RU2699983C1

RU2699983C1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL - продуцент мышиных моноклональных антител, специфичных к пептидогликан-ассоциированному липопротеину (PAL) Legionella pneumophila

Info

Publication number: RU2699983C1
Application number: RU2018142816A
Authority: RU
Inventors: Алена Константиновна Рябко; Максим Александрович Марьин; Алена Сергеевна Карцева; Наталья Алексеевна Зенинская; Марина Владимировна Силкина; Яна Олеговна Мунтян; Виктория Валерьевна Фирстова; Игорь Георгиевич Шемякин
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-09-11

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL – продуцент мышиных моноклональных антител, специфичных к пептидогликан-ассоциированному липопротеину (PAL) Legionella pneumophila. Гибридная клеточная линия 1F11PAL получена путем гибридизации мышиной миеломной линии Sp2/0-Ag14 со спленоцитами гипериммунных в отношении PAL мышей линии BALB/c депонирована в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером Н-78. Изобретение обеспечивает специфическую детекцию бактерий Legionella pneumophila и может быть использовано в лабораторных биологических и медицинских исследованиях, для получения и производства диагностических тест-систем, способных идентифицировать возбудителей легионеллезов. 4 ил., 4 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, биоинженерии, биофармакологиии может быть использовано для получения и производства диагностических тест-систем, способных идентифицировать возбудителей легионеллеза.

Основными сферами применения продуцируемых штаммом гибридных клеток 1F11PAL моноклональных антител к белку PAL являются лабораторные биологические и медицинские исследования, диагностика легионеллезов, разработка средств специфической детекции бактерий L. pneumophila, санитарно-гигиенический контроль за распространением данного патогенного микроорганизма.

Различные варианты белка PAL широко распространены в составе клеточной мембраны грамотрицательных бактерий, однако его структура высоко консервативна в нутрии рода. Белок PAL задействован в энергозависимом взаимодействии с белком TolA, обеспечивая существование комплекса, сформированного на внутренней мембране тремя белками (TolA, TolQ и TolR), а на внешней мембране белками TolB и PAL. Этот комплекс играет важную роль в обеспечении выживания бактерии и поддержании ее вирулентности, однако механизм его функционирования четко не установлен [Lazzaroni J.C. et al. // Biochimie. - 2002. - V. 84. - №5-6. - P. 391-397; Michel L.V. etal. // Microbiol. - 2015. - V. 161. - №6. - Р. 1251-1259].

Некоторые грамотрицательные микроорганизмы обладают способностью секретировать липопротеины во внеклеточную среду, в связи с чем детекцию таких высокоспецифичных молекул возможно использовать в диагностических целях. В частности, L. pneumophila при развитии инфекции высвобождает PAL в кровоток, и этот процесс способствует развитию септического шока [Godlewska R. Et al. // FEMS Microbiol Lett. - 2009. - V. 298. - №1. - P. 1-11]. PAL выводится из организма с мочой, которая и является основным клиническим материалом для его определения. На сегодняшний день известны достаточно эффективные клинические диагностические тесты, основанные на определении родоспецифического белка PAL в моче больного легионеллезом (Legionella urinary antigen), позволяющие выявить подавляющее большинство изолятов патогенной L. pneumophila. Детекция белка PAL в моче позволяет существенно сократить время, требуемое для идентификации возбудителя, по сравнению с его выделением из образов мокроты классическими микробиологическими методами.

Легионеллез, особенно протекающий в форме «болезни легионеров» - тяжелое инфекционное заболевание, характеризующееся высокой (до 40%) смертностью, повышенной в случае несвоевременного начала терапии. Комплексная диагностика легионеллеза основана на оценке клинической картины заболевания с учетом эпидемиологических данных, а также на основании данных клинической лабораторной диагностики, основы которой были определены в 2002 году Европейской рабочей группой по легионеллезу, которая включает: выделение культуры легионелл из отделяемого респираторного тракта или легочной ткани; определение нарастания титра специфических антител к L. pneumophila в реакции непрямой иммунофлуоресценции; определение растворимого антигена L. pneumophila в моче иммуноферментным или иммунохроматографическим методами [Эпидемиологический надзор за легионеллезной инфекцией: Методические указания (МУ 3.1.2.2412-08). - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - c.35; Legionella (Legionnaires' Disease and Pontiac Fever), 2017. Available at: https://www.cdc.gov/legionella/index.html (Page last updated: June 6, 2017); Joseph C.A. et al., on behalf of the European Working Group for Legionella Infections. European Guidelines for Control and Prevention of Travel Associated Legionnaires' Disease. - 2002; Joseph C.A. on behalf of the European Working Group for Legionella Infections. Legionnaires' disease in Europe 2000-2002. Epidemiol Infect. - 2004. - №132. - P. 417-424; European Centre for Disease Prevention and Control. European Legionnaires' Disease Surveillance Network (ELDSNet): Operating procedures. Stockholm: ECDC. - 2012.]. Бактериологический метод является единственным методом, позволяющим определить инфекцию, обусловленную всеми серогруппами L. pheumophila или другими видами Legionella spp., однако метод в последнее время признан малоэффективным в силу сложной техники избирательного культивирования, длительности роста (в среднем 4-5 суток), а иногда и технической невозможности забора образца, содержащего возбудитель. Также в современной клинической диагностике используют определение ДНК возбудителя методом ПЦР (iQ-Check® Legionella Real-Time PCR Kits, Bio-Rad; Legionella pneumophila Kit for genesig® q16, Genesis; New Legionella Quantitative kit - Real-Time PCR, Diatheva и др.), который, при всей его эффективности, обладает своими ограничениями, в частности это некомпетентность метода в случае отсутствия возбудителя в образце, невозможность определить присутствие антигена напрямую, ингибирование реакции компонентами пробы или ошибки при пробоподготовке. Своевременную диагностику способны обеспечить методы иммунодетекции PAL легионелл в моче. Определение PAL предпочтительно, в первую очередь, за счет родовой консервативности антигена, доступности клинического материала, а также сроков исследования, которые не превышают 4 ч. Секреция PAL в мочу наблюдается у более чем 80% пациентов с инфекцией L. pneumophila серогруппы I [Helbig J.H. et al. // J Clin Microbiol. - 2003. - №41. - P. 838-840.]. Чувствительность применяемых на сегодняшний день тестов для определения PAL в моче методами иммуноанализа колеблется от 75 до 99%, детекция антигена в моче возможна со 2-3 дня манифестации заболевания [Bartram J. Et al. Legionella and the Prevention of Legionellosis. Geneva: World Health Organization. - 2007.].

Впервые ИФА тест-система для определения легионеллеза на основе поликлональных кроличьих антител была разработана в 1979 году [Tilton R.С. // Ann Intern Med. - 1979. - V. 90. - P. 697-698; Kashuba A.D.M. et al.// Diagn Microbiol Infect Dis. - 1996. - V. 24. - №. 3. - P. 129-139.].

Известна ИФА тест-система на основе кроличьих поликлональных антител (IgG) к PAL Legionella pneumophila, при тестировании которой был доказан более высокий уровень чувствительности по сравнению с коммерческими тест-системами, где поликлональные антитела кролика были получены к пулу всех растворимых белковых антигенов (уринарный антиген) Legionella pneumophila серогруппы I, также отмечено отсутствие кросс-реактивности. Диагностическая точность этой тест-системы возрастала до 100% при использовании концентрированных проб мочи [Kim М.J. et al. // J Clin Microbiol. - 2003. - V. 41. - №. 7. - P. 2974-2979.].

Известна также более поздняя разработка аналогичной тест-системы на основе кроличьих и крысиных поликлональных антител (IgG) к PAL Legionella pneumophila, показавшая аналогичные результаты по показателям чувствительности и специфичности [Gholipour A. et al. // World J Microbiol Biotechnol. - 2014. - V. 30. - №. 5. - P. 1463-1471.].

Известены мышиные моноклональные антитела, полученные против белка внешней мембраны L. pneumophila [патент US 4931547]. Изобретение позволяет детектировать бактерии возбудителя легионеллеза в крови и моче посредством связывания с компонентом внешней мембраны - белком с молекулярной массой 28 кДа.

Также известен патент, описывающий мышиные моноклональные антитела, специфичные к белковому антигену L. pneumophila [US 5248594] массой 60 кДа. Описанное антитело предлагается к использованию в качестве специфического реагента в тест-системах на основе иммуноанализа.

Также известны другие запатентованные мышиные моноклональные антитела, полученные против инактивированных бактерий L. pneumophila серогруппы I [US 4780407], и предложенные к использованию в тест-системе в формате ИФА.

В целом, несмотря на достаточно высокую специфичность различных тест-систем для детекции легионелл, существует проблема недостаточной их чувствительности. Существенно повысить чувствительность детекции легионеллезов можно за счет разработки тест-систем, основанных на современных технологических платформах, таких как, в частности, иммуно-ПЦР [Reller L.B. et al. // Clin Infect Dis. - 2003. - V. 36. - №1. - P. 64-69; Gholipour A. Et al. // World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 2014. - V. 30. - №5. - P. 1463-1471].

В Российской Федерации существуют тест-системы для детекции легионелл на основе метода ПЦР (производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, ООО «ИнтерЛабСервис» и др.), однако тест-системы на основе иммуноанализа в России к настоящему моменту не производятся.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL, продуцирующего мышиные моноклональные антитела 1F11PAL со специфичностью к пептидогликан-ассоциированному липопротеину (PAL) Legionella pneumophila и пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя легионеллеза.

Технический результат достигается тем, что предложен штамм гибридных клеток Mus musculus 1F11PAL, продуцирующий одноименные мышиные моноклональные антитела (МКАт) 1F11PAL против пептидогликан-ассоциированного липопротеина (PAL) возбудителя болезни легионеров Legionella pneumophila.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL - продуцент мышиных моноклональных антител, специфичных к пептидогликан-ассоциированному липопротеину (PAL) Legionella pneumophila- депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», регистрационный номер Н-78.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL получают следующим образом:

Мышей линии BALB/c иммунизируют четырехкратно введением рекомбинантного белка PAL в дозе 100 мкг/мышь с периодичностью в 2 недели в течение 2 месяцев. На третьи сутки после последней иммунизации проводится гибридизация спленоцитов иммунных мышей (1×10⁸ клеток) по методу Келера и Мильнштейна с партнером для слияния - клетками мышиной миеломной линии Mus musculus Sp2/0-Ag14 (1×l0⁷ клеток). В качестве агента для слияния применяют раствор полиэтиленгликоля в диметилсульфоксиде. Слившиеся клетки рассевают на культуральных планшетах с заранее подготовленным фидерным слоем. После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридных клеток. Для характеристики МКАт 1F11PAL, производимых штаммом гибридных клеток 1F11PAL, применяется выращивание in vivo в виде иммуноасцитической жидкости и выделение из нее иммуноглобулиновой фракции посредством аффинной хроматографии и гель-фильтрации.

Характеристика штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL.

Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток 1F11PAL представлена слабо прикрепленными к подложке округлыми клетками размером с исходную миеломную.

Культуральные свойства. Штамм гибридных клеток 1F11PAL культивируют в виде стационарной суспензии в культуральных флаконах с площадью поверхности роста 25 см² и 75 см². Пересев клеток производится с кратностью рассева 1:2-1:3. Исходная посевная концентрация клеток составляет 1×10⁵ в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании должна составлять не более 1×10⁶ на 1 мл среды.

Стандартные условия выращивания. Культивирование штамма гибридных клеток 1F11PAL производится при температуре 37°С в атмосфере 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI-1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.

Культивирование гибридных клеток в организме животного. Для культивирования штамма гибридных клеток 1F11PAL in vivo используются мыши линии BALB/c, обработанные с возраста 20 недель пристаном по 0,5 мл внутрибрюшинно. Через 2-3 недели мышам вводят внутрибрюшинно по 5×10⁵-2×10⁶ гибридных клеток в среде RPMI-1640 без фетальной телячьей сыворотки. Появление иммуноасцитов регистрируется на 7-15 сутки, а отбор иммуноасцитической жидкости производится на 10-21 сутки в соответствии со скоростью созревания каждого отдельного асцита.

Продуктивность гибридной клеточной линии. Продукция моноклональных антител в асцитической жидкости - 2-6 мг/мл. Продукция моноклональных антител сохраняется на протяжении 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения).

Контаминация штамма гибридных клеток. Контаминации любого рода (включая бактерии, дрожжи, микоплазмы) не выявлены.

Криоконсервация. Суспензию гибридных клеток в защитной среде (эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%) замораживают по 1 мл в криопробирках (виалах) со скоростью 1°С/мин. Количество жизнеспособных клеток в 1 виале до криоконсервации составляет 1×10⁶-3×10⁶. Жизнеспособность восстанавливаемой культуры гибридных клеток после криоконсервации составляет 75-95%.

Характеристика полезного продукта. Полученный штамм гибридных клеток 1F11PAL производит высокоспецифичные моноклональные антитела к пептидогликан-ассоциированному липопротеину (PAL) Legionella pneumophila в иммуноасцитической жидкости, проявляющие активность в непрямом твердофазном ИФА вплоть до разведения 1:1 028 000. Моноклональные антитела из иммуноасцитической жидкости выделяют путем аффинной хроматографии на колонке с Protei G сефарозой, с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex 200 10/300 GL. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают методом электрофореза в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяют методом спектрофотометрии при длине волны 280 нм.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг. 1. Графическое представление результата выделения и очистки моноклональных антител (МКАт 1F11PAL) к рекомбинантному белку PAL Legionella pneumophila, продуцируемых гибридомой 1F11PAL, по результатам электрофоретического разделения в 10%-ом ПААГ в денатурирующих условиях.

Дорожка 1 - маркер молекулярной массы Page Ruler™ Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher, США). Дорожка 2 - образец очищенных МКАт 1F11PAL. Окраска геля кумасси бриллиантовым синим R-250.

Фиг. 2. Результат определения подкласса очищеных МКАт 1F11PAL с помощью иммунохроматографического экспресс-теста IsoQuick™ Stripsfor Mouse Monoclonal Isotyping (Envirologix, США).

1 - тест-полоска с нанесенными МКАт 1F11PAL к рекомбинантному белку PAL Legionella pneumophila; 2 - интерпретация результатов иммунохроматографического теста (изображение предоставлено производителем).

Фиг. 3. Результаты иммуноблоттинга нативного белка PAL и рекомбинантного белка PAL. Взаимодействие со специфичными МКАт 1F11PAL к рекомбинантному белку PAL.

Дорожка 1 - маркер молекулярной массы Page Ruler™ Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher, США).

Дорожка 2 -лизат Legionella pneumophila ATCC 33215.

Дорожка 3 - рекомбинантный белок PAL.

Фиг. 4. Результаты дот-блот анализа бактериальных лизатов.

Точки: A1 - Legionella pneumophila ATCC 33152; А2 - Legionella pneumophila ATCC 33155; A3 - Legionella pneumophila ATCC 33156; A4 - Legionella pneumophila ATCC 33215; A5 - Legionella pneumophila 439-406; A6 - Legionella pneumophila 7; A7 - Legionella pneumophila 253; A8 - Legionella longbeachae ATCC 33462; A9 - Legionella micdadei NCTC 11371; B1 - Brucella abortus 19BA; B2 - Campylobacter jejuni NCTC 11168; B3 - Escherichia coli K-12; B4 - Haemophilus influenzae ATCC 49766; B5 - Klebsiella pneumoniae ATCC 700603; B6 - Moraxella catarrhalis ATCC 25240; B7 - Neisseria meningitidis ATCC 35559; B8 - Pasteurella multocida NCTC 1032; B9 - Proteus vulgaris 19; C1 - Pseudomonas aeruginosa 140; C2 - Pseudomonas putida ATCC 17421; C3 - Salmonella typhimurium ATCC 14028; C4 - Serratia marcescens МГУ-5; C5 - Acinetobacter calcoaceticus ATCC 23055; C6 - Staphylococcus aureus ATCC 29213; C7 - Streptococcus pneumonia ATCC 49619; C8 - Streptococcus pyogenes CA-2-09. Лизаты бактериальных культур нанесены на мембрану в количестве 10⁶ м.к./пятно.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL.

Иммунизация лабораторных животных.

Мышей линии BALB/c иммунизируют введением фиксированных доз рекомбинантного белка PAL Legionella pneumophila по следующей схеме:

1) Подкожное введение отобранной группе мышей рекомбинантного белка PAL в дозе 100 мкг/мышь в полном адъюванте Фрейнда в объемном соотношении 1:1 в двух повторностях с интервалом в 2 недели;

2) Подкожное введение мышам рекомбинантного белка PAL в дозе 100 мкг/мышь в неполном адъюванте Фрейнда в объемном соотношении 1:1 в двух повторностях с интервалом в 2 недели.

Всего 4 инъекции за весь период иммунизации животных.

Кровь иммунизированных мышей отбирают на третий день после финальной инъекции. Титры специфических антител в полученных сыворотках крови определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.

Гибридизация.

Гибридизация производится по методу Келера и Мильштейна [

G., Milstein С. // Nature. - 1975. - Т. 256. - №. 5517. - С. 495-497.] с модификациями. Через 3 суток после финальной иммунизации мышей, чьи сыворотки крови показали наилучшие результаты при тестировании в ИФА, умерщвляют методом дислокации шейных позвонков, извлекают селезенки, и проводят процедуру слияния (гибридизации) 1×10⁸ спленоцитов гипериммунной мыши с 1×10⁷ клеток миеломной мышиной линии Sp2/0-Ag14 (ATCC® CRL-1581™). В качестве агента для слияния применяют раствор полиэтиленгликоля в диметилсульфоксиде (SigmaP7306, США). Слившиеся клетки рассевают в лунки культуральных планшетов с заранее подготовленным фидерным слоем, состоящим из мышиных перитонеальных макрофагов в количестве 1×10⁴ клеток на лунку. Культивирование полученных гибридных клеток осуществляют в СО₂-инкубаторе FormaSerias II (ThermoFisher, США) при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂, в среде RPMI-1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, однократным раствором гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT) (Gibco21060-017, ThermoFisher, США).

Селекция.

Селекцию полученных гибридных клеток проводят в ростовой среде с добавлением HAT в течение 3 недель. При последующем культивировании селективную добавку в среду больше не добавляют.

Скрининг гибридных клеток. Отбор положительных гибридных клеток, продуцирующих специфичные антитела, осуществляют методом непрямого твердофазного ИФА.

Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 1 мкг/лунку белка PAL L. pneumophila в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 1,76 мМ KH₂PO₄, рН 7.4) и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа на планшетном орбитальной шейкере (Elmi, Латвия) при скорости вращения платформы 370 об./мин. Трижды отмывают фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,5% детергента TWEEN® 20 (ФСБ-Тв), каждый раз внося в лунки планшета по 200 мкл отмывающего раствора. Затем вносят в лунки по 160 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина, проверенного на отсутствие пероксидазной активности, и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа при тех же условиях. Трижды отмывают ФСБ-Тв. Далее вносят в лунки супернатант культуральной жидкости, в которой культивировали тестируемый гибридные клетки, в объеме 100 мкл, инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа на шейкере. После этого лунки планшета трижды отмывают буфером ФСБ-Тв, и добавляют в лунки раствор кроличьих антител к целой молекуле IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США), в рабочем разведении (в соответствии с инструкцией изготовителя). Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа на шейкере, затем 6 раз отмывают буфером ФСБ-Тв. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора (10 мкл 30% Н₂О₂ и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно - цитратного буфера рН 5.0). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Учет результатов проводят на микропланшетном фотометре при длине волны 490 нм.

Клонирование.

Клонирование гибридных клеток проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на фидерном слое, состоящем из перитонеальных макрофагов в количестве 1×10⁴ клеток на лунку. Скрининг клонов проводят методом непрямого твердофазного ИФА, как было описано выше. Скринируют только те лунки, которые содержат моноклональную популяцию клеток. Клоны, показавшие наилучшие результаты в ИФА, тестируют не менее трех раз с интервалом 3-4 дня. Наиболее стабильные клоны гибридных клеток отбирают для дальнейшей работы. Наилучшие и стабильные результаты в ИФА показал клон гибридной клеточной линии 1F11PAL.

Культивирование.

Культивирование штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL ведут в культуральных флаконах Corning® Т-25 и Т-75 при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является RPMI-1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Количество клеток при субкультивировании поддерживают в диапазоне между 1×10⁵ - 1×10⁶ на 1 мл культуральной среды. Обновление среды путем частичной или полной замены производят каждые 2-3 дня.

Культивирование клона 1F11PAL гибридной линии в организме животного. Мышам линии BALB/c, начиная с возраста в 20 недель интраперитонеально вводят по 0,5 мл стимулятора образования асцитных форм опухолей пристала (Sigma, США), а через 2-3 недели вводят также внутрибрюшинно не менее 5×10⁵ и не более 2×10⁶ гибридных клеток 1F11PAL в среде RPMI-1640 без фетальной телячьей сыворотки. Появление иммуноасцитов регистрируют на 7-15 сутки, а отбор иммуноасцитической жидкости производят на 10-21 сутки в соответствии со скоростью созревания каждого отдельного асцита.

Выявление контаминации гибридной клеточной линии клона 1F11PAL. Контаминацию культуры гибридных клеток 1F11PAL оценивают визуально с помощью набора флюоресцентных красителей для определения бактериальной и грибковой контаминации клеточных культур Cell Culture Contamination Detection Kit C-7028 (ThermoFisher, США) и флюоресцентного красителя для ДНК, подходящего для определения контаминации микоплазмами Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, США). Всю пробоподготовку клеток гибридной линии и культуральной жидкости проводят согласно рекомендациям производителей. Подготовленные образцы рассматривают с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа CKX41 с ртутным осветителем U-RFLT50 (все Olympus, Япония).

Криоконсервация. Клон гибридных клеток 1F11PAL замораживают в специальных криопробирках (виалах) объемом 2 мл. В качестве среды для криоконсервации используют фетальную телячью сыворотку с добавлением 10% диметилсульфоксида. Снятие клеток с поверхностей культуральных сосудов производят потряхиванием культурального флакона и пипетированием. Суспензию клеток центрифугируют при 125×g в течение 5-7 минут, удаляют супернатант и ресуспендируют в 1 мл среды для криоконсервации. Криопробирки охлаждают до -80°С со скоростью заморозки 1°С/мин. Длительное хранение замороженных культур осуществляют в жидком азоте.

Пример 2. Выделение, очистка и определение подкласса моноклональных антител, продуцируемых гибридной клеточной линией 1F11PAL.

Выделение МКАт 1F11PAL, продуцируемых одноименной гибридной клеточной линией, из асцитической жидкости проводят с применением аффинной хроматографии на колонке с сорбентом Protein G сефарозой (Protein G Sepharose 4 FastFlow, GE Healthcare, Великобритания). Для нанесения образцов и буферов на колонки и контроля элюции белковой фракции используют хроматографическую систему

(GE Healthcare, США).

Клеточные компоненты асцитической жидкости удаляют центрифугированием (1000×g15 мин), преципитируют белковую фракцию асцитической жидкости добавлением насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄ в соотношении 1:1, выдерживают при температуре 4°С в течение ночи. Преципитат осаждают центрифугированием при 10000×g в течение 20 минут, удаляют супернатант. Осадок растворяют в буфере нанесения 50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 0,02% NaN₃, рН 8.6. Колонку, заполненную Protein G сефарозой, уравновешивают буфером нанесения, нанесение образца производят со скоростью 2 мл/мин на льду. После нанесения образца колонку отмывают от не связавшихся компонентов, и проводят элюцию иммуноглобулинов класса G буфером состава: 100 мМ глицина, 50 мМ Tris, 100 мМ NaCl, рН 2.4. Фракции элюата собирают после начала экспоненциального роста величины абсорбции при 280 нм (A₂₈₀) и заканчивают, когда A₂₈₀ начинает снижаться по логарифмическому закону (выходить на плато). Уровень рН элюата доводят до 7.4 добавлением 1 М раствора Tris основания. Выделенные иммуноглобулины концентрируют в центрифужных концентраторах Amicon Ultra-15 NMWL 100 kDa (Merck, США) до объема 0,5 мл и наносят на гель-фильтрационную колонку Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, Великобритания) емкостью 24 мл, уравновешенную ФСБ на скорости потока 0,5 мл/мин. Иммуноглобулиновую фракцию собирают через некоторое время, идентифицируя ее по изменению A₂₈₀. Чистоту полученной иммуноглобулиновой фракции оценивают методом SDS-электрофореза по Лэммли в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях (Фиг. 1).

Для определения подкласса очищенных моноклональных антител 1F11PAL, продуцируемых гибридной клеточной линией 1F11PAL, используют иммунохроматографический экспресс-тест IsoQuick™ Strips for Mouse Monoclonal Isotyping (Envirologix, США). Для этого очищенные моноклональные антитела разводят тысячекратно в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, добавляя к 1 мл фосфатно-солевого буфера 1 мкл антител. Затем в пробирку погружают тест-полоску и оставляют до проявки контрольной полосы. Место расположения контрольной полосы устанавливают, сравнивая в непосредственной близости тест-полоску и рефересное изображение (предоставлено производителем). МКАт 1F11PAL относятся к подклассу IgG1 (Фиг. 2).

Пример 3. Оценка специфической активности моноклональных антител 1F11PAL в отношении целевой мишени.

Для оценки специфического связывания моноклональных антител 1F11PAL с нативными рекомбинантным белками PAL Legionella pneumophila проводят SDS-электрофорез лизата одного из штаммов Legionella pneumophila и собственно рекомбинантного белка PAL в соседних дорожках. Используют 15% полиакриламидный гель, приготовленный на 8М мочевине. Лизат подготавливают следующим образом: 100 мкл суспензии с содержанием 1×10⁶ - 1×10⁷ живых клеток Legionella pneumophila ATCC 33215 в фосфатно-солевом буфере центрифугируют 5 000×g в течение 10 минут, удаляют супернатант, а бактериальный осадок ресуспендируют в 100 мкл 8М мочевины с 1% содержанием SDS, оставляют при комнатной температуре на 1 час. Далее отбирают 5-10 мкл лизата и смешивают с 5 мкл буфера для нанесения (Bio-Rad 4х Laemmli Sample Buffer + 2-меркаптоэтанол 9:1). Пробу рекомбинантного белка PAL в количестве 0,5 мкг также смешивают с буфером для нанесения того же состава в соотношении 1:4. Полученные смеси не кипятят, сразу вносят в лунки полиакриламидного геля.

После проведения электрофортического разделения белки из геля переносят на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (GE Healthcare, США) с помощью прибора Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, CIIIA). Свободные центры связывания мембраны блокируют обезжиренным молоком (массовая доля жира не более 0,5%) в течение 1 часа, трижды отмывают раствором ФСБ-Тв, и последовательно инкубируют по 1 часу с МКАт 1F11PAL и пероксидазным конъюгатом кроличьих антител к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США), осуществляя трехкратную отмывку мембраны после каждой инкубации. Визуализацию реакции проводят раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0,05% диаминобензидин (Sigma, США), 0,015% Н₂О₂ в ФСБ). Реакцию останавливают промывкой мембраны дистиллированной водой с последующим высушиванием.

Как показывает проведенный анализ, результаты которого отражены на Фиг. 3, МКАт 1F11PAL специфически взаимодействуют как с нативным, так и с рекомбинантным PAL.

Пример 4. Определение специфической и кросс-реактивности полученных моноклональных антител 1F11PAL методом дот-блот анализа.

Для определения специфической активности полученных МКАт 1F11PAL используют растворимые фракции нативных белковых антигенов, приготовленные методом ультразвукового лизиса 7 штаммов Legionella pneumophila различных серогрупп, 2 различных штаммов бактерий рода Legionella, не относящихся к виду Legionella pneumophila и 17 различных штаммов бактерий, не относящихся к роду Legionella. В проведении данного исследования используют следующие штаммы: Legionella pneumophila ATCC 33152, Legionella pneumophila ATCC 33155, Legionella pneumophila ATCC 33156, Legionella pneumophila ATCC 33215, Legionella pneumophila 439-406, Legionella pneumophila 7, Legionella pneumophila 253, Legionella longbeachae ATCC 33462, Legionella micdadei NCTC 11371, Brucella abortus 19BA, Campylobacter jejuni NCTC 11168, Escherichia coli K-12, Haemophilus influenza ATCC 49766, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Moraxella catarrhalis ATCC 25240, Neisseria meningitidis ATCC 35559, Pasteurella multocida NCTC 1032, Proteus vulgaris 19, Pseudomonas aeruginosa 140, Pseudomonas putida ATCC 17421, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Serratia marcescens МГУ-5, Acinetobacter calcoaceticus ATCC 23055, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Streptococcus pneumonia ATCC 49619, Streptococcus pyogenes CA-2-09. Штаммы бактерий были получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», 100 мкл суспензии с содержанием 1×10⁷ бактериальных клеток в фосфатно-солевом буфере обрабатывают ультразвуком на сонификаторе Bioruptor UCD-200 (Diagenode, Бельгия) в режиме мощности «High» в течение 10 минут, используя цикл 30 секунд-работа, 30 секунд-пауза. Далее сорбируют по 100 мкл осветленных лизатов (супернатант после центрифугирования лизата 15000×g 10 минут) на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (GE Healthcare, США) с помощью прибора BIO-DOT (Bio-Rad, США). Затем мембрану блокируют обезжиренным молоком в течение 1 часа, трижды отмывают буферным раствором ФСБ-Тв, и последовательно инкубируют по 1 часу с МКАт 1F11PAL и пероксидазным конъюгатом кроличьих антител к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США), делая трехкратную отмывку мембраны после каждой инкубации. Визуализацию реакции проводят раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0,05% диаминобензидин (Sigma, США), 0,015% Н₂О₂ в ФСБ). Реакцию останавливают промывкой мембраны дистиллированной водой.

Как показывает проведенный анализ, результаты которого отражены на Фиг. 4, моноклональные антитела 1F11PAL:

1) взаимодействуют со всеми исследуемыми штаммами Legionella pneumophila (регистрация позитивного результата в точках A1-А7);

2) взаимодействуют со всеми исследуемыми штаммами непатогенных легионелл, то есть полученные МКАт к рекомбинантному белку PAL Legionella pneumophila проявляют активность к нативному белку PAL других бактерий рода Legionella (регистрация позитивного результата в точках А8, А9);

3) не взаимодействуют со всеми исследуемыми штаммами грамотрицательных (регистрация негативного результата в точках В1-В9, C1-С5) и грамположительных (регистрация негативного результата в точках С6-С8) бактерий, не относящихся к роду Legionella.

Claims

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL - продуцент мышиных моноклональных антител, специфичных к пептидогликан-ассоциированному липопротеину (PAL) Legionella pneumophila, депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», коллекционный номер Н-78.