JP2006104154A - リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体、これを生産するハイブリドーマ、これを含む試験キット及びこれを使用した検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明はリステリアモノサイトゲネスのp60タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、これを生産するハイブリドーマ細胞、このようなモノクローナル抗体を含む試験キット及びこのようなモノクローナル抗体を使用してリステリアモノサイトゲネスを検出する方法に関する。
【解決手段】
本発明のモノクローナル抗体はリステリアモノサイトゲネスだけを選別的に認知することによりこのような抗体を使用して人間に病原性である菌により汚染された食品の汚染有無を迅速に検定しうる。
【選択図】 なし
Description
過程で長い間生存及び増殖が可能なので、冷蔵保存食品を媒介にした食中毒発生の主な原因菌になっている。さらに、この細菌によるリステリア感染症(Listeriosis)は重症に進む場合敗血症及び脳髄膜炎を引き起こし姙産婦の流産を引き起こす。新生児、高齢者、姙産婦及び免疫欠乏患者が特に危険であり、感染症を引き起こした患者では30%に至る高い死亡率を示す。このようなリステリア感染症の発生は食肉及び食肉加工品、野菜、乳化工品などのような食品が主要感染経路であると知られている。従って、リステリア症を予防するためにリステリアモノサイトゲネスによる食品の汚染有無を迅速に診断する必要がある。
Bubert A.et al.,Appl. Environ Microbiol、60(9)、3120-7、1994
パク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を試料サンプルと接触させリステリアモノサイトゲネスのp60タンパク質とモノクローナル抗体の抗原-抗体複合体の存在を調べることを特徴として、リステリアモノサイトゲネス汚染を検出する方法を提供する。
本発明の試験キットは、望ましくはELISA用キットまたは免疫クロマトグラフィを
用いたディップスティックである。
する。
リステリアモノサイトゲネスのp60タンパク質のiap(invasion-associated prote
in)遺伝子(Andreas、B.et al.、J.Bacteriol.、174:8166-8171、1992)をクローニングするために先にこの遺伝子をPCTを通して増幅した。
2-1: 抗体生成細胞
実施例1で製造したp60タンパク質をSDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)が含まれたゲルで電気電気泳動し(100μg)、ゲルの断片を切った後同じ体積の完全フロイントアジュバントが配合されたエマルジョンを製造した。前記エマルジョンを生後7週齢雌BALB/Cマウス5匹の腹腔内に注射した。1匹当たり20μgの抗原を注射し、総体積は400μlにした。2週後に不完全フロイントアジュバントと抗原を混合したエマルジョンを前記マウスの腹腔に注入した後、2週間後PBSに溶かした抗原を(10μg/mouse)腹腔内に注射して抗体生成を誘導した。抗体生成有無を確認するためにELISA及びウェスタンブロット検定を施して抗体を確認した後、細胞融合に入る3日前にマウスの尻尾静脈にPBSに溶かした抗原を再度注射した。汚染を防止するために全てのマウスを選択した領域で飼育した。
2-2: 抗体生成細胞の確認及び選別
前記方法により免疫化されたマウスで血液試料を目(eye ball)から取得して1.5ml遠心分離チューブに入れて血清を遠心分離して(1800rpm、10分)抗体の生成有無を実験する前まで-20℃で保管した。
2-3: ハイブリドーマ細胞製造
抗体生成が確認された後マウスを犠牲させ抗体生産脾臓細胞を分離し、これと骨髄腫細胞(myeloma cell)P3X63Ag8.653を融合方法(Cesar Milstein and Georges Kohler's method)から由来した変形された方法(Method in enzymology、vol.73、 p3.Academic Press、New York)により融合した。
2-4: ハイブリドーマの選別及び分離
前記実施例で収得した培養上澄液を取って直接的ELISA方法でp60に対する陽性クローンを選別した後、ウェスタンブロットで陽性クローンであることを再び確認した。多数のハイブリドーマのうちp60タンパク質について抗体活性が高い(OD1.2以上)10種のハイブリドーマ細胞を得た。
前記実施例2で得られた各抗体別陽性クローンを用いてマウス腹腔培養液を製造し、これより抗体を分離した。各抗体別に生産ハイブリドーマ細胞が違うだけ、腹腔培養液製造及び分離方法は同様に行なった。
前記実施例3において分離されたモノクローナル抗体p6007及びp6017についてELISA及びウェスタンブロットを行ない、これら抗体が公知のペプチドpepA(Ser-Thr-Pro-Val-Ala-Pro-Thr-Gln-Glu-Val-Lys-Lys)(配列3)及びpepD(Gln-Gln-Gln-Thr-Ala-Pro-Lys-Ala-Pro-Thr-Glu)(配列4)を認知するのかを観測した。
リステリアモノサイトゲネスを検出するためのELISA検定キットを製造するためにリステリアモノサイトゲネスに特異的なp6007モノクローナル抗体とリステリア種に特異的なp6017モノクローナル抗体を用いた。
主要食中毒原因菌であるリステリアモノサイトゲネスを迅速にスクリーニングするための免疫クロマトグラフィを用いたディップスティックを製造するために、モノクローナル抗体p6007をコロイド状金(40nm)と結合させ、モノクローナル抗体p6017を捕獲抗体として使用し、抗マウスIgGを対照抗体として使用した。対照線にバンドが発生すれば有効な実験として見なし、二つのバンド、すなわち捕獲線と対照線にバンドが生ずると陽性と見なし、リステリアモノサイトゲネス菌を分離及び同定し、対照線だけでバンドが発生すれば陰性と見なしてリステリアモノサイトゲネスがないことと判断した。
本実施例に用られた試験方法は次の通りである。
1.リステリアモノサイトゲネスを選別的に認知するモノクローナル抗体(p6007またはp6017)を各ウェルに100ng/100μlに分注し37℃で2時間30分間インキュベーションした。
2.0.05% Tween20のPBS溶液で各ウェルを3回ずつ洗浄した。
3.1%BSAを100μlずつ分注し37℃で1時間インキュベーションして遮断した。
4.0.05% Tween20のPBS溶液で各ウェルを3回ずつ洗浄した。
5.抗原を各ウェルに100μlずつ分注し37℃で1時間インキュベーションした。具体的に、ブランクの場合0.1%BSAを分注し、陽性対照群の場合リステリアモノサイトゲネスから組換えp60を100ng/ウェルになるよう分注し、試験菌株の場合5mlのBHI(brain hert infusion;DIFCO社)肉汁培地で18時間37℃で培養した後BHI肉汁培地を遠心分離(3000rpm、15分)してその上澄液を各ウェルに分注した。
6.0.05%Tween20のPBS溶液で各ウェルを3回ずつ洗浄した。
7.ポリクローナル抗体(ラビット)またはモノクローナル抗体を各ウェルに100ng/100μlずつ分注し37℃で1時間インキュベーションした。
8.HRP(horse radish peroxidase)-結合抗ラビット抗体(PBSTで1:1000に稀釈)を各ウェルに100ng/100μlずつ分注し、37℃で1時間インキュベーションした。
9.0.05%Tween20のPBS溶液で各ウェルを5回ずつ洗浄した。
10.発色試薬緩衝溶液9.45mlと4%OPD(o-フェニレンジアミン)0.5mlとH2O2 0.05mlを混合した発色試薬を製造して各ウェルに100μlずつ分注し常温で20分間インキュベーションした。
12.492nmでOD値を測定した。
1.抗原を各ウェルに100μlずつ分注し、37℃で2時間30分間インキュベーションした。
2.0.05%Tween20のPBS溶液で各ウェルを3回ずつ洗浄した。
3.1%BSAを100μl分注し37℃で1時間インキュベーションして遮断した。
4.0.05%Tween20のPBS溶液で各ウェルを3回ずつ洗浄した。
5.抗体または1%BSA(ブラック)を各ウェルに100μlずつ分注し37℃で1時間インキュベーションした。
6.HRP-結合抗マウス抗体またはHRP-結合抗ラビット抗体(PBSTで10、000で稀釈)を100μlずつ分注し37℃で1時間インキュベーションした。
7.発色試薬緩衝溶液9.45mlと4%OPD(o-フェニリンジアミン)0.5mlとH2O2 0.05mlを混合した発色試薬を各ウェルに100μlずつ分注し常温で20分間インキュベーションした。
9.492nmでOD値を測定した。
1.リステリア種をBHI肉汁培地で一晩中37℃で培養して得た上澄液250μlとブリリアントブルーR(brilliant blue R)を染料として使用したサンプル緩衝液(X6)50μlをよく混合してお湯に5分間浸した後そのうち20μlを取って12%スルフェイト-ポリアクリレートゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルにローディングした。
2.電気電気泳動が完了された後4℃で一晩中NC(ニトロセルロース)膜に移動させた。
3.PBSに0.05%Tween20を添加した溶液で洗浄した。
4.常温で1時間5%脱脂牛乳で遮断した。
5.PBSに0.05%Tween20を添加した溶液で洗浄した。
6.ニトロセルロース膜を常温で1時間10mlの5%脱脂牛乳に抗体10μlを混合した溶液に浸漬した。
7.PBSに0.05%Tween20を添加した溶液で洗浄した。
8.ニトロセルロース膜を常温で1時間HRP-結合された抗-マウス抗体またはHRP-結合された抗ラビット抗体(5%脱脂牛乳で1:10、000で稀釈)10mlに浸漬した。
9.SuperSignal(登録商標)WestPico Chemiluminescent Substrate(PIERCEキット)を使って発光させ化学発光計で発光を測定した。
1.金粒子(gold particle; 40nm)に結合させるp6007モノクローナル抗体の最適濃度を決定してからコロイド状金に適した濃度の抗体を入れ30分間室温で回転させながら反応させた。30分後、BSAを入れ4℃で一晩中反応させた。4℃で10000rpmで1時間遠心分離した後、上澄液を用心深く捨てて金パレットを最初体積の10分の1程度に浮遊させた。このようにp6007モノクローナル抗体が結合された金粒子を420nmで吸光度が1になるよう調節して接合パッドに噴射した後、接合パッドを60℃で真空状態で1時間乾燥させた。乾燥してから使用前までは絶対湿度(RH)30%以下で保管した
2.ニトロセルロース膜に捕獲抗体及び対照抗体処理を施した。捕獲抗体としてリステリア種に特異的なモノクローナル抗体p6017をニトロセルロース膜1cm当り1μgを分注し、対照抗体として濃度が1ml当り1mgである抗-マウスIgGをニトロセルロース膜1cm当り1μgになるよう分注した。処理された膜を37℃で一晩中乾燥させた後、使用前まで絶対湿度(RH)30%以下で保管した。
3.サンプルの適用に適した条件のためサンプルパッドを適した緩衝溶液で遮断した。60℃で1時間乾燥させてから、使用前まで絶対湿度30%以下に保管した。
4.前記で用意されたパッドを接合パッドに連結させた後サンプルスクリーニングに使用した。
5.リステリア増菌培地で一晩中増菌し1mlを取って3000rpmで10分間遠心分離した後上澄液を10分間沸してサンプルとして使用した。
6.前記で用意されたサンプル100μlをサンプルパッドに滴下した後5分後に判読した。
Claims (11)
- 受託番号KCTC−10431BPのハイブリドーマ細胞を用いて生産される、リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のp60タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体。
- 受託番号KCTC10432BPのハイブリドーマ細胞を用いて生産される、リステリア種(Listeria spp.)のp60タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体。
- 請求項1のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞KCTC10431BP。
- 請求項2のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞KCTC10432BP。
- 請求項1のモノクローナル抗体を試料サンプルと接触させリステリアモノサイトゲネスのp60タンパク質とモノクローナル抗体の抗原-抗体複合体存在を調べることを特徴として、リステリアモノサイトゲネス汚染を検出する方法。
- 抗原-抗体複合体をRIA、ELISA、免疫蛍光法、色彩粒子結合法、または化学発光物質結合法で検出する請求項5に記載の方法。
- 請求項1のモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第2抗体として請求項2のモノクローナル抗体を使って検出する請求項5または6に記載の方法。
- 請求項1のモノクローナル抗体を含むことを特徴とするリステリアモノサイトゲネス汚染を検出するためのキット。
- キットはELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)法を用いる請求項8に記載のキット。
- キットは免疫クロマトグラフィ法を用いる請求項8に記載のディップスティックキット。
- 請求項1のモノクローナル抗体に捕獲された抗原に結合する第2抗体として請求項2のモノクローナル抗体を使用する請求項8ないし10のうちいずれか1項に記載のキット。
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KR100906160B1 (ko) | 2007-06-15 | 2009-07-03 | 한국외국어대학교 연구산학협력단 | 중합효소연쇄반응과 효소결합면역반응을 이용한 식중독 세균 Listeria monocytogenes의 검출법 |
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