JP2005029501A

JP2005029501A - モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、腸管毒素の検査方法及びその除去方法

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Publication number: JP2005029501A
Application number: JP2003196072A
Authority: JP
Inventors: Hiroyoshi Kawamoto; 尋義川本; Erina Kamiyama; 恵理奈神山; Takeshi Kuzuguchi; 剛葛口; Toru Oyama; 徹大山; Toshihiro Watabe; 俊弘渡部; Yuichi Kouguchi; 裕一孝口; Soichi Genban; 宗一玄番; Yoshitake Terano; 由剛寺野; Takanori Sasaki; 孝則佐々木; Yukihiro Akao; 幸博赤尾
Original assignee: Gifu Prefecture; Gifu International Institute of Biotechnology
Current assignee: Gifu Prefecture; Gifu International Institute of Biotechnology
Priority date: 2003-07-11
Filing date: 2003-07-11
Publication date: 2005-02-03

Abstract

【課題】黄色ブドウ球菌腸管毒素に結合するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、検出感度を高めつつ腸管毒素の検査を迅速かつ正確に行うことが容易な腸管毒素の検査方法並びに腸管毒素を除去することが容易な腸管毒素の除去方法を提供する。
【解決手段】モノクローナル抗体及びハイブリドーマは、黄色ブドウ球菌が産生する腸管毒素蛋白質又は黄色ブドウ球菌の腸管毒素遺伝子を導入した形質転換体が産生する腸管毒素リコンビナント蛋白質を抗原として作製される。腸管毒素の検査方法は、前記モノクローナル抗体を用いたイムノアッセイ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡにより腸管毒素を含む可能性のある検査試料を検査するものである。腸管毒素の除去方法は、前記モノクローナル抗体が固定化された固定化担体を用いて腸管毒素を除去するものである。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、食中毒の原因物質である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）が産生する腸管毒素（エンテロトキシン）に対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、前記腸管毒素を検査する方法及び除去する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、黄色ブドウ球菌及びエンテロトキシンの検出法としては、非特許文献１に開示されているような方法が知られている。即ち、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンによる中毒は食品内毒素型中毒であり、摂取から発症までの潜伏時間が約３時間と、他の細菌性中毒よりも短いという特徴をもつ。
【０００３】
黄色ブドウ球菌の検出方法としては、選択培地のマンニット食塩培地に生育し、該培地を黄変するものであって、コアグラーゼを産生するグラム陽性球菌を確認することに行われ、検出までの所要時間は１〜２日である。検出された菌がエンテロトキシンを産生するか否かは、毒素遺伝子をＰＣＲ法により検出することで行われる。しかし、前記ＰＣＲ法では検出菌が毒素遺伝子を保有しているかの知見は得られるが、原因菌が食品内で毒素を産生したことの証明にはならないため、食中毒の診断としては間接的なデータにとどまる。さらに、最近起こった食中毒事件では、原因が疑われる食材からは黄色ブドウ球菌は検出されずエンテロトキシンのみが存在したという、世界的にも報告が少ない特殊な例が見られた。
エンテロトキシンは熱に安定なことから、製造での熱殺菌工程を潜り抜け、耐酸性があるために胃酸にも安定で、原因菌の殺菌による死滅とは無関係に中毒を発症させる。
【０００４】
一方、エンテロトキシンの検出法には、免疫学的検出法、ゲル内沈降反応、生物学的検出法等があるが、広く用いられているのは免疫学的検出法の逆受身ラテックス凝集反応（ＲｅｖｅｒｓｅｄＰａｓｓｉｖｅＬａｔｅｘＡｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ；ＲＰＬＡ）であり、検出感度も１ｎｇ／ｍｌ以下と高い。前述の食中毒事件では、原因食材と考えられた食材中のエンテロトキシンの濃度が低く、そのままの状態では検出が不可能であった。これに対して大阪府立公衆衛生研究所では、前記食材中の濃縮法を開発して検出感度を２０倍程度高めることに成功している。
【０００５】
【非特許文献１】
坂本道子、“病原微生物や微生物トキシンの検出の現状２．黄色ブドウ球菌の検出法”、［ｏｎｌｉｎｅ］、（株）メルシャンクリンテック、［平成１５年５月２７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍ−ｃｌｅａｎｔｅｃ．ｃｏｍ／ｇｉｊｙｕｔｕｓｉｒｙｏｕ３．ｈｔｍ＞
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来のエンテロトキシンの検出法では、前記食中毒事件発生当時のような予測不可能な事態を考慮に入れた場合には、検出感度がまだまだ十分であるとは言えない。さらには、現在最も有用性が高く検出感度に優れているとされるＲＰＬＡでさえ、免疫血清（ポリクローナル抗体）を用いた検出法であることから擬陽性（ｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅ）や擬陰性（ｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅ）の問題が常に大きなウェイトを占めつつつきまとっている。このため、これら予測不可能な事態にできる限り備えつつ、食中毒拡大の進行に対する時間的な競争に打ち克つことができる新技術の開発が社会的に大きく渇望されている。
【０００７】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、黄色ブドウ球菌腸管毒素に対して結合することができるモノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を容易に提供することができるハイブリドーマを提供することにある。別の目的とするところは、検出感度を高めつつ黄色ブドウ球菌腸管毒素の検査を迅速かつ正確に行うことが容易な腸管毒素の検査方法、及び黄色ブドウ球菌腸管毒素を除去することが容易な腸管毒素の除去方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明のモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌の腸管毒素に対するものである。
【０００９】
請求項２に記載の発明のハイブリドーマは、黄色ブドウ球菌の腸管毒素に対するモノクローナル抗体を産生するものである。
請求項３に記載の発明の腸管毒素の検査方法は、黄色ブドウ球菌の腸管毒素を検査する方法であって、黄色ブドウ球菌の腸管毒素に対するモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより、前記腸管毒素を含む可能性のある検査試料を検査することを特徴とするものである。
【００１０】
請求項４に記載の発明の腸管毒素の検査方法は、請求項３に記載の発明において、前記イムノアッセイは、同じ毒素型の腸管毒素蛋白質の異なるエピトープと結合する２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項５に記載の発明の腸管毒素の除去方法は、黄色ブドウ球菌の腸管毒素を除去する方法であって、黄色ブドウ球菌の腸管毒素に対するモノクローナル抗体が固定化された固定化担体を用いて腸管毒素を除去することを特徴とするものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
黄色ブドウ球菌腸管毒素（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ；ＳＥ）は、黄色ブドウ球菌の菌体外に産出される分子量３万弱の単純蛋白質である。このＳＥは、１００℃で３０分の加熱処理及び胃酸等のプロテアーゼ消化によっても毒性を失わない性質を有しているうえ、スーパー抗原としても機能する。このＳＥは、抗原性の違いによりＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌ等の様々な毒素型に分類されている。
【００１３】
実施形態のモノクローナル抗体としての腸管毒素特異モノクローナル抗体（ＳＥ−ＭＡｂ）は、ＳＥに対して反応するものであり、好ましくは該ＳＥに対して特異的に結合するものである。このモノクローナル抗体は、食品検査や食中毒の検査等におけるＳＥの検出、毒素型の判別、ＳＥ濃度の定量等に利用される。前記特異的に結合するとは、エンザイム・イムノアッセイ等のイムノアッセイにより特異的な抗原抗体反応が検出可能であることを意味する。さらに、このモノクローナル抗体としては、ＳＥの検出感度等を容易に高めるために、作製時に用いた抗原そのものに対する交差反応性を１００％としたとき、その抗原以外（特にＳＥ以外のもの）に対する交差反応性が好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、さらに好ましくは０．５％未満であるとよい。
【００１４】
このモノクローナル抗体は、黄色ブドウ球菌が産生する天然のＳＥ蛋白質（ＳＥ）又は黄色ブドウ球菌の腸管毒素遺伝子を導入した形質転換体が産生するＳＥリコンビナント蛋白質（ｒＳＥ）を抗原として常法に従って作製される。即ち、このモノクローナル抗体は、まず、前記抗原を免疫動物に免疫した後、該免疫動物から抗体産生細胞を採取して不死化細胞と融合させてハイブリドーマ（不死化雑種細胞株）を作出する。続いて、前記抗原を用いてＳＥ−ＭＡｂ産生ハイブリドーマをスクリーニングし、得られたハイブリドーマ（クローン）をインビトロ又はインビボで培養することによって得られる。なお、前記ハイブリドーマのスクリーニングにおいて、ＳＥ以外の公知の抗原性物質（アルブミン、グロブリン、カゼインのような飲食品に含まれる蛋白質等）に対して反応するハイブリドーマ（クローン）を除去するための負のスクリーニングを行うのが好ましい。このとき、ＳＥの検査において擬陽性や擬陰性を減らすことが極めて容易となる。
【００１５】
このモノクローナル抗体は、用いられる抗原の種類（毒素型）によって、抗ＳＥＡ特異モノクローナル抗体（ＳＥＡ−ＭＡｂ）、抗ＳＥＢ特異モノクローナル抗体（ＳＥＢ−ＭＡｂ）、抗ＳＥＣ特異モノクローナル抗体（ＳＥＣ−ＭＡｂ）、抗ＳＥＤ特異モノクローナル抗体、抗ＳＥＥ特異モノクローナル抗体、抗ＳＥＧ特異モノクローナル抗体、抗ＳＥＨ特異モノクローナル抗体（ＳＥＨ−ＭＡｂ）、抗ＳＥＩ特異モノクローナル抗体、抗ＳＥＪ特異モノクローナル抗体、抗ＳＥＫ特異モノクローナル抗体、抗ＳＥＬ特異モノクローナル抗体等の毒素型別に分類される。さらに、これらモノクローナル抗体は、抗原としての各ＳＥが複数のエピトープを有していることから、同一毒素型内であっても異なるエピトープを認識するものが複数種類存在し得る。
【００１６】
実施形態の腸管毒素の検査方法は、前記ＳＥ−ＭＡｂを用いたイムノアッセイにより、ＳＥを含む可能性のある検査試料を検査するものであり、該検査試料からのＳＥの検出、毒素型の判別及びＳＥ濃度の定量から選ばれる少なくとも１種を目的とする。前記検査試料としては、例えば、食中毒の原因菌や原因毒素の混入が疑われる食品（Ｆｏｏｄ）や飲料品、食中毒患者から採取した吐物（Ｖｏｍｉｔ）や便（Ｆｅｃｅｓ）、或いはそれらを拭き取ったもの（Ｗｉｐｅ）等が挙げられる。また、この検査方法を飲食品の品質検査に使用するように設計してもよい。前記イムノアッセイとしては、ＳＥの検出感度を高めるのが容易であることから、好ましくはエンザイム・イムノアッセイ、特に好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）が用いられる。
【００１７】
この検査方法に適したサンドイッチＥＬＩＳＡとしては、第１抗体と標識化第２抗体との間に抗原（ＳＥ）を挟み込む様式で行われる方法が採用される。この方法では、まず、ＥＬＩＳＡプレート等のマイクロプレートのウェル（担体）に第１抗体を固定化（吸着）させる。次に、前記ウェル内に検査試料を加え、該試料中のＳＥと前記ウェルに固定化された第１抗体との間で抗原抗体反応を行わせ、前記ＳＥをウェルに結合（吸着）させる（第１抗原抗体反応）。続いて、同ウェル内に標識化第２抗体を加え、該第２抗体と前記ウェルに結合したＳＥとの間で抗原抗体反応を行わせ、前記第２抗体をウェルに結合（吸着）させる（第２抗原抗体反応）。その後、前記ウェルに結合した標識化第２抗体の標識を利用してＳＥ（抗原）の検出や定量を行う。
【００１８】
前記第１抗体としてはＳＥ−ＭＡｂが用いられ、標識化第２抗体としてはペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識化された酵素標識ＳＥ−ＭＡｂが好適に用いられる。なお、この検査方法において、同一のウェルに加えられる第１抗体と第２抗体とは、同じ毒素型のＳＥに結合するモノクローナル抗体が用いられるが、ＳＥの検出や毒素型判別における擬陽性や擬陰性が現れにくくなることから同じ毒素型のＳＥの異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が好適に用いられる。
【００１９】
実施形態の腸管毒素の検査キットは、前記第１抗体又は該第１抗体が固定化されたマイクロプレートと、前記標識化第２抗体とを備えている。さらに、この検査キットとしては、マイクロプレートのウェル内を洗浄するための洗浄液（所定塩濃度の緩衝液）、第２抗体を標識するための酵素の基質、検量線作製のための濃度既知ＳＥ（抗原）溶液又は粉末等を備えていてもよい。
【００２０】
実施形態の腸管毒素の除去方法は、上記ＳＥ−ＭＡｂが固定化された固定化担体を用いて、ＳＥを含む可能性のある液体から該ＳＥを除去するものであり、例えば飲食品の製造又は加工工程で実施される。前記固定化担体としては、ビーズ、ゲル、樹脂フィルム、樹脂シート、合成繊維、ガラス繊維、中空糸膜等が挙げられる。この除去方法を飲料品の製造工程で実施する場合には、浄水器による飲料水の浄化と同様に実施すればよく、例えば前記固定化担体からなるフィルターに飲料品を通すことにより実施される。このとき、前記固定化担体を定期的に回収してＳＥの検査（検出）や該固定化担体の洗浄を行うことにより、食中毒事件の発生を未然に防ぐために役立てることが容易となる。
【００２１】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・実施形態のＳＥ−ＭＡｂは、ＳＥに対して結合し、ＳＥ以外の抗原性物質に対して反応（結合）しないものである。このため、このＳＥ−ＭＡｂは、食品検査や食中毒の検査等においてＳＥの検出を極めて高感度かつ正確に行うことができる。また、飲食品中からのＳＥの除去にも利用することができる。さらに、このＳＥ−ＭＡｂがＳＥＡ，ＳＥＢ，ＳＥＣ，ＳＥＤ，ＳＥＥ，ＳＥＧ，ＳＥＨ，ＳＥＩ，ＳＥＪ，ＳＥＫ又はＳＥＬのいずれか１種類の毒素型のみに対して特異的に結合するものである場合には、ＳＥの毒素型の判別やＳＥ濃度の定量に好適に利用することができる。
【００２２】
・実施形態のＳＥの検査方法は、ＳＥ−ＭＡｂを用いたイムノアッセイによる検査方法である。この検査方法は、モノクローナル抗体（特にＩｇＧ抗体）が用いられていることから、ポリクローナル抗体を用いたＲＰＬＡと比べて、ＳＥに対する特異性が著しく高い。このため、擬陽性や擬陰性の判定がされにくいことから、ＳＥの検査を極めて迅速かつ正確に行うことができる。さらに、この検査方法では、イムノアッセイが適用されていることから、ＳＥの検査における検出感度を著しく容易に高めることができるうえ、操作も極めて容易である。特に、エンザイム・イムノアッセイを適用する場合には、該検出手段が数段階に及ぶ検出シグナルの増幅を伴っていることから、検出感度を容易に高めることができるうえ定量性にも優れている。
【００２３】
さらに、このＳＥの検査方法として、第１抗体と標識化第２抗体との間に検査試料中に含まれるＳＥを挟み込む形式のサンドイッチＥＬＩＳＡを行う場合には、食品検査や食中毒の検査において最も適した検査システムが構築され得る。即ち、このサンドイッチＥＬＩＳＡでは、検査試料中に含まれている可能性のあるＳＥを第１抗体によって特異的に認識させる反応と、該第１抗体に認識されたＳＥを標識化第２抗体によって特異的に認識させる反応との２段階の抗原抗体反応を経ている。このため、これら２段階の反応全てに適切に関与する抗原以外は検出されることがないため、非特異的な反応（バックグラウンド）を著しく効果的に抑えることができ、擬陽性や擬陰性の判定が現れにくくなる。特に、前記第１抗体と標識化第２抗体とがＳＥ蛋白質の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体である場合には、検査の信頼性が著しく顕著に向上する。
【００２４】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜モノクローナル抗体の作製と評価＞
（ＳＥＡ−ＭＡｂ、ＳＥＢ−ＭＡｂ、ＳＥＣ−ＭＡｂの作製と評価）
１）免疫動物の免疫：抗原としては、各種黄色ブドウ球菌株の培養上清から精製したＳＥＡ及びＳＥＢと、Ｔｏｘｉｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＳＥＣ１とを用いた。各抗原をフロイントの完全アジュバント（ＣＨＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）に混合してエマルジョンを作製した後、該エマルジョンをＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢のメス）に腹腔内注射（抗原５０μｇ／免疫マウス）した。その後２週間毎に計３回、追加免疫として、同じ抗原をフロイントの不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製）に混合したエマルジョンを腹腔内注射（抗原２５μｇ／免疫マウス）した。次に、キャピラリー（ＤＲＵＭＭＯＮＤ社製）を用いて免疫マウス眼底静脈叢より採血し、ＥＬＩＳＡ法にて各抗原に対する血清抗体価（ＩｇＧクラス）の上昇を確認した。下記細胞融合を行う４日前に、最終免疫として、同じ抗原を生理食塩水に溶解した抗原溶液を腹腔内注射（抗原２５μｇ／免疫マウス）するとともに、細胞融合における親細胞株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）をスケールアップ（２５ｍｌ／マウス）した。
【００２５】
２）細胞融合：前記各免疫マウスから全血採血した後に脾臓（細胞融合用）を摘出するとともに、正常マウスより胸腺（Ｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒ調製用）を摘出した。続いて、摘出された各組織から脾臓細胞浮遊液と胸腺細胞浮遊液とをそれぞれ作製した後、脾臓細胞と前記スケールアップされたＰ１Ｕ３とを１０対１の割合で混合し、ポリエチレングリコール（ＨａｍｐｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて細胞融合を実施した。細胞融合終了後、これらの細胞を前記胸腺細胞から調製したＦｅｅｄｅｒｌａｙｅｒに懸濁し、９６ウェル培養プレート（ＣＯＳＴＡＲ社製）に１００μｌ／ｗｅｌｌでまき、３７℃のＣＯ_２インキュベータにて培養した。
【００２６】
３）ＨＡＴセレクション：前記細胞融合実施後１８時間以内に、１ウェルあたり５０μｌのＨＡＴ培地を追加して第１回目のＨＡＴセレクションを行った。その後、３〜４日おきに計３回、１ウェルあたり培養上清を７０μｌずつ抜き取った後に８０μｌのＨＡＴ培地を追加することにより、第２回目〜第４回目のＨＡＴセレクションを行った。
【００２７】
４）ハイブリドーマのスクリーニング：スクリーニング開始の２日前に１ウェルあたり１００μｌのＨＴ培地を追加し、スクリーニング開始日に培養上清を１ウェルあたり１００μｌずつ抜き取った後、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。予め各抗原を吸着させた抗原プレートを準備しておき、該抗原プレートのウェル内に遠心上清を７０μｌずつ分注した後、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ−ＡＰ（ＳＢＡ社製）とＰＮＰＰ（ＷＡＫＯ社製）とからなるＥＬＩＳＡの系で特異抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）をスクリーニングした。
【００２８】
５）リクローニング：モノクローナルな細胞株を樹立する目的で、前記４）にてスクリーニングされた各ハイブリドーマを段階希釈してリクローニングを行った。培地にはＨＴ培地にて作製した前記胸腺細胞浮遊液を使用し、これを約２週間培養した。その結果、下記表１に示されるように、ＳＥＡ−ＭＡｂを産生する９つのハイブリドーマクローンと、ＳＥＢ−ＭＡｂを産生する４つのハイブリドーマクローンと、ＳＥＣ１−ＭＡｂを産生する４つのハイブリドーマクローンとが得られた。
【００２９】
【表１】

６）腹水タイプ抗体の調製：前記５）で樹立した各ハイブリドーマクローンが産生する抗体のＩｇＧサブクラスを決定した（結果を上記表１に示す）。次に、各ハイブリドーマを培養によりスケールアップした後、予めプリスタン（ＳＩＧＭＡ社製）処置しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に移植（５×１０^６ｃｅｌｌｓ／マウス）した。約１０〜１４日後に前記マウスの腹水を回収し、硫安塩析及びプロテインＧアフィニティーカラム（ＫＰＲ社製）によって腹水タイプ抗体を精製した。
【００３０】
７）抗体力価測定及び交差反応性試験：前記各腹水タイプ抗体を１μｇ／ｍｌの濃度に調整した抗体溶液を段階希釈して希釈系列を作製した。次に、予め上記表１に示される各抗原を吸着させた抗原プレートを準備しておき、該抗原プレートのウェル内に前記抗体溶液の希釈系列を７０μｌずつ分注した後、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ１−ＡＰ又はａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ２−ＡＰと、ＰＮＰＰとからなるＥＬＩＳＡの系で発色させた。そして、４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより抗体力価及び交差反応性を調べた。結果を上記表１に示す。なお、表中のＳＥＣ２はＴｏｘｉｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入した。
【００３１】
表１より、９つのＳＥＡ−ＭＡｂ、２つのＳＥＢ−ＭＡｂ（１４Ｆ２Ｇ，１９Ａ９Ｇ）及び３つのＳＥＣ１−ＭＡｂ（２３Ｅ４Ｈ，２４Ｅ１１Ｈ，２５Ｂ１１Ｈ）は、いずれも作製時に用いた毒素型のＳＥのみに特異的に結合し、それ以外の毒素型のＳＥに対しては交差反応性を示さない有用なものであることが確認された。また、１９Ｂ５Ｇハイブリドーマが産生するＳＥＢ−ＭＡｂは、ＳＥＣ１やＳＥＣ２に対して交差反応性が０．３％程度と極めて低いことから、ＳＥＢに対して特異的に結合するＭＡｂであると位置づけられる。その他の２つのＳＥ−ＭＡｂ（１７Ｆ５Ｇ，２３Ｇ８Ｈ）では、異なる２種類の毒素型に対してそれぞれ高い交差反応性を示すものであることから、毒素型の判別には不向きであるが、ＳＥを含むか否かのＳＥ検査（検出のみ）に用いることは可能である。一方、これら表１に示される１７のＳＥ−ＭＡｂはいずれも、黄色ブドウ球菌が産生するプロテインＡ及びボツリヌスＣ型毒素複合体に対しては反応しなかった。
【００３２】
＜ＲＰＬＡ，ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲによるＳＥの検査＞
下記表２に示される黄色ブドウ球菌２２株について、ＳＥ蛋白質の有無をＰＬＲＡにて調べるとともに、ＳＥ遺伝子の有無をＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲにて調べた。なお、表２に示される各菌株は、主に国内で発生した食中毒事件で分離されたものであり、その発生年と由来とを同表に示した。ＲＰＬＡによる検査は、従来法により行われ、その多くは食中毒事件当時に行われた検査結果をそのまま引用した。ＰＣＲによる検査は、各菌株からゲノムＤＮＡを抽出した後、ＳＥＡ〜ＳＥＩ遺伝子に特異的なプライマー（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９（３）４２６−４３０、Ｊａｒｒａｕｄｅｔａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７（８）２４４６−２４４９、Ｍｏｎｄａｙｅｔａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７（１０）３４１１−３４１４）を用いてＰＣＲを行いアガロースゲル電気泳動にてＰＣＲ産物を確認することにより行った。ＲＴ−ＰＣＲによる検査は、各菌株からトータルＲＮＡを抽出した後、前記ＳＥＡ〜ＳＥＩ遺伝子に特異的なプライマーを用いて常法に従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を下記表２に示す。
【００３３】
【表２】

表２より、多くの菌株では、ＲＰＬＡ（ＳＥＡ〜ＳＥＤのみが検査可能）での検査によって確認されていた毒素型の遺伝子に加えて、その他の毒素型の遺伝子をもゲノム中に保有していたことがＰＣＲにより新たに確認された。さらに、今回新たにＰＣＲによって確認されたその他の毒素型の遺伝子を保有する菌株のほとんどでは、該遺伝子のｍＲＮＡが発現していたこともＲＴ−ＰＣＲによって確認された。また、Ｓａ１及びＳａ２は、これまでの報告には見られなかったＳＥＨ単独での食中毒の発症例である可能性が高いことも示された。さらには、今回ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲによって確認されたＳＥＡ遺伝子とＳＥＨ遺伝子とを同時に保有する菌株は、実際の食中毒事件における被害状況と照らし合わせてみると、特に被害が大きかったことも示された。
【００３４】
＜サンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＥの検査＞
（標識化第２抗体の作製）
上記６）腹水タイプ抗体の調製で作製した抗体（３Ｈ１１ｂ１２，１９Ｂ５Ｇ，２５Ｂ１１Ｈが産生する抗体）をＣｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ−１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にて濃縮した後、２ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））に溶解させた。次に、Ｅｚ−Ｌｉｎｋｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を２０μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）加え、氷中に２時間放置した。続いて、ＣｅｎｔｒｉｃｏｎＹＭ−１００にて未反応のビオチンを除去することによって標識化第２抗体としてのビオチン化抗体を作製した。このビオチン化抗体は０．１％ＮａＮ_３を添加して４℃で保存可能である。
【００３５】
（サンドイッチＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに上記６）腹水タイプ抗体の調製で作製した抗体（ビオチン化されていない；第１抗体）所定量を吸着させて洗浄した後、０．１％ゼラチンにてブロッキング処理を行った。次に、各ウェルに上記各抗原の希釈系列を添加して抗原抗体反応を行わせた後に洗浄し、さらに前記ビオチン化抗体所定量を添加して抗原抗体反応を行わせた。各ウェルを洗浄した後にアルカリフォスファターゼ標識化アビジンを添加し、ウェル内に吸着されているビオチン化抗体（前記ビオチン化されていない抗体と同じハイブリドーマが産生したもの）と結合させた後、前記アルカリフォスファターゼの基質を加えて発色させた。そして、４０５ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定することにより検量線を作製した。その結果、ＳＥＡを測定するための検量線はｙ＝０．０７５ｘ、Ｒ^２＝０．９９９、ＳＥＢを測定するための検量線はｙ＝０．８３８ｘ、Ｒ^２＝０．９９７３、ＳＥＣを測定するための検量線はｙ＝０．０３４ｘ、Ｒ^２＝０．９９６８と極めて定量性が高いことが示された。
【００３６】
次に、前記抗原として上記表２に示される各菌株の培養上清を用いた以外は全く同様にサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、前記各検量線を用いて各菌株培養上清中に含まれる抗原（ＳＥ）濃度を求めた。結果を上記表２に示す。なお、ＳＥＣ１−ＭＡｂ（２５Ｂ１１Ｈ）にてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った結果は、全ての菌株培養上清で不検出（ＮＤ）であった。表２より、サンドイッチＥＬＩＳＡにて得られた結果は、ＲＰＬＡによって得られた結果と完全に一致することが確認された。
【００３７】
また、Ｓａ１１５２０では、ＳＥＡ遺伝子がゲノム中に保有されており（ＰＣＲの結果参照）、かつ該遺伝子のｍＲＮＡが発現している（ＲＴ−ＰＣＲの結果参照）にも関わらず、サンドイッチＥＬＩＳＡでは検出できなかった（勿論ＲＰＬＡでも不検出であった）。この結果は、ｍＲＮＡの発現とＳＥ蛋白質の産生とが完全に一致しないケースも存在し得ることを示している可能性が高く、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲでの検査結果を実際の食中毒事件の原因究明の柱とするのは不適切であることが容易に示唆され得る。
【００３８】
＜ＳＥの回収試験＞
牛乳（小岩井乳業の生乳原液）又はマウス血清１０倍希釈液中に上記各抗原（ＳＥＡ，ＳＥＢ，ＳＥＣ１）を下記表３の添加量欄に示される終濃度となるように添加してＳＥ添加試料を作製した。上記（サンドイッチＥＬＩＳＡ）における培養上清（抗原）の代わりに前記各ＳＥ添加試料を用いて全く同様にサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、各ＳＥ添加試料中に含まれるＳＥ濃度（回収量及び回収率）を求めた。このサンドイッチＥＬＩＳＡは各ＳＥ添加試料について合計３回行い、その平均値と標準偏差とを求めた。結果を下記表３に示す。
【００３９】
【表３】

その結果、ＳＥＡ，ＳＥＢ，ＳＥＣ１ともに、ＲＰＬＡの検出限界であると言われる１ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で、約９０％以上の回収率であったことが確認された。この回収率は１〜２５ｎｇ／ｍｌの濃度においてもほとんど同じ値であることから、１ｎｇ／ｍｌ未満のＳＥ濃度でも十分に実用的かつ正確なＳＥの検出及び定量が可能であることが強く示唆される。また、この回収試験の結果より、ＳＥを含有する飲食品等をＳＥ−ＭＡｂと接触させることにより、約９０％以上のＳＥを極めて容易に除去することが可能であることが容易に予想され得る。
【００４０】
＜ＳＥＨ−ＭＡｂの作製と評価＞
ＳＥＨ遺伝子の存在が確認された２つの黄色ブドウ球菌株Ｓａ１又はＳａ２の培養上清中の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認したところ、ＳＥＨ蛋白質に相当する染色バンドを確認することができなかったことから、天然蛋白質の精製は極めて困難であることが予想された。このため、前記菌株からＳＥＨ遺伝子をクローニングしてリコンビナントＳＥＨ蛋白質（ｒＳＥＨ）を作製する方針で以下の操作を行った。即ち、黄色ブドウ球菌株Ｓａ１又はＳａ２から、ＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した後、遺伝子発現用に制限酵素部位（ＮｃｏＩ，ＸｈｏＩ）が付加されたＰＣＲプライマーを用いてＳＥＨ遺伝子をＰＣＲ増幅した。続いて、ＰＣＲ増幅された増幅遺伝子をＴＯＰＯＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてサブクローニングした後に塩基配列を決定したところ、ＳＥＨ遺伝子と一致していたことが確認された。
【００４１】
次に、前記塩基配列を確認した遺伝子を、大腸菌ペリプラズム領域に発現させるためのベクターであるｐＥＴ２０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、大腸菌ＤＥ３を形質転換することによってクローンＳＨＥ／ｐＥＴ２０ｂ／ＢＬ２１（ＤＥ３）を作製した。該クローンの培地に０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加して３時間インキュベートし蛋白質発現を誘導した後、浸透圧ショックによりペリプラズム画分蛋白質を抽出し、さらに該蛋白質をニッケルカラムにて精製することによってｒＳＥＨを得た。得られたｒＳＥＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認したところ、分子量約３０ｋＤａの単一の濃い染色バンドが確認された。さらに、このｒＳＥＨをペプチドシーケンスしたところ、ｐｅｌＢシグナル配列が取り除かれた目的とする蛋白質であることも確認された。なお、この蛋白質は、天然のＳＥＨ蛋白質のＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｕ）の前に開始コドンに対応するメチオニンが付加され、Ｃ末端のアミノ酸（Ｖａｌ）の後にオリゴヒスチジンタグが付加されている。このｒＳＥＨを大量生産した後、該ｒＳＥＨを抗原として上記と同様にハイブリドーマを作製したところ、天然ＳＥＨ及びｒＳＥＨに結合するモノクローナル抗体（ＩｇＭ抗体）を産生するハイブリドーマが得られた。
【００４２】
なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・上記ＳＥ−ＭＡｂは、作製時に用いたＳＥと同じ毒素型に特異的に結合するものであるのが最も好ましいが、その他の毒素型のＳＥに対して５％以上の交差反応性を示すものであってもよい（例えば上記１７Ｆ５Ｇ，１９Ｂ５Ｇ，２３Ｇ８Ｈ）。このように構成した場合、１種類のＳＥ−ＭＡｂにより、一度に複数種類の毒素型の検出を同時に行うことができることから、検査試料中にＳＥが含まれる可能性が低い食品検査においては、費用対効果の関係から極めて利用しやすい。
【００４３】
・上記サンドイッチＥＬＩＳＡとして、イムノクロマトグラフィー法を採用してもよい。このイムノクロマトグラフィー法では、上記マイクロプレートの代わりにメンブレンフィルター等が用いられること以外は上記サンドイッチＥＬＩＳＡとほぼ同様に実施され得る。
【００４４】
・上記サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた検査方法において、同一のウェルに加えられる第１抗体と第２抗体とは、同じ毒素型のＳＥに結合するモノクローナル抗体であって、異なるハイブリドーマクローンが産生したものを用いてもよい。このように構成した場合、上記同じ毒素型のＳＥの異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体を用いた場合と同様に、ＳＥの検出や毒素型判別における擬陽性や擬陰性を現れにくくすることが容易となる。
【００４５】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・黄色ブドウ球菌が産生する腸管毒素蛋白質又は黄色ブドウ球菌の腸管毒素遺伝子を導入した形質転換体が産生する腸管毒素リコンビナント蛋白質を抗原として作製されることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【００４６】
・黄色ブドウ球菌の腸管毒素Ａ、腸管毒素Ｂ、腸管毒素Ｃ又は腸管毒素Ｈに対するモノクローナル抗体。このように構成した場合、黄色ブドウ球菌腸管毒素に対して結合することができる。
【００４７】
・黄色ブドウ球菌の腸管毒素Ａに対して結合し、腸管毒素Ｂ及び腸管毒素Ｃに対して結合しないモノクローナル抗体。黄色ブドウ球菌の腸管毒素Ｂに対して結合し、腸管毒素Ａ及び腸管毒素Ｃに対して結合しないモノクローナル抗体。黄色ブドウ球菌の腸管毒素Ｃに対して結合し、腸管毒素Ａ及び腸管毒素Ｂに対して結合しないモノクローナル抗体。これらのように構成した場合、黄色ブドウ球菌腸管毒素の毒素型の判別に容易に利用することができる。
【００４８】
・黄色ブドウ球菌の腸管毒素を検査するための検査キットであって、第１抗体と標識化第２抗体とを備えるとともに、該第１抗体及び標識化第２抗体は黄色ブドウ球菌の腸管毒素に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする腸管毒素の検査キット。このように構成した場合、検出感度を高めつつ黄色ブドウ球菌腸管毒素の検査を迅速かつ正確に行うことが容易である。
【００４９】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の発明のモノクローナル抗体によれば、黄色ブドウ球菌腸管毒素に対して結合することができる。請求項２に記載の発明のハイブリドーマによれば、黄色ブドウ球菌腸管毒素に対して結合する腸管毒素特異モノクローナル抗体を容易に提供することができる。
【００５０】
請求項３及び請求項４に記載の発明の腸管毒素の検査方法によれば、検出感度を高めつつ黄色ブドウ球菌腸管毒素の検査を迅速かつ正確に行うことが容易である。請求項５に記載の発明の腸管毒素の除去方法によれば、黄色ブドウ球菌腸管毒素を除去することが容易である。

Claims

黄色ブドウ球菌の腸管毒素に対するモノクローナル抗体。
黄色ブドウ球菌の腸管毒素に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
黄色ブドウ球菌の腸管毒素を検査する方法であって、
黄色ブドウ球菌の腸管毒素に対するモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより、前記腸管毒素を含む可能性のある検査試料を検査することを特徴とする腸管毒素の検査方法。
前記イムノアッセイは、同じ毒素型の腸管毒素蛋白質の異なるエピトープと結合する２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項３に記載の腸管毒素の検査方法。
黄色ブドウ球菌の腸管毒素を除去する方法であって、
黄色ブドウ球菌の腸管毒素に対するモノクローナル抗体が固定化された固定化担体を用いて腸管毒素を除去することを特徴とする腸管毒素の除去方法。