln zu entwickeln.
  • Figure 00490001
  • Krankheiten, die mit einer Chlamydien-Infektion in Verbindung stehen
  • Es wurde eine Verbindung zwischen einer chronischen Chlamydien Infektion von Körperflüssigkeiten und/oder Geweben mit verschiedenen Krankheitssyndromen von vorher unbekannter Ätiologie in Menschen aufgefunden, die auf einzigartige Regimen, die hier beschrieben sind, ansprechen. Bis heute umfassen diese Krankheiten multiple Sklerose (MS), rheumatoide Arthritis (RA), entzündliche Darmerkrankung (IBD), interstitielle Zystitis (IC), Fibromyalgie (FM), autonome Nerven Dysfunktion (AND, neuronal vermittelte Hypotonie), Pyoderma Gangrenosum (PG), chronische Erschöpfung (CF) und chronisches Erschöpfungssyndrom (CFS). Andere Krankheiten werden untersucht. Eine Korrelation zwischen einer Chlamydien Infektion und diesen Krankheiten wurde erst vor kurzem als Ergebnis, der hier beschriebenen Diagnose-Methodologien und der Kombinationstherapien hergestellt.
  • Auf Grundlage dieses Beweises, publiziertem Anzeichen für eine Verbindung zwischen Arteriosklerose und Chlamydien (Grupta et al., Circulation, 96: 404–407 (1997)), und einem Verständnis der Bedeutung der Chlamydien Infektionen auf infizierte Zellen und das Immunsystem, fanden die Erfinder eine Verbindung zwischen Chlamydien und einem weiten Bereich an entzündlichen-, autoimmun- und Immunmangel-Erkrankungen. Daher beschreibt die Erfindung Verfahren zur Diagnose und/oder Behandlung von Krankheit, die mit einer Chlamydien-Infektion in Verbindung steht, wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen, entzündlichen Krankheiten und Krankheiten, die in Individuen mit geschwächtem Immunsystem auftreten, durch Diagnostizieren und/oder Behandeln der Chlamydien-Infektion in einem Individuum, das dies benötigt, unter Verwendung einer der hier beschriebenen Tests oder Therapien. Der Verlauf der Behandlung kann serologisch beurteilt werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Chlamydien unter Verwendung von beispielsweise der hier bereitgestellten Diagnoseverfahren bestimmt werden, wobei dieser Wert mit serologischen Werten verglichen werden kann, die zuvor in der Therapie gemessen wurden. Die körperliche Verbesserung der Zustände und Symptome, die üblicherweise mit der zu behandelnden Krankheit verbunden sind, sollte auch beurteilt werden. Auf Grundlage dieser Erhebungsfaktoren kann der Arzt die Anti-Chlamydien Therapie beibehalten oder entsprechend verändern. Beispielsweise kann der Arzt ein Mittel aufgrund von nachteiligen Nebenwirkungen, die durch das Mittel hervorgerufen werden, Unwirksamkeit des Mittels oder aus anderen Gründen, austauschen. Wenn sich die Antikörpertiter während der Behandlung erhöhen, sollen wechselnde Verbindungen ersetzt werden, um die niedrigen Antikörpertiter zu erreichen, die die spezifische Empfindlichkeit der Chlamydien gegenüber dem neuen Regime aufzeigen. Ein Austausch oder eine Ersetzung eines Mittels gegen ein anderes Mittel, das gegen das gleiche Lebensstadium von Chlamydia wirksam ist, ist erwünscht.
  • Die hier beschriebenen Therapien können daher für die Behandlung von akuten und chronischen Immun- und Autoimmunerkrankungen verwendet werden, wenn bei den Patienten eine Belastung mit Chlamydien durch die hier beschriebenen Diagnoseverfahren festgestellt wurde, welche Erkrankungen umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf chronische Hepatitis, systemischer Lupus Erythematodes, Arthritis, Thyroidose, Skleroderma, Diabetes Mellitus, Graves Krankheit. Beschet's Krankheit und Transplantats-Abstoßung. Die hier beschriebenen Therapien können auch zur Behandlung jeglicher Störungen verwendet werden, bei denen eine Chlamydien-Spezies ein Faktor oder Co-Faktor ist.
  • Daher können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung einer Auswahl an Störungen zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Immun- und Autoimmunerkrankungen verwendet werden, wenn durch die hier beschriebenen Diagnoseverfahren gezeigt wird, dass sie mit einer Chlamydien-Infektion in Verbindung stehen, beispielsweise können verschiedene Infektionen behandelt werden, von denen viele eine Entzündung als primäres oder sekundäres Symptom erzeugen, jedoch nicht beschränkt sind auf, umfassend, Sepsis-Syndrom, Kachexie, Kreislaufkollaps und Schock resultierend aus einer akuten oder chronischen bakteriellen Infektion, akute und chronische parasitäre und/oder infektiöse Erkrankungen aus bakteriellen, viralen oder von Pilzen abgeleiteten Quellen, wie beispielsweise HIV, AIDS (einschließlich Symptomen der Kachexie, Autoimmunstörungen, AIDS Demenz Komplex und Infektionen), als auch Wegner's Granulomatose.
  • Unter den verschiedenen entzündlichen Erkrankungen gibt es bestimmte Eigenschaften des Entzündungsverlaufs, die allgemein anerkannt charakteristisch sind. Diese beinhalten die Fenestration des Mikrogefäßsystems, Auslaufen von Blutelementen in den interstitiellen Raum und Migration von Leukozyten in das entzündete Gewebe. Auf makroskopischer Ebene wird dies häufig durch die bekannten klinischen Anzeichen wie Erythem, Ödem, schmerzhafte Spannungen (Überempfindlichkeit) und Schmerz begleitet. Entzündliche Erkrankungen, wie beispielsweise chronisch entzündliche Pathologien und vaskuläre entzündliche Pathologien, einschließlich chronisch entzündlicher Pathologien wie beispielsweise Aneurysma, Hämorrhoiden, Sarkoidose, chronisch entzündliche Darmerkrankungen, eiternde Dickdarmentzündung bzw. Kolitis und Crohn's Krankheit und vaskuläre entzündliche Pathologien wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf disseminierte intravaskuläre Koagulation, Arteriosklerose und Kawasaki-Symptom sind für die Behandlung durch hier beschriebene Verfahren geeignet. Die Erfindung kann auch zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen verwendet werden, wie beispielsweise Koronararterien-Erkrankung, Hypertonie, Schlaganfall, Asthma, chronische Hepatitis, multiple Sklerose, periphere Neuropathie, chronische oder wiederkehrende Halsschmerzen, Laryngitis, Tracheobronchitis, chronische vaskuläre Kopfschmerzen (einschließlich Migräne, Cluster Kopfschmerzen und Anspannungs-Kopfschmerzen) und Lungenentzündung, wenn gezeigt wurde, dass die Erkrankung pathologisch auf einer Chlamydien-Infektion beruht.
  • Behandelbare Störungen, wenn sie mit einer Chlamydien-Infektion in Verbindung stehen, umfassen ebenfalls, sind jedoch nicht beschränkt auf neurodegenerative Erkrankungen, wie beispielsweise multiple Sklerose und akute transverse Rückenmarksentzündung, extrapyramidale und cerebrale Störungen, wie beispielsweise Läsionen des corticospinalen Systems, Störungen der Basalganglien oder cerebrale Störungen, hyperkinetische Bewegungsstörungen wie beispielsweise Huntingtons Chorea und senile Chorea, durch Medikamente induzierte Bewegungsstörungen, wie beispielsweise solche, die durch ZNS Dopamin-Rezeptor-Blocker induziert werden, hypokinetische Bewegungsstörungen, wie beispielsweise Parkinson Krankheit, progressive supranukleäre Lähmung, cerebrale und spinocerebrale Störungen, wie beispielsweise strukturelle Läsionen des Cerebellum, spinocerebrale Degenerierungen (spinale Ataxie, Friedrichs Ataxie, cerebrale corticale Degenerierungen, multiple Systemdegenerierungen (Mencel, Dejerne-Thomas, Shi-Drager und Machado Joseph)) und systemische Störungen (Refsum's Krankheit, Abetalipo proteinämie bzw. eine beta-Lipoproteinämie, Ataxie, Teleangiektasie und mitochondriale Multisystemstörung), demyelinierende Kern- bzw. Markstörungen, wie beispielsweise multiple Sklerose, akute transverse Rückenmarksentzündungen, Störungen der motorischen Einheit, wie beispielsweise neurogener Muskelschwund, (Vorderhorn-Zelldegenerierung, wie beispielsweise amyotrophische laterale Sklerose, frühkindlicher spinaler Muskelschwund und jugendlicher spinaler Muskelschwund), Alzheimer, Down Syndrom im mittleren Alter, diffuse Lewy-Körper-Erkrankung, senile Demenz des Lewy-Körper-Typs, Wernicke-Korsakoff-Syndrom, chronischer Alkoholmissbrauch, Creutzfeld-Jakob-Krankheit, subakute skierotisierende Panencephalitis, Hallerorden-Spatz-Krankheit und Dementis pugilistica oder jegliche Teilmenge davon.
  • Es wird ebenfalls anerkannt, dass maligne Pathologien, die Tumore oder andere bösartige Tumore umfassen, wie beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf Leukämie (akute, chronische myeloische, chronisch lymphatische und/oder myelodyspastisches Syndrom), Lymphome (Hodgkins und Non-Hodgkins Lymphome, wie beispielsweise maligne Lymphome (Burkitt's Lymphome oder Mykose)), Karzinome (wie beispielsweise Kolon Karzinom) und Metastasen davon, Krebs-bezogene Angiogenese, frühkindliche Hämangiome, durch Alkohol hervorgerufene Hepatitis. Okulare Neovaskularisierung, Schuppenflechte, Zwölffingerdarmgeschwüre, Angiogenese des weiblichen Fortpflanzungstrakts können auch behandelt werden, wenn durch die hier beschriebenen Diagnoseverfahren gezeigt wird, dass sie mit einer Chlamydien-Infektion in Verbindung stehen.
  • Ein Individuum mit geschwächtem Immunsystem wird allgemein als eine Person definiert, die eine abgeschwächte oder reduzierte Fähigkeit aufzeigt, eine normale zelluläre oder humorale Verteidigung gegen infektiöse Mittel wie beispielsweise Viren, Bakterien, Pilze und Protozoen aufzubauen. Personen, die als mit einem geschwächten Immunsystem angesehen werden, beinhalten unterernährte Patienten, Patienten, die operiert werden und eine Knochenmarkstransplantation erhalten, Patienten, die eine Chemotherapie oder Radiotherapie bekommen, Patienten mit Neutropenie, HIV-infizierte Patienten, Trauma-Patienten, brandverletzte Patienten, Patienten mit chronischen oder resistenten Infektionen, wie beispielsweise solchen, die vom myelodysplastischen Syndrom herrühren, und die älteren Menschen, von denen alle ein geschwächtes Immunsystem aufweisen. Ein mit Protein unterernährtes Individuum wird allgemein als eine Person definiert, die einen Serum Albumin Spiegel von weniger als ungefähr 3,2 Gramm pro Deziliter (g/dl) und/oder einen unbeabsichtigten Gewichtsverlust von mehr als 10 % des normalen Körpergewichts aufweist.
  • Der Verlauf der Therapie, die serologischen Ergebnisse und klinischen Verbesserungen von einer teilnehmenden Anti-Chlamydien-Therapie bei Patienten, die die aufgeführten Erkrankungen aufweisen, wurden beobachtet und in Beispiel 5 berichtet. Die Daten stellen Anzeichen bereit, um zu begründen, dass die Behandlung der Chlamydien-Infektion zur serologischen und körperlichen Verbesserung eines Krankheitsstadiums eines Patienten führt, der die Kombinationstherapie durchläuft. Diese Beobachtungen waren einheitlich unter einer Vielzahl von verschiedenen Erkrankungen, die unter eine generalisierte Krankheitsklasse fallen.
  • Andere Erkrankungen unbekannter Atiologie mit neuen Anzeichen für eine Chlamydia pneumoniae Atiologie
  • Sowohl C. trachomatis, wie C. psittaci weisen einen wechselnden Krankheitskomplex auf, der abhängig von verschiedenen Serovarietas ist. Eine bisher bekannte Grundlage für diese Verschiedenheit ist die Aminosäuresequenz des MOMP. 1 zeigt einen Sequenzabgleich von verschiedenen Chlamydien MOMPs. Beachte, dass die Größe und Sequenz relativ homolog sind, außer für die vier variablen Regionen, die für das Serovar (Serotyp), Grundlage der Klassifizierung, verantwortlich sind. Weiter wurde gefunden, dass C. pneumoniae Blutgefäß Endothelzellen infiziert, aus denen EBs in den Blutstrom freigesetzt werden. Zusätzlich sind Makrophagen bekannte Ziele von C. pneumoniae und sie können als Reservoir dienen und zusätzliche Mechanismen der Transmission bereitstellen. C. pneumoniae ist deshalb in der Lage, sich im gesamten menschlichen Körper auszubreiten und dabei Infektionen an vielen Orten und in einer Mehrzahl von Organsystemen zu schaffen. Infizierte Orte können über einen längeren Zeitraum, ohne dass Symptome induziert werden, bestehen, die von dem Patienten oder einem untersuchenden Arzt festgestellt werden. Die Sequenzvariabilität von MOMPs und anderen Chlamydien-Antigenen können eine Grundlage für eine Organspezifität bereitstellen, während andere Chlamydien-Proteine, wie beispielsweise das 60 K bzw. kDa und 70 K Hitze-Schock-Proteine oder LPS, die Immunantwort beeinflussen können.
  • C. psittaci und C. pecorum sind bekannt dafür, einen Wirt von Infektionen in ökonomisch wichtigen Tieren zu verursachen. Daher sind die Lehren dieser Erfindung relevant für Tiere. Durch diese Anmeldung hindurch und für die Zwecke dieser Erfindung, soll "Patient" sowohl Menschen, als auch Tiere umfassen. Nahezu alle Kaninchen und Mause die bisher getestet wurden, weisen PCR Signale für C. pneumoniae auf. Sie können als geeignete Tiermodelle für die Behandlung unter Verwendung spezifischer Kombinationen von Antibiotika verwendet werden, um die Therapie zu verbessern. (Ranks et al., Amen. J. of Obstetrics and Gynecology 138 (7Pt2): 952–956 (1980)), (Moazed et al., Am. J. Pathol. 148 (2): 667–676 (1996)), (Masson et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39 (9): 1959–1064 (1995)), (Patton et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37 (1): 8–13 (1993)), (Stephens et al., Infect. Immun. 35 (2): 680–684 (1982)) und (Fong et al., J. Clin. Microbiol. 35 (1): 48–52 (1997)).
  • Verbunden mit diesen Entwicklungen sind die in letzter Zeit entwickelten Kaninchenmodelle der koronaren Arterienerkrankung, wobei Kaninchen nach einer Exposition mit C. pneumoniae arterielle Plaques, ähnlich denen in Menschen, entwickelten (Fong et al., J. Clin. Microbiol. 35: 48–52 (1997)). Vor kurzem wurde durch eine Studie an dem St. George's Hospital in London festgestellt, dass ca. Dreiviertel von 213 Herzanfallopfern signifikant erhöhte Spiegel von Antikörpern gegen C. pneumoniae aufwiesen und dass die, die solche Antikörper aufweisen, signifikant niedrigere Raten eines weiteren ungünstigen Herzvorfalls aufweisen, wenn sie mit Antibiotika behandelt werden (Grupta et al., Circulation 95: 404–407 (1997)). Zusammengenommen liefern diese drei Hinweise (die Bakterien, die in erkranktem Gewebe aufgefunden wurden, Beimpfung bzw. Inokulation mit diesen Bakterien führt zur Erkrankung und Behandlung gegen die Bakterien lindert die Erkrankung) Argumente für einen kausalen Zusammenhang.
  • Beifügungsmittel, die in Verbindung mit der Kombinationstherapie verwendet werden Zusätzlich zu den zuvor ausgeführten Kombinationstherapien können andere Verbindungen einem Individuum co-verabreicht werden, das einer Anti-Chlamydien Therapie zur Handhabung einer chronischen/systemischen Infektion unterzogen wird. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, ein oder eine Kombination aus Anti-Entzündungsmitteln und/oder immunsuppressiven Mitteln zur Verbesserung von Nebenwirkungen, die als Antwort auf ein bestimmtes Anti-Chlamydien Mittel auftreten können, beispielsweise Herxheimer Reaktionen, einzuschließen bzw. beizufügen. Die anfängliche Zuführung eines anti-entzündlichen Steroids kann zur Minimierung von Nebenwirkungen der Anti-Chlamydien Therapie in solchen Patienten eingeführt werden, bei denen das klinische Urteil die Möglichkeit einer schweren entzündlichen Spätkomplikation nahe legt ist.
  • Geeignete anti-entzündlichen Mittel (Steroid- und Nicht-Steroid-Mittel) umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf Prednison, Cortison, Hydrocortison und Naproxin. Vorzugsweise ist das anti-entzündlichen Mittel ein Steroid-Mittel, wie beispielsweise Prednison. Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung dieser beigefügten Verbindungen wird abhängig von der Gesundheit des Patienten, seinem Alter, klinischem Status und anderen Faktoren sein, die dem medizinischen Fachmann offensichtlich sind.
  • Vitamin C (2 Gramm Angebot (bid)) wurde ebenfalls auf Grundlage des Berichts eingefügt, dass Vitamin C (Ascorbinsäure) bei moderaten intrazellulären Konzentrationen die Replikation von C. trachomatis stimuliert (Wang et al., J. Clin. Micro. 30: 2551–2554 (1992)), wie auch aufgrund seines potenziellen Effekts auf die Biofilm-Ladung und Infektiosität des Bakteriums und speziell des EB (Hancock, R.E.W., Annual Review in Microbiology, 38: 237–264 (1984)).
  • Außerdem kann Probenicid optional als Verstärker der Therapie zugegeben werden. Probenicid ist für die Erhöhung der Penicillin-Plasmaspiegel durch die Blockade der urikosurikären (uricosuric) und Nierenkanal-Ausscheidung dieser Medikamente bekannt.
  • Diagnose und Behandlung einer sekundären Porphyrie
  • Chlamydia ist ein Parasit einer normalen Energieproduktion in infizierten eukaryotischen Zellen. Als Resultat weisen Wirtszellen nicht genügend Energie auf, um normal zu funktionieren. Die Energieverknappung kann auch dazu führen, dass die Mitochondrien der Wirtszelle versuchen, bestimmte entscheidende Enzyme, die in der Energieproduktion vorkommen, zu synthetisieren, um die Energieproduktion zu erhöhen. Da Chlamydia auch den Abschluss dieser Synthese unterbindet, stauen sich die Vorstufen dieser Enzyme, genannt Porphyrine, in der Zelle an und entkommen oft in das intrazelluläre Milieu. Porphyrine bilden leicht freie Radikale, die wiederum Zellen schädigen. Daher gibt es eine viele Chlamydien-Infektionen begleitende gebundene sekundäre Porphyrie. Eine Therapie gegen diese sekundäre Porphyrie, die einer Anti-Chlamydien Therapie beigefügt ist, bezieht wenigstens drei Strategien ein: a) Ergänzen der zellulären Energieversorgung zur Abschwächung der Zell-Fehlfunktion und der Bildung von Porphyrinen, b) Reduzieren der Spiegel der systemischen Porphyrine und c) Abschwächen der schädlichen Effekte der Porphyrine.
  • Die Pathogenese einer chronischen/systemischen Chlamydien-Infektion ist einzigartig insofern, als dass die intrazelluläre Infektion mit diesem Parasiten in einer Anzahl von bisher unbemerkten Begleiterscheinungen und obligatorischen metabolischen/autoimmun Störungen, einschließlich sekundärer Porphyrie mit dazugehörigen Antikörpern gegen die Porphyrine, resultiert. Eine Kreuzreaktion mit Vitamin B12 kann zu einem autoimmun-vermittelten Vitamin B12 Mangel mit nur geringen klinischen Krankheitszeichen führen. Diese assoziierten Störungen benötigen oftmals eine Diagnose und eine präventive und/oder eine spezifisch zusätzliche bzw. Zusatz-Therapie.
  • Die erste dieser Begleiterscheinungsstörungen ist eine Porphyrie, die ein direktes Ergebnis der Chlamydien-Infektion der Wirtszellen ist. Diese Form der Porphyrie ist eine sekundäre, da sie nicht aus einer genetischen Fehlfunktion der in der Biosynthese von Häm beteiligten Enzyme resultiert. Auf Grundlage der Feststellung dieser zweiten Form der Porphyrie ist eine einzigartige Herangehensweise zur Diagnose und Behandlung von obligatorischen und sekundären Störungen, die durch Chlamydien-Infektionen hervorgerufen werden, entwickelt worden. Die Zusatz-Therapie, die hier beschrieben ist, kann in Kombination mit der geeigneten antimikrobiellen Therapie verwendet werden, die für die Ausrottung des Pathogens benötigt wird. Diese Zusatz-Therapie für sekundäre Porphyrie ist insbesondere wichtig für eine antimikrobielle Langzeit-Therapie von chronischen/systemischen Infektionen, da solche Therapien oft Symptome der sekundären Porphyrie hervorrufen.
  • Die folgende Diskussion behandelt die angenommenen Mechanismen, durch die Chlamydien die sekundären metabolischen Störungen induzieren. Die Bezeichnung "durch Chlamydien induzierte Porphyrie" wird hier als eine obligatorische und sekundäre metabolische Störung definiert, die das direkte Ergebnis einer Chlamydien-Infektion ist und die klinisch relevant eine phänotypische Expression aufweist, die eine intervenierende Therapie nötig macht.
  • Chlamydien sind Prokaryoten, die sich in eukaryotischen Zellen entwickeln und Teile des Metabolismus der Wirtszellen nutzen (Becker, Y., Microbiol Reviews, 42: 247–306 (1978); McClairty, G., Microbiology, 2: 157–164 (1994)). Die Transition der Elementarkörperchen (EBs) zu Retikularkörperchen (RBs) für Chlamydien-Spezies erfordert die Anwesenheit funktionierender Mitochondrien in der infizierten Zelle, sowie die Herstellung von Nukleosidtriphosphaten durch die Wirtszelle, die für die Biosynthese der Nukleinsäuren durch die Chlamydien benötigt werden (Becker, Y., Microbiol Reviews, 42: 247–306 (1978); McClairty, G., Microbiology, 2: 157–164 (1994); Ormsbee, R.A. und Weiss, E. und Kiesow, L.A., Bacteriology, 90: 243–253 (1965); Weiss, E. and Wilson, N.N:, Jour. Of Bacteriology, 97: 719 (1969); Hatch et al., Jour. of Bacteriology, 150: 662–670 (1985)). Es ist bekannt, dass Chlamydien Teile des Glykolyse-, Pentose-Phosphat- und des Zitronensäure-Weges aufweisen und dass es so aussieht, als ob sie in der Lage sind, Glucose-6-Phosphat (jedoch nicht Glucose) in Pyruvat und Pentose umzuwandeln (Ormsbee, R.A. und Weiss, E., Science, 2: 1077 (1963); Weiss, E. und Kiesow, L.A., Bacteriology Proceedings, 85 (1966)). Allerdings sieht es so aus, als ob Chlamydien keine Enzyme aufweisen, die für die netto Erzeugung von Adenosin-Triphosphat (ATP) benötigt werden (Weiss, E., Jour. of Bacteriology, 90: 243–253 (1965)). Daher ist die Chlamydienentwicklung abhängig von einer aktiven Mitochondrien- und nukleären Funktion der Wirtszelle. Aus diesem Grund werden Chlamydien als obligatorische intrazelluläre Parasiten angesehen (McClairty, G., Microbiology, 2: 157–164 (1994)). Die Abhängigkeit der Chlamydien von der Energie der Wirtszelle muss notwendiger Weise den existierenden Energie-Output der Wirtszelle auf Nettokosten der Biosynthesewege der beraubten Wirtszelle verringern.
  • Die Erfordernis einer exogenen Quelle für ATP und die Gegenwart eines spezifischen ATP Transportsystems in Chlamydiae stellten unterstützende Anzeichen für das Energie-Parasiten-Konzept bereit (Hatch et al., Jour. Of Bacteriology, 150: 662–670 (1985)). Dieses ATP Transportsystem ist ein Adenosindiphosphat (ADP) Austausch-Mechanismus (Peeling et al., Infect. And Immun., 57: 3334–3344 (1989)), ähnlich dem, der in Mitochondrien aufgefunden wurde (Penefsky, H.S. und Cross, R.L., Adv. Enzym. And Rel. Areas in Molec. Bio., 64: 173–214 (1991)). Darüber hinaus zeigten elektronenmikroskopische Untersuchungen, dass sich replizierende Chlamydien immer in unmittelbarer Nähe zu Mitochondrien aufgefunden werden. Deshalb wurde vorgeschlagen, dass sich Chlamydien in umgekehrter Art und Weise zu Mitochondrien verhalten, indem Mitochondrien ADP aus der Wirtszelle importieren und ATP exportieren, während Chlamydiae ATP importieren und ADP exportieren (Becker, Y., Microbiological Reviews, 42: 247–306 (1978)).
  • Die Produktion von ATP innerhalb der Mitochondrien wird durch einen Mechanismus angetrieben, der chemiosmotische Kopplung genannt wird (Kalckar, H.M., Annu. Review of Biochem., 60: 1–37 (1991); Lehrringer, A.L., The Mitochondrion: Molecular Basis of Structure and Function, The Benjamin Company, Incorporated, New York; Slater, E.C., Europ. Journ. of Biochem., 166: 489–504 (1987); Babcock, G.T. und Wickström, M., Nature, 356: 301–309 (1992); Senior, A.E., Physiology Review, 68: 177–231 (1988); Pedersen, P.I. und Carafoli, E., Trends in Biochem. Sci., 12: 145–150 (1987)). Der Zitronensäurezyklus treibt die Oxidation von NADH oder FADH2 an, die wiederum ein Hybridion (H–) freisetzen, das schnell in ein Proton (H+) und zwei Hoch-Energie Elektronen (2 e–) gewandelt wird. Da das Hoch-Energie Elektronenpaar auf jeden dieser drei Multiproteinkomplexe übertragen wird, laufen die produzierten Protonen ungehindert von den Mitochondrienmatrix durch Kanäle in den Komplexen I, III und IV in den Intermembranraum. Daher bewirkt der Elektronentransfer von NADH die Elektronentransportkette hinunter, dass die Protonen aus der Mitochondrien-Matrix hinaus in den Intermembranraum gepumpt werden. Diese Protonen gelangen dann durch einen spezifischen Kanal in Komplex V zurück in die Matrix. Dieser Protonengradient entlang der inneren Membran resultiert in der Protonenantriebskraft, die die ATP-Synthese betreibt.
  • Die Chlamydien-ATPase konkurriert im Wesentlichen mit der ATPase der Mitochondrien um die Protonen der Wirtszelle. Das vermindert natürlich das ATP, das durch die Mitochondrien produziert wird. Eine Nettoreduzierung von ATP in den Mitochondrien der Wirtszelle führt zu einer gleichzeitigen Verringerung des Elektronentransfers in den Mitochondrien der Wirtszelle, da der Elektronentransfer und die ATP-Synthese unmittelbar miteinander verbunden sind, wobei keine der Reaktionen ohne die andere auftritt. Die Einführung eines großen elektrochemischen Protonengradienten entlang der inneren Mitochondrienmembran stoppt normalerweise den Elektronentransport und kann sogar eine Umkehr im Elektronenfluss in einigen Bereichen der Atmungskette der Wirtszelle bewirken. Die Reduzierung des Elektronentransfers in den Mitochondrien der Wirtszelle erniedrigt wiederum die Translokation und Verringerung von außerhalb der Matrix vorkommendem Eisen(III) zu innerhalb der mitochondrialem Matrix vorkommendem Eisen(II). Dieser Energieschwund wiederum beeinträchtigt die Biosynthese von Häm.
  • A. Biosynthese von Häm
  • Häm ist ein Fe2+ Komplex, indem das Eisen (II)-Ion inmitten des organischen Liganden, Tetrapyrrol Makroring, gehalten wird. Die Häme-Enthaltenden Tetrapyrrol-Makroringpigmente sind als Porphyrinogene bekannt und spielen eine wichtige Rolle in der zellulären Biochemie. Eine Anzahl von entscheidenden zellulären Funktionen, wie beispielsweise Elektronentransport, Reduktion von Sauerstoff und Hydroxylierung werden durch eine Familie von auf Häm basierenden Cytochromen, einschließlich Katalase, Peroxidase und Superoxid Dismutase vermittelt. Außerdem basieren die den Sauerstoff tragenden Eigenschaften von Hämoglobin und Myoglobin auf Häm. Viele zelluläre Enzyme, wie beispielsweise Cytochrom P-450 und Tryptophan Pyrolase enthalten Häm.
  • Die Biosynthese von Häm (Battersby et al., Nature, 285: 17- (1980); Batterspy, A.R., Proceedings of the Royal Society of London, 225: 1–26 (1985)) ist ein energieabhängiges Verfahren, das durch den Verlust von Wirtszellenergie nachteilig beeinflusst wird. Die metabolische Konsequenz der Unterbrechung der Häm-Biosynthese ist Porphyrie (Ellefson, R.D., Mayo Clinic Proceedings, 57: 454–458 (1982); Hindmarsh, J.T., Clin. Chem., 32: 1255–1263 (1986); Meola, T. und Lim, H.W., Bullous Diseases, 11: 583–596 (1993); Moore, M.R., Int'l. Journ. of Biochem., 10: 1353–1368 (1993)). Die Häm-Synthese ist eine Reihe von nicht umkehrbaren biochemischen Reaktionen, von denen einige in den Mitochondrien der Zelle stattfinden und andere in dem Zytoplasma. Die intra-mitochondrialen Reaktionen sind hauptsächlich Oxidation-Reduktion, während die im Zytosol ablaufenden Kondensation und Decarboxylierung sind.
  • Porphyrinogene, Porphyrine und Porphyrie betreffen alle die Häm-Synthese. Die Biosynthese von Häm findet in allen menschlichen Zellen statt und beinhaltet eine relativ geringe Menge von Ausgangsmaterialien, die kondensiert werden, um Porphyrinogene zu bilden, wobei die Porphyrine durch nicht-enzymatische Oxidation aus den Porphyrinogenen gebildet werden. Beim Durchlaufen der Porphyrinogene durch den Häm-Biosynthese-Weg nimmt die Anzahl der Carboxyl-Seitengruppen des entsprechenden Porphyrins ab, so wie die Wasserlöslichkeit der Zusammensetzung.
  • Die Porphyrien sind Folgen jeglicher Schwächung in der Bildung von Porphyrinogenen oder in deren Umwandlung zu Häm. Porphyrine werden aus Porphyrinogenen durch nicht-enzymatische Oxidation gebildet. Jede der verschiedenen genetischen Porphyrien steht mit einem Enzymausfall in dem Häm-Biosyntheseweg in Zusammenhang. Als Folge des Enzymdefekts gibt es eine erhöhte Aktivität des initialen und des Geschwindigkeits-Beistimmenden Enzyms dieses Biosynthesewegs, was zu einer Überproduktion und erhöhten Ausschüttung von Porphyrinogen-Vorstufen und Porphyrinogenen führt. Die Schritte der Häm-Biosynthese sind in Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle 7: Vereinfachte Darstellung von Enzymen und Vorstufen in dem Häm-Biosyntheseweg
    Enzym Anderer Vorstufe Inhibitor Ergebnisb
    Glycin und Succinyl Coenzym A
    D-ALA Synthase Pyridoxal 5'-Phosphat Häm Delta-Aminolävulinsäure (D-ALA)
    D-ALA Dehydratase* Blei und Häm Porphobilinogen (PBG)
    PBG Deaminase* Tetrapyrrol Hydroxymethylbilan
    Uroporphyrinogen-III Cosynthase* Uroporphyrinogen-IIIa
    Uroporphyrinogen Decarboxylase* 7,6,5-Carboxyl Porphyrinogen-III
    Coproporphyrinogen Oxidase Coproporphyrinogen-III
    Protoporphyrinogen Oxidase Protoporphyrinogen
    Protoporphyrinogen Oxidase Protoporphyrin
    Ferrochelatase Eisen (II) Häm
    • a In Abwesenheit dieses Schritts wird das symmetrische Uroporphyrinogen-I gebildet
    • b Wird Vorstufe des nächsten Schritts
    • * Anwesend in zirkulierenden roten Zellen
  • Reichern sich Porphyrinogene aufgrund von enzymatischen Defekten in dem Häm-Biosyntheseweg an, dann werden sie zu photosensibilisierenden Porphyrinen oxidiert. Porphyrine werden als photodynamische Mittel klassifiziert, da sie im Allgemeinen Superoxide/Sauerstoffe/Elektronen benötigen, um ihre schädigenden biologischen Wirkungen auszuführen. Porphyrine können von nicht-angeregten nach der Absorption von Strahlung zu angeregten Molekülen gewandelt werden. Angeregte Porphyrine übertragen Energie auf Sauerstoff-Moleküle und erzeugen reaktive Sauerstoffspezies, wie beispielsweise Singulettsauerstoff, Superoxid-Anion, Superoxid-Radikal, Hydroxyl-Radikal und Wasserstoffperoxid.
  • Reaktive Sauerstoffspezies wurden beim Zerbrechen von Membranlipiden, Cytochrom P-450 und DNA-Strukturen beobachtet. Wenn diese reaktiven Sauerstoffspezies in den extrazellulären Raum entlassen werden, was bei der akuten Porphyrie beobachtet wurde, dann kann das zur Autooxidation des umgebenden Gewebes führen. Daher stellt die Anreicherung von Porphyrinogenen/Porphyrinen im menschlichen Gewebe und Körperflüssigkeiten einen Zustand der chronischen Systemüberladung von oxidativem Stress mit Langzeit-Wirkungen her, die insbesondere für neurales, hepatisches und renales Gewebe beobachtet werden.
  • B. Chlamydien und sekundäre Porphyrie
  • Wie bereits erwähnt ist die Translokation von Eisen (II)/Eisen (III) ein entscheidender Schritt bei der Biosynthese von Häm, da sie den oxidativen Eintritt von Coproporphyrinogen in die Mitochondrienmatrix als Protoporphyrinogen katalysiert, wobei Chlamydien durch die Verringerung des Elektronentransfers in der Wirtszelle diesen Schritt behindert. Wenn Coproporphyrinogen nicht in der Lage ist, in die mitochondriale Matrix zurückzukehren, reichert es sich zuerst im Zytosol an und dann in dem extrazellulären Milieu. In der Mitochondrien-Matrix kommen die letzten Schritte in der Biosynthese vom Häm zum Stillstand. Da die Anreicherung von Häm in der mitochondrialen Matrix gewöhnlich eine negative Rückmeldung auf die Häm-Biosynthese ausübt, führt die Verringerung von Häm, die durch die Unfähigkeit des Coproporphyrinogen in die mitochondriale Matrix zurückzukehren, hervorgerufen wird, zu einer erhöhten Produktion von Häm-Vorstufen, wie beispielsweise Δ-ALA und PBG, den ersten und zweiten Produkten in der Häm-Biosynthese. Daher beginnen Porphyrin-Vorstufen, wie beispielsweise, Δ-ALA und PBG, sich in der mitochondrialen Matrix, dann im Zytosol und dann in dem extrazellulären Milieu anzureichern.
  • Die Auszehrung der Wirtszellenenergie durch die intrazelluläre Infektion mit Chlamydien-Spezies führt zu zusätzlichen energiebezogenen Komplikationen. Wenn weniger Elektronen zur Verfügung stehen, um durch die Elektronentransportkette der mitochondrialen Matrixmembran der Wirtszelle zu wandern, produziert der Zitronensäurezyklus mehr Succinyl-CoA, das wiederum eine erhöhte Synthese von Δ-ALA fördert. Das Nettoergebnis ist eine höhere Menge von Häm-Vorstufen, die zu Porphyrinen werden. Die Anwesenheit von Porphyrinen in der mitochondrialen Matrix schädigt die Zelle, da diese Moleküle instabil sind und freie Radikale bilden. Die Hoch-Energie-Elektronen, die durch diese freien Radikale erzeugt werden, werden durch Ubiquinon und Cytochrom c "eingefangen", die in der mitochondrialen Matrixmembran vorkommen. Dies entkoppelt natürlich effektiv den Elektronentransport von der ATP-Synthese und "schließt" die Protonen antreibende Kraft "kurz": die ATP-Synthese wird dann reduziert. Weniger ATP wiederum bedeutet erhöhte Porphyrine und ein zerstörerischer Zyklus beginnt.
  • Die klinische Folge der intrazellulären und extrazellulären Anreicherung von Porphyrinen, wenn sie ausgedehnt ist, ist eine Gewebe/Organ-spezifische Porphyrie, die viele der klassischen Erscheinungsformen der erblichen Porphyrie erzeugt. Während die mit Chlamydien infizierte Wirtszelle lysiert, wie es im normalen Lebenszyklus von Chlamydien geschieht, werden die intrazellulären Porphyrine freigesetzt und führen zu einer sekundären Porphyrie. Außerdem wird, wenn die Chlamydien-Infektion Leberzellen einschließt, die Verwendung von jeglichen pharmakologischen Mitteln, die in der Leber durch Cytochrom P-450 verstoffwechselt werden, der Bedarf an Cytochrom P-450 erhöht, das ein auf Häm basierendes Enzym ist. Deshalb wird die Biosynthese von Häm in der Leber erhöht. Wenn Leberzellen mit Chlamydien-Spezies infiziert sind, gestattet die erniedrigte Energie in der Wirtszelle der Häm-Synthese nicht zum Abschluss zu gelangen, wobei Porphyrine in dem Leber/entero-hepatischen Kreislauf erhöht sind. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass jegliche mit einer Chlamydien-Spezies infizierte Wirtszelle eine erhöhte Menge an intrazellulären Porphyrinen aufweist, die freigesetzt werden, wenn antimikrobielle Mittel den Mikroorganismus töten.
  • Obwohl eine Anzahl an Forschern über rätselhafte Porphyrien in Patienten berichtet hat, die kein Anzeichen für abnormale Enzyme in dem Häm-Biosyntheseweg aufwiesen (Yeung Laiwah et al., Lancet, i: 790–792 (1983); Mustajoki, P. und Tenhunen, R., Europ. Journ. of Clin. Invest., 15: 281–284 (1985)), wurde die intrinsische sekundäre, obligatorische Porphyrie, die durch eine Chlamydien-Infektion, die hier offenbart ist, hervorgerufen wurde, weder in der Medizinliteratur beschrieben, noch wurde darüber eine Hypothese aufgestellt. Diese obligatorische sekundäre Porphyrie ist beim Umgang mit chronisch systemischen Chlamydien-Infektionen, wie sie mit intravaskulären Infektionen gesehen wird, die durch Chlamydia pneumoniae hervorgerufen werden, eindeutig von herausragender Wichtigkeit.
  • Die Diagnose der mit Chlamydien assoziierten sekundären Porphyrie ist wegen den wohl bekannten neuropsychiatrischen Erscheinungsformen wichtig (Gibson et al., Journal of Pathology and Bacteriology, 71: 495–509 (1956); Bonkowsky et al., Seminars in Liver Diseases, 2: 108–124 (1982); Brennan et al., International Journal of Biochemistry, 833–835 (1980); Burgoyne et al., Psychotherapy and Psychosomatics, 64: 121–131 (1995)). Außerdem wurde eine chronische Exposition mit überschüssigen Porphyrinen mit Krebs in Verbindung gebracht (Kordac, V., Neoplasma, 19: 135–139 (1972); Lithner et al., Acta Medica Scandanavia, 215: 271–274 (1984)). Von besonderem Interesse ist, dass Infektionen mit Chlamydia pneumoniae mit Lungenkrebs in Verbindung gebracht wurden (Cerutti P.A., Science, 227: 375–381 (1985)).
  • Die Diagnose von genetischer Porphyrie in Patienten mit systemischen Chlamydien-Infektionen ist wichtig, da diese Patienten ein schwerer porphyrischen bzw. Porphyr Anfall niederschlagen kann, wenn sie antimikrobielle Mittel zur Behandlung ihrer Infektion erhalten. Um die schwere Porphyrie zu steuern, benötigen die Patienten deshalb zusätzlich zu der oralen Verabreichung von anti-porphyrischen Mitteln die intravenöse Verabreichung von Hämatin und/oder Plasmapherese. Im Gegensatz dazu kann die Diagnose der mit Chlamydien assoziierten sekundären Porphyrie schwierig sein, da die Porphyrie minimal und Gewebespezifisch sein kann. Die Messung von 24-Stunden Urin-Porphyrinen ist nicht in jedem Fall sensibel genug, um die sekundäre Porphyrie, die durch eine Chlamydien-Infektion hervorgerufen wurde, zu erfassen.
  • Angesichts der vorausgegangenen Diskussion über die Ätiologie der Porphyrie betrifft ein Aspekt der Erfindung Verfahren zur Unterscheidung von Porphyrien, die durch Chlamydien hervorgerufen werden, von denen, die durch eine latente genetische Störung in einem Individuum hervorgerufen werden. Das Verfahren umfasst, Behandlung der Chlamydien-Infektion in allen Stadien ihres Lebenszyklus unter Verwendung der an anderer Stelle in dieser Offenbarung ausführlich beschriebenen Therapien und dann Beurteilen, ob die Symptome der Porphyrie reduziert wurden. Eine Reduzierung in den Symptomen der Porphyrie (beispielsweise biochemische, enzymatische oder körperliche Erscheinungsformen) deutet darauf hin, dass die Porphyrie eine sekundäre Porphyrie ist, die durch Chlamydien hervorgerufen wurde.
  • Die Diagnose der genetischen Porphyrie wird ganz einfach während eines akuten porphyrischen Anfalls getätigt, da dann Porphyrinogen-Vorstufen und Porphyrine im Blut, Urin und Stuhl vorhanden sind (Kaupeinen et al., British Journal of Cancer, 57: 117–120 (1988)). Die Diagnose der sekundären Porphyrie ist nicht so einfach durchzuführen, da eine abnormale Menge an Porphyrinogen-Vorstufen und Porphyrinen im Blut, Urin oder Stuhl nicht zwangsläufig vorhanden sein muss. Allerdings können verschiedene Enzyme, die früh im Häm-Biosyntheseweg vorkommen, leicht in peripheren roten Blutkörperchen erfasst werden (Percy et al., South African Forensic Medicine Journal, 52: 219–222 (1977); Welland et al., Metabolism, 13: 232–250 (1964); McColl et al., Journal of Medical Genetics, 19: 271–276 (1982)). Spezifische erbliche Porphyrien, die durch die Erfassung von niedrigen Spiegeln von peripheren roten Blutzell-Enzymen diagnostiziert werden können, sind akute unterbrochene Porphyrie, angeborene erythropoetische Porphyrie, Porphyrie durch Δ-Aminolävulinsäure Dehydratasemangel und Porphyrie cutanea tarda. Daher deuten erhöhte Porphyrinspiegel in Patienten, die keine niedrigen Spiegel dieser Enzyme aufweisen, auf eine nicht-genetische Porphyrie hin, wie beispielsweise eine durch Chlamydien induzierte sekundäre Porphyrie. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform eine Porphyrie, die durch Chlamydien in einem Individuum hervorgerufen wird, das damit verbundene Symptome aufweist, durch die Bestimmung der Anwesenheit und/oder der Menge von obligatorischen Enzymen in der Häm-Biosynthese in roten Blutkörperchen des Individuums diagnostiziert werden. Die Anwesenheit oder Menge des obligatorischen Enzyms wird mit einem normalen Patienten verglichen, der keine Porphyrie hat oder mit einem früheren Testergebnis des Patienten, um die Porphyrie-Symptome des Patienten zu bestimmen und/oder ob die Therapie wirksam ist. Zum Beispiel ist die Anwesenheit von ALA Synthase und/oder PBF Deaminase oder eines der anderen bekannten Enzyme, die in der Häm-Biosynthese vorkommen (siehe Tabelle 7), in abnormalen Spiegeln (d.h. signifikante Abweichung von normalen Spiegel in gesunden Patienten, die keine genetische Porphyrie haben) indikativ für sekundäre Porphyrie.
  • Die Diagnose der mit Chlamydien assoziierten sekundären Porphyrie kann schwierig sein, da die Porphyrie minimal und Gewebe-spezifisch sein kann. Die Erfassung von 24-Stunden Urin- oder Stuhl-Porphyrinen kann in vielen Fällen zur Erfassung der sekundären Porphyrie von Chlamydien-Infektionen nicht sensibel genug sein. Hier hängt die Diagnose von der Tatsache ab, dass die Vorstufen der roten Blutkörperchen die überschüssigen Porphyrine absorbieren und Häm herstellen, wenn die überschüssigen Porphyrine den Kreislauf erreichen. Deshalb erhöhen sich die Enzyme für die Häm-Biosynthese in den differenzierten roten Blutkörperchen und bleiben für die Lebensdauer des roten Blutkörperchens erhöht. Dies ermöglicht die Diagnose einer episodischen Niedrig-Spiegel sekundären Porphyrie, wie sie bei der Chlamydien-Infektion gesehen wird. Daher können die erhöhten Häm-Synthese-Spiegel zur Diagnose der intrazellulären Porphyrie verwendet werden. Siehe Beispiel 7.
  • Wie vorstehend beschrieben, weisen einige Patienten mit einer durch Chlamydien induzierten Porphyrie keine abnormalen Spiegel von Häm-Vorstufen auf. Bei diesen Patienten kann es angebracht sein, die Anwesenheit von Chlamydien, sowie von Porphyrinen in dem Individuum zu bestimmen. Die Anwesenheit von sowohl dem Pathogen, als auch von dem Porphyrin (beispielsweise durch den ELISA-Test bestimmt, der später beschrieben wird) ist eher indikativ für eine sekundäre Chlamydien-Porphyrie, als für eine genetisch-basierende Porphyrie. Eine geeignete Diagnose kann daher das therapeutische Regime bestimmen, das zur Behandlung der Infektion und der Symptome der sekundären Porphyrie benötigt wird.
  • Die Erfinder haben die Vorkommen von Antikörpern zu den verschiedenen Metaboliten der Häm-Biosynthese, sowie zu Vitamin B12 (Cobalamin), das diesen Metaboliten molekular ähnlich ist, in Patienten mit einer aktiven systemische Infektion mit C. pneumoniae funden. Die Antikörper sind primär IgM, das ähnlich zu den Antikörperantworten auf das MOMP von C. pneumoniae in schwer symptomatischen Patienten ist. Beispiel 8 zeigt Titer in symptomatischen Patienten mit systemischen C. pneumoniae Infektionen. Die Anwesenheit von Antikörpern gegen Vitamin B12 kann durch die Reduzierung der Menge an biologisch verfügbarem Vitamin B12 funktionell wichtig sein. Deshalb kann eine Chlamydien-Infektion einen zuvor unbemerkten sekundären Vitamin B12-Mangel hervorrufen. Die Verabreichung (z.B. intramuskulär) von großen Mengen Vitamin B12 (1000 bis 5000 μg) (z.B. parenterale Cobalamin-Therapie) erzeugt große Mengen an Vitamin B12, das für die Bindung an die nativen Rezeptoren der Antikörper mit einer Affinität für Vitamin B12 verfügbar ist, wobei dadurch diese anti-Vitamin B12 Antikörper absättigt und die Menge des biologisch verfügbaren zirkulierenden Vitamin B12 erhöht werden.
  • Die zuvor unbekannte Tatsache, dass der Körper Antikörper gegen Porphyrine herstellt, ermöglicht die Bestimmung der Anwesenheit von Porphyrinen in einem Patienten oder Tier durch die Bestimmung der Anwesenheit von anti-Porphyrin Antikörpern. Die Erfinder haben ein Verfahren entwickelt, wobei IgM und IgG Antikörper gegen Porphyrine mit einem ELISA-Verfahren erfasst werden können. Es wurde gezeigt, dass dieses ein viel exakteres Verfahren zur Bestimmung der chronischen Anwesenheit von Porphyrinen ist.
  • Porphyrine können auch zur Erzeugung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern unter Verwendung von Standardverfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Antikörper können in einer Vielzahl von diagnostischen Tests und in anti-Porphyrin Therapie-Strategien verwendet werden.
  • Die Behandlung der Chlamydien-Infektion kann die sekundäre Porphyrie durch Erhöhung des Metabolismus der kryptischen Chlamydien oder durch Beschleunigung des Todes der infizierten Zellen mit erhöhten Spiegeln von intrazellulärem Porphyrin erschweren.
  • Sobald eine sekundäre Porphyrie diagnostiziert wurde, können die Chlamydien-Infektion und die mit Porphyrie assoziierten Symptome behandelt werden. Das folgende therapeutische Regimen zielt auf die Steuerung der mit Chlamydien assoziierten sekundären/obligatorischen Porphyrie, deren Symptome während einer antimikrobiellen Therapie der Chlamydien-Infektion tatsächlich zunehmen können. Diese porphyrische Reaktion auf die antimikrobielle Therapie sollte als solche erkannt und von der erwarteten durch Zytokin vermittelten Immunantwort unterschieden werden, die durch Antigenablagerung während der anti-Chlamydien Therapie verursacht wird. Diese obligatorischen und sekundären metabolischen Störungen durch Chlamydien werden durch spezifische Diäten und eine Kombination aus pharmakologischen Mitteln behandelt, von denen jedes auf einen anderen Aspekt der metabolischen Störung ausgerichtet ist. Beispielsweise kann eine durch Chlamydien induzierte Porphyrie mit einer spezifischen anti-porphyrischen bzw. Anti-Porphyr Diät und einer Kombination aus anti-porphyrischen Mitteln behandelt werden, von denen jedes auf unterschiedliche Aspekte der Porphyrine/Porphyrie ausgerichtet ist. Dem Zweck dieser Erfindung dienend soll die Bezeichnung "anti-porphyrische(s) Mittel" jede dieser hier beschriebenen Therapien zur Handhabung der Porphyrie einbeziehen. Zusätzlich zu der anti-porphyrischen Diät und den anti-porphyrischen Mitteln kann der Patient die intravenöse Gabe von Glucose und Hämatin, renaler Dialyse und/oder Plasmapherese benötigen, insbesondere solche Patienten, die sowohl eine genetische Porphyrie, wie auch eine sekundäre Porphyrie aufweisen, die durch eine Chlamydien-Infektion induziert ist. Geeignete Diäten und anti-porphyrische Mittel werden im Folgenden beschrieben.
  • C: Therapien zur Verbesserung der zellulären Funktion
  • Glucose ist eine wichtige zelluläre Energiequelle. Glucose-Spiegel können, wie im Folgenden beschrieben, durch Diät und durch Vitaminergänzungsmittel verbessert werden.
  • Eine Diät mit vielen Kohlehydraten sollte zur Glucoseproduktion beibehalten werden (Pierach et al., Journal of the American Medical Association, 257: 60–61 (1987)). Schätzungsweise 70 % der kalorischen Aufnahme sollte in Form von komplexen Kohlenhydraten, wie beispielsweise Brot, Kartoffeln, Reis und Nudeln bestehen. Die übrigen 30 % der täglichen Diät sollten Protein und Fett umfassen, die idealerweise in Form von Fisch oder Hühnchen aufgenommen werden sollten. Rotes Fleisch, beinhaltend Rindfleisch, dunkler Truthahn, Thunfisch und Lachs enthalten Tryptophan. Erhöhte Tryptophan-Spiegel in der Leber inhibieren die Aktivität der Phosphoenol Pyruvat Carboxykinase mit daraus folgender Unterbrechung der Gluconeogenese. Dies erklärt die abnormale Glucosetoleranz, wie sie bei Porphyrie beobachtet werden kann. Erhöhte Plasmakonzentrationen von Tryptophan verstärken auch den Tryptophantransport in das Gehirn. Die Konzentration von Tryptophan im Gehirn ist der begrenzende Faktor für die Rate der Synthese des Neurotransmitters 5-Hydroxytryptamin (5-HAT, Serotonin). Serotonin wird durch das Endothel von Hirnkapillaren für zirkulierendes Tryptophan synthetisiert. Deshalb würde erwartet werden, dass erhöhte Konzentrationen von Tryptophan im Gehirn die Herstellung von Serotonin und seines Metaboliten 5-Hydroxyindolessigsäure (5HIAA) verstärkt. Akuten Erhöhungen in der Serotoninumwandlung im Hirn folgen vaskuläre und metabolische Änderungen, die Abnahmen bei der Glucosekonsum, Störungen in EEG-Verfolgungen und Abnahmen in der post-ischämischen neurologischen Punktbewertung beinhalten. Während Serotonin die Hirnperfusion bei einer einzelnen Injektion erhöht, öffnet die wiederholte Verabreichung zusätzlich zunächst die Blut-Hirn-Schranke und induziert anschließend die Vasokonstriktion. Es ist wahrscheinlich, dass jegliche flüchtige Öffnung der Blut-Hirn-Schranke durch Serotonin es zirkulierenden Substraten ermöglicht, wie beispielsweise ALA und PBG, falls anwesend, in das zentrale Nervensystem einzudringen. Wie es von dem Standort der Serotoninrezeptoren und der Schrankenfunktion des Endothels der cerebralen Arterien zu erwarten gewesen wäre, wird die verengende Wirkung des Serotonin in den cerebralen Arterien verstärkt, in denen das Endothel beschädigt oder entfernt ist. Geschädigte Endothelzellen, wie sie bei einer Chlamydien-Infektion zu erwarten sind, könnten nicht länger funktionsfähige katabolische Verfahren für Serotonin aufweisen. Dies würde insbesondere in dem Fall des erschöpften ATPs zutreffen, wie es durch eine Chlamydien-Infektion hervorgerufen wird. Das bedeutet, dass erhöhte Konzentrationen von Serotonin die glatte Muskulaturschicht der cerebralen Gefäße erreichen und noch mehr Verengung bewirken werden. Letztendlich wird Serotonin auch in Bluttplättchen gelagert. Da Blutplättchen unter normalen Umständen nicht anheften und aggregieren, entlassen sie kein Serotonin, wenn das Gefäßlumen intakt ist. Allerdings können eine Bluttplättchenablagerung und ein Freisetzen von Serotonin auftreten, wenn das Lumen durch eine Chlamydien-Infektion verändert wird.
  • Ein weiterer ungünstiger Effekt eines erhöhten Serotonin-Spiegels aufgrund einer Porphyrie kann im Nervengewebe gesehen werden. Enden von sympathischen Nerven lagern Serotonin ein, das sie aus dem Kreislauf aufnehmen. Diese serotoninergen Neuronen bilden Plexen um Hirngefäße, wo sie sehr wahrscheinlich ihre Serotonininhalte freisetzen, wenn sie einer zellulären Lyse aus einem der Gründe einschließlich Ischämie, Beschädigungen der Zellmembran durch Ionisierung durch freie Radikale und/oder Chlamydien-Infektion ausgesetzt werden.
  • In Ratten wurde gezeigt, dass erhöhtes zirkulierendes Tryptophan sowohl strukturelle Veränderungen von Hirnastrozyten, Oligodendroglia und Neuronen produziert, als auch Degenerierung von Purkinje-Zellen und Verschleiß von Axonen. Ähnliche neurohistologische Veränderungen wurden über Patienten mit akuter Porphyrie berichtet. Erhöhte Tryptophan-Spiegel im Plasma und im Gehirn wurden mit menschlicher Enzephalopathie in Verbindung gebracht. Letztendlich wird Serotonin auch als ein aktiver Neurotransmitter in dem Gastrointestinaltrakt angesehen. Die pharmakologischen Effekte von Serotonin in dem zentralen Nervensystem und im Gastrointestinaltrakt gleichen den neurologischen Erscheinungsformen von akuten porphyrischen Anfällen. Es wurde tatsächlich darüber berichtet, dass die Verabreichung von entweder Tryptophan oder Serotonin an Menschen zu schweren abdominalen Schmerzen, psychomotorischen Störungen, Übelkeit und Harnzwang führen kann, von denen alle Symptome der akuten Porphyrie darstellen.
  • Saccharose und Fructose sollten gemieden werden (Bottomly et al., American Journal of Clinical Pathology, 76: 133–139 (1981)), da die Aufnahme großer Fructosemengen die hepatische Gluconeogenese auslösen kann, die dann die verfügbare Glucose erniedrigt, die aus der Glycogenspaltung innerhalb der Leber herrührt. Es wird empfohlen, dass Sportgetränke, die Glucose enthalten, konsumiert werden sollen.
  • Es wird empfohlen, dass ein Patient, der an Porphyrie leidet, keine Milchprodukte zu sich nehmen soll. Milchprodukte enthalten Laktose und Lactoferrin und es wurde empirisch gezeigt, dass sie die Symptome der Porphyrie verschlimmern.
  • Multivitamine, die die B-Komplex Vitamine enthalten, sollten zur Erhöhung der Glucoseverfügbarkeit täglich verabreicht werden (beispielsweise einmal oder öfter), vorzugsweise in Überschuss der RDA. Die Spaltung von Glycogen in der Leber mit einer Erzeugung von Glucose wird durch die Aufnahme dieser Multivitamine, die die B-Komplex Vitamine enthalten, unterstützt. Pyridoxin minimiert die auf Porphyrin bezogene porphyrale Neuropathie. B-Komplex Vitamine beinhalten Folsäure (beispielsweise 400 μg pro Dosis, 1200 μg tägliches Maximum), Vitamin B-1 (Thiamin, beispielsweise 10 mg pro Dosis, 30 mg tägliches Maximum), B-2 (Riboflavin, beispielsweise 10 mg pro Dosis, 30 mg tägliches Maximum), B-5 (Pantothensäure, beispielsweise 100 mg pro Dosis, 300 mg tägliches Maximum), B-6 (Pyridoxin, beispielsweise 100 mg pro Dosis; 300 mg tägliches Maximum) oder Pyridoxal-5-Phosphat (beispielsweise 25 mg pro Dosis, 100 mg tägliches Maximum) und B-12 (beispielsweise 500 μg pro Dosis, 10.000 μg tägliches Maximum). Das bevorzugte Verfahren der Verabreichung ist für die meisten dieser Vitamine (zweimal täglich) oral, außer für B-12, für das eine sublinguale Verabreichung (dreimal täglich) bevorzugt wird. Es wurde festgestellt, dass ein wichtiger Effekt dieser sekundären Porphyrie in einigen Patienten in der Herstellung von IgM und IgG Antikörpern gegen Coproporphyrinogen-III besteht. Diese Antikörper kreuzreagieren mit Vitamin B12 (Cobalamin) und können deshalb einen Mangel hervorrufen. Eine Vitamin B12-Ergänzung (beispielsweise parenterale Cobalamin-Therapie) kann den Mangel bekämpfen.
  • D. Verringern der Porphyrinspiegel
  • Diätische und pharmazeutische Verfahren können zur Verringerung der systemischen Porphyrinspiegel (sowohl wasserlösliche, als auch fettlösliche) verwendet werden.
  • Viele orale Fluide bzw. Flüssigkeiten in Form von bikarboniertem Wasser oder "Sportgetränken" (d.h. Wasser mit Glucose und Salzen) sollten in das Regimen einbezogen werden. Das spült wasserlösliche Porphyrine aus dem System des Patienten. Das Trinken von Selterswasser ist der einfachste Weg dieses Ziel zu erreichen. Die Farbe des Urins sollte immer fast klar sein, anstelle von gelb. Es ist bekannt, dass Dehydrierung Porphyrine konzentriert und Patienten symptomatischer macht.
  • Aktivkohle kann täglich in einer Menge verabreicht werden, die zur Absorption von fettlöslichen Porphyrinen aus dem entern-hepatischen Kreislauf ausreichend ist. Die orale Behandlung mit Aktivkohle, die nicht-absorbierend ist und Porphyrine in dem Gastrointestinaltrakt bindet und deshalb deren entern-hepatischen Kreislauf unterbricht, wurde mit einer Verringerung von Porphyrinspiegeln von Plasma und Haut in Verbindung gebracht. Kohle sollte zwischen zwei Mahlzeiten und ohne jegliches andere orale Medikament eingenommen werden, wobei andernfalls die Kohle anstelle der Porphyrine eher die Nahrung oder das Medikament absorbieren wird. Die Personen, die Schwierigkeiten haben, die Kohle aufgrund anderer über den Tag genommener Medikamente zu nehmen, können die gesamte Kohle auf einmal vor dem Zubettgehen einnehmen. Die Einnahme zwischen 2 und 20 Gramm, vorzugsweise wenigstens 6 Gramm (24 × 250 mg Kapseln) Aktivkohle pro Tag wird empfohlen (Perlroth et al., Metabolism, 17: 571–581 (1968)). Viel mehr Kohle kann ohne Bedenken eingenommen werden, bis zu 20 Gramm sechsmal täglich über neun Monate wurden schon aufgenommen, ohne dass Nebenwirkungen auftraten.
  • Bei schwerer Porphyrie können chelatbildende und andere Mittel zur Verringerung bzw. Reduzierung von Porphyrinspiegeln im Blut verabreicht werden, einzeln oder in Kombination. Beispiele von chelatbildenden Mitteln beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Kemet (Succimer, von ungefähr 10 mg/kg bis ungefähr 30 mg/kg), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), BAL (Dimercaprol, beispielsweise 5 mg/kg maximal tolerierbare Dosis alle vier Stunden), Edetatcalciumdinatrium (beispielsweise von ungefähr 1000 mg/m2 bis ungefähr 5000 mg/m2 pro Tag, kann in Kombination mit BAL verwendet werden), Deferoxaminmesylat (beispielsweise von ungefähr 500 mg bis ungefähr 6000 pro Tag), Trientinhydrochlorid (beispielsweise von ungefähr 500 mg bis ungefähr 3 g pro Tag), Panhematin bzw. Panhämatin (beispielsweise von ungefähr 1 mg/kg bis ungefähr 6 mg/kg pro Tag), Penicillamin. Intravenöses Hämatin kann ebenfalls verabreicht werden. Chinin-Derivate, wie beispielsweise jedoch nicht begrenzt auf Hydroxychloroquin, Chloroquin und Quinacrin sollten dem Patienten täglich in einer Dosis von ungefähr 100 mg bis ungefähr 400 mg pro Tag verabreicht werden, vorzugsweise ungefähr 200 mg ein- oder zweimal täglich mit einer maximal täglichen Dosis von 1 g. Hydroxychloroquin ist am meisten bevorzugt. Es wird angenommen, dass der Wirkungsmechanismus von Hydroxychloroquin die Bildung eines wasserlöslichen Medikament-Porphyrin-Komplexes einschließt, der aus der Leber entfernt und in den Urin ausgeschieden wird (Tschudy et al., Metabolism, 13: 396–406 (1964); Primstone et al., The New England Journal of Medicine, 316: 390–393 (1987)).
  • Zur Reduzierung von porphyrischen Anfällen während der Therapie gegen chronische Chlamydien-Infektionen kann die Verwendung einer Blutdialyse, einer Plasmapherese, von chelatbildenden Mitteln und/oder einer intravenösen Gabe von Hämatin nötig sein. Jegliches oder eine Kombination davon kann zur Behandlung des Patienten verwendet werden und liegt im Bereich der Kenntnisse des Fachmanns, dem bekannt ist, wie diese Zusatz-Therapien durchgeführt werden müssen.
  • E. Abschwächung der Wirkungen von Porphyrinen
  • Antioxidantien in höheren Dosierungen (vorzugsweise zweimal täglich eingenommen) helfen bei der Abschwächung der Effekte, die durch freie Radikale entstehen, die von Porphyrinen hergestellt werden. Beispiele geeigneter Antioxidantien beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Vitamin C (beispielsweise 1 Gramm pro Dosis, 10 g tägliches Maximum), Vitamin E (beispielsweise 400 Einheiten pro Dosis, 3000 tägliches Maximum), L-Carnitin (beispielsweise 500 mg pro Dosis, 3 g tägliches Maximum), Coenzym Q-10 (Ubiquinon (beispielsweise 30 mg pro Dosis, 200 mg tägliches Maximum)), Biotin (beispielsweise 5 mg pro Dosis, 20 mg tägliches Maximum), Liponsäure (beispielsweise 400 mg pro Dosis, 1 g tägliches Maximum), Selen (beispielsweise 100 μg pro Dosis, 300 μg tägliches Maximum), Glutamin (beispielsweise von 2 bis ungefähr 4 g pro Dosis), Glucosamin (beispielsweise von ungefähr 750 bis ungefähr 1000 mg pro Dosis) und Chondroitinsulfat (beispielsweise von ungefähr 250 bis ungefähr 500 mg pro Dosis).
  • Die vorstehend erwähnte therapeutische Diät kann mit traditionellen oder erst vor kurzem anerkannten Medikamententherapien gegen Porphyrie kombiniert werden. In einer Ausführungsform können Benzodiazepin-Medikamente bzw. -Arzneimittel, wie beispielsweise jedoch nicht begrenzt auf Valium, Klonafin, Flurazepamhydrochlorid (beispielsweise DalmancTM, Roche) und Alprazolam (beispielsweise Xanax) verabreicht werden. Vorzugsweise können Sedativa wie beispielsweise Alprazolam (beispielsweise Xanax, 0,5 mg pro Dosis für drei- bis viermal täglich) bei Panikattacken verschreiben werden und Flurazepamhydrochlorid (beispielsweise DalmaneTM, Roche oder RestorilTM (beispielsweise 30 mg pro Dosis)) zum Schlafen. Das Verhältnis basiert auf der Anwesenheit von peripherem Benzodiazepin-Rezeptoren in großer Anzahl in phagozytischen Zellen, von denen bekannt ist, dass sie hohe Spiegel an Spezies von Sauerstoffradikalen erzeugen. Es wurde gezeigt, dass periphere Benzodiazepin-Rezeptoren eine schützende Rolle gegen Wasserstoffperoxid spielen. Das legt nahe, dass diese Rezeptoren Mitochondrien vor Schädigungen durch Radikale schützen könnten und dabei die Apoptose in dem hämatopoetischen System regulieren. Es wurde auch gezeigt, dass Benzodiazepine den intrazellulären Kreislauf von Häm und Porphyrinogenen beeinträchtigen (Scholnik et al., Journal of Investigative Dermatology, 1973, 61: 226–232). Dies wird sehr wahrscheinlich die Porphyrine und deren schädlichen Wirkungen vermindern. Das spezifische Benzodiazepin wird von den auf Porphyrin bezogenen Symptomen abhängen.
  • Cimetidin kann auch getrennt oder in Kombination mit Benzodiazepin-Arzneimitteln verabreicht werden. Es wurde gezeigt, dass Cimetidin wirksam Hydroxylradikale einfängt, obwohl es ein nicht wirksamer Radikalfänger für Superoxidanion und Wasserstoffperoxid ist. Cimetidine scheinen in der Lage zu sein, Eisen zu binden und zu deaktivieren, was weiter seine antioxidativen Fähigkeiten betont. Cimetidine sind auch ein wirksamer Radikalfänger für Hypochlorsäure und Monochloramin, die cytotoxische Oxidantien sind, die aus entzündlichen Zellen, wie beispielsweise Neutrophilen, hervorgehen. Daher wurde angenommen, dass Cimetidine für die Therapie von oxidativen Schädigungen, die durch freie Radikale vermittelt wurden, die durch eine Chlamydien-Porphyrie hervorgerufen wurden, nützlich sein kann. Neueste Studien in Japan fanden heraus, dass Cimetidin bei der Behandlung von Porphyrie wirksam ist. Die empfohlene Menge an Cimetidin liegt bei ungefähr 400 mg ein- oder zweimal pro Tag.
  • Die Komplexität des Lebenszyklus von Chlamydien, die Wirtsantwort auf die Infektion, sowie auf die Therapie, die große Häufigkeit von bedauerlichen Nebenwirkungen der antimikrobiellen Therapie, die obligatorischen metabolischen Störungen und der Wunsch nach einer anhaltenden Therapie, machen die Unterrichtung des Patienten, seine Überwachung und Unterstützung zu einem wichtigen Schlüsselfaktor in der erfolgreichen Ausrottung von chronischen/systemischen Chlamydien-Infektionen. Wenn die Anwesenheit von Chlamydien im Blut durch Kultur und/oder PCR erfasst wurde und die IgM und IgG Antikörpertiter erhöht sind, wird eine vermutliche Diagnose einer chronischen/systemischen Chlamydien-Infektion erstellt. Das Potential für sekundäre Wirkungen, wie beispielsweise Porphyrie, sollte dann überprüft werden. Zum Beispiel kann dies durch die Durchführung eines oder einer Kombination aus den folgenden Tests ermittelt werden: 1) Vollblutzählung (CBC), 2) Leberfunktionstests, 3) Harnsäure, 4) Eisenuntersuchung im Serum, 5) IgM und IgG Antikörper gegen Coproporphyrinogen-III und Vitamin B12 und 6) ALA-Dehydratase und PBG-Deaminase. Urin- und Stuhlproben sollten auch auf die Anwesenheit von Porphyrinen getestet werden, vorzugsweise sollten die 24-Stunden Proben verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des therapeutischen Regimens wird der Patient auf das anti-Porphyr Regimen gesetzt, vorzugsweise mindestens zwei Wochen bevor irgendeine Antibiotikabehandlung gestartet wird. Dem folgt der Start mit einem reduzierenden Mittel. Diese enthalten Amoxicillin (500 mg alle 12 Stunden), Penicillamin (250 mg alle 12 Stunden) und Cycloserin (250 mg alle 12 Stunden). Der Patient wird für mindestens zwei Wochen auf diesem Regimen streng überwacht, um zu Bestimmen, ob irgendwelche Nebenwirkungen auftreten. Dieses Regime wird für den gesamten Verlauf der Therapie fortgeführt und ist entscheidend, da es die EB-Belastung vermindert. Nachdem der Patient mit dem Amoxicillin oder Penicillamin eingestellt wurde, wird eine Kombination aus antimikrobiellen Mitteln dazugegeben. Der Patient wird zur Bestimmung seiner Toleranz gegenüber den antimikrobiellen Mitteln streng überwacht.
  • Vitamine, Antioxidantien und andere anti-porphyrische Mittel können in der hier beschriebenen Menge in funktionelle Lebensmittel, in medizinische Nahrungsmitteln, Diätergänzungsstoffen und diätische Ernährungsformulierungen, einschließlich Getränken und Lebensmitteln, wie beispielsweise Ernährungsriegel, eingebaut werden, um die nicht-genetische, sekundäre Porphyrie, die durch eine Chlamydien-Infektion hervorgerufen wird, zu handhaben. Alternativ kann eine Kombination aus Vitaminen und Antioxidantien zu einer Packung oder einem Kit gepackt werden, wie woanders beschrieben und/oder zu einer Zusammensetzung in Mengen dazu formuliert werden, die zur Verabreichung an ein Individuum, das eine nicht-genetische, sekundäre Porphyrie aufweist, geeignet sind.
  • Verabreichungsmodi
  • Basierend auf der Fähigkeit der Kombinationstherapie dieser Erfindung, sowohl den serologischen und den körperlichen Zustand eines Patienten zu verbessern, der einer Behandlung unterzogen wurde, können pharmazeutische Zusammensetzungen oder Präparationen hergestellt werden, die mindestens zwei unterschiedliche Mittel umfassen, die aus den folgenden Gruppen ausgewählt wurden: a) mindestens ein Mittel, das gegen die Elementarkörperchen-Phase des Lebenszyklus von Chlamydien (beispielsweise reduzierende Disulfid-Mittel) gerichtet ist, b) mindestens ein Mittel, das gegen die replizierende Phase des Lebenszyklus von Chlamydien (beispielsweise Anti-Chlamydien-Mittel) gerichtet ist und c) mindestens ein Mittel, das gegen die kryptische Phase des Lebenszyklus von Chlamydien (beispielsweise anaerobe bakterizide Mittel) gerichtet ist. Wie ausführlicher nachfolgend beschrieben, können die Mittel in einem physiologisch verträglichen Vehikel in einer Form formuliert sein, die von dem Verfahren abhängig ist, mit dem es verabreicht wird.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Kombination von Mitteln, die mindestens zwei Mittel umfassen, wobei jedes von denen gegen eine unterschiedliche Phase des Lebenszyklus von Chlamydien, wie vorstehend ausgeführt, gerichtet ist. Die Kombination von Anti-Chlamydien-Mitteln kann bei der Handhabung einer Infektion mit Chlamydien oder einer Prophylaxe davon, verwendet werden, um eine wiederholte Infektion zu verhindern. Die Kombination von Mitteln kann in der Form einer eines Zusatzmittels, als eine Packung (ausführlich nachfolgend ausgeführt) oder individuell vorliegen, und/oder aufgrund der Instruktion eine derartige Kombination herzustellen. Es sollte klar sein, dass eine Kombinationstherapie mehrere Mittel umfassen kann, die in einer bestimmten Phase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind. Die Kombination von Anti-Chlamydien-Mitteln können weiterhin immunsupprimierende Mittel, anti-entzündliche Mittel, Vitamin C und Kombinationen davon umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, falls lediglich ein in einem asymptomatischen Patienten zu verwendendes Anti-Chlamydien-Mittel ausgewählt wird, um eine chronische Infektion zu verringern/verhindern, ist dieses Mittel ein reduzierendes Mittel, wie beispielsweise Penicillamin.
  • Die neuen hier beschriebenen therapeutischen Verfahren können verwendet werden, um Zustände/Symptome zu verbessern, die mit den vorstehend beschriebenen Erkrankungszuständen assoziiert sind, wenn die Erkrankung durch eine Infektion durch Chlamydien beginnt oder verschlechtert wird. Die Mittel dieser Erfindung können Tieren einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere, einschließlich den Menschen, verabreicht werden. Verbindungen und Mittel, die hier beschrieben wurden, können einem Individuum unter Verwendung von Standardverfahren und Modi verabreicht werden, die gewöhnliche Routine bei dem Erkrankungszustand darstellen.
  • Kombination(en) von Anti-Chlamydien-Mitteln dieser Erfindung können zur Herstellung eines Medikaments zur gleichzeitigen, getrennten oder sequentiellen Verwendung bei einer Handhabung einer Infektion mit Chlamydien oder einer Prophylaxe davor verwendet werden. Die Mittel können auch für die Herstellung eines Medikaments zur Therapie einer Erkrankung verwendet werden, die mit einer Infektion von Chlamydien, beispielsweise einer Autoimmun-Erkrankung, entzündlichen Erkrankung, Immundefekt-Erkrankung, assoziiert ist.
  • Die Mittel können subkutan, intravenös, parenteral, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, topikal, enteral (beispielsweise oral), sublingual, rektal, nasal, bukkal, vaginal, durch Inhalation eines Sprays, durch eine Arzneimittelpumpe, über ein implantiertes Reservoire in Dosierungsformulierungen verabreicht werden, die herkömmliche nicht toxische, physiologisch verträgliche Träger oder Vehikel beinhalten. Das bevorzugte Verfahren einer Verabreichung besteht in einer oralen Zuführung. Die Form, in der es verabreicht wird (beispielsweise Sirup, Elixir, Kapsel, Tablette, Lösung, Schäume, Emulsion, Gel, Sol) wird teilweise von der Route abhängig sein, auf der es verabreicht wird. Beispielhaft kann eine mukosale (beispielsweise orale Mucosa, rektale, intestinale Mucosa, bronchiale Mucosa) Verabreichung über Nasentropfen, Aerosole, Inhalationsmittel, Vernebler, Augentropfen oder Zäpfchen erfolgen. Die Verbindungen und Mittel dieser Erfindung können zusammen mit anderen biologisch aktiven Mitteln verabreicht werden.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann es wünschenswert sein die Mittel der Erfindung lokal an einen behandlungsbedürftigen lokalisierten Bereich zu verabreichen, wobei dies beispielsweise erreicht werden kann und nicht beschränkt wird durch eine lokale Infusion während eines chirurgischen Eingriffs, topikales Aufbringen (beispielsweise für Haut-Zustände wie beispielsweise Psoriasis), transdermale Pflaster, durch Injektion, mittels eines Katheters, mittels eines Zäpfchens oder mittels eines Implantats, wobei das Implantat aus einem porösen, nicht-porösen oder gelatineartigen Material besteht, einschließlich Membranen, wie beispielsweise sialastischen bzw. Sialin-Membranen oder Fasern. Das Mittel kann in die Gelenke injiziert werden.
  • In einer spezifischen Ausführungsform, falls es wünschenswert ist das Arzneimittel auf das Zentralnervensystem zu richten, können Verfahren verwendet werden, die die Blut-Hirnschranke für eine Zeitdauer opportunistisch öffnen, die geeignet ist, um das Arzneimittel dadurch zuzuführen. Eine Zusammensetzung von beispielsweise 5 % Mannitose und Wasser kann verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können die Mittel durch die Plazenta einem Fötus zugeführt werden, da zahlreiche der Mittel klein genug sind, um durch die Plazentarschranke zu passen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen. Derartige Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch (oder prophylaktisch) wirksame Menge des Mittels und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Arzneiträger. Derartige Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf eine Salzlösung, eine gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerol, Ethanol und Kombinationen davon. Der Träger und die Zusammensetzung können steril sein. Die Formulierung sollte zu dem Modus der Verabreichung passen.
  • Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Wasser, Salzlösungen (beispielsweise NaCl), Alkohole, Gum-Arabicum, Pflanzenöle, Benzylalkohole, Polyethylenglycole, Gelatine, Kohlenhydrate, wie beispielsweise Laktose, Amylose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, visköses Paraffin, Parfum-Öl, Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, etc.. Die pharmazeutischen Präparationen können sterilisiert werden und falls erwünscht mit Hilfs- bzw. Zusatzstoffen, beispielsweise Schmiermitteln, Konservierungsstoffen, Stabilisatoren, Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zum Beeinflussen des osmotische Drucks, Puffer, Farbstoffen Geschmacks- und/oder Aromastoffen und dergleichen vermischt werden, die nicht schädlich mit den aktiven Verbindungen reagieren.
  • Die Zusammensetzung kann, falls erforderlich, ebenfalls geringe Mengen von Netz- oder Emulgatormitteln oder pH-Wert Puffermittel beinhalten. Die Zusammensetzung kann eine flüssige Lösung, Suspension, Emulsion, Tablette, Pille, Kapsel, eine nachhaltige Freisetzungs- bzw. Depot-Formulierung oder ein Pulver sein. Die Zusammensetzung kann als ein Zäpfchen mit gewöhnlichen Bindemitteln und Trägern, wie beispielsweise Triglyceriden, formuliert sein. Eine orale Formulierung kann Standardträger, beispielsweise Pharmakon- bzw. Arzneimittelqualität von Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Polyvinylpyrrolidon, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat, etc., umfassen.
  • Die Zusammensetzung kann gemäß der Routineverfahren als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert sein, die für eine intravenöse Verabreichung an Menschen angepasst ist. Gewöhnlich sind Zusammensetzungen für eine intravenöse Verabreichung Lösungen in einem sterilen isotonischen Puffer. Wo erforderlich, kann die Zusammensetzung ebenfalls ein Solubilisierungsmittel umfassen und ein Lokalanästhetikum, um Schmerz an der Stelle der Injektion zu lindern. Allgemein werden die Bestandteile entweder getrennt oder miteinander in einer Einheitendosierungsform vermischt, beispielsweise als trockenes gefriergetrocknetes Pulver oder wasserfreies Konzentrat, in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie beispielsweise einer Ampulle oder Sacchette, geliefert, die die Quantität eines aktiven Mittels anzeigen. Soll die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden, kann sie mit einer Infusionsflasche verabreicht werden, die steriles Wasser, eine Salzlösung oder Dextrose/Wasser einer Pharmakonqualität beinhaltet. Soll die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht werden, kann eine Ampulle sterilen Wassers zur Injektion oder Salzlösung bereitgestellt werden, so dass die Bestandteile vor der Verabreichung vermischt werden können.
  • Zur topikalen Aufbringung werden als nicht aufsprühbare Formen, visköse bis halbfeste oder feste Formen verwendet bzw. angewendet, die einen mit einer topikalen Aufbringung verträglichen Träger umfassen und wobei sie eine dynamische Viskosität aufweisen, die größer als Wasser ist. Geeignete Formulierungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremes, Salben, Pulver, Einläufe, Lotionen, Solen, Einreibemitteln, Wundsalben, Aerosole, etc., die, falls erwünscht, sterilisiert oder mit Hilfsmitteln, beispielsweise Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Netzmitteln, Puffer oder Salzen zum Beeinflussen des osmotischen Drucks, etc., vermischt werden. Das Arzneimittel kann in einer Kosmetischen Formulierung enthalten sein. Zur topikalen Aufbringung sind ebenfalls aufsprühbare Aerosolpräparationen geeignet, bei denen der aktive Bestandteil, vorzugsweise in Kombination mit einem festen oder flüssigen inerten Trägermaterial, in einer Quetsch- bzw. Pressflasche oder in Beimischung mit einem unter Druck stehenden flüchtigen gasförmigen Treibmittel, beispielsweise unter Druck stehender Luft, verpackt vorliegt.
  • Hier beschriebene Mittel können als neutrale oder Salzformen formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen solche, die mit freien Aminogruppen, wie beispielsweise jenen von Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, etc. abgeleitet sind und solchen die mit freien Carboxylgruppen, wie beispielsweise jenen, die von Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium, Eisen (III)-hydroxiden, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain, etc. abgeleitet sind.
  • Die Menge von Mitteln, die bei der Behandlung einer/s bestimmten Störung oder Zustands wirksam sein wird, ist von der Beschaffenheit der Störung oder des Zustands abhängig, und kann durch Klinische Standardverfahren bestimmt werden. Außerdem können in vitro oder in vivo Tests wahlweise verwendet werden, um unterstützend optimale Dosierungsbereiche zu identifizieren. Die in der Formulierung anzuwendende genaue Dosis, wird ebenfalls von der Route einer Verabreichung und dem Schweregrad der Erkrankung oder Störung abhängig sein, und sollte entsprechend der Entscheidung des Fachmanns bzw. praktischen Arztes und den jeweiligen Umständen des Patienten entschieden werden. Wirksame Dosierungen können von Dosis-Antwort-Kurven extrapoliert werden, die aus in vitro oder Testsystemen von Tiermodellen abgeleitet wurden.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls eine Basis für eine/n pharmazeutische/n Packung oder Kit bereit, die/der einen oder mehrere Behälter umfasst, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung gefüllt sind. Wahlweise kann mit einem/mit derartigen Behälter(n) ein Hinweis in der Form assoziiert sein, die durch eine Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln oder biologischen Mitteln reguliert, welcher Hinweis eine Zulassung für die Herstellung, die Verwendung und den Verkauf für eine Verabreichung an den Menschen durch die Behörde widerspiegelt. Die Packung oder der Kit können mit Information hinsichtlich des Modus einer Verabreichung, Reihenfolge einer Verabreichung eines Arzneimittels (beispielsweise getrennt, sequentiell oder gemeinsam), oder dergleichen gekennzeichnet sein. Die Packung oder der Kit können ebenfalls Mittel zum Erinnern des Patienten umfassen, um die Therapie einzunehmen. Die Packung oder der Kit können eine einzelne Einheitendosierung der Kombinationstherapie sein oder sie/er können mehrere Einheitendosierungen sein. Insbesondere können die Mittel getrennt, in einer beliebigen Kombination miteinander vermischt, in einer einzelnen Ampulle oder Tablette vorliegen. Mittel, die in einer Blisterpackung oder einem anderen Verabreichungsmittel angeordnet sind, sind bevorzugt. Für den Zweck dieser Erfindung ist vorgesehen, dass Einheitendosierung eine Dosierung bedeutet, die von der individuellen Pharmakodynamik eines jeden Mittels abhängig ist und in von der FDA zugelassenen Dosierungen in Standardzeitabläufen verabreicht wird.
  • Diagnostische Reagenzien
  • Die Erfindung stellt ebenfalls eine Basis für eine diagnostische/n Reagenzienpackung oder Reagenzien-Kit, die/der einen oder mehrere Behälter umfasst, die mit einem oder mehreren der Bestandteile gefüllt vorliegen, die in den hier beschriebenen Tests verwendet wurden. Wahlweise können mit einem/mit derartigen Behälter(n) ein Hinweis in der Form assoziiert sein, der durch eine Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, die die Herstellung, die Verwendung und den Verkauf diagnostischer Produkte reguliert, wobei der Hinweis eine Zulassung der Herstellung, der Verwendung und des Verkaufs für eine Verabreichung an den Menschen durch die Behörde widerspiegelt. Die Packung oder der Kit können mit einer Information hinsichtlich eines Verabreichungsmodus, Reihenfolge der Ausführung (beispielsweise getrennt, sequentiell oder gleichzeitig) oder dergleichen gekennzeichnet sein. Die Packung und der Kit können einen einzelnen Einheiten-Test sein oder sie/er können mehrere Einheiten-Tests umfassen. Insbesondere können die Mittel getrennt, in einer beliebigen Kombination miteinander vermischt sein, in einer einzelnen Ampulle oder Tablette vorhanden sein. Für die Zwecke dieser Erfindung ist vorgesehen, dass Einheiten-Tests Materialien bedeuten, die ausreichend sind, um lediglich einen einzelnen Test auszuführen.
  • Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele von diagnostischen und therapeutischen Verfahren dargestellt werden. Alle prozentualen Angaben erfolgen durch Gewicht solange nicht anderweitig spezifiziert wird.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) für das Volllängen MOMP-Gen von C. pneumoniae und anderen Spezies von Chlamydia (Diagnostisch)
  • a. Lösungs-PCR
  • Serum, Blut oder Gewebeproben wurden in der Anwesenheit von 10 μM Dithiotreitol bei Raumtemperatur für 2 Stunden vorinkubiert, um die Disulfidbindungen zu reduzieren und eine Freisetzung der Elementarkörperchen der äußeren Hülle zu fördern. CSF und andere Körper-Fluide bzw. -Flüssigkeiten sind ebenfalls zur beschriebenen Verwendung geeignet. Andere geeignete reduzierende Mittel zur Verwendung in diesem Schritt umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Succimer und Glutathion (beispielsweise einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Glutathionester, andere Analoge und Derivate). Das Versäumnis ein reduzierendes Mittel initial einzuschließen, kann, folgend auf den Schritt eines Proteaseverdaus zu einem negativen PCR-Signal führen. Geeignete Konzentrationen von diesen reduzierenden Mitteln können durch den Fachmann, ohne unangemessenes Experimentieren, unter Verwendung der 10 μM Konzentration von Dithiotreitol als eine Richtlinie einfach bestimmt werden. Alternativ kann Guanidin-Isothiocyanat für den Disulfidreduktions/Protease-Schritt ersetzt werden. Tabelle 8 zeigt die Wirkung von verschiedenen reduzierenden Mitteln auf die Empfindlichkeit von EBs gegenüber einem Verdau mit Proteinase K, um eine DNA-Extraktion für eine PCR-Amplifikation zu ermöglichen.
  • Figure 00840001
  • Es werden Serum, Blut oder Gewebeproben über Nacht bei 37°C in der Anwesenheit von SDS lysiert, das DNAsen und Proteinase K hemmt, die Protein (d.h. 2x Zelllyse-Puffer: 1% SDS, 0,2 M NaCl, 10 mM EDTA, 20 mM Tris-KCl, pH-Wert 7,5 plus Proteinase K bis zu einer Endkonzentration 20 mg/ml) verdaut. Folgend auf den Verdau wird das Lysat mit Phenol 1x extrahiert, gefolgt durch eine 2x Extraktion mit Chloroform. Die DNA wird aus der schließlich ergebenden wässrigen Phase durch die Zugabe von 1/10 Volumen Na-Acetat (3 M) und 2–2,5 Volumen kalten Ethanols präzipitiert. Die DNA wird durch Zentrifugation pelletiert und die DNA wird in 10–20 μl Wasser resuspendiert, wobei eine PCR-Amplifikation in dem gleichen Mikroröhrchen ausgeführt wird. Das gesamte Gen vom MOMP (1,2 Kb) wird unter Verwendung des CHLMOMPDB2 Primers für den kodierenden Strang (5'-ATGAAAAAAC TCTTAAAGTC GGCGTTATTA TCCGCCGC; SEQ ID NO. 41) und des CHLMOMPCB2 Primers für den komplementären Strang (5'-TTAGAATCTG AACTGACCAG ATACGTGAGC AGCTCTCTCG; SEQ ID NO. 42) amplifiziert. Alternativ können verkürzte Primer verwendet werden, indem geeignete Modifikationen in dem Primer ausgeführt werden: DNA-Hybridisierungs-Temperatur lediglich für eine PCR-Detektion. Die geeignete Primerauswahl kann jedoch zu der Abwesenheit von Signal führen, falls ein unbekannter Stamm mit Mutationen in einem oder beiden Primerbindungsregionen vorhanden ist. Die Frequenz von positiven Signalen unter Verwendung der bevorzugten Primer, die das Volllängen MOMP-Gen amplifizieren, legt nahe, dass Mutationen in diesen Regionen von C. pneumoniae selten auftreten. Die Standardbedingungen für dieses Genprodukt in einem 50 μl Volumen bestehen in 35 Zyklen mit 1 Sekunde Anlaufzeiten zwischen den Schritten von 94°C für 1 Minute, 58°C für 2 Minuten und 74°C für 3 Minuten. Bei der PCR-Reaktion wurden 0,1 mM von jedem Primer in Deep Vent-Puffer mit 200 mM von jedem dNTP und 1,0 E der Deep Vent DNA-Polymerase verwendet. Die amplifizierte DNA wird getrennt und durch eine Elektrophorese in 1,2 % Agarose- oder 6 % Polyacrylamid-Gelen identifiziert, die in dem TBE-Puffer (88 mM Tris-Borat, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA) bei 120 Volt für 1 Stunde laufen. Die DNA-Banden werden durch eine Färbung mit Ethidiumbromid und einer Detektion mit UV-Licht identifiziert. Die Produktspezifität wurde durch eine Restriktionsenzymanalyse von Spaltungs-Produkten als auch einer DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Die Negativ-Kontrollen bestehen aus einer Amplifikation von Extrakten von Lysepuffer. Es muss eine besondere Vorsicht ausgeübt werden, um alle Komponenten dieser Zelllyse und Komponenten des Amplifikationspuffers zu durchmustern, um verunreinigende MOPM-DNA auszuschließen, die gewöhnliche Verunreinigungen in derartigen Qualitäts-Chemikalien für Labore und Molekularbiologie darstellen.
  • b. In situ PCR
  • Dieses Verfahren identifiziert individuelle Zellen, die RB und kryptische Formen von C. pneumoniae beinhalten. Es werden kultivierte Zellen auf Glasobjektträgern mit Formalin adhäriert bzw. anhaftend gemacht, oder mit Formalin fixierte Gewebeschnitte, die in Paraffin eingebettet vorliegen, werden auf Glasobjektträgern adhäriert und einem Protease-Verdau (d.h. Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin oder andere spezifische Proteasen) unterzogen. Jede Verdauzeit und jeder pH-Wert (d.h. Pepsin bei einem pH-Wert 2,5 oder Trypsin bei einem pH-Wert 7–8, etc.) mit einer Standard-Konzentration einer jeden Protease müssen für jeden Gewebetyp für optimale Verdauzeiten beurteilt werden. Die Proteaseaktivität wird durch Waschen und/oder eine Änderung des pH-Werts gestoppt und die Zielzellen werden einer Taq-Polymerase, dNTPs und Primern ausgesetzt. Für das MOMP-Gen wurden die Primer CHLMOMPDB2 und CHLMOMPCB2 mit einem Biotin an dem 5'-Terminus entwickelt. Für eine in situ PCR, die Markierungen mit Biotin verwendet, die an dem 5'-Terminus der Amplifikationsprimer eingebaut sind, führt jede DNA-Kettenamplifikation in jeder Doppelstrang-DNA dazu, dass sie 2 Moleküle Biotin beinhaltet. Die Standardbedingungen einer Amplifikation sind identisch zu der vorstehend beschriebenen Lösungs-PCR. Nach dem Ende der PCR-Zyklen werden die Objektträger gewaschen und einer Streptavidin-β-Galactosidase (oder einem anderen mit Streptavidin konjugierten Signalenzym) ausgesetzt. Eine Sichtbarmachung des amplifizierten MOMP-Gens wird dadurch erreicht, dass gebundenes Enzym lösliches Substrat hydrolysiert, was ein unlösliches Produkt ergibt, das anschließend durch standardisierte Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden kann.
  • Alternativ können andere spezifische DNA-Sequenzen, einschließlich der Unterabschnitte des Volllängen MOMP-Gens (beispielsweise Unterabschnitte einschließlich von Gensequenzen für die Peptide in 4) verwendet werden, obwohl die vorstehend beschriebene Sequenz die bevorzugte Ausführungsform darstellt, da das hergestellte große Produkt (1,2 kb) eine Diffusion verhindert, der man mit kleineren DNA-Amplifikationen begegnen kann. Auf ähnliche Art und Weise können andere Detektionsmarkierungen (beispielsweise Fluorescein) an dem 5'-Ende eingebaut oder Dixoxigenin bzw. Digoxigenin & UTP können in die amplifizierte DNA eingebaut werden. Alternativ zum Markieren des Produktes können spezifische Hybridisierungssonden gegen konstante Regionen der amplifizierten DNA verwendet werden, um ein amplifiziertes Produkt zu identifizieren. Dieses letztere Verfahren weist eine besondere Nützlichkeit für die Konstruktion eines automatisierten Laborgerätes für eine auf Lösung basierende PCR auf. Beispielsweise können mit Streptavidin beschichtete ELISA-Platten verwendet werden, um einen oder beide Stränge von einer 5'-Biotinmarkierten DNA einzufangen, wobei eine Detektion durch Fluoreszenz eines fluoreszenten oder einer anderen eingebauten fluorophoren Detektionssonde erfolgt.
  • Beispiel 2
  • Enzymimmuntest (ELISA, Diagnostisch)
  • a. Auf rekombinantem MOMP basierender ELISA
  • Das Volllängen MOMP-Gen von C. pneumoniae wurde unter Verwendung von Primern direktional in das pET Expressionsplasmid an der NCOI und NOTI Restriktionsstellen kloniert, um diese einzigartigen Restriktionsstellen in die MOMP-Enden einzubauen. Die Primersequenzen sind wie folgt:
    CPOMPDNCO (kodierender Strang): 5'-AGCTTACCAT GGCTAAAAAA CTCTTAAAGT CGGCGTTATT ATCCG-3' (SEQ ID NO. 43)
    CPOMP_CNOT (komplementärer Strang): 5'-ATATGCGGCC GCTCATAGAA TCTGAACTGA CCAGATACG-3' (SEQ ID NO. 43)
  • Die Konstruktion des MOMP-Einsatzes in den pET Expressionsvektor (Novagen, Inc.) ergibt auf Transformation von permissiven bzw. erlaubenden E. coli eine aminoterminale Thioredoxin-Fusions-Domäne, ein Polyhistidin für eine Ni+-Affinitätschromatographie, eine Solubilitäts-Sequenz von ungefähr 5 kD und eine Spaltstelle für eine Endopeptidase, die ein Volllängen MOMP mit einem modifizierten Amino-Terminus (wie in 2 dargestellt) ergibt, das einen Alanin-Einsatz zwischen dem aminoterminalen Methionin und dem benachbarten Lysin beinhaltet. Es können entweder das exprimierte rekombinante Volllängen Fusionsprotein oder das modifizierte MOMP, nach der Spaltung mit Endopeptidase, als das Antigen für einen Chlamydien-Spezies-ELISA verwendet werden. Es können andere Expressionssysteme in E. coli oder Baculovirus für die Synthese des MOMP-Proteins als das Antigen in dem ELISA verwendet werden. Das Verfahren wird durch eine nicht kovalente Anbringung von 50 ng von rekombinantem MOMP in jedes Loch (Reihen 1–11) einer 96-Loch Mikrotiterplatte (Immulon 4) in Carbonat-Puffer bei pH-Wert 9,5 mit einer über Nacht dauernden Inkubation bei 4°C ausgeführt. Die Platte wird mit PBS, 0,15 % Tween20 ×3 gewaschen und wird anschließend mit PBS, 1 % BSA, 0,15 % Tween 20 mit 300 ml bzw. μl pro Loch für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und dann ×3 mit PBS, 0,15 % Tween20 gewaschen. Das Serum wird in PBS in Triplikaten in einer getrennten Platte seriell verdünnt, wobei 50 μl von jedem Loch zu einem entsprechenden Loch einer MOMP Liganden-Platte übertragen wurde, wobei der folgenden Reihenfolge gefolgt wurde: Inkubieren bei 37°C für 1 Stunde unter Verwendung von Parafilm oder einer anderen geeigneten Abdeckung, um eine ungleichmäßige Verdampfung zu verhindern. Waschen ×5 mit PBS, 1% FCS, 0,05 % NaN3. Inkubieren von jedem Loch mit einer bestimmten Verdünnung von mit Biotin konjugiertem Anti-Mensch monoklonalen IgG oder monoklonalen IgM. Inkubieren bei 37°C für 1 Stunde mit Bedeckung. Waschen (3×) mit PBS, 1 % FCS, 0,05 % NaN3. Folge mit 50 μl eines Konjugates von Strepavidin-alkalische Phosphatase (1:200 in PBS, 1 % BSA, 0,15 % Tween20) für 1 Stunde bei 37°C mit Bedeckung. Waschen ×3 mit PBS, 1 % CS (Kälberserum), 0,05 % NaN3. Die Färbung wird mit p-Nitrophenylphosphat in Glycine-Puffer bei einem pH-Wert 9,6 entwickelt. Die Färbungsausbeute wird auf einem Mikrotiter-Kolorimeter unter Verwendung eines 405 nm Filters erfasst. Der Endpunkttiter ist die höchste Serum-Verdünnung oder Sekretion, die eine Färbungsausbeute > 3SD über dem Hintergrund (n = 8) ergibt. Die Analyse wird durch von einem Computer erzeugten Endpunkten des Antikörpertiters oder einer anderen Erfassungsidentifkation eines Antikörperspiegels und/oder Quantität eines spezifischen Antikörpers (IgG, IgM oder Gesamt-Ig) in der Testprobe unter Verwendung geeigneter Kontrollen vereinfacht. Es können andere Enzymkonjugate von Streptavidin oder Avidin, wie beispielsweise Streptavidin-Peroxidase oder Streptavidin-Galactosidase, substituiert werden, wobei ein geeigneter Ersatz eine detektierbare Färbung zur Quantifizierung ergibt.
  • b. Auf Peptid basierender ELISA
  • Der auf rekombinantem MOMP basierende ELISA, der vorstehend beschrieben wurde, stellt ein empfindliches Verfahren für die Quantifizierung von Immunglobulinen gegen die Chlamydien-Gattung im Serum, Plasma, CSF und anderen Körperflüssigkeiten bereit. Um ELISA-Tests bereitzustellen, die Spezies- und möglicherweise Stammspezifisch für die verschiedenen Chlamydien sind, wurden zwei Regionen in dem MOMP identifiziert, die minimale Aminosäuresequenzhomologien zeigen und von denen durch eine Computeranalyse (Intelligenetics) vorhergesagt wird, dass sie aufgrund von Hydrophilie und Mobilität an der dem Lösungsmittel zugänglichen Oberfläche von MOMP hervorragende antigene Domänen sind. 3 stellt die konstante und variable Domäne (VD) der unterschiedlichen Chlamydien-Spezies dar. Die identifizierten Spezies-spezifischen antigenen Domänen sind in VD1 und VD2 angeordnet. 4 stellt die Aminosäuresequenzen des Peptids dar, die für die Konstruktion von auf Peptid basierenden ELISAs mit einer Speziesspezifität für VD 1 verwendet werden. 5 stellt die Peptide für VD2 dar, die in ähnlicher Weise zu den VD1 Sequenzen verwendet werden. Die ELISA-Methodologie verläuft der vorstehend beschriebenen für den auf rekombinantem MOMP basierenden ELISA parallel. Außerdem wurde eine hoch antigene Domäne (6) identifiziert, die allen Chlamydien gemeinsam ist und wurde als ein alternativer Gattungsspezifischer ELISA fürdie Chlamydien entwickelt. Die Immunisierung von Kaninchen bestätigte die Antigenität von jedem Peptid zu jedem Peptid (Tabelle 9). Monoklonale Antikörper bestätigten weiterhin die Spezifitäten und die Antigenität von jedem Peptid (Tabelle 8), wie durch die Computeranalyse fürdie durch Nukleotide erzeugte Aminosäuresequenz von jedem Spezies-spezifischem MOMP vorhergesagt wurde. Tabelle 9 Antigene Antworten auf Peptide von 4 Spezies von Chlamydia, die durch Hydrophilie und Peptidbewegung als hoch antigen identifiziert wurden
    Titera
    Chlamydia Species Peptidb Vor Nach
    C pneumoniae 90–105 100 > 3200
    C. trachomatis L2 91–106 800 > 3200
    C. psittaci 92–106 400 > 3200
    C. trachomatis (Maus) 89–105 0 > 3200
    Titera
    Chlamydia Species Peptidb Vor Nach
    C. pneumoniae 158–171 25 > 3200
    C. trachomatis L2 159–175 200 > 3200
    C. psittaci 160–172 100 > 3200
    C. trachomatis (Maus) 158–171 800 > 3200
    Titera
    Chlamydia Species Peptidb Vor Nach
    C. pneumoniae 342–354 200 > 3200
    C. trachomatis L2 342–354 100 > 3200
    C. psittaci NDc
    C. trachomatis (Maus) NDc
    • a Reziproker Titer
    • b Immunogenes Peptid und ELISA-Antigen einer spezifischen Aminosäuresequenz gegenüber dem angezeigten Prä-Immunisierungs- und Post-Immunisierungs-Kaninchenserum
    • c ND, nicht detektiert
  • Tabelle 10 stellt reziproke Titer eines polyklonalen und monoklonalen Antikörpers gegen C. pneumoniae dar, die kreuzreaktiv gegenüber einem Peptid von C. pneumoniae sind, das die Aminosäuren 342–354 umfasst und ein Volllängen MOMP von C. pneumoniae. Tabelle 10 Reziproke Titer eines polyklonalen und eines monoklonalen Antikörpers gegen C. pneumoniae, die gegenüber einem Peptid von C. pneumoniae kreuzreaktiv sind, das die Aminosäuren 342–354 umfasst und ein Volllängen MOMP von C. pneumoniae.
    Titera
    Antigen Polyklonaler Abb Monoklonaler Abc
    CPN Mompd 400 0
    CPN 90–105e 50 0
    CPN 158–171f 50 0
    CPN 342–354g > 3200 1600
    • a Reziproker Titer
    • b Polyklonaler Ziegen Ab von Chemicon Inc. gegen MOMP von C. trachomatis
    • c Monoklonaler Ab (ICN, Inc) gegen MOMP von C. trachomatis
    • d C. pneumoniae rekombinantes MOMP
    • e Peptid mit Aminosäuren 90–105 von C. pneumoniae
    • f Peptid mit Aminosäuren 158–171 von C. pneumoniae
    • g Peptid mit Aminosäuren 342–354 von C. pneumoniae
  • Beispiel 3
  • Verfahren eines Detektionstests (Diagnostisch)
  • a. Immunglobulin (Ig)-Test
  • EBs von C. pneumoniae wurden in primären menschlichen Endothelzellen von Nabelvenen (HuEVEC, frühe Passage), HeLa 199, oder einer geeigneten Alternative in der Anwesenheit von 1 μg/ml Cycloheximid bei 35°C unter 5 % CO2 gezüchtet. Es wurden permissive Zellen durch Ultraschalbehandlung an Tag 3 lysiert, wodurch EBs freigesetzt wurden. Die letzteren wurden von Infektionsflaschen geerntet, mit Ultraschall behandelt, wobei die zellulären Trümmer, nach der Ultraschallbehandlung durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (~600x g) für 5 Minuten entfernt wurden. Die EBs wurden durch eine Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit (30.000x g) für 30 Minuten bei 4°C pelletiert. Das EB-Pellet wurde mit 1×PBS gewaschen und in 2 ml PBS pro vier 25 cm3 Kulturflaschen rekonstituiert und bei maximaler Leistung für 20 Sekunden und einem 0,5 Zeit-Zyklus unter Verwendung eines Braun-Sonic U Ultraschallgerätes mit Ultraschall behandelt. Die Proteinkonzentration von EB wurde durch das Bradford-Verfahren bestimmt und die mit Ultraschall behandelte infektiöse EB-Suspension wurde durch Zugabe einer 37 % Formaldehyd-Lösung bis zu einer End-Konzentration von 10 % Formaldehyd nicht infektiös gemacht, wobei während der Zugabe ständig bewegt wurde. Die mit Formalin behandelten EBs wurden 96-Loch-Platten mit 50 μl pro Loch zugegeben, die 50 ng EB (gesamt von 5 μg/Platte) beinhalten und luftgetrocknet wurden. Die Platte wurde mit PBS-0,15 % Tween20 3× gewaschen und dann mit PBS-1 % BSA-0,15 % Tween20 mit 300 μl pro Loch für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und anschließend 3× mit PBS-0,15 % Tween20 gewaschen. Serum wurde seriell in PBS in Duplikaten in einer getrennten Platte verdünnt und 50 μl von jedem Loch wurden entsprechenden Löchern einer MOMP-Liganden-Platte übertragen, wobei der folgenden Reihenfolge gefolgt wurde: Inkubieren bei 37 C für 1 Stunde unter Verwendung von Parafilm als Abdeckung, Waschen 5× mit PBS-1 % FCS-0,05 % NaN3, Inkubieren von jedem Loch mit einer bestimmten Verdünnung eines mit Biotin konjugierten Anti-Mensch monoklonalen IgG oder monoklonalen IgM; Inkubieren bei 37°C für 1 Stunde mit Abdeckung; Waschen (×3) mit PBS,1 % FCS, 0,05 % NaN3; Folgen mit 50 μl Konjugat von Strepavidin-alkalische Phosphatase (1:200 in PBS-1 % BSA-0,15 % Tween20) für 1 Stunde bei 37°C mit Abdeckung, und Waschen ×3 mit PBS, 1 % CS, 0,05 % NaN3. Die Färbung wurde mit p-Nitrophenylphosphat in Glycin-Puffer bei einem pH-Wert 9,6 entwickelt. Die Färbungsausbeute wurde an einem Durchfluss- bzw. Ausfluß-Mikrotiter-Kolorimeter unter Verwendung eines 405 nm Filters erfasst. Der Endpunkttiter war die höchste Verdünnung von Serum oder Sekretion, was eine Färbungsausbeute > 3 SD über dem Hintergrund (n = 8) ergibt.
  • b. Western-Blot
  • Western-Blots wurde durch SDS-PAGE von C. pneumoniae (nicht Formalin fixiert) präpariert, die von infizierten HuEVEC oder HeLa-Zelllysaten geerntet wurden, wurden unter standardisierten Bedingungen für SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose übertragen, wobei dies durch einen aktiven Diffusionstransfer erreicht wurde. Es wurden mit Albumin blockierte Streifen von den Nitrocelluloseblättern präpariert und 1 Stunde mit 1,2 ml einer 1:40 Verdünnung von Testserum inkubiert. Die Detektion erfolgte mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Maus-Anti-Mensch Antikörper, der mit 5-Brom-4-Chlor-3'-Indolyphosphat-p-Toluidin/Nitro-Blau-Tetrazolium-Chlorid (BCIP/NBT, Pierce Chemicals Company) entwickelt wurde. Es können alternativ polyklonale Tier Anti-Mensch Antikörper verwendet werden.
  • c. Antigen-Fang-Test fürChlamydien MOMP
  • Die in 3–5 beschriebenen Peptide wurden über eine Disulfidbindung an Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke durch Standardverfahren (Bernatowicz et al., Anal. Biochem. 155(1)(1986), 95–102) konjugiert. Die Peptidkonjugate in Alaun wurden verwendet, um polyklonale und/oder monoklonale Antikörper gegen die Spezies-spezifischen Domänen von MOMP zu erzeugen, die als ein Fang-Antikörper in 96-Loch-Mikrotiter-Platten verwendet wurden. Die Endkonfiguration kann einer Anzahl von alternativen Routen folgen, um eine Quantifizierung von MOMP in Körperflüssigkeiten zu erhalten. Die bevorzugte Konfiguration verwendet mit Biotin markiertes rekombinantes MOMP in einem Kompetitions-Test mit einer Streptavidin/alkalische Phosphatase erzeugten Färbungsentwicklung, die auf der Quantität von biotinyliertem rekombinantem MOMP basiert, das durch nicht markiertes MOMP in Körperflüssigkeiten verdrängt wurde.
  • Beispiel 4
  • In vitro antimikrobielles Empfindlichkeits-Testen auf C. pneumoniae Gewebekulturzellen, die kryptische Phase C. pneumoniae (H-292, HeLa, HEL, HuEVEC, McCoy, etc.) beinhalten, werden bei Subkonfluenz in eine 96-Loch Mikrotiterplatte (Flaschen und Platten oder andere Konfigurationen können alternativ verwendet werden) ausplattiert und in der Anwesenheit von verschiedenen Antibiotika (einzeln und in Kornbination) kultiviert, wobei das Medium täglich gewechselt wird. Die Analyse einer Chlamydien-Aktivität wird durch Beurteilen eines Verlustes von Signal einer Lösungs-PCR ausgeführt, oder es kann die relative Aktivität durch Verdünnungs-Titer des Ausgangsmaterials unter Verwendung der Abwesenheit von PCR-Signal als dem Endpunkttiter (d.h. die letzte Verdünnung, um ein spezifisches PCR-Signal zu erhalten) quantifiziert werden.
  • Eine zweiwöchige Exposition von einzelnen Mitteln, einschließlich des Fluoroquinolon, Ofloxacin, und des Makrolids, Clarithromycin, mit 1 μg/ml scheiterte HeLa-Zellen in Kultur von einem detektierbaren PCR-Signal für das MOMP-Gen von C-pneumoniae zu klären. Im Gegensatz dazu führten Dreifach-Mittel, bestehend aus Isoniazid (INH), Metronidazol und Penicillamin (1 μg/ml jeweils) zu einem nicht detektierbaren PCR-Signal (Tabelle 11).
  • Keines dieser Mittel, die in der Dreifach-Kombination wirksam sind, wurde gegenwärtig als ein Anti-Chlamydien-Mittel anerkannt.
  • Tabelle 12 stellt die Ergebnisse einer erweiterten Untersuchung von antimikrobiellen Empfindlichkeiten bei zwei unterschiedlichen Konzentrationen von antimikrobiellen Mitteln bereit, die alleine und in Kombination verwendet werden, wenn sie den antimikrobiellen Mitteln für zwei Wochen ausgesetzt wurden. Zusätzlich zu den bereits erwähnten Mitteln scheiterten Minocyclin, Doxycyclin, Rifampin und Sulfamethoxizol/Trimethoprim bei allen getesteten Konzentrationen das PCR-Signal für Chlamydien-MOMP zu klären. Lediglich die Dreifach-Kombination von Isoniazid, Metronidazol und Penicillamin klärten das PCR-Signal in zwei Wochen. Die Dreifach-Kombination war sowohl bei niedrigen als auch bei hohen Konzentrationen wirksam. Tabelle 12 zeigt ebenfalls die Wirkung einer 4 Wochenexposition mit der gleichen erweiterten Reihe von antimikrobiellen Mitteln alleine und in Kombination.
  • Eine Anzahl von Dreifach-Kombinationen von antimikrobiellen Mitteln führte zu Zellkulturen, in denen das PCR-Signal für das Chlamydien MOMP-Gen bei vier Wochen nicht detektiert werden konnte. Die am meisten wirksamen Kombinationen, die die/den größte/n Wirkung bzw. Einfluss auf die Lebenszyklus-Phasen aufweisen, sind jene, die gemäß der in dem vorstehend betitelten Abschnitt "Methodologie zur Auswahl möglicher Mittel-Kombinationen" vorhergesagt wurden. Tabelle 11 Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika für kryptische C. pneumoniae, die in HeLa-Zellena kultiviert wurden
    Antibiotikum Konz. (μg/ml) PCRb
    Ofloxacin 1 Positiv
    Clarithromycin 1 Positiv
    INH 1 Positiv
    Metronidazol 1 Positiv
    Penicillamin 1/1 Positiv
    INH + Metronidazol + Penicillamin 1/1/4 Negativ
    Kontrolle 0 Positiv
    • a Kultiviert in der Anwesenheit des/der angezeigten Antibiotikums/Antibio tika, jedoch nicht mit Cycloheximid. Medienwechsel erfolgte 48–72 Stunden.
    • b Analyse folgend einer 2-wöchigen Exposition gegenüber antimikrobiellen Mitteln.
  • Figure 00950001
  • Figure 00960001
  • Beispiel 5
  • Antwort auf Antibiotika-Therapie
  • Tabelle 13(a) stellt typische Antworten auf die Therapie mit Kombinations-Antibiotika in einer Vielzahl von Patienten mit diagnostischen Anzeichen einer aktiven Infektion durch C. pneumoniae dar. Ungleich gewöhnlichen Immunantworten auf eine Infektion mit infektiösen Mitteln weisen die meisten eingeschlossenen Patienten nicht nur detektierbare IgM-Titer gegen die Chlamydien-Gattung, sondern in vielen Fällen sehr hohe IgM-Titer auf. Im Allgemeinen fielen mit der spezifischen Therapie die IgM-Titer über die Zeit, wobei IgG-Titer anstiegen (wie erwartet). Gegenwärtige Verfahren zum Detektieren von Antikörpern gegen C. pneumoniae (indirekte Immunfluoreszenz, MIF) können einen hohen IgM-Titer gegen C. pneumoniae nicht genau identifizieren. Außerdem sind gegenwärtige Verfahren gattungsspezifisch und nicht speziesspezifisch, wie Peptid basierte ELISAs. Beim Klären des Pathogens fällt der IgG-Titer. Ein Begleitumstand mit der Therapie mit Kombinations-Antibiotika besteht in einer allgemeinen Verbesserung der Patientensymptome, die mit der spezifischen Diagnose assoziiert sind, die Anzeichen einer aktiven Infektion mit Chlamydien anzeigen.
  • Tabelle 13(b) beschreibt den Verlauf einer Therapie für eine Anzahl von Individuen, die mit einer Kombination von Mitteln behandelt wurden und deren Klinische Resultate.
  • Tabelle 13(c) beschreibt die ausführlichen Krankengeschichten der Patienten, die sich einer Kombinations-Therapie, wie in Tabelle 13(b) berichtet, unterziehen.
  • Tabelle 13(d) stellt eine Liste von für jene hier verwendeten Arzneimitteln und Standarddosierungen bereit. Tabelle 13a: Serologische und PCR-Antworten auf eine Kombinations-Antibiotika-Therapie
    Titer
    Patient Diagnosea IgM IgG Therapiezeit PCR Status
    PH FM 800 3200 800 800 1600 200 6 Monate + + wk+ asymptomatisch
    BL MS 2000 400 500 3200 9 Monate - + - wk+ dramatische Verbesserung
    MM CFS/AND 3200 400 800 1600 1 Monat + + Verbesserung; Rückfall (nicht folgend)
    PM CFS 2000 400 25 800 6 Monate + wk+ asymptomatisch
    AM IBD 800 3200 0 400 6 Monate wk+ + 90% Verbesserung
    FO MS 800 800 400 400 3200 800 800 800 10 Monate st+ + wk+ + Verbessereung in Sprache und Darmkontinenz
    WM CF 25 1000 50 50 50 25 25 800 1600 400 wk+ st+ + wk+ – asymptomatisch
    HM CF 2000 3200 200 0 100 3200 800 6 Monate + + wk+ asymptomatisch
    CN CFS 320 800 800 800 8 Monate + wk+ 75% Verbesserung
    AN MS/CFS 400 200 400 3200 wk+ st+ verbesserte Kraft, Nachlassen d. Ermüdung
    JS CFS (schwer) 2000 2000 200 2000 2000 800 5 Monate st+ + – asymptomatisch
    AG IBD 3200 800 800 800 400 400 800 400 9 Monate + + + – Verbesserung in Gelenk Sx
    AT CF 3200 1600 1600 800 400 3200 1600 1600 800 400 9 Monate + + + + + asymptomatisch
    LH RA 3200 800 200 1600 400 50 6 Monate wk+ wk+ + Verbesserung
    MS MS 2000 3200 50 400 800 200 5 Monate + + – Verbesserung
    Tabelle 13a (fortgesetzt)
    LH RA 3200 800 200 600 400 50 6 Monate wk+ wk+ + Verbesserung
    HS MS 2000 3200 50 400 800 200 5 Monate + + – Verbesserung
    ST CFS/FM > 1000 1000 400 800 100 100 100 100 3200 100 7 Monate wk+ wk+ + + asymptomatisch
    RV CF 1000 400 400 100 1600 400 10 Monate + + – asymptomatisch
    • a CF = chronische Erschöpfung < 6 Monate; CFS = chronisches Erschöpfungssyndrom, FM = Fibromyalgie, IBD = Entzündliche Darmerkrankung, MS 0 Multiple Sklerose, AND = Autonome nervöse Funktionsstörung (Nerven-vermittelte Hypotonie), RA = rheumatoide Arthritis IgM >> IgG: Immuntoleranz gegen das Antigen, IgG >> IgM: erfolgreiche Immunkontrolle des Antigens
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    Tabelle 13c: Ausführliche Krankengeschichten
    Patient Diag. Testdaten1 Krankengeschichte
    BL MS Reihe 2 Erste Symptome begannen mit Taubheit im linken Arm und Bein, die zu einer teilweisen Brown-Sequard Lähmung (d.h. – Strangmyelitis) rasch fortschritt, die mit einer Harnretention assoziiert war. Trotz einer Therapie mit Corticosteroiden und Beta-Interferon schritt sie über die nächsten drei Monate mit einem EDSS = 8.0 (Triplegie plus Sprach- und Schluckbeeinträchtigungen) rasch fort. Eine positive CSF PCR und Kultur für C. pneumoniae führte zu einer Behandlung mit Kombinations-Antibiotika. Der Patient verbesserte sich in allen Wirkungsbereichen neurologischer Funktion über die folgenden sechs Monate. Seine EDSS-Punktbewertung (Score) war 9 Monate später 3.0, wobei er zur Arbeit und athletischen Routineaktivitäten (beispielsweise Jogging) zurückkehrte. Sein neurologischer Zustand blieb stabil und er setzt ein Anti-Chlamydien Kombinations-Regimen fort.
    MC MS Dieser Patient hatte eine zehn Jahre dauernde Geschichte von MS mit Anzeichen einer progressiven Ataxie und schwäche in den Beinen. Über 5 Monate verschlechterte sich seine EDSS-Punktbewertung von 7,0 auf 8,0. Sein CSF war positiv für C. pneumoniae durch PCR und er wurde auf Kombinations-Antibiotika gesetzt. Über die nächsten sechs Monateverbesserte sich sein Gleichgewicht, seine Koordination und Stärke der unteren Extremitäten. Seine letzte EDSS-Punktbewertung betrug 6,5.
    JM MS Anfänglich mit einer rasch fortschreitenden Paraparese, die sekundär zu MS war. Er reagierte bei zwei aufeinander folgenden Gelegenheiten nicht auf Corticosteroide. Fünf Monate später war seine EDSS-Punktbewertung 7,5. Folgend auf eine positive PCR für C. pneumoniae wurde er auf ein Kombinations-Antibiotika gesetzt. Er erwarb schrittweise Stärke in seinen unteren Extremitäten und fünf Monate später war er fähig mit einer Gehhilfe (EDSS = 6,5) zugehen, während er auf Kombinations-Antibiotika gehalten wurde.
    • 1 Bezieht sich auf Reihe in Tabelle 13b, die die ELISA und PCR-Geschichten dieser Patienten aufweist.
    Tabelle 13c: (fortgesetzt)
    Patient Diag. Testdaten1 Krankengeschichte
    LL MS Patient mit einer langen Geschichte (14 Jahre) einer sekundären progressiven MS mit neuen progressiven bulbären Symptomen, Ataxie und Querschnittslähmung (EDSS = 8,5). Die PCR für das MOMP-Gen von C. pneumoniae in dem CSR war positiv. Sie wurde auf Kombinations-Antibiotika gesetzt, wobei keine weitere Progression von Symptomen für die letzten sechs Monate auftraten.
    AN MS Reihe 10 Eine lange Geschichte von MS und für ungefähr zehn Jahre an den Rollstuhl gebunden. Sie erhielt fortdauernd physikalische Therapie, um den Beinmuskeltonus zu erhalten. Nach ungefähr 6 Monaten von Kombinations-Antibiotika konnte sie ohne Hilfe stehen und ohne Hilfe mehrere Schritte gehen. Sie berichtet eine signifikante Abnahme bei der Erschöpfung und kognitiven Funktionsstörungen. Sie blieb auf Kombinations-Antibiotika und anderen unterstützenden Medikationen.
    FO MS Reihe 6 An den Rollstuhl gebunden mit einer langen Geschichte von MS mit einer 2–3 jährigen Progression schweren Dysarthrie und Inkontinenz. Auf Kombinations-Antibiotika (14 Monate) verbesserte sich seine Sprache und Inkontinenz. Die Sprache, die Fähigkeit für den Zahnarzt den Mund zu öffnen und das Stehvermögen verbesserten sich. Kann besser auf seinem eigenen mittleren Übergang stehen (Can stand better an his own mid-transfer). Er bleibt an den Rollstuhl gebunden.
    JC MS Die Diagnose auf MS mit einer Entwicklung eines Hangfußes ungefähr ein Jahr vor der Therapie, erforderte die Verwendung eines Spazierstocks beim Gehen. Ungefähr vier Monate nach Beginn einer Therapie mit Kombinations-Antibiotika berichtet der Patient eine Umkehr beim Hängefuß und dass sie den Spazierstock nicht langer benötigt. Sie führt die Antibiotika-Therapie fort.
    Tabelle 13c: (fortgesetzt)
    Patient Diag. Testdaten1 Krankengeschichte
    FW MS Männliche Führungskraft in den späten 50 zigern mit einer 15 jährigen Geschichte von MS. Verwendete einen Spazierstock für einen rollenden unstabilen Gang. Leicht erschöpft. Nach 12 Monaten Kombinations-Antibiotika war er fähig ohne Spazierstock oder übermäßige Erschöpfung zu gehen, obwohl sein Gang immer noch schweifend sein kann. Kann leicht über den Parkplatz gehen, was vorher eine Herausforderung war. Stoppte Antibiotika obwohl er immer noch PCR positiv war, plante die Therapie erneut zu starten, falls er ein weiteres Aufflackern hat.
    LH RA Reihe 14 Patient LH weist einen aktiven Fall von RA auf, der moderat hinderlich war. Nach zwei Monaten einer Therapie mit Kombinations-Antibiotika befindet sich ihr RA in kompletter Remission.
    XX IC Sie reagierte auf Kombinations-Antibiotika mit einer kompletten Remission der Symptome nach einem Monat. Absetzen der Antibiotika führte zu einer Wiederkehr der Symptome.
    NC PG PCR+ 61 jähriger Mann, der fürmehrere Jahre Läsionen auf wies. Große vereiterte Läsionen an den Füßen, die auf eine Therapie mit Kombinations-Antibiotika zurückgingen. Lediglich restliche hypertrophe Narben blieben.
    CH PG PCR+ 75 Jahre alter diabetischer Mann mit mehreren, großen, schweren Läsionen an beiden Beinen, Abdomen und Armen. Die Läsionen bildeten sich zuerst 1993. Die Schwere des Verlaufs erforderte chronische häusliche Krankenpflege mit geschätzten Kosten von $300–400 pro Tag. Auf die Therapie mit Kombinations-Antibiotika gingen alle Läsionen über dem Knie zurück: Es blieben lediglich läsionen am rechten unteren Bein, an dem eine ungeeignete Blutversorgung eine schlecht Prognose bietet. Der Patient erfordert keine häusliche Krankenpflege mehr.
    Tabelle 13c: (fortgesetzt)
    Patient Diag. Testdaten1 Krankengeschichte
    RI PG PCR+ Ursprünglich schwere PG Läsionen an Beinen, die eine beidseitige Amputationen erforderten. Die Läsionen traten nun an den Armen auf. Die Behandlung mit Kombination-Antibiotika führte zum Rückgang der Läsionen, obwohl bis heute nicht vollständig. [Keine Aktualisierung – Diagramm fehlt]
    PL PG PCR+ 18 jährige Frau mit einer Geschichte von Geschwüren am Bein. Mehrere PG läsionen vollständig verheilt auf eine Therapie mit Kombinations-Antibiotika. Patient verlor dann ihren Job und konnte es sich nicht leisten das Arzneimittelregime aufrechtzuerhalten.
    TW PG Schwere PG, die nach einer chemischen Verbrennung 1991 begann, jedoch mit einer PCR negativen Serologie für C. pneumoniae. Patient reagierte anfänglich nicht auf die Therapie mit Kombinations-Antibiotika. Eine positive Biopsiekultur für C. pneumoniae führte zu der Wiedereinführung von Kombinations-Antibiotika. Der Patient verließ die Therapie nach keiner Verbesserung.
    AM IBO Reihe 5 Dies ist ein 35 jähriger Mann, der sich als ein Prostilitis vor zehn Jahren mit dem Alter von 25 vorstellte. Dies setzte sich zu einer akuten eiternden Kolitis fort, die den gesamten Kolon betraf, was mit einer schweren Arthritis, Iritis und Gewichtsverlust assoziiert war. Die Diagnose war durch die Biopsie bestätigt. Die Kontrolle erforderte hohe Corticosteroid-Dosen und Azacol. Versuche die Steroide zu verringern führte zu einer teilweisen Kontrolle der Symptome. Sechs Monate vor Beginn einer Therapie mit Kombinations-Antibiotika durchlebte der Patient eine Häufigkeit (20–25-mal pro Tag) offenes Bluten und Mukus im Stuhl. Patient erhielt für ein Jahr auf Kombinations-Antibiotika. Folgend auf signifikanten Stress zeigte der Patient einen signifikanten Anstieg in den Symptomen. Änderung der Antibiotka-Kombination führte zu normalem Eingeweideverhalten mit keinem Mukus und minimalem Blut. Assoziierte neuropsychiatrische Manifestationen einer kognitiven Funktionsstörung und Depression gingen zurück. Steroide wurden eingestellt.
    Tabelle 13c: (fortgesetzt)
    Patient Diag. Testdaten1 Krankengeschichte
    Ag IBD Reihe 12 Diese 27 jährige weiße Frau mit einer zweimonatigen Geschichte einer fulminanten eitrigen Kolitis, die nicht auf die gewöhnliche medizinische Therapie reagierte. Eine totale abdominale Kolektomie mit Ileostomie und einem Stuhlbeutel wurde ausgeführt. Die mikroskopische Erscheinung bestätigte die eitrige Kolitis. Folgend auf die Kolektomie durchlebte der Patient neurologische Symptome, Erschöpfung, Myalgien, Arthralgien und akneartige Hautausschlag. Es wurde eine Serologie für C. pneumoniae ausgeführt und die positiv war mit einem IgM von 1:3200, IgG 1:400 und PCR positiv. Es wurde eine Therapie mit Kombination-Antibiotika begonnen. Nach sechs Monaten der Antimikrobiellen Therapie war ihre Serologie IgM 1:800, IgG 1:400 und PCR positiv. Die neurologischen Symptome, Erschöpfung, Myalgien, Arthralgien und akneartigen Ausschlag gingen vollständig zurück. Es gab keinen weiteren Anzeichen einer entzündlichen Darmerkrankung und die Ileostomie wurde erfolgreich an den rektalen Stumpen anastomisiert. Die Patientin fühlte sich energiegeladener. Die Serologie nach 1 Jahr war PCR negativ.
    DMI BD Diese 37 jährige Frau weist eine sechsjährige Geschichte einer entzündlichen Darmerkrankung (unsicher CD oder UC) auf, die mit schmerzlosem rektalem Bluten, Arthritis, Myalgien, Hauteiterung, Bauchkrämpfe/Diarrhöe und rektale Fisteln. Sie zeigte erhöhte Erschöpfung, die sie häufig die Arbeit als kleine Beamtin vermissen ließ. Bei Therapie mit Kombination-Antibiotika gingen alle Symptome zurück, die jedoch bei Absetzen der Antibiotika, während der Ferien wieder auftraten. Wiedereinführen der Kombinations-Antibiotika führten zu einer zweiten Remission der Symptome. Vor der Therapie mit Kombinations-Antibiotika war sie nicht länger als 3 Monate ohne eine anale Manifestation von IBD. Sie war über ein Jahr von IBD-Symptomen frei.
    Tabelle 13c: (fortgesetzt)
    Patient Diag. Testdaten1 Krankengeschichte
    RP IBD Der Patient stellte sich mit Proktokolektomie und Ileostomie aufgrund einer UC vor. Folgend auf eine Erkältungs-ähnliche Erkrankung 1993 wurde sie erschöpft und anämisch mit Blutgefärbter Diarrhöe. Die Untersuchung ihres Ileostomiebeutels ergab eine Entzündung und Geschwüre. Obere GI Serien/Dünndarm-Serien ergaben keine Anormalitäten und es wurde kein Grund für ihre Anämie diagnostiziert. Auf Kombination-Antibiotika wurde ihre Ileostomieaktivität mehr regelmäßig und weniger spastisch. Sie erklärte sich besser zu fühlen mit höheren Energieniveaus und setzte die Antibiotika-Therapie ab. Sechs Monate nach der Antibiotika-Therapie blieb sie anderweitig als einer moderaten Anämie symptomfrei.
    AB IBD Patient mit einer langen Geschichte von CD, die den Dünndarm, den großen Darm und den Anus beteiligt. Sie wurde mit einer Dünndarmresektion und einer Fissurektomie behandelt. Sie litt weiterhin an zahlreichen rektalen Fisteln. Auf die Kombinations-Antibiotika durchlebte sie mehrere symptomatische Verbesserungen, ihre gesamten IBD-Symptome scheiterten jedoch zurückzugehen. Sie setzte die Antibiotika möglicherweise aufgrund einer chronischen Herxheimer-Reaktion ab. Gegenwärtig ist sie füreine Nachsorge verloren.
    EU IBD Kolitis mit entzündetem sigmoidalem Kolon und Proktitis, die mit häufigem losem Stuhl mit signifikantem Mukus assoziiert ist. Folgend auf eine sechswöchige Therapie mit Kombinations-Antibiotika verringerten sich die Symptome signifikant. Kurz nach Absetzen der Antibiotika kehrten ihre Symptome wieder. Wiedereinsetzen der Antibiotika führte zu einer zweiten Remission ihrer Hauptsymptome mit Rückgang ihrer Proktitis auf visuelle Untersuchung.
    Tabelle 13c: (fortgesetzt)
    Patient Diag. Testdaten1 Krankengeschichte
    NM CFS Vanderbilt Universität Initial-Patient, der dazu führte unserer ersten Assoziation von C. pneumoniae führte, wobei er sich anfänglich über die heimtückischen Beginn von hinderlicher Erschöpfung beschwerte. Dies war mit einer schweren kognitiven Funktionsstörung assoziiert, die seine Fähigkeit als Abteilungsleiter eines Klinischen Diagnoselabors zu arbeiten zerstörte. Trotz sechs Monaten intensiver diagnostischer Bemühungen durch die Klinik für Infektionskrankheiten in Vanderbilt konnten keine definitive oder vermutliche Diagnose gestellt werden. Ein nachfolgender hoher Antikörpertiter gegen C. pneumoniae führte zu standardisierter Anti-Chlamydien Antibiotika-Therapie über eine Periode von drei Monaten mit einem schrittweisen Verschwinden der Erschöpfung und der kognitiven Symptome. Auf Absetzen eines Fluoroquinolon-Antibiotikums kehrten die Symptome innerhalb von zwei Wochen wieder. Er wurde auf Kombinations-Antibiotika gesetzt, wobei nach sechs Monaten eine vollständige Umkehr der Symptome erfolgte. Er blieb symptomfrei.
    JS CFS Reihe 11 Akademischer Mediziner mit einer mehr als 10 jährigen Geschichte von CFS. Kognitionsprobleme führten zu seiner Erdung als Privatpilot. Eine anfängliche Behandlung mit Kombinations-Antibiotika führte zu einer offensichtlichen Herxheimer-Reaktion mit einer Rückgang über einer Periode von zwei Wochen mit gradueller Verbesserung in den Symptomen. Nach drei Monaten Therapie steuerte er ein leichtes Flugzeug unter Instrumenten von Florida nach North Carolina. Er nahm weiterhin Kombinations-Antibiotika für über ein Jahr und ist symptomfrei.
    PM CFS Reihe 4 Mediziner mit anhaltender CFS. Behandelt mit Kombinations-Antibiotika mit schrittweisem Rückgang von Symptomen. Während des Verlaufs der Behandlung entwickelte er eine Herzmyopathie. Gegenwärtig von CFS symptomfrei. Die Herzmyopathie ging über eine Periode von sechs Monaten auf Kombinations-Antibiotika zurück.
    Tabelle 13c: (fortgesetzt)
    Patient Diag. Testdaten1 Krankengeschichte
    MM CFS Reihe 2 CFS und AD. Rückgangeiner Stellungs-Tachycardie über 1 Monat einer Therapie mit Kombinations-Antibiotika. Teilweise Umkehr der Erschöpfung während dieser Periode. Patient nach einem Monat nicht einwilligend und für die Nachsorge verloren.
    PH FM Reihe 1 Drei Jahre dauernde Geschichte einer hinderlichen FM, die auf die Belastung als ein Belästigungsopfer folgte. Patient relativ symptomfrei nach neun Monaten einer Therapie mit Kombinations-Antibiotika.
    CN CFS Reihe 9 Fünf Jahre dauernde Geschichte einer schweren CFS mit hinderlicher kognitiver Funktionsstörung und Depression. Schrittweise Verbesserung auf Kombinations-Antibiotika für ungeführ neun Monate. Geschätzt 75 % der normalen Funktion.
    PG CFS Zehn Jahre dauernde Geschichte einer CFS mit kognitiver Funktionsstörung. Vollständige Reaktion auf Kombinations-Antibiotika über einen Verlauf von einem Jahr.
    AT CF Reihe 13 Moderate Erschöpfung und kognitive Funktionsstörung folgend auf eine entzündlichen Erkrankung. Depression war das hauptsächliche Problem. Während eines einjährigen Kombinations-Antibiotika Verlaufs kehrte sich die Erschöpfung und kognitive Funktionsstörung größtenteils um. Während des mittleren Verlaufs der Therapie entwickelte der Patient Angstattacken, die mit einer Antiprophyrin-Therapie gelindert wurden.
    Tabelle 13c: (fortgesetzt)
    Patient Diag. Testdaten1 Krankengeschichte
    WM CF Reihe 7 CF folgend auf akuten Stress. Vor-Krankheitsserum war negativ für Chlamydia pneumoniae Antikörper, die sechs Wochen nach Stress gipfelten. Vor-Krankheits-PCR war schwach positiv, die stark positiv wurde. Auf eine Therapie mit Kombination-Antibiotika wurde er nach 3 Monaten symptomfrei. Absetzen von Antibiotika führte zu einem symptomatischen Rückfall. Gegenwärtig mit niedrigen Serum-Antikörpern und negativer PCR symptomfrei.
    HM CF Reihe 8 Medizinstudent mit einer kurzen Geschichte von CF und kognitiven Funktionsstörungen, die die Studien beeinträchtigten. Kombinations-Antibiotika über einen Verlauf von mehreren Monaten führten zur vollständigen Umkehr der Symptome.
    ST CFS Reihe 17 Mutter von Patient AT. Drei Jahre dauernde Geschichte einer CF mit FM. Eine Therapie mit Kombinations-Antibiotika führte im Patienten zu einer Umkehr der Symptome, was ihr ermöglichte einen in Gefahr befindlichen Job zu behalten. Geschätzt gegenwärtig 80–90 % normaler Funktion.
    RV CF Geschichte einer Erschöpfung, obwohl nicht behindernd. Eine Therapie mit Kombinations-Antibiotika führte zu einer 100 % Rückkehr der normalen Funktion.
    EB CFS Teenager mit langer Geschichte einer CFS, die zu einem zuhause geführten Schulunterricht führte. Auf eine Therapie mit Kombinations-Antibiotika Rückkehr zur Schule und graduierte kürzlich. Die Genesung war möglicherweise sekundär wegen einer Nichtbefolgung der Therapie nicht vollständig.
    Tabelle 13d Arzneimittel und Standarddosierung
    Arzneimittel Gattung Einheiten dosierung Tägliche Dosierung
    Cupramin Penicillimin 250 mg 2×
    Amoxicillin 500 mg 2×
    Flagyl Metronidazol 500 mg 2×
    INH 300 mg 1×
    Rifampin 300 mg 2×
    Floxin Ofloxacin 400 mg 2×
    Levaquin 500 mg 1×
    Bactrim SMZ/TMP Doppelte 2×
    Stärke
    Biaxin Clarithromycin 500 mg 2×
    Minocyclin 100 mg 2×
    Doxycyclin 100 mg 2×
    Probenicid 500 mg 2×
  • Figure 01160001
  • Beispiel 6
  • Beispiel eines Klärens von Mäusen
  • Es wurde ein Satz Mause auf die Infektion von Chlamydien getestet. Von den 10 getesteten Mäusen waren 8 (80 %) PCR positiv für C. pneumoniae. Die Mause wurden anschließend auf eine Dreifach-Antibiotika-Therapie gesetzt: Amoxicillin, Metronidazol und INH mit 50 μg/ml jeweils in deren Wasser. Basierend auf deren Wasserverbrauch von 6,8 bis 7 ml pro Tag erhielten die Mause effektiv täglich ungefähr 350 μg von jedem Arzneimittel.
  • Die Mause wurden, sobald sie alt genug waren, an der ersten Generation von Jungtieren erneut durch PCR getestet. Sie wurden immer noch durch PCR positiv getestet. Die Mauskolonie wurde anschließend für mehrere Monate bei der Kombinations-Therapie in Wasser gehalten. Ungefähr sieben Monate nach dem Beginn dieser Untersuchung, wurde dem Wasser ebenfalls Probenicid zugegeben. Grobe 2 bis 3 Wochen später nachdem Probenicid zugegeben worden war, wurde die dann dritte oder vierte Generation von Mäusen erneut getestet. Alle getesteten 22 Mause waren PCR negativ.
  • Beispiel 7
  • Bestimmung einer sekundären Porphyrie
  • Patienten mit systemischen Infektionen, die durch C. pneumoniae bedingt sind, wurden auf eine sekundäre Porphyrie beurteilt. Die Anwesenheit von Enzymen (d.h. Δ-ALA Synthase und PBG-Deaminase) für die Häm-Biosynthese wurde unter Verwendung bekannter Verfahren bestimmt. Erhöhte fäkale und Harn-Porphyrine wurden bei 24 Stunden erfasst. Die Ergebnisse werden in Tabelle 14 berichtet.
  • Figure 01180001
  • Figure 01190001
  • Beispiel 8
  • Anwesenheit von Autoantikörpern gegen Strukturen des Porphyrinrings
  • Patienten mit systemischen Infektionen, die durch C. pneumoniae bedingt sind, wurden auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen Strukturen des Porphyrinrings (d.h. Vitamin B12, Coproporphyrinogen-III, Protoporphyrin, Porphyrobelinigen und Δ-ALA) getestet. IgM und IgG Antikörper-Titer wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests bestimmt, für den das Protokoll nachfolgend beschrieben wird.
  • ELISA-Test-Protokoll
    • 1. Plattenvorbereitung: Coproporphyrin III wird als ein Beispiel verwendet, wobei das Verfahren ebenfalls durch Beschichten der Platten mit einer der folgenden anderen Ringstrukturen mit der gleichen Konzentration ausgeführt werden kann: Vitamin B12, Protoporphyrin IX, Porphobilinogen und Δ-Aminolevulininsäure. Zugabe von 50 ng von Coproporphyrin III in 50 μl eines Carbonat-Beschichtungs-Puffers zu jedem Loch in den Säulen 1–11 einer 96-Immulon 4 Mikrotiterlochplatte. Bedecken mit Frischhaltefolie und inkubieren bei 4°C über Nacht.
    • 2. Blockierungsschritt: Platten dreimal mit Tween 20 Wasch-Puffer waschen. (0,1 M Tris, 0,15 % Tween20, 0,05 5NaN3). Blockieren der Platten durch Zugabe von 200 μl Tris-Blockierungs-Puffer (Tris 0,1 M, 1 % Rinderserumalbumin, 0,15 % Tween20) zu jedem Loch von Säulen 1–11. Belasse die Löcher von Säule 12 trocken. Wickle die Platte in Frischhaltefolie und inkubiere bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
    • 3. Proben-Vorbereitung: Während die Platten blockiert werden, werden die Proben und Kontrollen hergestellt. Patientenseren werden 1:10 in Block verdünnt und gut gevortext.
    • 4. Platten-Vorbereitung: Platten mit Tween20 Wasch-Puffer dreimal waschen und 50 μl Block in jedes Loch in jeder Reihe zugegeben, ausgenommen der Reihe A und jeder Säule ausgenommen Säule 12. Belasse Reihe A und Säule 12 leer.
    • 5. Plattekonfiguration: Anordnen von 100 μl von Patientenverdünnungen in Duplikaten in Reihe A. Bereite Platten in Duplikaten und markiere eine Platte für eine IgG und für eine IgM Detektion. Verwende das Cetus-Propet-Gerät, um eine zweifache serielle Verdünnung (1:10 bis 1:1280) der Proben in Säulen 1–10 bereitzustellen. Die folgende Beladungskonfiguration wird für die Patientenproben und Kontrollen verwendet: Probe 1 -Säulen 1 und 2 Probe 2 -Säulen 3 und 4 Probe 3 -Säulen 5 und 6 Probe 4 -Säulen 7 und 8 Stark positive Kontrolle-Säule 9 Schwach positive oder negative Kontrolle-Säule 10 Nur Block-Säule 11 Säule 12 trocken-Leerwert Wickle in Frischhaltefolie und inkubiere bei 37°C für 1 Stunde.
    • 6. Detektions-Antikörper: Bereite fünf Minuten bevor die Inkubation beendet ist, getrennte 1:2000 Verdünnungen von monoklonalen mit Biotin markiertem Maus Anti-Mensch IgG und IgM in Tris-Block-Puffer. Wasche die Platten in FCS-Wasch (0,1 M Tris, 0,05 % NaN3, 0,15 % Tween20, 1% FCS) viermal und ordne 50 μl der Anti-Mensch IgG Verdünnung in jedem Loch von Säulen 1–11 der mit IgG markierten Platten an. Wiederhole dies unter Verwendung von Anti-Mensch IgM mit IgM markierten Platten. Wickle mit Frischhaltefolie ein und inkubiere füreine Stunde bei 37°C.
    • 7. Ligand: Bereite fünf Minuten bevor die Inkubation beendet ist eine 1:1000 Verdünnung des Konjugats von Streptavidin-alkalischer Phosphatase in Tris-Block-Puffer. Wasche die Platten mit FCS viermal und ordne 50 μl der Streptavidin-Verdünnung in jedes Loch der Säulen 1–11. Wickle in Frischhaltefolie ein und inkubiere eine Stunde bei 37°C.
    • 8. Bereite P-Nitrophenylphosphat (PNPP) 30 Minuten bevor die Inkubation beendet ist durch Lösen von Immunopure PNPP-Tabletten in Diethanolamin Substrat-Puffer. Bereite eine Tablette in fünf mL 1× DEA-Substrat-Puffer für jede Platte.
    • 9. Ist die Inkubation beendet, werden die Platten in FCS-Wasch viermal gewaschen und es werden 50 μl von PNPP zu jedem Loch von Säulen 1–11 zugegeben. Wickle in Kunststofffolie ein und gestatte, dass sich durch Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur eine Färbung entwickelt. Am besten wird während der Inkubationsperiode vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubationsperiode wird die Färbungsentwicklung durch Zugabe von 50 μl 3N NaOH zu jedem Loch von Säulen 1–11 gestoppt.
    • 10. Auslesen der Platten bei einer Wellenlänge von 404 nm unter Verwendung eines Titertek Plattenlesegerätes.
  • Die Ergebnisse werden nachfolgend in Tabelle 15 berichtet.
  • Figure 01230001

Claims (31)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung mit mindestens zwei Mitteln, von denen jedes wirksam ist gegen eine unterschiedliche Phase des Lebenszyklus von Chlamydien, worin eines der Mittel ein Rifamycin ist und worin die Mittel ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: a) Mitteln, welche gegen die kryptische Phase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind; b) Mitteln, welche gegen die elementare Körperphase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind; und c) Mitteln, welche gegen die Replikationsphase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin eines der Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Macrolid-Antibiotika und Azalid-Antibiotika.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das gegen die elementare Körperphase wirksame Mittel ein reduzierendes Disulfid-Mittel ist.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das reduzierende Disulfid-Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,3-Dimercaptosuccinsäure, Penicillamin, β-Lactamen, Dithiotreitol, Mercaptoethylamin und N-Acetylcystein.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das reduzierende Disulfid-Mittel Penicillamin ist.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das β-Lactam Amoxicillin ist.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das gegen die kryptische Phase wirksame Mittel eine aromatische Nitroverbindung ist.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die aromatische Nitroverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nitroimidazolen, Nitrofuranen, Analogen, Derivaten und Kombinationen davon.
  9. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–10 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Chlamydien-Infektion.
  10. Ex vivo Verfahren zum Klaren biologischen Materials von Chlamydien, welches den Schritt umfasst, Inkontaktbringen des biologischen Materials mit mindestens zwei Mitteln, von denen jedes gegen eine unterschiedliche Phase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam ist, worin eines der Mittel ein Rifamycin ist, bis das biologische Material gemäß einem Test auf Chlamydien negativ ist, mit dem die elementare Körperphase von Chlamydien, die Replikationsphase von Chlamydien und die kryptische Phase von Chlamydien nachgewiesen wird.
  11. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Mittel ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: a) Mitteln, welche gegen die kryptische Phase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind; b) Mitteln, welche gegen die elementare Körperphase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind; und c) Mitteln, welche gegen die Replikationsphase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind.
  12. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 11, wobei das gegen die elementare Körperphase wirksame Mittel ein reduzierendes Disulfid-Mittel ist.
  13. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 12, wobei das reduzierende Disulfid-Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,3-Dimercaptosuccinsäure, Penicillamin, β-Lactamen, Dithiotreitol, Mercaptoethylamin und N-Acetylcystein.
  14. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 13, wobei das reduzierende Disulfid-Mittel Penicillamin ist.
  15. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 13, wobei das β-Lactam Amoxicillin ist.
  16. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 10, wobei das gegen die kryptische Phase wirksame Mittel eine aromatische Nitroverbindung ist.
  17. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 16, worin die aromatische Nitroverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nitroimidazolen, Nitrofuranen, Analogen, Derivaten und Kombinationen davon.
  18. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 10, wobei eines der Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Makrolid-Antibiotika und Azalid-Antibiotika.
  19. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Test, mit dem die elementare Körperphase von Chlamydien, die Replikationsphase von Chlamydien und die kryptische Phase von Chlamydien nachgewiesen wird, einen Nukleinsäure-Amplifikationsschritt umfasst.
  20. Ex vivo Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Test die Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer mit den Mitteln in Kontakt gebrachten biologischen Probe; b) Inkontaktbringen der Probe mit einem reduzierenden Disulfidmittel; c) Inkontaktbringen der mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel in Kontakt gebrachten Probe mit einer Protease; d) Extrahieren von DNA aus der mit der Protease in Kontakt gebrachten Probe; e) Amplifizieren eines ggf. vorhandenen Chlamydien-Gens oder eines Teils davon aus der extrahierten DNA mittels Polymerasekettenreaktion; und f) Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit des amplifizierten Chlamydien-Gens oder Teils davon.
  21. Verwendung von mindestens zwei Mitteln, von denen jedes gegen eine unterschiedliche Phase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam ist, worin eines der Mittel ein Rifamycin ist, zur Herstellung eines Medikaments oder von Medikamenten zur gleichzeitigen Verabreichung, zum Klären biologischen Materials von Chlamydien, bis das biologische Material gemäß einem Test auf Chlamydien negativ ist, mit dem die elementare Körperphase von Chlamydien, die Replikationsphase von Chlamydien und die kryptische Phase von Chlamydien erfaßt wird.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Mittel ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus a) Mitteln, welche gegen die kryptische Phase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind; b) Mitteln, welche gegen die elementare Körperphase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind; und c) Mitteln, welche gegen die Replikationsphase des Lebenszyklus von Chlamydien wirksam sind.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei das gegen die elementare Körperphase wirksame Mittel ein reduzierendes Disulfidmittel ist.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das reduzierende Disulfid-Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,3-Dimercaptosuccinsäure, Penicillamin, β-Lactamen, Dithiotreitol, Mercaptoethylamin und N-Acetylcystein.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei das reduzierende Disulfid-Mittel Penicillamin ist.
  26. Verwendung nach Anspruch 24, worin das β-Lactam Amoxicillin ist.
  27. Verwendung nach Anspruch 21, wobei das gegen die kryptische Phase wirksame Mittel eine aromatische Nitroverbindung ist.
  28. Verwendung nach Anspruch 27, worin die aromatische Nitroverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nitroimidazolen, Nitrofuranen, Analogen, Derivaten und Kombinationen davon.
  29. Verwendung nach Anspruch 21, wobei eines der Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Makrolid-Antibiotika und Azalid-Antibiotika.
  30. Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Test, mit dem die elementare Körperphase von Chlamydien, die Replikationsphase von Chlamydien und die kryptische Phase von Chlamydien nachgewiesen wird, einen Nukleinsäure-Amplifizierungsschritt umfasst.
  31. Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Test die Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer mit den Mitteln in Kontakt gebrachten biologischen Probe; b) Inkontaktbringen der Probe mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel; c) Inkontaktbringen der mit einem reduzierenden Disulfid-Mittel in Kontakt gebrachten Probe mit einer Protease; d) Extrahieren von DNA aus der mit der Protease in Kontakt gebrachten Probe; e) Amplifizieren eines ggf. vorhandenen Chlamydien-Gens oder eines Teils davon aus der extrahierten DNA mittels Polymerasekettenreaktion; und f) Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit des amplifizierten Chlamydien-Gens oder Teils davon.
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