ES2269115T3 - Diagnostico de la enfermedad de whipple. - Google Patents
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Abstract
Bacteria Tropheryma whippelii responsable de la enfermedad de Whipple aislada y establecida en cultivo.
Description
Diagnóstico de la enfermedad de Whipple.
La presente invención se refiere al campo del
diagnóstico. Más precisamente, la invención se refiere a un método
para el diagnóstico serológico in vitro de la enfermedad de
Whipple así como a un dispositivo para la utilización de dicho
método. La invención se refiere asimismo a un estuche para la
detección in vitro de la bacteria responsable de la
enfermedad de Whipple.
La presente invención se refiere asimismo al
campo de las técnicas de detección y/o de amplificación y
secuenciación con la ayuda de sondas o de cebadores
oligonucleotídicos y su aplicación en la búsqueda de la presencia o
para la identificación de las bacterias de la especia Tropheryma
whippelii.
La enfermedad de Whipple es una enfermedad que
se presenta bajo unas formas variadas. La forma más clásica es la
de una fiebre con diarrea crónica que conlleva adelgazamiento, pero
es además una enfermedad que es susceptible de producir unas
afecciones articulares crónicas, unas afecciones cerebrales con
demencia y asimismo una afección cardiaca en particular una
endocarditis con un hemocultivo negativo. Desde su descripción en
1907, Whipple evoca la existencia de una bacteria asociada a la
"lipodistrofia intestinal" ante la observación de numerosos
microorganismos después de una coloración argéntica de un ganglio
mesentérico (Whipple, Bull. John Hopkins Hosp., 1907;
18:328-391). La puesta en evidencia del carácter PAS
(del inglés, "periodic acid Schiff") positivo no específico de
esta bacteria, y las observaciones al microscopio electrónico
confirman la presencia de una especie bacteriana intracelular de
estructura Gram positiva (Chears et al., Gastroenterology
1961; 41: 129-138). La herramienta molecular
universal ARNr 16S ha permitido confirmar esta hipótesis al precisar
la taxonomía filogénica de esta nueva especie bacteriana, y
asignándole el nombre provisional de Tropheryma whippelii
para evocar la malabsorción intestinal y honrar al descubridor de la
afección (Relman et al., N. Engl. J. Med. 1992; 327:
293-301). La secuenciación directa de 721 bases de
un fragmento amplificado a partir de una biopsia del intestino
delgado de un paciente (Wilson et al., Lancet 1991; 338:
474-475) y después a partir de un ganglio de otro
paciente (Wilson et al., ASM News 1992; 58:
318-321) confirma la originalidad de la especie
bacteriana asociada a la enfermedad de Whipple. La secuenciación por
Relman et al (op. Citado) de 1321 bases que representan el
90% del gen sobre una muestra y un fragmento de 284 en otros cuatro
pacientes ha permitido confirmar que la especie bacteriana asociada
a la enfermedad de
Whipple constituía una nueva especie, precisar su posición taxonómica en el filo de los actinomicetos, es decir de unas bacterias de estructura Gram positivas con un alto contenido en guanosina más citosina, que representa una nueva ramificación relativamente próxima a dos especies conocidas en patología humana, Actinomyces pyogenes y Rothia dentocariosa.
Whipple constituía una nueva especie, precisar su posición taxonómica en el filo de los actinomicetos, es decir de unas bacterias de estructura Gram positivas con un alto contenido en guanosina más citosina, que representa una nueva ramificación relativamente próxima a dos especies conocidas en patología humana, Actinomyces pyogenes y Rothia dentocariosa.
Actualmente, el diagnóstico de la enfermedad se
lleva a cabo mediante observación después de la coloración de unos
frotis microscópico obtenidos de una biopsia o por amplificación y
secuenciación de la herramienta del gen universal ARNr 16S (Reiman
et al., op. Citado).
Hoy en día en efecto, no se ha podido aislar y
cultivar la bacteria responsable de la enfermedad de Whipple de
modo que se pueda prever una serología.
Contra toda previsión, el solicitante ha puesto
a punto un procedimiento que permite el cultivo de la bacteria
responsable de la enfermedad de Whipple.
Los inventores han descubierto que el cultivo
celular que permite el aislamiento y la multiplicación de la
bacteria Tropheryma whippelii debía tener tanto una duración
de vida larga como un tiempo de multiplicación lento. En efecto han
puesto en evidencia que el tiempo de desdoblamiento de la bacteria
es muy largo (18 días). Preferentemente, el
primo-cultivo debe realizarse incluso directamente
sobre unas células inmortalizadas.
Los trabajos anteriores realizados sobre unos
primo-cultivos de monocitos de sangre humana
(SHOEDON et al., "Journal of Infectious Diseases",
Volumen 176, número 3, 1997 páginas 672-677) no han
podido servir de base para establecer un cultivo de la bacteria
Tropheryma whippelii de forma que ésta se pueda multiplicar,
porque la vida media de estos monocitos es de sólo 30 días, lo que
es insuficiente teniendo en cuenta el tiempo del desdoblamiento de
la bacteria.
Además, si las células se multiplican muy
rápido, en relación con el tiempo de crecimiento de la bacteria,
éstas no se pueden cultivar, porque se produce un efecto de dilución
y es imposible segregar las células infectadas en relación con las
células no infectadas.
En una forma de realización preferida, los
inventores han utilizado unas células de fibroblastos
inmortalizadas. Estas células de fibroblastos se extienden en el
fondo del frasco de cultivo, dejan de multiplicarse cuando han
llenado todo el tapiz celular, pero se pueden mantener durante
varios meses vivas en estas condiciones.
Más precisamente, el método de aislamiento y
cultivo de la bacteria que se detalla en los ejemplos 1 y 2
siguientes, comprende la inoculación de un triturado de válvula
cardiaca sobre unos fibroblastos humanos de la línea HEL en un
medio MEM. Se ha aislado la bacteria responsable de la enfermedad de
Whipple y se ha establecido en cultivo después de un mínimo de dos
meses de incubación, se ha sustituido regularmente el medio de
cultivo. Por "establecido en cultivo", se entiende que se
obtiene la bacteria de forma reproductible y se multiplica a lo
largo del tiempo, especialmente por repicado sucesivo del cultivo de
las células.
La presente invención se refiere por lo tanto a
la bacteria aislada de este modo y establecida como fuente de
antígeno. Esta bacteria se ha depositado en la CNCM (París -
Francia) con el número I-2202 y la referencia de
identificación TWIST-Marseille.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un antígeno de la bacteria según la invención. Más particularmente,
la presente invención tiene por objeto un antígeno que es una
proteína seleccionada de entre las proteínas de peso molecular de
aproximadamente 10, 20, 35, 50, 60, 80, 100, 120, 150, 170 y 200 KD
determinadas por electroforesis sobre gel de poliacrilamida según
la técnica de SDS-PAGE y por Western Blot.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un anticuerpo específico dirigido contra la bacteria o un antígeno
según la invención; más particularmente un anticuerpo policlonal de
origen animal, particularmente una inmunoglobulina de ratón o
conejo, o un anticuerpo monoclonal, especialmente un anticuerpo
monoclonal producido por el hibridoma depositado en la CNCM del
Institut Pasteur con el número de registro nº I-2411
y la referencia de identificación TW 17G2.
La presente invención tiene asimismo por objeto
la detección de un anticuerpo específico de una inmunoglobulina
humana que reconoce dicha bacteria, preferentemente IgG, IgM o IgA y
más particularmente una inmunoglobulina animal, especialmente una
inmunoglobulina antihumana de cabra.
La presente invención tiene además más
particularmente como objetivo un antígeno, caracterizado porque se
trata de una proteína de 200 kD que reacciona con un anticuerpo
monoclonal producido por los hibridomas según la invención
mencionados anteriormente.
La presente invención se refiere también a la
utilización de una bacteria, de un antígeno de la bacteria o de un
anticuerpo específico según la invención, en un procedimiento de
diagnóstico in vitro de enfermedades ligadas a unas
infecciones por la bacteria Tropheryma whippelii, así como a
un procedimiento para el diagnóstico serológico de la infección por
la bacteria Tropheryma whippelii según la invención, que
comprende la puesta en contacto del suero o cualquier otro líquido
biológico de un paciente con dicha bacteria y la detección de una
reacción inmunológica.
Más particularmente, la presente invención tiene
por objeto un procedimiento de diagnóstico serológico in
vitro de las infecciones por Tropheryma whippelii, en el
que se pone en contacto la bacteria según la invención, un antígeno
de la bacteria según la invención o un anticuerpo específico según
la invención, con una muestra proveniente de un paciente
constituido por un suero, un fluido biológico, o una muestra
humana.
El procedimiento según la invención comprende la
etapa que consiste esencialmente en detectar una reacción
inmunológica entre un anticuerpo específico de la bacteria según la
invención y un antígeno de dicha bacteria, o entre un anticuerpo
específico de una inmunoglobulina según la invención que reconoce
esta bacteria y dicha inmunoglobulina humana que reconoce dicha
bacteria.
La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento para el diagnóstico serológico in vitro de la
enfermedad de Whipple, que comprende la puesta en contacto del suero
o de cualquier otro líquido biológico de un paciente con la
bacteria tal como se ha definido anteriormente y la detección de la
reacción inmunológica.
En una forma de realización, el procedimiento de
diagnóstico según la invención comprende:
- -
- el depósito en un o sobre un soporte sólido de una solución de bacteria según la invención, particularmente de 0,5 a 5 \mul, preferentemente 1 \mul de dicha solución que contiene dicha bacteria;
- -
- la introducción en o sobre dicho soporte de suero o de fluido biológico que se debe ensayar preferentemente diluido;
- -
- la introducción en o sobre el soporte de una solución de un anticuerpo marcado, particularmente una inmunoglobulina antihumana animal específica de la inmunoglobulina humana, especialmente del tipo IgG, IgM o IgA que reconoce dicha bacteria;
- -
- la observación de un periodo de incubación;
- -
- el aclarado eventual del soporte sólido y
- -
- la detección propiamente dicha de la reacción inmunológica entre especialmente un anticuerpo humano que reconoce dicha bacteria y dicha inmunoglobulina antihumana.
Ventajosamente, el procedimiento de diagnóstico
de la invención utiliza una dosificación inmunoenzimática de tipo
ELISA o una dosificación inmunofluorescente. Más particularmente, el
procedimiento según la invención comprende:
- -
- el depósito en un o sobre un soporte sólido de una solución de bacteria aislada y establecida como se ha indicado anteriormente;
- -
- la introducción en o sobre dicho soporte de suero o de fluido biológico que se debe ensayar diluido;
- -
- la introducción en o sobre el soporte de una solución de inmunoglobulina antihumana marcada;
- -
- la observación de un periodo de incubación;
- -
- el aclarado eventual del soporte sólido y
- -
- la detección propiamente dicha de la reacción inmunológica.
Como soporte sólido, se puede utilizar cualquier
dispositivo adaptado para la manipulación de suspensiones celulares
y bacterianas y particularmente unos tubos, unas láminas de vidrio,
unos tubos de tipo bijoux o unas placas rígidas de microtitulación
en polietileno, poliestireno, cloruro de polivinilo o nitrocelulosa
que presentan unos micropocillos, se prefieren unas láminas de
vidrio.
El anticuerpo detectado es una inmunoglobulina,
particularmente del tipo G, M o A, específica de la bacteria
responsable de la enfermedad de Whipple. Como tipo de marcaje de la
inmunoglobulina antihumana, se utiliza un marcaje enzimático,
radioactivo o fluorescente, preferentemente éste último.
La expresión "marcaje fluorescente"
significa que el anticuerpo se ha hecho fluorescente mediante un
agente fluorescente apropiado como el iso(tio)cianato
de fluoresceína combinada con una inmunoglobulina animal que
reconoce el anticuerpo humano.
La expresión "marcaje radioactivo"
significa que el anticuerpo presenta, o bien sobre un elemento de su
estructura, por ejemplo los residuos de tirosina constituyentes, o
bien sobre un radical adecuado que se ha fijado al mismo, un
isótopo radioactivo que permite dosificarlo por recuento de la
radioactividad que se le asocia.
La expresión "marcaje enzimático" significa
que el anticuerpo se acopla a una enzima que, asociada al uso de
reactivos adecuados, permite una medida cuantitativa de este
anticuerpo específico.
El sustrato y los reactivos se seleccionan de
modo que el producto final de la reacción o de la secuencia de
reacciones provocadas por la enzima y que utiliza dichas sustancias
sea:
o bien una sustancia coloreada o fluorescente
que difunde en el medio líquido envolviendo la muestra ensayada y
que constituye el objetivo, o bien de la medición espectrométrica o
fluorimétrica final, respectivamente, o bien de una evaluación a
ojo desnudo, eventualmente en relación con una gama de tinciones
contrastadas,
o bien una sustancia coloreada insoluble que se
deposita sobre la muestra ensayada y que puede ser el objetivo, o
bien de una medida fotométrica por reflexión, o bien una evaluación
a ojo desnudo, eventualmente en relación con una gama de tinciones
contrastadas.
Cuando se utiliza un anticuerpo convertido en
fluorescente, la fluorescencia asociada a la muestra se lee
directamente en un aparato adecuado.
Cuando se utiliza una sonda radioactiva, como
por ejemplo Yodo 125, la radioactividad asociada a la muestra
ensayada se cuenta en un contador gamma según cualquier modalidad
adecuada y por ejemplo después de la solubilización de las células
en una solución alcalina (por ejemplo una solución de sosa) y
recuperación de la solución que contiene la radioactividad con la
ayuda de un tampón absorbente.
Cuando se utiliza una enzima sobre el anticuerpo
específico, se obtiene la aparición de un producto coloreado o
fluorescente al añadir una solución que contiene el sustrato de la
enzima y uno o más reactivos auxiliares que permiten obtener
finalmente como producto de reacción, o bien un producto coloreado
soluble en el medio o bien un producto coloreado insoluble, o bien
un producto fluorescente soluble como se ha explicado anteriormente.
Se ha medido a continuación la señal luminosa procedente de las
muestras tratadas de este modo, con la ayuda de las herramientas
adaptadas para cada caso: fotómetro en transmisión, o en reflexión o
fluorímetro respectivamente. Alternativamente, se puede evaluar al
ojo desnudo a la coloración obtenida, ayudándose de una gama de
soluciones de coloración contrastadas.
Al utilizar como enzima la fosfatasa alcalina,
el acoplamiento de dicha enzima al anticuerpo específico se efectúa
según el procedimiento propuesto por Boehringer
Mannheim-Biochemica. Los sustratos preferidos de
cada enzima son el paranitrofenilfosfato para una lectura
espectrofotométrica final o el
metil-4-umbelliferilfosfato para
una lectura fluorimétrica o el
bromo-5-cloro-4-indolil-3-fosfato
para obtener un producto de reacción coloreado insoluble. Se puede
asimismo utilizar como enzima la
\beta-galactosidasa cuyos sustratos preferidos
son el ortonitrofenil
\beta-D-galactopiranósido o el
metil-4 umberlliferil
\beta-D-galactopiranósido.
Preferentemente, se pueden acoplar anticuerpos
específicos a la peroxidasa. En este caso, el procedimiento de
acoplamiento se deriva del descrito por M.B. WILSON y P.K. NAKANE in
inmunofluorescence and Related Staining Techniques, W.Knapp, K.
Kolubar, G. Wicks Ed. Elsevier/North Holland. Amsterdam 1978, p.
215-224.
Los reactivos utilizados para revelar la
peroxidasa conjugada con los anticuerpos específicos contienen agua
oxigenada, sustrato de la enzima y un cromogeno adecuado por ejemplo
la ortofenilendiamina o el ácido azino-2,2' bis
(etil-3-tiazolina
sulfónico-6) o ABTS para obtener un producto final
de reacción colocreado y soluble en el medio o bien la
diamino-3,3'-dencidina o el
amino-3-etil-9-carbazol
o el cloro 4-\alpha-naftol para
obtener un producto final de reacción insoluble, o bien el ácido
parahidroxifenil propiónico para obtener un producto de reacción
fluorescente soluble en el medio.
Otra forma de realización de la invención es la
utilización de anticuerpos específicos acoplados a la
acetilcolinesterasa.
La acetilcolinesterasa se acopla al anticuerpo
utilizando preferentemente un procedimiento derivado del descrito
en la patente francesa nº 2 550 779 o un procedimiento que implica
esquemáticamente la preparación de fragmentos del anticuerpo
mediante una técnica conocida, la modificación de la enzima por
reacción con un agente heterobifuncional adecuado y por último el
acoplamiento de productos así obtenidos. Otros procedimientos
conocidos de construcción de conjugado inmunoenzimáticos puede
también utilizarse en este caso.
La revelación de la actividad enzimática ligada
específicamente al antígeno reconocido por el conjugado a la
acetilcolinesterasa se lleva a cabo preferentemente según la técnica
bien conocida que emplea la acetiltiocolina como sustrato de la
enzima y el reactivo de Ellman, o ácido ditio-5,5'
nitro 2-benzoico como cromógeno, según cualquier
variante adaptada al caso examinado, por ejemplo la descrita por
Pradelles et al., en Anal. Chem, 1985, 57:
1170-1173.
Los cromógenos citados se utilizan como tal o en
forma de sales estables en el agua.
El método de diagnóstico serológico de la
invención se adapta a una utilización en unos laboratorios de
biología y/o de anatomopatología. Para este fin, se propone un
dispositivo para la utilización de dicho procedimiento, que
comprende un soporte sólido sobre o en el que se deposita una
solución que contiene la bacteria como se ha definido
anteriormente.
La invención se refiere asimismo según otro
aspecto a un estuche para la detección in vitro de la
bacteria responsable de la enfermedad de Whipple. Dicho estuche
comprende como componentes:
- -
- una solución que contiene la bacteria o un antígeno según la invención, y/o,
- -
- una solución que contiene por lo menos un anticuerpo según la invención y/o,
- -
- una solución que contiene por lo menos un anticuerpo específico de una inmunoglobulina humana que la reconoce.
Más particularmente, el estuche comprende:
- -
- una solución que contiene la bacteria responsable de la enfermedad de Whipple, aislada y establecida como se ha descrito anteriormente, a modo de control positivo,
- -
- una solución que contiene un anticuerpo específico marcado,
- -
- eventualmente, una solución de lavado.
El anticuerpo específico utilizado en el estuche
de la invención está ventajosamente marcado por una sonda
radioactiva, una enzima o un agente fluorescente.
Cuando el anticuerpo específico está marcado por
una enzima, el estuche comprende además el sustrato de la enzima y
uno o varios reactivos para visualizar la actividad de la
enzima.
Cuando el anticuerpo específico está marcado por
un agente fluorescente, se utiliza preferentemente el
iso(tio)cianato de fluoresceína.
Según una forma de realización preferida de la
invención, se utiliza como anticuerpo específico una
inmunoglobulina, en particular una inmunoglobulina de ratón.
La presente invención tiene asimismo como
objetivo el gen rpoB de la bacteria Tropheryma
whippelii según la presente invención. La secuencia del gen
rpoB se ha determinado por amplificación enzimática y
secuenciación automática directa con unos cebadores consenso entre
un gran número de otras bacterias, de géneros y especies
diferentes.
El gen rpoB codifica para una de las
subunidades de la ARN polimerasa bacteriana y constituye un marcador
genético que permite la detección específica de la bacteria de la
especie Tropheryma whippelii.
Más particularmente, la presente invención tiene
por objeto un fragmento del gen rpoB, caracterizado porque
presenta la secuencia nucleotídica SEC ID nº 3 de la lista de
secuencias adjunta.
La presente invención se refiere asimismo por lo
tanto a unas secuencias de ácidos nucleicos específicos de la
especie Tropheryma whippelii, cuya secuencia nucleotídica se
ha obtenido del gen rpoB de dicha bacteria y especialmente
del fragmento del gen rpoB apuntado anteriormente.
Según Lazcano et al [J. Mol. Evol. (1988)
27: 365-376], las ARN polimerasas se dividen en dos
grupos dependiendo de su origen, uno constituido por las ARN
polimerasas víricas ARN o ADN dependientes, y el otro constituido
por las ARN polimerasas ADN-dependientes de origen
eucariota o procariota (arqueobacterias y eubacterias). Las ARN
polimerasas ADN dependientes eubacterianas se caracterizan por una
constitución multimérica simple y conservada marcada como "core
enzyme", representada por \alpha\beta\beta' u
"holoenzima" representado por \alpha\beta\beta'\sigma
[Yura and Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979)
13:59-97].
Numerosos experimentos han puesto en evidencia
el papel funcional, en el seno del complejo enzimático multimérico,
de la subunidad \beta de la ARN polimerasa eubacteriana. Las ARN
polimerasas arqueobacterianas y eucariotas presentan, por su parte,
una estructura muy compleja que pueden alcanzar la decena, o incluso
la treintena de subunidades [Pühler et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1989) 86:4569-4573).
Los genes que codifican para las diferentes
subunidades \alpha\beta\beta'\sigma de la ARN polimerasa
ADN dependiente en las eubacterias, respectivamente los genes
rpoA, rpoB, rpoC y rpoD se clasifican en
diferentes subgrupos que comprenden unos genes que codifican para
unas proteínas constitutivas de subunidades ribosómicas o para unas
enzimas implicadas en la replicación y la reparación del genoma
[Yura and Yshihama, Ann. Rev. Genet. (1979)
13:59-97]. Determinados autores han demostrado que
las secuencias nucleicas de los genes rpoB y rpoC se
pueden utilizar respectivamente para construir unos árboles
filogenéticos [Rowland et al., Biochem. Soc. Trans. (1992)
21:40s] que permiten separar las diferentes ramificaciones y
subramificaciones de entre los reinos vivos.
Antes de exponer con más detalle este aspecto de
la invención, a continuación se definen diferentes térmicos
utilizados en la descripción y las reivindicaciones:
- -
- por "ácido nucleico extraído de bacterias" se entiende o bien el ácido nucleico total, o bien el ADN genómico, o bien los ARN mensajeros, o bien incluso el ADN obtenido a partir de la transcripción inversa de los ARN mensajeros;
- -
- un "fragmento nucleotídico" o un "oligonucleótido" son dos términos sinónimos que describen el encadenamiento de motivos nucleotídicos caracterizado por una secuencia informativa de los ácidos nucleicos naturales (o eventualmente modificados) y susceptibles de hibridarse, como los ácidos nucleicos naturales, con un fragmento nucleotídico complementario o sensiblemente complementario, en unas condiciones predeterminadas de astringencia estricta. El encadenamiento puede contener unos motivos nucleotídicos de estructura diferente a la de los ácidos nucleicos naturales. Un fragmento nucleotídico (u oligonucleótido) puede contener por ejemplo hasta 100 motivos nucleotídicos. Generalmente contiene por lo menos 10, y en particular por lo menos 12 motivos nucleotídicos y se puede obtener a partir de una molécula de ácido nucleico natural y/o por recombinación genética y/o por síntesis química,
- -
- un motivo nucleotídico deriva de un monómero que puede ser un nucleótido natural de ácido nucleico cuyos elementos constitutivos son un azúcar, un grupo fosfato y una base nitrogenada seleccionada de entre la adenina, la guanina, el uracilo, la citosina, la timina; o bien el monómero es un nucloeótido modificado en por lo menos uno de los tres elementos constitutivos anteriores; a modo de ejemplo, la modificación puede intervenir o bien a nivel de las bases con unas bases modificadas como la inosina, la metil-5-desoxicitidina, la desoxiuridina, la dimetilamino-5-desoxiuridina o cualquier otra base modificada capaz de producir hidratación, o bien a nivel del azúcar, por ejemplo la sustitución de por lo menos una desoxirribosa por una poliamida [P.E. Nielsen et al., Science, (1991) 254: 1497-1500] o bien incluso a nivel del grupo fosfato, por ejemplo por sustitución por unos ésteres seleccionados de entre los difosfatos, los aquil- y arilfosfonatos y los fosforotioatos,
- -
- por "secuencia informativa" se entiende cualquier cadena ordenada de motivos de tipo nucleotídico, cuya naturaleza química y el orden en el sentido de referencia constituyen una información análoga a la proporcionada por la secuencia de los ácidos nucleicos naturales,
- -
- por "hibridación" se entiende el proceso a través del cual, en unas condiciones adecuadas, dos fragmentos nucleotídicos que presentan unas secuencias suficientemente complementarias son susceptibles de asociarse por unos enlaces de hidrógeno estables y específicos, para formar una doble hebra. Las condiciones de hibridación se determinan por la "astringencia", es decir el rigor de las condiciones operativas. La hibridación es por tanto más específica cuando se efectúa a una astringencia más fuerte. La astringencia está en función especialmente de la composición en bases de un conjunto sonda/diana, así como del grado de desapareamiento entre dos ácidos nucleicos. La astringencia puede asimismo estar en función de los parámetros de la reacción de hibridación, como la concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la solución de hibridación, la naturaleza y la concentración de agentes desnaturalizantes y/o de la temperatura de hibridación. La astringencia en unas condiciones en las que debe realizarse una reacción de hibridación depende principalmente de las sondas utilizadas. Todos estos datos son bien conocidos y las condiciones adecuadas pueden determinarse eventualmente en cada caso mediante unos experimentos de rutina. En general, según la longitud de las sondas utilizadas, la temperatura para la reacción de hibridación está comprendida entre aproximadamente 20 y 65ºC, en particular entre 35 y 65ºC en una solución salina a una concentración de aproximadamente 0,8 a 1 M,
- -
- una "sonda" es un fragmento nucleotídico que comprende por ejemplo de 10 a 100 motivos nucleotídicos, particularmente de 12 a 35 motivos nucleotídicos, que presenta una especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para formar un complejo de hibridación con un ácido nucleico que presenta, en el caso actual, una secuencia nucleotídica comprendida ya sea en un ARN mensajero, o bien en un ADN obtenido por transcripción inversa de dicho ARN mensajero, producto de la transcripción; se puede utilizar una sonda con fines diagnósticos (particularmente las sondas de captura o de detección) o con unos fines terapéuticos,
- -
- una "sonda de captura" está inmovilizada o es inmovilizable sobre un soporte mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo por covalencia, por adsorción, o por síntesis directa sobre un sólido. Unos ejemplos de soportes comprenden unas placas de microtitulación y las matrices de ADN,
- -
- una "sonda de detección" se puede marcar mediante un agente marcador seleccionado de entre los isótopos radioactivos, las enzimas, en particular las enzimas susceptibles de reaccionar con un sustrato cromógeno, fluorígeno o luminiscente (especialmente una peroxidasa o una fosfatasa alcalina), los compuestos químicos cormóforos, los compuestos cromógenos, fluorígenos o luminiscentes, los análogos de bases nucleotídicas y los ligandos como la biotina,
- -
- una "sonda de especie" es una sonda que permite la identificación de la especie de una bacteria,
- -
- una "sonda de género" es una sonda que permite la identificación del género de una bacteria,
- -
- un "cebador" es una sonda que comprende por ejemplo de 10 a 100 motivos nucleotídicos y que presenta un especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para la iniciación de una polimerización enzimática, por ejemplo en una técnica de amplificación como la PCR, en un proceso de secuenciación, en un procedimiento de transcripción, etc…
Un objeto de la presente invención es un
oligonucleótido monocatenario seleccionado de entre los
oligonucleótidos que presentan una secuencia de por lo menos 12
motivos nucleotídicos consecutivos incluidos en una de las
secuencias SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5 en el listado de las secuencias
adjunta y de entre los oligonucleótidos complementarios de dichos
oligonucleótidos. Dichos oligonucleótidos pueden ser unos
oligodesoxiribonucleótidos (ADN) y unos oligoribonucleótidos (ARN)
en los que "T" se ha sustituido por "U".
En particular, un oligonucleótido según la
presente invención presenta por lo menos 12 motivos como los
descritos anteriormente y como máximo 50 motivos. Más
particularmente, un oligonucleótido según la presente invención
presenta de 12 a 35 motivos.
Un oligonucleótido preferido presenta una
secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 4 y 5.
La inosina es capaz de aparearse con cualquier
otra base.
Las secuencias SEC ID nº 4 y 5 se pueden
preparar por síntesis química utilizando las técnicas bien conocidas
por el experto en la materia y descritas por ejemplo en el artículo
de Itakura et al., [(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:223].
Una primera aplicación de un oligonucleótido de
la invención es su utilización como sonda para la detección, en una
muestra biológica, de bacterias de la especie Tropheryma
whippelii que comprende una secuencia nucleotídica de por lo
menos 12 motivos nucleotídicos consecutivos incluidos en una de las
secuencias SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5 y sus secuencias
complementarias. En la continuación de la descripción, tal sonda de
la invención se denominará sonda de la especie.
Las sondas según la invención se pueden
utilizar, con fines de diagnóstico, en la búsqueda de la presencia
o ausencia de un ácido nucleico diana en una muestra, según todas
las técnicas de hibridación conocidas y especialmente las técnicas
de depósito puntual sobre un filtro, denominadas
"DOT-BLOT" [Maniatis et al. (1982)
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor], las técnicas de
transferencia de ADN denominadas "SOUTHERN BLOT" [Southern
E.M., J. Mol. Biol. (1975) 98:503], las técnicas de transferencia
del ARN denominadas "NORTHERN BLOT", o las técnicas
denominadas "sándwich" [Dunn A.R:, Hassel J.A. (1977) Cell
12:23]. Se utiliza en particular la técnica de "sándwich", con
una sonda de captura y/o una sonda de detección, dichas sondas son
capaces de hibridarse en dos regiones diferentes del ácido nucleico
diana, y por lo menos una de dichas sondas (generalmente la sonda
de detección) es capaz de hibridarse con una región de la diana que
es específica de la especie, entendiendo que la sonda de captura y
la sonda de detección deben tener unas secuencias nucleotídicas por
lo menos parcialmente diferentes.
El ácido nucleico que se debe detectar (diana)
puede ser de ADN o de ARN (uno u otro eventualmente obtenido
después de amplificación por PCR). En el caso de la detección de una
diana de tipo ácido nucleico de doble hebra, resulta conveniente
desnaturalizar éste último antes de utilizar el procedimiento de
detección. El ácido nucleico diana se puede obtener por extracción
según los procedimientos conocidos de los ácidos nucleicos de una
muestra a examinar. La desnaturalización de un ácido nucleico de
doble hebra se puede llevar a cabo utilizando los procedimientos
conocidos de desnaturalización química, física o enzimática, y en
particular por calentamiento a una temperatura adecuada, superior a
80ºC.
Para utilizar las técnicas de hibridación
citadas anteriormente, y en particular de las técnicas de
"sándwich", una sonda de la invención denominada sonda de
captura se inmoviliza sobre un soporte sólido, y otra sonda de la
invención, denominada sonda de detección, se marca con un agente
marcador.
Los ejemplos de soportes y de agente marcador
son como se han definido anteriormente.
Otro objeto de la presente invención es un
procedimiento para la determinación de la presencia o ausencia de
una bacteria Tropheryma whippelii, en una muestra que
contiene o es susceptible de contener unos ácidos nucleicos de por
lo menos dicha bacteria, que comprende las etapas que consisten en
poner en contacto dicha muestra con por lo menos una sonda de la
especie de la invención, después en determinar de forma conocida la
formación o la ausencia de formación de un complejo de hibridación
entre dicha sonda y el ácido nucleico de la muestra.
Unos ejemplos de detección de la formación o
ausencia de formación de un complejo de hibridación entre dicha
sonda y el ácido nucleico comprenden las técnicas descritas
anteriormente, es decir las técnicas
"DOT-BLOT", "SOUTHERN BLOT " y
"sándwich".
Según una forma de utilización particular dicho
procedimiento para la determinación de la presencia o ausencia de
una especie de Tropheryma whippelii, se utilizan varias
sondas de especie de la invención, entendiendo que dichas sondas
son capaces de hibridrarse con unas regiones no redundantes de un
ácido nucleico que corresponde al gen rpoB de Tropheryma
whippelii.
De forma ventajosa, una sonda de especie se
inmoviliza sobre un soporte sólido y otra sonda de especie se marca
con un agente marcador.
Otra aplicación de un oligonucleótido de la
invención es su utilización como cebador nucleotídico que comprende
un oligonucleótido monocatenario seleccionado de entre los
oligonucleótidos que comprende una secuencia de por lo menos 12
motivos nucleotídicos incluida en una de las secuencias SEC ID nº 4
y SEC ID nº 5 que es utilizable en la síntesis de un ácido nucleico
en presencia de una polimerasa mediante un procedimiento conocido
por sí mismo, particularmente en unos procedimientos de
amplificación que utilizan tal síntesis en presencia de una
polimerasa (PCR, RT-PCR, etc.). En particular, un
cebador de la invención se puede utilizar para transcripción
inversa específica de una secuencia de ARN mensajero de
Tropheryma whippelii para obtener una secuencia del ADN
complementario correspondiente. Tal transcripción inversa puede
constituir la primera etapa de la técnica de
RT-PCR, la etapa siguiente sería la amplificación
por PCR del ADN complementario obtenido. Se pueden asimismo
utilizar unos cebadores de la invención para la amplificación
específica por reacción de polimerización en cadena de la secuencia
total del ADN del gen rpoB de Tropheryma
whippelii.
Según un caso particular, dicho cebador que
comprende un oligonucleótido de la invención comprende además la
secuencia sentido o antisentido de un promotor reconocido por una
ARN polimerasa (promotores T7, R3, SP6 por ejemplo [Studier FW, BA
Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189:113], tales cebadores son
utilizables en unos procedimientos de amplificación de ácido
nucleico que hace intervenir una etapa de transcripción, como por
ejemplo las técnicas NASBA o 3SR [Van Gemen B. et al.,
Abstract MA 1091, 7^{th} Internacional Conference on AIDS (1991)
Florence, Italy].
Otro objeto de la invención es un cebador
nucleotídico que comprende un oligonucleótido monocatenario
seleccionado de entre los oligonucleótidos que comprende una
secuencia de por lo menos 12 motivos nucleotídicos consecutivos
incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5 que es
utilizable para la secuenciación total o parcial del gen
rpoB de una cepa cualquiera de Tropheryma whippelii.
En particular, el cebador nucleotídico es utilizable para la
secuenciación de un ácido nucleico amplificado. La secuenciación es
la obtención de la secuencia total o parcial del gen rpoB
mediante un procedimiento conocido, polimerización absortiva que
utiliza unos di-desoxinucleótidos [Sanger F.,
Coulson A.R., (1975) J. Mol. Biol. 94:441] o hibridaciones múltiples
que utilizan unas matrices de ADN.
Preferentemente, en una utilización como cebador
o para la secuenciación de los genes rpoB, se utilizan las
secuencias SEC ID nº 4 y 5.
Por último, un último objeto de la invención es
una sonda de terapia génica para tratar las infecciones provocadas
por una cepa de Tropheryma whippelii, comprendiendo dicha
sonda un oligonucleótido como se ha definido anteriormente. Dicha
sonda de terapia génica, capaz de hibridarse sobre el ARN mensajero
y/o sobre el ADN genómico de dichas bacterias, puede bloquear los
fenómenos de traducción y/o de transcripción y/o de replicación.
El principio de los métodos de terapia génica es
conocido y radica particularmente en la utilización de una sonda
que corresponde a una hebra antisentido: la formación de un híbrido
entre la sonda y la hebra es capaz de perturbar por lo menos unas
de las etapas de encriptación de la información genética. Las sondas
de terapia génica son por lo tanto utilizables como medicamentos
antibacterianos, que permiten luchar contra las infecciones
causadas por las espiroquetas.
La invención se entenderá mejor a partir de la
descripción siguiente, dividida en ejemplos, que se refiere a unos
experimentos realizados con el fin de llevar a cabo la invención, y
que se presentan a título únicamente ilustrativo.
Las figuras 1 a 4 son unas fotografías de gel de
electroforesis.
La figura 1 representa el perfil proteico sobre
SDS-PSGE de Tropheryma whippelii.
La figura 2 representa el perfil antigénico de
Tropheryma whippelii obtenido por Western Blot.
- Línea 1 = suero de ratón inmunizado.
- Línea 2 = suero de conejo inmunizado.
- Línea 3 = suero de paciente (IgG + IgM).
- Línea 4 = anticuerpo monoclonal 1.
- Línea 5 = anticuerpo monoclonal 2.
- Línea 6 = anticuerpo monoclonal 3.
- Línea 7 = anticuerpo monoclonal 4.
La figura 3 representa un Western Blot realizado
sobre una cepa TWIST Nº I-2202 con un suero de
paciente afectado de la enfermedad de Whipple con detección de
IgM.
La figura 4 representa la visualización del
producto de amplificación del gen rpoB de Tropheryma
whippelii con unos cebadores de SEC ID nº 1 y 2 después de la
coloración con bromuro de etidio.
- Línea 1 = Tropheryma whippelii
- Línea 2 = Nocardia otitidiscaviarum
- Línea 3 = Mycobacterium tuberculosis
- Línea 4 = Staphylocccus epidemidis
- Línea 5 = Corynebacterium amycolatum
- Línea 6 = Mycobacterium avium
- Línea 7 = Escherichia coli
- Línea 7 = H_{2}O
- Línea 7 = H_{2}O
Ejemplo
1
El primoaislamiento se ha llevado a cabo con la
técnica de centrifugación sobre unos tubos de tipo bijoux
inoculados con una línea de fibroblastos humanos HEL disponible en
la ATCC. Las células HEL se cultivan en medio MEM (Gibco) al que se
añade el 10% de suero bovino fetal (Gibco) y 2 mM de
L-glutamina (Gibco). Los tubos de tipo bijoux
(Sterilin-Fletan-England 3,7 ml) que
presentan una lámina de soporte de 12 mm de diámetro se inoculan
con 1 ml de medio de cultivo que contiene aproximadamente 50.000
células y se incuban a una temperatura de 37ºC durante 3 días al 5%
de CO_{2} de forma que se obtiene un tapiz de células confluentes.
La válvula cardiaca estudiada se tritura en medio MEM, y la
suspensión se utiliza para inocular los tres tubos de tipo bijoux.
Estos tubos se centrifugan después a 700 g durante 1 hora a una
temperatura de 22ºC. A continuación se retira el sobrenadante, las
células se lavan dos veces con tampón PBS estéril, y se incuban a
continuación con 1 ml de medio a una temperatura de 37ºC al 5% de
CO_{2.} El seguimiento de los cultivos se realiza por
citocentrifugación de 100 \mul de sobrenadante de los tubos de
tipo bijoux y coloración de Giménez. Se repite este procedimiento a
los 10, 20 y 30 días. Al cabo de 30 días se recogen el sobrenadante
y el tapiz celular de los tubos de tipo bijoux y se repican sobre
una extensión celular confluente en un frasco de cultivo de 25
cm^{2} (frasco 1) con 15 ml de medio de cultivo y se incuban a
37ºC al 5% de CO_{2}. Durante las 6 semanas siguientes cada
semana (J72), se examina la extensión de células con la ayuda de un
microscopio invertido con el fin de estudiar un efecto citopatógeno
y se sustituye el medio de cultivo por medio fresco. Antes de
cambiar el medio, se utilizan 200 \mul para realizar una
citocentrifugación coloreada por coloración de Giménez.
No se ha detectado ningún efecto citopatógeno
antes del día 65. Al día 72, el examen del tapiz celular en el
microscopio inverso ha permitido detectar unas pequeñas inclusiones
oscuras e irregulares de las células HEL. Se han detectado varios
bacilos finos sobre la coloración de Giménez de la
citocentrifugación del sobrenadante del frasco 1, la mayoría de
localización intracelular donde son más pequeños que los
extracelulares. Sin embargo, la mayoría estaban mal teñidos o sin
teñir por la coloración de Giménez y aparecen muy pálidos. Se han
detectado numerosos bacilos con la tinción de Gram. La mayoría son
Gram positivos pero muchos sólo eran parcialmente violetas o
parecían Gram negativos. Con la tinción de Ziehl dichos bacilos no
son ácido-alcohol resistentes. Con la tinción por
PAS, los bacilos PAS positivos son más numerosos que en las
coloraciones anteriores, La mayoría de los bacilos largos son
observables en localización extracelular. Las células HEL parecían
llenas de conglomerados PAS positivo y de finos y cortos bacilos
PAS positivo.
Ejemplo
2
Todo el proceso se ha realizado sobre unas
células HEL cultivadas en medio MEM al que se añade el 10% de suero
bovino fetal y 2 mM de L-glutamina y se incuban a
una temperatura de 37ºC al 5% de CO_{2.} A los 75 días se han
utilizado 3 ml de sobrenadante del frasco 1 para inocular 10 tubos
de tipo bijoux mediante el método utilizado anteriormente y 2 ml de
sobrenadante se han utilizado para tapiz celular confluente en un
frasco de cultivo de 25 cm^{2} (frasco A) con 15 ml de medio. Se
recogen las células del frasco 1 así como el resto de sobrenadante
que han permitido obtener 10 ml de suspensión. Esta suspensión se ha
dividido después en 5 alicuotas de ml. Una de las alícuotas se ha
congelado en nitrógeno líquido. Se ha inoculado una alícuota sobre
el tapiz celular en un frasco de cultivo de 25 cm^{2} (frasco B)
con 15 ml de medio. Se han lisado las células de una alícuota
mediante 4 ciclos de congelación-descongelación
utilizando nitrógeno liquido y agua caliente (55ºC) y se han
inoculados a continuación sobre un tapiz celular confluente en un
frasco de cultivo de 25 cm^{2} (frasco C) con 15 ml de medio. Se
ha inoculado una alícuota en un frasco de cultivo sin tapiz celular
de 25 cm^{2} (frasco D) con 15 ml de medio. Al día 85, el medio de
todos los frascos y de todos los tubos de tipo bijoux se ha
sustituido por medio fresco. Las células se han recogido e inoculado
en un frasco de cultivo de 75 cm^{2} (frasco D2) con 30 ml de
medio. Antes de cambiar el medio, se han utilizado 200 \mul de
sobrenadante para realizar una citocentrifugación coloreada mediante
una coloración por el PAS y el resto de sobrenadante se ha
congelado con vistas a ser utilizado como antígeno para la
serología. A los días 95 y 105, se ha cambiado el medio de todos
los frascos y tubos de tipo bijoux tal como se ha descrito
anteriormente. Se han rascado pequeñas porciones del tapiz celular
con de fin de realizar unos frotis de las células con vistas a una
coloración utilizando el PAS. La eficacia de la propagación de la
cepa se ha llevado a cabo mediante una evaluación semicuantitativa.
La presencia de bacilos PAS positivos se ha evaluado
microscópicamente utilizando un aumento de X1000 de la forma
siguiente: 0, ausencia, +, presentes pero difíciles de encontrar,
++, más fáciles de encontrar en todos los campos, +++, presentes en
todos los campos. Dichas evaluaciones se han realizado a
ciegas.
Todos los procedimientos de propagación se han
mostrado eficaces ya que todos han permitido encontrar la muestra
después de 30 días de subcultivo (Tabla 1). La evaluación
semicuantitativa ha permitido observar que los procesos más
eficaces son el repicado de los tubos de tipo bijoux, el subcultivo
de sobrenadantes (frasco A) y el repicado de células (frascos D,
D2).
| Tubo de tipo bijoux | Frasco A | Frasco B | Frasco C | Frasco D | Frasco D2 | ||
| Día 10 | Sobrenadante | + | - | + | - | + | NH |
| Día 20 | Sobrenadante | + | - | + | + | NH | - |
| Frotis celular | NH | + | + | + | NH | - | |
| Día 30 | Sobrenadante | +++ | +++ | ++ | + | NH | ++ |
| Frotis celular | NH | ++ | + | + | NH | ++ | |
| NH: no hecho |
Ejemplo
3
La detección de las bacterias intracelulares se
ha realizado al día 105 directamente en un tubo de tipo bijoux por
inmunofluorescencia. Después de la fijación con acetona, se ha
lavado el tubo dos veces con PBS. Se han añadido 100 \mul de
suero del paciente diluido al 1:50 con PBS con 3% de leche
descremada y se ha incubado el tubo en una cámara húmeda a 37ºC
durante 30 min. Después de tres lavados con PBS se ha incubado el
tubo durante 30 min a 37ºC con 100 \mul de inmumglobulina de
cabra antihumana marcada con isotiocianato de fluoresceína
(Fluoline H, Biomerieux, Marcy l'Etoile, France) diluida al 1:200
con PBS al que se han añadido 0,2% de Azul de Evans. Después de 3
lavados con PBS se ha montado la lámina (las células hacia abajo) en
glicerina tamponada (pH 8) y se han examinado con un aumento x400
con la ayuda de un microscopio de fluorescencia Zeiss y de un
microscopio confoncal (LEICA DMIRBE) provisto de un objetivo x 100
(NA. 1,4) a inmersión.
El examen con inmunofluorescencia muestra que la
coloración por el PAS así como las otras coloraciones evalúan la
infección celular. En la lámina después de 30 días de subcultivo
todas las células están llenas de antígeno bacteriano. EL estudio
con el microscopio confocal confirma la localización intracelular de
la bacteria. Se detectan muchas bacterias aisladamente en forma de
bacilos finos que se parecen a los observados con coloración PAS.
Sin embargo, la mayoría de material inmunopositivo corresponde a
grandes inclusiones en las que es posible individualizar unas
bacterias. No se detecta material inmunopositivo en el núcleo de las
células.
Ejemplo
4
Al día 105, se prepararon 300 \mul de una
solución que contiene las células recogidas del frasco D2 para el
estudio al microscopio electrónico. Las células se han fijado en una
solución de glutaraldehído al 2,5% en tampón cacodilato 0,1 M que
contiene sacarosa 0,1 M durante 1 hora a una temperatura de 4ºC. Se
han aclarado las células una noche en el mismo tampón y se han
fijado a continuación 1 hora a temperatura ambiente en tetraóxido
de osmio en tampón cacodilato 0,1 M. La deshidratación se llevado a
cabo por lavados sucesivos en unas soluciones de etanol a
concentraciones crecientes. A continuación se han incluido las
células en unos bloques de Epon 812. Después se han cortado unas
secciones finas a partir de los bloques con la ayuda de un microtomo
LKB ultratomo III y después se han teñido con una solución saturada
de acetato de uranilo en el metanol y una solución acuosa de
citrato de plomo antes del examen en el microscopio electrónico Jeol
JEM 1200 EX.
El estudio al microscopio electrónico confirma
que las inclusiones PAS positivo y el material inmunopositivo
corresponden a unas bacterias intactas o en vía de degradación. La
membrana citoplasmática de estas bacterias está compuesta por dos
capas densas a los electrones. La pared bacteriana fina está a veces
recubierta por una seudomembrana externa que da un aspecto
trilaminar. Se han observado unas bacterias en división.
Ejemplo
5
Se ha inyectado un ratón de la cepa Balb C de
forma intraperitoneal con 0,5 ml de sobrenadante que contiene
10^{4} bacterias responsables de la enfermedad de Whipple. Después
se ha reinyectado el ratón 1, 2 y 3 semanas después con 0,5 ml de
la misma suspensión. Se ha desangrado el ratón 1 semana después de
la última inyección. Se ha ensayado el suero por una parte contra
la bacteria responsable de la enfermedad de Whipple en cultivo y
por otra parte sobre la válvula de un paciente que padece la
enfermedad de Whipple, una vez por inmunofluorescencia y una vez
por inmunoperoxidasa. Los anticuerpos reveladores eran unos
anticuerpos antiratón marcados con fluoresceína o marcados con
inmunoperoxidasa (suministrada por la empresa Inmunotech).
Se han podido visualizar las bacterias en el
interior de las células. La presente solicitud se refiere por lo
tanto asimismo a la detección directa de la bacteria responsable de
la enfermedad de Whipple en las biopsias y las diferentes
extracciones por ejemplo: válvula cardiaca, biopsia digestiva o
biopsia de cualquier otro órgano que se sospecha pueda estar
infectado por la bacteria responsable de la enfermedad de
Whipple.
Ejemplo
6
Cepa de Tropheryma whippelii. La cepa de
Tropheryma whippelii utilizada para producir y cribar los
hibridomas y ensayar la especificidad de los anticuerpos
monoclonales (Mabs) es la cepa TWIST-Marseille
depositada en el CNCM Nº 1-2202. Se ha cultivado
Tropheryma whippelii sobre unos fibroblastos embrionarios
humanos (HEL) en las condiciones de cultivo descritas
anteriormente. Al día 75, se han extraído las células infectadas en
un frasco y se han centrifugado 10 minutos a 4000 g. El depósito de
la centrifugación se ha resuspendido a continuación en 5 ml de PBS.
Se han inoculado 0,5 ml de esta suspensión en cada ratón. Asimismo
se han purificado las bacterias por gradiente de renografina y se
han resuspendido en agua desionizada para el
SDS-PAGE o en PBS para la microinmunofluorescencia
(MIF).
Producción de anticuerpos monoclonales (Mabs),
Unos ratones BALB/C hembra de seis semanas se han inoculado tres
veces en un intervalo de 7 días mediante una inyección
intraperitoneal de 0,5 ml de suspensión de Tropheryma
whippelii TWIST-Marseille CNCM Nº
1-2202 en PBS. Una semana después de la última de
las 3 inyecciones, los ratones han recibido una dosis de recuerdo
en IV de 0,1 ml de Tropheryma whippelii en suspensión en PBS.
Tres días más tarde, se ha extraído el bazo de los ratones
inmunizados y se han fusionado las células esplénicas con unas
células mielomatosas SP2/0-Ag14 (10:1) utilizando
polietilenglicol al 50% (peso molecular:
1.300-1.600; Sigma Chemical Co., St Louis, Mo.) Las
células fusionadas se han cultivado en un medio de cultivo para
hibridoma (Seromed. Berlin, Germany) suplementado con suero bovino
fetal al 20% (Gibco BRL) e hipoxantina
aminopterin-timidina (Sigma Chemical CO., St Louis,
Mo). a una temperatura de 37ºC en una atmósfera húmeda enriquecida
de 5% en CO_{2}.
Se ha detectado la presencia de anticuerpos anti
T. whippelii en el sobrenadante por MIF. Los hibridomas
positivos se han cultivado para la producción de ascitis. Los
isótopos de los Mabs se han determinado con la ayuda de un kit
inmuno Type Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (SIGMA) que
contiene unos antisueros de ratón IgM IgA IgG1 IgG2a IgG2b y IgG3
(Sigma). La especificidad de los Mabs se ha ensayado por Western
blot. Una semana después de la inyección intraperitoneal a los
ratones de 0,5 ml de pristane (2, 62 10,
14-tetrametilpendecano; Sigma), se han producido
los anticuerpos en ascitis por inyección intraperitoneal de
3x10^{6} hibridomas en suspensión en 0,5 ml de PBS.
Microinmunofluorescencia (MIF). Se ha utilizado
la MIF para el cribado de los hibridomas y para determinar la
especificidad de los Mabs. Los antígenos constituidos por unos
cultivos de Tropheryma whippelii se han depositado sobre
unas láminas de 24 pocillos con la ayuda de una pluma. Después de la
fijación con metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente, se
han depositado e incubado los Mabs en una cámara húmeda a 37ºC
durante 30 minutos. A continuación se han lavado las láminas dos
veces 5 minutos en PBS y después con agua destilada, se han secado
al aire y se han incubado a continuación durante 30 minutos a 37ºC
con la ayuda de un anticuerpo de cabra antiIgM y antiIgG de ratón
conjugados con la fluoresceína, se han diluido al 1/200 en PBS que
contiene 0,2% de azul Evans (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia).
Después del aclarado, se han montado las láminas con la ayuda de
Fluorep (BioMérieux) y se han examinado a continuación en un
microscopio de fluorescencia con un aumento de x400 (Axloskop 20;
Carl Zeiss, Gottinge, Germany). Los sueros de los ratones
inmunizados se han utilizado como controles positivos y los sueros
de los ratones sanos como controles negativos.
Para detectar los anticuerpos anti Tropheryma
whippelii en el suero de los pacientes afectados por la
enfermedad de Whipple, se ha realizado la MIF sobre las láminas
Labtech [Raoult D. et al., N. Engl. J. Med., 2000]. Se han
diluido los sueros al 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 y 1:800.
SDS-PAGE y Western Blot. El
SDS-PAGE y el Western Blot se han efectuado según el
procedimiento de Laemmli modificado para la utilización de un gel
separador al 12% de poliacrilamida y de un gel de transferencia al
5%. Se ha calentado una suspensión de Tropheryma whippelii
que contiene 4 mg de proteína/ml en tampón (Tris hidrocloruro
0,0625 [Ph 8,0], SDS 2%, 2-mercaptoetanol al 5% y
glicerol al 10%, azul de bromofenol al 0,02%) a 100ºC durante 5
minutos. Los antígenos disueltos se han separado por electroforesis
del gel con una intensidad constante de 8 a 10 mA durante 3 a 4
horas en una cubeta de electroforesis (Mini Protein II: Bio Rad,
Richmond, Calif) (tampón de migración: Tris 25 mM, glicina 192 mM,
SDS 0,1%). El tamaño de las proteínas se ha determinado por
comparación con un marcador de peso peptídico (Low rang: Bio Rad).
Los antígenos separados de este modo se han transferido sobre una
membrana de nitrocelulosa (poros de 0,45 \mum) con la ayuda de un
tampón de transferencia (Tris 2,5 mM, glicina 192 mM, metanol al
20%) bajo una corriente de 50V durante 1 hora a una temperatura de
+4ºC en una cubeta Western blot (Mini Trans Blot; Bio Rad). Después
de la transferencia, las membranas de nitrocelulosa se han incubado
toda la noche con una solución de 5% de leche descremada para
bloquear los sitios de fijación no específicos. Entonces se han
lavado las membranas 3 veces con PBS y se han secado a continuación
al aire. Entonces se han incubado con el sobrenadante de los
hibridomas diluidos al 1:4 o el suero de pacientes diluido al 1:100
en PBS al que se ha añadido el 3% de leche a temperatura ambiente
durante 1 hora después de lavarse como se ha descrito anteriormente.
Las membranas son a continuación incubada a temperatura ambiente
durante 1 hora con un fragmento F (ab')2 de anticuerpos de cabra
antiIgG de ratón conjugado con la peroxidasa (Heavy and light
chains: AffiniPure; Jackson ImmunoResearch) diluido al 1:500 en PBS
al que se ha añadido el 3% de leche descremada, y después se han
lavado con PBS. La presencia de anticuerpos específicos se ha
indicado por la presencia de una actividad peroxidasa gracias la
sustrato 4 cloro-1-
naftol.
naftol.
Ensayos a ciegas de los Mabs. La especificidad
de los anticuerpos monoclonales se ha evaluado a ciegas sobre 19
bacterias mediante MIF: 12 especies de Bartonella, 5 B. quitana,
B. henselae Marseille, B. henselae Houston, B. Vinsonii Baker, B.
elizabethae, B. grahamii, B. doshiae, B. taylorii, Coxiella burnetii
Nine Mile y 6 cepas variadas aisladas del laboratorio de los
presentes inventores a partir de muestras clínicas, de las que
Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus
bovis, Mycobacterium avium, Corynebacterium ANF group.,
Actinomyces mayerii. Después de la suspensión en PBS y el
depósito en unas láminas a pocillos, se ha estimado la reactividad
de los Mabs por MIF como se ha descrito anteriormente con el líquido
de los ascitis diluido al 1:100.
Pacientes: se han llevado a cabo ensayos en 15
pacientes: 8 pacientes de la enfermedad de Whipple de localización
digestiva únicamente, cuyo diagnóstico se había realizado por
histología y/o por amplificación de T. whippelii por PCR en
unas biopsias digestivas; 7 pacientes afectados de endocarditis con
T. whippelii por PCR en unas biopsias valvulares.
Ratones y conejos. Se han inoculado 5 ratones y
1 conejo con una suspensión de T. whippelii con el fin de
determinar cuáles serían los antígenos reconocidos por la respuesta
inmunitaria.
Perfiles de SDS-PAGE (Fig. 1).
El SDS-PAGE de T. whippelii ha revelado más
particularmente 7 bandas principales a:10, 20, 80, 120, 150, 170,
200 kDA.
Producción de Mabs. Se ha ensayado el
sobrenadante de 4 hibridomas por MIF. Cuatro hibridomas se han
revelado específicos de T. whippelii. Se ha depositado un
hibridoma en la CNCM del Institut Pasteur 25 rue du Docteur Roux
PARIS 75724 con el número I-2411 y la referencia de
identificación TW 17G2.
Ensayos serológicos realizados en los pacientes.
Han presentado una serología positiva 13 de los 15 pacientes que se
han sometido al ensayo (86,7%), con una tasa de IgM \geq 1:100. El
perfil antigénico observado por Western Blot ha revelado una
reactividad con muchas bandas en las que la banda superior a 200 kDa
en IgG (Figura #2).En IgM se han identificado varios perfiles
proteicos de reactividad contra unas proteínas de 100, 60, 50 y 35
kDa (figura #3).
Ensayos serológicos realizados en los ratones y
conejo inmunizados. Los ratones y conejo inmunizados han presentado
una serología positiva, con una tasa de IgM \geq 1:100. El perfil
antigénico observado por Western Blot ha revelado una reactividad
diferente entre ratón y conejo y diferente de la observada en los
pacientes. Por el contrario, se ha observado una reactividad
superior con banda de 200 kDa.
Caracterización de los Mabs (Fig. 2) Los 4 Mabs
han presentado una reactividad específica para un antígeno de 200
kDA, ya puesta en evidencia en los Western blot de los pacientes,
ratón y conejo. Todos se han identificado como unas IgM. El
antígeno reconocido ha sido destruido por acción de la proteinasa K,
demostrando que se trata de una proteína.
Ejemplo
7
La secuencia del gen rpoB de
Tropheryma whippelii se ha determinado por amplificación
enzimática y secuenciación automática directa de los cebadores
consenso.
Los cebadores consenso utilizados presentaban
como secuencia
| SEC ID nº 1 | = | 5'-TIA TGG GII CIA AIA TGC A-3' | |
| SEC ID nº 2 | = | 5'-GCC CAI CAT TCC ATI TCI CC-3' (I = lnosina) |
Se ha incorporado el ADN extraído de la cepa
Tropheryma whippelii TWIST-Marseille CNCM Nº
I-2202 por lisis mecánica y química
(Fast-Prep Bio) 101 en las condiciones
experimentales siguientes: 35 ciclos de amplificación, cada ciclo
presenta una desnaturalización del ADN a una temperatura de 94ºC
durante 30 seg., una hibridación inicial de los cebadores a una
temperatura de 50ºC durante 30 seg. que presenta un "camping"
descendiente de 0,1ºC por ciclo y después una elongación a una
temperatura de 72ºC durante 60 seg.
Las secuencias SEC ID n1 1 y SEC ID nº 2 se han
determinado mediante el alineamiento de las secuencias peptídicas
depositadas en los GenBank con los números de acceso siguientes para
las bacterias siguientes: Bacillus subtilis, L43593,
Bartonella henselae, AF171070, Borrelia burgdorferi,
AE001144, Buchnera aphidicola, Z11913, Chlamydia
pneumoniae, AE001593, Chlamydia trachomatis, AE001304,
Coxiella burnetti, U86688, Escherichia coli, U 76222,
Haemophilus influenzae, U32733, Helicobacter pylori,
E000625, Legionella pneumophila, AF087812, Mycobacterium
leprae, Z14314, Mycobacterium smegmatis, U24492,
Mycobacterium tuberculosis, L27989, Mycoplasma
gallisepticum, L38402, Mycoplasma genitalium, U39715,
Mycoplasma pneumoniae, AE00030, Neisseria
meningitidis, Z54353, Pseudomonas putida, X15849,
Rickettsia prowazekii, AF034531, Rickettsia typhi,
P77941, Salmonella enterica Typhimurium, X04642,
Spiroplasma citri, U25815, Staphylococcus aureus,
U970062, Synechocystis spp., D90905, Termotoga
maritima, X72695, Treponema pallidum, AE001205 y
Human Granulocytic Ehrlichiosis agent, AF237414.
Las secuencias SEC ID nº 1 y 2 se han elegido
seleccionando las que estaban más conservadas, utilizando como
hipótesis que estaban también presentes en Tropheryma
whippelii.
La secuencia parcial del gen rpoB de
Tropheryma whippelii (GenBank accesion number AF 243072) que
corresponde a SEC ID nº 3, obtenido con la ayuda de cebadores SEC
ID nº 1 y nº 2, es la siguiente:
Ejemplo
8
Se han seleccionado las secuencias específicas
para Tropheryma whippelii siguientes en el fragmento de la
SEC ID nº 3
| SEC ID nº 4 | : | 5'-GCA TTG TGG GGG ATG TTT-3' | |
| SEC ID nº 5 | : | 5'-TTG GGG TCA CCT TAC CAA-3' |
Se han seleccionado como específicas para
Tropheryma whippelii por comparación con las secuencias
conocidas del gen rpoB de 28 bacterias descritas en los Gen
Bank descritos anteriormente.
Ejemplo
9
Se ha amplificado el gen rpoB de
Tropheryma whippelii mediante la técnica de PCR utilizando 35
ciclos de amplificación que presentan cada uno una fase de
desnaturalización de 94ºC durante 30 segundos, una fase de
hibridación de los cebadores SEC ID nº 4 y 5 a una temperatura de
52ºC durante 30 segundos y una fase de elongación a una temperatura
de 72ºC durante 90 segundos. El producto de amplificación se
visualiza después de la coloración con el bromuro de etidio (figura
4).
No se han detectado las bacterias control, es
decir Mycobacterium avium, Mycobacterium Tuberculosis, Nocardia
Ottidiscaviarum, Escherichia coli, Staphylococcus Epidermilis,
Corynebacterium Amycolatum, lo que demuestra la especificidad
de los cebadores ensayados.
Las secuencias del gen rpoB de estas
especies control depositados en los GenBank con los números de
acceso siguientes Mycobacterium avium ATCC 25291, AF060336
Mycobacterium Tuberculosis U12205, Escherichia coli
K-12, U77436 se han seleccionado debido a su
proximidad genética con Tropheryma whippelii o porque su
presencia como posible contaminante de las extracciones clínicas
sometidas para la detección de Tropheryma whippelii.
<110> Université de la Méditérranée
(Aix-Marseille II)
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Diagnóstico de la enfermedad de
Whipple
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> H52437-2
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<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 99 03989
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<151>
1999-03-26
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<151>
1999-05-21
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<160> 7
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<170> PatentIn Ver 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
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<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskiptnatgggnnc naanatgca
\hfill19
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<210> 2
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgcccancatt ccatntcncc
\hfill21
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<210> 3
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<211> 612
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<212> ADN
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<213> Tropheryma whippelii
\newpage
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<400> 3
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipgcattgtggg ggatgttt
\hfill18
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<210> 5
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<211> 18
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipttggggtcac cttaccaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (25)
1. Bacteria Tropheryma whippelii
responsable de la enfermedad de Whipple aislada y establecida en
cultivo.
2. Bacteria según la reivindicación 1, obtenida
a partir de un cultivo de células de fibroblasto humano después de
por lo menos 2 meses de incubación en un medio de cultivo a base de
MEM.
3. Bacteria según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque se deposita en la CNCM del Institut
Pasteur con el número I-2202.
4. Antígeno específico de una bacteria según
una de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Antígeno según la reivindicación 4,
caracterizado porque se trata de una proteína seleccionada de
entre las proteínas de peso molecular de aproximadamente 100 y 200
kD determinados en las figuras 2 y 3 por electroforesis sobre gel
de poliacrilamida según la técnica Western Blot.
6. Anticuerpo específico dirigido contra la
bacteria o un antígeno de la bacteria según una de las
reivindicaciones 1 a 5.
7. Anticuerpo según la reivindicación 6,
caracterizado porque se trata de un anticuerpo policlonal de
origen animal, preferentemente una inmunoglobulina de ratón.
8. Anticuerpo según la reivindicación 6,
caracterizado porque se trata de un anticuerpo
monoclonal.
9. Anticuerpo según la reivindicación 8,
caracterizado porque se trata de un anticuerpo monoclonal
producido por un hibridoma depositado en la CNCM del Institut
Pasteur con el número de registro I-2411.
10. Antígeno según la reivindicación 5,
caracterizado porque se trata de una proteína de 200 kD que
reacciona con un anticuerpo según la reivindicación 9.
11. Utilización de una bacteria según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 o un antígeno según las
reivindicaciones 4, 5 ó 10 para el diagnóstico in vitro de
enfermedades ligadas a infecciones por la bacteria Tropheryma
whippelii.
12. Utilización de un anticuerpo según
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, para el diagnóstico in
vitro de la enfermedad ligada a infecciones por unas bacterias
Tropheryma whippelii.
13. Método para el diagnóstico serológico in
vitro de la enfermedad de Whipple que comprende las etapas que
consisten esencialmente en detectar una reacción inmunológica entre
un anticuerpo específico de la bacteria según una de las
reivindicaciones 6 a 9, y un antígeno de dicha bacteria según una de
las reivindicaciones 4, 5 y 10.
14. Método para el diagnóstico serológico in
vitro según la enfermedad de Whipple que comprende la etapa que
consiste esencialmente en detectar una reacción inmunológica entre
un anticuerpo específico de una inmunoglobulina humana que reconoce
dicha bacteria según una de las reivindicaciones 1 a 3, y dicha una
inmunoglobulina que reconoce dicha bacteria según una de las
reivindicaciones 1 a 3.
15. Método de diagnóstico serológico según la
reivindicación 14, que comprende las etapas siguientes:
- -
- el depósito en un o sobre un soporte sólido de una solución que contiene la bacteria como se ha definido en una de las reivindicaciones 1 a 3,
- -
- la introducción en o sobre dicho soporte de suero o de fluido biológico que se va ensayar,
- -
- la introducción en o sobre el soporte de una solución de un anticuerpo marcado específico de una inmunoglobulina humana que reconoce dicha bacteria;
- -
- la observación de un periodo de incubación;
- -
- el lavado eventual del soporte sólido y
- -
- la detección de dicha de la reacción inmunológica.
16. Estuche para la detección in vitro de
la la enfermedad de Whipple según el método de una de las
reivindicaciones 13 a 15 que comprende esencialmente como
componentes:
- -
- una solución que contiene la bacteria o un antígeno como se ha definido en una de las reivindicaciones 1 a 5 y 10, y/o,
- -
- una solución que contiene por lo menos un anticuerpo según una de las reivindicaciones 6 a 9.
17. Estuche según la reivindicación 16,
caracterizado porque comprende además una solución que
contiene por lo menos un anticuerpo específico de una
inmunoglobulina humana que reconoce dicha bacteria según una de las
reivindicaciones 1 a 3.
18. Estuche según la reivindicación 16 ó 17,
caracterizado porque comprende por lo menos un anticuerpo
específico marcado.
19. Fragmento del gen rpoB de la bacteria
Tropheryma whippelii según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica SEC
ID nº 3.
20. Oligonucleótido que comprende una secuencia
específica del gen rpoB de la bacteria Tropheryma whippelii
según una de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicha
secuencia específica por lo menos 12 motivos nucleotídicos
consecutivos incluidos en la secuencia SEC ID nº 3.
21. Oligonucleótido monocatenario según la
reivindicación 20 seleccionado de entre los oligonucleótidos que
presentan una secuencia de por lo menos 12 motivos nucleotídicos
consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID nº 4 y 5, y
de entre los oligonucleótidos complementarios de dichos
oligonucleótidos.
22. Oligonucleótido según la reivindicación 20 ó
21, caracterizado porque está constituido en las secuencias
SEC ID nº 4 y 5.
23. Sonda para la detección, en una muestra
biológica, de bacterias Tropheryma whippelii
caracterizada porque comprende una secuencia según la
reivindicación 19 o un oligonucleótido según una de las
reivindicaciones 20 a 22.
24. Procedimiento para la determinación de la
presencia o ausencia de una bacteria Tropheryma whippelii en
una muestra que contiene o es susceptible de contener unos ácidos
nucleicos de por lo menos dicha bacteria, caracterizado
porque se pone en contacto dicha muestra con por lo menos una sonda
de la reivindicación 23, después se determina la formación o
ausencia de formación de un complejo de hibridación entre dicha
sonda y el ácido nucleico de la muestra.
25. Cebador nucleotídico utilizable para la
síntesis del gen rpoB de Tropheryma whippelii en presencia de
una polimerasa, caracterizado porque comprende un
oligonucleótido según una de las reivindicaciones 20 a 22,
preferentemente un oligonucleótido que comprende una de las
secuencias SEC ID nº 4 y SEC ID nº 5.
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