KR100504132B1 - 리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 시험 키트 및 이를 사용한 검출 방법 - Google Patents

리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 시험 키트 및 이를 사용한 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본원에는 리스테리아 모노사이토게네스의 p60단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포, 이러한 단클론 항체를 포함하는 시험 키트 및 이러한 단클론 항체를 사용하여 리스테리아 모노사이토게네스를 검출하는 방법에 대해 기술되어 있다. 본 발명의 단클론 항체는 리스테리아 모노사이토게네스만을 선별적으로 인지함으로써 이러한 항체를 사용하여 사람에게 병원성인 상기 균으로 오염된 식품의 오염 여부를 신속하게 검정할 수 있다.

Description

리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 시험 키트 및 이를 사용한 검출 방법{Monoclonal antibody selectively recognizing Listeria monocytogenes, hybridoma producing the antibody, test kit comprising the antibody and detection method using the antibody}
리스테리아(Listeria)의 균종들은 그람 양성의 통성 혐기성 간균으로서 자연계에 널리 분포하고 있다. 리스테리아 종(Listeria spp.)에는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 리스테리아 시일리게리(Listeria seeligeri), 리스테리아 웰쉬메리(Listeria welshimeri) 및 리스테리아 그라이(Listeria grayi)등의 다수의 종들이 있으며, 이중에서 리스테리아 모노사이토게네스만이 사람에게 병원성이 있으며, 동물에 병원성이 있는 균주는 리스테리아 모노사이토게네스와 리스테리아 이바노비이다. 특히, 리스테리아 모노사이토게네스는 냉장 보존을 요하는 식품에 오염되는 경우 저온 보존 과정에서 오랫동안 생존 및 증식이 가능하기 때문에 냉장보존 식품을 매개로한 식중독 발생의 중요한 원인균이 되고 있다. 더욱이 이 세균에 의한 리스테리아 감염증(Listeriosis)은 중증으로 진행하는 경우 패혈증 및 뇌수막염을 일으키고 임산부의 유산을 유발한다. 신생아, 고령자, 임산부 및 면역결핍환자가 특히 위험하며, 감염증을 일으킨 환자에서는 30%에 이르는 높은 사망률을 나타낸다. 이러한 리스테리아 감염증의 발생은 식육 및 식육 가공품, 야채, 유가공품 등과 같은 식품이 주요 감염 경로인 것으로 알려져 있다. 따라서, 리스테리아증을 예방하기 위하여 리스테리아 모노사이토게네스에 의한 식품의 오염 여부를 신속하게 진단할 필요가 있다.
현재 병원 및 산업체(식품회사, 식육회사 및 유가공업체) 등에서 사용할 수 있는 리스테리아 동정 방법으로는 여러가지 생화학적 검사법을 사용하는 전통적인 방법이 있으나 많은 시간과 인력이 요구되는 비효율적인 방법이다.
리스테리아 모노사이토게네스에 의한 감염 여부 및 식품에서의 오염 여부를 신속히 확인하기 위한 진단 방법으로 중합효소 연쇄반응(PCR) 법과 같은 분자 생물학적 방법이 이용되고 있으나 기술력과 정밀성이 요구되기 때문에 실제 임상 및 산업적으로 적용하기에는 부적합한 방법이다. 또한, 효소면역법(EIA : Enzyme immunoassay)과 같은 면역학적 방법이 많이 사용되고 있으나 비특이성이 나타나기 때문에 부정확한 검사 결과가 얻어지거나 추가 확인 시험이 필요한 경우가 생기게 된다.
리스테리아균을 신속히 검출하기 위한 키트로는 PCR 기법, 핵산 하이브리드화 분석법을 이용한 비방사활성 DNA 프로브 키트, 면역검정법을 이용한 키트 등이 알려져 있으며, 또한 면역크로마토그라피법을 이용한 딥-스틱(dip-stick) 방법으로 개발된 제품도 있으나 이들 키트 모두 리스테리아모노사이토게네스만을 특이적으로 검출하지 못하거나 모든 리스테리아 종들이 검출되는 단점을 가지고 있다.
리스테리아 모노사이토게네스에 대한 단클론 항체의 생산이 어려웠으므로 상기 균주를 선택적으로 인지하는 단클론 항체를 사용한 ELISA 또는 딥-스틱 검출 키트가 개발되지 못했다. 이는 리스테리아 모노사이토게네스 균주 전체를 항원으로 사용하였거나 일부 특정 항원을 사용한 경우에도 리스테리아 모노사이토게네스에 대해서만 특이한 단클론 항체가 생산되지 않았기 때문이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자는 리스테리아 속(genus)에 공통으로 존재하는 뮤레인 하이드롤라제 효소 p60중에서 리스테리아 모노사이토게네스의 p60의 특이적 항원 결정기를 인지하는 단클론 항체를 제조하였다.
발명의 요지
본 발명은 수탁번호 KCTC 10431BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 수탁번호 KCTC 10432BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는, 리스테리아 종(Listeria spp.)의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함하는, 리스테리아 모노사이토게네스 오염을 검출하기 위한 시험 키트를 제공한다.
상기 시험 키트는, 바람직하게는 ELISA용 키트 또는 면역크로마토그래피를 이용한 딥-스틱이다.
상기 시험 키트에서, 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체에 포획된 항원에 결합하는 제2 항체는 바람직하게는 리스테리아 종의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체이다.
또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 리테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질과 단클론 항체의 항원-항체 복합체의 존재를 조사함을 특징으로 하여, 리스테리아 모노사이토게네스 오염을 검출하는 방법을 제공한다.
상기 검출 방법에서, 항원-항체 복합체는 바람직하게는 RIA, ELISA, 면역형광법, 색체입자결합법 또는 화학발광물질결합법으로 검출한다.
상기 검출 방법에서, 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체에 포획된 항원에 결합하는 제2 항체는 바람직하게는 리스테리아 종의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체이다.
본 발명은 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 특이적으로 검출하는 단클론 항체에 관한 것이다.
구체적으로, 하나의 양태로서 본 발명은 수탁번호 KCTC 10431BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는, 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC 10432BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는, 리스테리아 종(Listeria spp.)의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체에 관한 것이다.
리스테리아 종(Listeria spp.)에 공통적으로 존재하는 뮤레인 하이드롤라제 효소인 p60은 리스테리아가 세포 분열을 위해 분비하는 엑소(exo) 효소로서, 본 발명 이전, p60의 특정 펩타이드, 예를 들어 pepA 및 pepD(Bubert A. et al., Appl. Environ Microbiol, 60(9), 3120-7, 1994)를 사용하여 다클론 항체를 제조한 바 있다. 본 발명자는 상기 pepA 및 pepD 펩타이드 부위와 다른 부위에 특이적으로 결합하여(실시예 4, 도 4a) 리스테리아 모노사이토게네스만을 선별적으로 인지할 수 있는 신규한 단클론 항체를 제조하였다.
본원에 사용된 용어 "단클론 항체"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 결정기(에피토프)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론 항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또다른 장점을 갖는다.
본 발명의 단클론 항체는 p60을 면역원으로 하여 동물을 면역화시킨 후, 면역화된 동물의 비장 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성하고, 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질과 특이적으로 결합하는 하이브리도마를 선별하여 이로부터 제조한 항체이다.
구체적으로, 본 발명에서는 단클론 항체 제조에 재조합 p60 단백질을 면역원으로 사용하였으며, 이는 공지의 염기서열(Andreas B., et al., J. Bacteriol., 174: 8166-8171, 1992)을 이용하여 당 분야의 통상적인 방법에 따라 PCR 증폭 산물을 pET-21a 벡터에 삽입하고 이 벡터를 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 발현시키고 정제하여 제조하였다. 정제된 재조합 p60 단백질을 면역원으로 하여 마우스를 면역화시키고 이로부터 비장 세포를 분리한 후 골수종 세포 P3X63Ag8.653와 융합시킨 후 ELISA 및 웨스턴 블롯 시험으로 p60 단백질에 대해 항체 활성이 높은 하이브리도마를 선별한 후, 이를 다시 배양하여 다시 ELISA 및 웨스턴 블롯 시험으로 양성 하이브리도마 p6007 및 6017을 선별하였다. 상기 하이브리도마의 배양 상등액을 사용한 ELISA 및 웨스턴 블롯 시험 결과, 하이브리도마 p6007만이 리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하였다. 상기 선별한 하이브리도마를 동물 복강내에 주입하고 주입 후 일정기간이 지난 다음 회수한 동물의 복수로부터 단클론 항체를 분리하였다.
정제된 단클론 항체를 사용하여 샌드위치 및 직접적 ELISA, 웨스턴 블롯 시험을 통해 각각의 모노클로날 항체를 규명하였다. 본원에서 사용된 용어 "단클론 항체 p6007"은 하이브리도마 p6007에 의해 분비되는 단클론 항체이며, 용어 "단클론 항체 p60017"은 하이브리도마 p6017에 의해 분비되는 단클론 항체이다.
샌드위치 ELISA 및 웨스턴 블롯 시험 결과, 단클론 항체 p6007이 리스테리아 모노사이토게네스만을 선별적으로 인지하는 단클론 항체로 밝혀졌으며, 단클론 항체 p6017은 리스테리아 종들을 선별적으로 인지하는 단클론 항체로 밝혀졌다(도 1).
상기한 바와 같이 리스테리아 모노사이토게네스만을 선별적으로 인지하는 것으로 확인된 단클론 항체 p6007 및 리스테리아 종들을 선별적으로 인지하는 것으로 확인된 단클론 항체 p6017은 식품에서 분리된 33개의 리스테리아 모노사이토게네스 균주 모두를 선별적으로 인지하였다(도 2b 및 2c).
또한, 본 발명의 단클론 항체 p6007 및 p6017이 pepA 및 pepD 펩타이드를 인지하는지의 여부를 직접적 ELISA로 시험하였다. 본 발명의 단클론 항체 p6007 및 p6017은 pepA 및 pepD와 결합하지 않았으며, 이로부터 본 발명의 단클론 항체는 pepA 및 pepD의 에피토프를 이용하지 않는 것으로 확인되었다(도 4a). pepA/pepD의 경쟁(competition)을 샌드위치 ELISA로 검증한 경우에도, 단클론 항체 p6007이 pepA와 pepD의 에피토프를 이용한다면 pepA와 pepD의 첨가량 변화에 따라 OD 값이 변해야하나 펩타이드 첨가량의 변화에 대해 차이 없이 포화된 OD 값을 나타내었으므로 단클론 항체 p6007은 pepA와 pepD의 에피토프를 이용하지 않는 것으로 확인되었다(4b 및 4c).
본 발명의 리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 단클론 항체 p6007을 생산하는 하이브리도마 p6007은 KCTC(Korean Culture for Type Cultures)에 2003년 2월 21일자로 수탁번호 KCTC 10431BP로 기탁되었으며, 리스테리아 종을 선별적으로 인지하는 단클론 항체 p6017을 분비하는 하이브리도마 p6017은 KCTC에 2003년 2월 21일자로 수탁번호 KCTC 10432BP로 기탁되었다.
따라서, 또다른 양태로서 본 발명은 단클론 항체 p6007을 생산하는 하이브리도마 p6007(KCTC 10431BP)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단클론 항체 p6017을 생산하는 하이브리도마 p6017(KCTC 10432BP)에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단클론 항체p6007은, 표준 균주들의 면역학적 검정으로 접근가능한 항원결정인자와의 반응성에 더하여, 식품에서 분리된 리스테리아 모노사이토게네스에 대해서도 높은 특이성과 감도를 지니므로 리스테리아 모노사이토게네스를 특이적으로 검출하는데 적합하다.
따라서, 또다른 양태로서 본 발명은 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 p6007을 시료 샘플과 접촉시켜 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질과 단클론 항체의 항원-항체 복합체 존재를 조사함으로써, 리스테리아 모노사이토게네스의 오염을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 시료중의 리스테리아 모노사이토게네스의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 p60 단백질 항원과 이를 인지하는 단클론 항체의 결합물을 의미한다.
본 발명의 검출 방법에서는 시료 샘플로서 5 내지 15분 동안 가열한 배양 상등액을 사용한다.
본 발명의 단클론 항체 p6007과 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질과의 항원-항체 복합체의 검출은 당 업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적, 기타 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 목적상, 항원-항체 복합체의 검출 방법으로는 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역형광법, 색체입자결합법, 화학발광물질결합법 등이 바람직하게 이용될 수 있다.
항원-항체 복합체의 검출은 직접적으로나 간접적으로 표지된 항체의 사용을 수반하며, 사용 가능한 검출 표지로는, 예를 들어 바이오틴-스트렙트아비딘 결합체, 형광 염료(예: 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광 단백질 등), 방사성표지물(예: 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예: HRP, 알칼라인 포스파타제 및 기타 ELISA에서 일반적으로 사용되는 것들), 및 색채표지물, 예를 들어 콜로이드상 금 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다. 이러한 표지물의 사용을 기술하고 있는 문헌[U.S. Pat. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; and 4,366,241; Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene Oreg.)]을 참조한다.
본 발명에서 항원-항체 복합체의 검출에 특히 바람직한 방법은 ELISA이다. ELISA 검출 방법에 따라, 시료 샘플은 고체 지지체, 예를들어 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 테스트 스트립 등에 코팅된 본 발명의 단클론 항체와 접촉된다. 구체적 일례로서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 본 발명의 단클론 항체로 코팅하고 점유되지 않은(nonoccupied) 결합 부위를 예를 들어 BSA로 차단한 후, 코팅된 플레이트의 웰을 시료 샘플과 인큐베이션하고, 이어서 항원-항체 복합체의 존재를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체의 존재는 항원-항체 복합체의 항원에 대해 특이적인 항체, 예를 들어 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체를 사용하거나 리스테리아 종의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 단클론 또는 다클론 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출 표지를 갖지 않는 경우 이들 단클론 또는 다클론 항체를 검출할 수 있는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서, 리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 단클론 항체 p6007과 결합된 항원에 결합하는 제2 항체로는 바람직하게는 리스테리아 종들을 선별적으로 인지하는 단클론 항체가 사용될 수 있으며, 특히 p6017가 바람직하다.
하나의 예시로서, 단클론 항체 p6007과 시료를 반응시키고 이어서 리스테리아 종의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 p6017를 결합시켜 이로부터 검출 표지 신호를 측정하거나 이들 복합체에 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지를 갖는 항체를 첨가하여 이로부터 검출 표지 신호를 측정하여 리스테리아 모노사이토게네스를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서 항원-항체 복합체의 검출에 특히 바람직한 또다른 방법으로는 단클론 항체를 콜로이드상 금입자와 결합시키는 금입자결합법을 들 수 있다.
또다른 양태로서, 본 발명은 상기한 바와 같은 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 p6007을 포함하는, 리스테리아 모노사이토게네스의 오염을 검출하기 위한 시험 키트에 관한 것이다.
본 발명의 리스테리아 모노사이토게네스의 검출 시험 키트에 사용되는 단클론 항체는, 이 항체가 리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단클론 항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 리스테리아 모노사이토게네스 검출 시험 키트에는 리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 단클론 항체 p6007 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 검출 방법 및 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다.
본 발명의 리스테리아 모노사이토게네스 검출을 위한 시험 키트는 바람직하게는 ELISA 키트 또는 면역크로마토그래피를 이용한 딥-스틱이다.
본 발명의 시험 키트에서, 리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 단클론 항체 p6007과 결합된 항원에 결합하는 제2 항체로는 바람직하게는 리스테리아 종을 선별적으로 인지하는 단클론 항체가 사용될 수 있으며, 특히 단클론 항체 p6017이 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 보다 구체적으로 설명된다. 그러나, 예시된 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
실시예
본 실시예에 이용된 시험 방법들은 다음과 같다.
시험예 1 : 샌드위치 ELISA 시험
1. 리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 단클론 항체(p6007 또는 p6017)를 각 웰에 100ng/100㎕로 분주하고 37℃에서 2시간 30분 동안 인큐베이션하였다.
2. 0.05% Tween 20의 PBS 용액으로 각 웰을 3회씩 세척하였다.
3. 1% BSA를 100㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 차단하였다.
4. 0.05% Tween 20의 PBS 용액으로 각 웰을 3회씩 세척하였다.
5. 항원을 각 웰에 100㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 구체적으로, 블랭크의 경우 0.1% BSA를 분주하고, 양성 대조군의 경우 리스테리아 모노사이토게네스로부터의 재조합 p60을 100ng/웰이 되도록 분주하며, 시험 균주의 경우 5㎖의 BHI(brain hert infusion; DIFCO사) 브로쓰에서 18시간 동안 37℃에서 배양한 후 BHI 브로쓰를 원심분리(3000 rpm, 15분)하여 그 상등액을 각 웰에 분주하였다.
6. 0.05% Tween 20의 PBS 용액으로 각 웰을 3회씩 세척하였다.
7. 다클론 항체(래비트) 또는 단클론 항체를 각 웰에 100ng/100㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
8. HRP(horse radish peroxidase)-결합 항-래비트 항체(PBST로 1:1000으로 희석)를 각 웰에 100ng/100㎕씩 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
9. 0.05% Tween 20의 PBS 용액으로 각 웰을 5회씩 세척하였다.
10. 발색시약 완충 용액 9.45 ㎖와 4% OPD(o-페닐렌 디아민) 0.5 ㎖와 H2O2 0.05㎖를 혼합한 발색 시약을 제조하여 각 웰에 100㎕씩 분주하고 상온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
발색시약 완충 용액
시약명 첨가량
시트르산(일수화물) 3.66 g
인산칼륨(K2PO4) 11.35 g
D.W 1000 ㎖
11. 정지 용액 8N H2SO4를 각 웰에 15㎕씩 분주하였다.
12. 492 nm에서 OD 값을 측정하였다.
시험예 2 : 직접적 ELISA 시험
1. 항원을 각 웰에 100㎕씩 분주하고 37℃에서 2시간 30분 동안 인큐베이션하였다.
2. 0.05% Tween 20의 PBS 용액으로 각 웰을 3회씩 세척하였다.
3. 1% BSA를 100㎕ 분주하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 차단하였다.
4. 0.05% Tween 20의 PBS 용액으로 각 웰을 3회씩 세척하였다.
5. 항체 또는 1% BSA(블랭크)를 각 웰에 100㎕씩을 분주하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
6. HRP-결합 항-마우스 항체 또는 HRP-결합 항-래비트 항체(PBST로 10,000으로 희석)를 100㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
7. 발색시약 완충 용액 9.45 ㎖와 4% OPD(o-페닐린 디아민) 0.5 ㎖와 H2O2 0.05㎖를 혼합한 발색 시약을 각 웰에 100㎕씩 분주하고 상온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
발색시약 완충 용액
시약명 첨가량
시트르산(일수화물) 3.66 g
인산칼륨(K2PO4) 11.35 g
D.W 1000 ㎖
8. 정지 용액 8N H2SO4를 각 웰에 15㎕씩 분주하였다.
9. 492 nm에서 OD 값을 측정하였다.
시험예 3: 웨스턴 블롯 시험
1. 리스테리아 종들을 BHI 브로쓰에서밤새 37℃에서 배양하여 수득한 상등액 250 ㎕와 브릴란트 블루 R(brilliant blue R)을 염료로 사용한 샘플 완충액(X6) 50㎕를 잘 혼합하여 끓는 물에 5분 동안 담근 후 그 중 20㎕를 취해 12% 설페이트-폴리아크릴레이트 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 겔에 로딩하였다.
2. 전기영동이 완료된 후, 4℃에서 밤새 NC(니트로셀룰로스) 막에 이동시켰다.
3. PBS에 0.05% Tween 20을 첨가한 용액으로 세척하였다.
4. 상온에서 1시간 동안 5% 탈지 우유로 차단하였다.
5. PBS에 0.05% Tween20을 첨가한 용액으로 세척하였다.
6. 니크로셀룰로스 막을 상온에서 1시간 동안 10ml의 5% 탈지 우유에 항체 10μl를 혼합한 용액에 담그었다.
7. PBS에 0.05% Tween 20을 첨가한 용액으로 세척하였다.
8. 니트로셀룰로스 막을 상온에서 1시간 동안 HRP-결합된 항-마우스 항체또는 HRP-결합된 항-래비트 항체(5% 탈지 우유로 1:10,000으로 희석) 10 ㎖에 담그었다.
9. SuperSignal?? WestPico Chemiluminescent Substrate(PIERCE 키트)를 사용하여 발광시키고 화학발광계로 발광을 측정하였다.
시험예 4 : 딥-스틱 시험
1. 금입자(gold particle; 40nm)에 결합시킬 p6007 단클론 항체의 최적 농도를 결정한 다음 콜로이드상 금에 적합한 농도의 항체를 넣고 30분 동안 실온에서 회전시키면서 반응시켰다. 30분 후, BSA를 넣고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 4℃에서 10000rpm으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상등액을 조심스럽게 버리고 금 펠렛을 처음 부피의 10분의 1 정도로 부유시켰다. 이렇게 p6007 단클론 항체가 결합된 금입자를 420nm에서 흡광도가 1이 되게 조절하여 접합 패드에 분사한 후, 접합 패드를 60℃에서 진공상태에서 1시간 동안 건조시켰다. 건조한 후 사용 전까지 절대습도(RH) 30% 이하에서 보관하였다.
2. 니트로셀룰로스 막에 포획 항체 및 대조 항체 처리를 하였다. 포획 항체로서 리스테리아 종에 특이적인 단클론 항체 p6017을 니트로셀룰오스 막 1cm당 1ug을 분주하고, 대조 항체로서 농도가 1ml당 1mg인 항-마우스 IgG를 니트로셀룰오스 막 1cm당 1ug되게 분주하였다. 처리된 막을 37℃에서 밤새 건조시킨 후, 사용 전까지 절대습도(RH) 30% 이하에서 보관하였다.
3. 샘플을 적용하기에 적합한 조건을 위해 샘플패드를 적합한 완충용액으로 차단하였다. 60℃에서 1시간 동안 건조시킨 다음, 사용 전까지 절대습도 30%이하에 보관하였다.
4. 상기에서 준비된 패드들을 접합 패드에 연결시킨 다음 샘플 스크리닝에 사용하였다.
5. 리스테리아 증균 배지에서 밤새 증균하고 1ml을 취하여 3000rpm에서 10분 동안 원심분리한 다음 상등액을 10분 동안 끓여서 샘플로 사용하였다.
6. 상기에서 준비된 샘플 100ul을 샘플패드에 떨어뜨린 다음 5분 후에 판독하였다.
실시예 1: PCR 및 클로닝
리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질의 iap(invasion-associated protein) 유전자(Andreas, B. et al., J. Bacteriol., 174: 8166-8171, 1992)를 클로닝하기 위해서 먼저 이 유전자를 PCR을 통해 증폭하였다.
프라이머, 즉 iap-F-pET (5' - GGG AAT TCC ATA TGA GCA CTG TAG TAG TCG AAG CT - 3') (서열 1) 및 iap-R-pET(5' - GCC GCT CGA GTA CGC GAC CGA AGC CAA C - 3') (서열 2)를 시그날 서열을 제외한 모든 부분이 포함되도록 디자인하였으며, pET-21a 벡터의 특성에 따라 스톱 코돈도 제외하였다. 또한, 클로닝을 위해 전방향 프라이머에는 NdeI, 역방향 프라이머에는 XhoI 제한효소 부위를 첨가하였다. PCR은 전체 볼륨을 50ul로 하였으며, 리스테리아 모노사이토게네스의 염색체 DNA 10ng, 10◎fu 완충액(Stratagene) 5ul, 클로닝된 Pfu 폴리머라제 1U, 0.2mM dNTP, 각각 10pmol의 프라이머를 배합하여 PCR하였다. 보다 높은 신뢰도(fidelity)를 위해 Pfu 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였다. PCR은 PTC-150(MJ Research)을 사용하여 30 사이클 동안 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분의 조건으로 하였다.
PCR 완료 후, PCR 산물을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 이용해서 정제하였다. 정제된 DNA는 클로닝을 위해 NEB 완충액 4(New England Biolabs))에서 제한효소 NdeI과 XhoI(New England Biolabs)을 처리했다. 제한효소 처리 후, 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고 Geneclean 스핀 키트(Q-bio gene)을 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 삽입 DNA를 NdeI과 XhoI으로 처리한 pET-21a 벡터와 T4 DNA 결합 완충액에서 T4 DNA 리가제(NEB)로 결합하여 이. 콜라이 DH10b에 일렉트로포레이션하였다. 클로닝 여부는 플라스미드 스핀 키트(Genenmed)로 미니프렙하여 확인하였다.
pET 시스템의 발현을 위해 클로닝된 벡터를 발현 균주 이. 콜라이 BL21로 형질전환하고 다시 미니프렙을 통해 확인하였다. 클로닝된 이. 콜라이를 플레이트에서 밤새 키운 후, 하나의 콜로니를 5ml LB amp 브로쓰에 접종하여 약 OD600이 1.0일 때까지 배양하였다. 이 배양액 5ml을 새로운 500ml LB amp 브로쓰에 가하고 2 내지 3시간 동안 배양하여 OD600이 0.5 내지 1.0이 되면 IPTG를 1mM되게 가하여 단백질의 발현을 유도하였다. 20℃에서 밤새 유도한 뒤, 배양액을 원심분리하여 상등액을 버리고 이. 콜라이만을 얻었다. 이후의 단백질 정제는 His·Bind 정제 키트(Novagen)를 사용하여 수행하였다. 세포 펠렛을 1/25 부피의 완충액(0.1% Triton X-100, 50mM pH 8.0 Tris-HCl)에 부유시킨 후, 리소자임 0.1mg/ml(Sigma)를 넣고 초음파 처리하여 이. 콜라이를 부수었다. 다시 27000xg에서 30분 동안 원심분리한 후, 충진 완충액으로 Ni 이온을 충진시켜 미리 준비된 NTA-킬레이트화 아가로즈 CL-6B(Peptron) 컬럼에 이 상등액을 통과시켰다. 단백질이 흡착된 컬럼을 10배 컬럼 부피의 결합 완충액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM pH7.9 Tris-HCl)과 6배 부피의 세척 완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM pH7.9 Tris-HCl)으로 비특이적으로 흡착되어 있는 단백질을 제거하였다. 마지막으로 용출 완충액(1mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM pH7.9 Tris-HCl)으로 컬럼에 결합된 p60를 분리하였다. 얻어진 p60을 SDS-PAGE 겔을 통하여 확인하였다.
실시예 2: 하이브리도마 세포 제조
2-1: 항체 생성 세포
실시예 1에서 제조한 p60 단백질을 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)이 포함된 겔에서 전기영동하고(100ug), 겔의 단편을 자른 후 같은 부피의 완전한 프로인트 아주방트가 배합된 에멀젼을 제조하였다. 상기 에멀젼을 생후 7 주령 암컷 BALB/C 마우스 5 마리의 복강내에 주사하였다. 1 마리당 20 μg의 항원을 주사하되 총 부피는 400 ㎕로 하였다. 2주 뒤에 불완전 프로인트 아주방트와 항원을 혼합한 에멀전을 상기 마우스의 복강에 주입한 후, 2주일 후 PBS 에 녹인 항원을(10 μg/mouse) 복강내에 주사하여 항체 생성을 유도하였다. 항체 생성 여부를 확인하기 위하여 ELISA 및 웨스턴 블롯 검정을 실시하여 항체를 확인한 후, 세포 융합에 들어가기 3일 전에 쥐의 꼬리 정맥에 PBS에 녹인 항원을 재차 주사하였다. 오염을 방지하기 위해서 모든 마우스를 선택된 영역에서 사육하였다.
2-2: 항체 생성 세포의 확인 및 선별
상기 방법에 따라 면역화된 마우스에서 혈액 시료를 눈으로(eye ball)부터 취득하여 1.5 ml 원심분리 튜브에 담아 혈청을 원심분리하여(1800 rpm, 10분) 항체의 생성 여부를 실험하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.
p60 단백질로 ELISA 방법에 의해 항체의 생성을 확인한 후 항체 생성 세포에 대한 융합에 착수하였다. 상기 이. 콜라이에서 발현시킨 p60 단백질을 0.5 μg/웰로 96-웰 플레이트에 코팅한 후에 하룻밤 동안 반응시켰다. PBST(PBS buffer, 0.05% Tween 20)로 3차 세척한 후 1% BSA로 반응을 종료하였다. 다시 PBST로 3차 세척한 후 혈청을 1:500 내지 2000까지 희석하여 처리한 후 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 3차 세척한 후, 항-마우스 IgG 결합 HRP를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, PBST로 3차 세척한 후, 100 μl OPD(Sigma)를 처리한 후 20분 동안 발색시켰다. 15 μl 반응 종료 용액(8N 황산)을 첨가한 후, 492 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
2-3: 하이브리도마 세포 제조
항체 생성이 확인된 후 마우스를 희생시켜 항체 생산 비장 세포를 분리하고, 이와 골수종 세포(myeloma cell) P3X63Ag8.653를 융합 방법(Cesar Milstein and Georges Kohler's method)에서 유래된 변형된 방법(Method in enzymology, vol. 73, p3. Academic Press, New York)에 따라 융합하였다.
마우스의 P3X63Ag8.653 세포를 배양 접시에 10% FBS RPMI1640 배지를 이용하여 최적 성장기에 이르도록 유지시켰다. 세포 융합 하루 전에 P3X63Ag8.653 세포를 3 x 105 세포/ml로 희석하여 다음날 50 ml을 취하여 3분간 400 xg 에서 원심분리하였다. 무혈청 배지로 2번 세척한 후, 1 x 107 세포/ml이 되게 농도를 맞추었다. 이어서, 마우스를 경추이탈(cervical dislocation)에 의해 희생시켜 비장을 취득하고 이것을 메쉬 용기에 넣고 세포를 하나씩 분리시켰다. 이때, 모든 배지는 무혈청으로 사용하였다. 완전히 분리된 항체 생산 세포를 5분 동안 400 xg에서 원심분리한 후, 무혈청 배지로 2번 세척하고 10 ml의 배지에 현탁시켰다. 림프구를 혈구계수기(haemocytomer)로 계수하여 108 의 림프구를 1 x 107 P3X63Ag8.653 세포 (10:1)와 섞어 3분 동안 400 xg로 원심분리하였다. 37℃에서 전처리된 50% PEG (Sigma) 1ml 용액을 1분에 걸쳐 서서히 떨어뜨리면서 섞었다. 생성된 융합 혼합액을 RPMI 1640 배지로 4ml/3분, 이어서 5ml/4분, 이어서 20ml/5 분에 걸쳐 희석하고 3분 동안 400 xg에서 원심분리한 후, HAT 선택배지 35 ml에 세포를 현탁시켰다. 100 ul의 현탁액을 하루전에 공급세포(feeder cell, 마우스의 복강에서 PBS로 분리한 대식구)를 코팅한 96-웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 7 내지 14 일 동안 배양하였다.
2-4: 하이브리도마의 선별 및 분리
상기 실시예에서 수득한 배양 상등액을 취하여 직접적 ELISA 방법으로 p60에 대한 양성 클론을 선별한 후, 웨스턴 블롯으로 양성 클론임을 다시 확인하였다. 다수의 하이브리도마중에서 p60 단백질에 대해 항체 활성이 높은(OD 1.2 이상) 10 가지 하이브리도마 세포를 얻었다.
이렇게 확인된 양성 클론을 일련의 과정으로 희석하여 하나의 융합세포를 96-웰 플레이트의 한웰 당 0.5 세포씩 분주하여 7일 동안 배양한 후, ELISA와 웨스턴 블롯으로 검증하였다. 이로부터 최종 양성 클론을 검증하여 항체의 성질과 인지 부위에 따라 p6007, p6013, p6017, p6030 및 p6033을 분리하였다. 최종적으로 검증된 융합세포를 24-웰로 옮겨 규모를 조금씩 키워서 T25 플라스크에 최종적으로 이전시켜 분리 배양하였다.
선별된 p60 단백질 항체를 생산하는 하이브리도마중 하이브리도마 p6007 및 p6017을 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지)에 2003년 2월 21일자로 각각 KCTC 10431BP 및 KCTC 10432BP로 기탁하였다.
실시예 3: 항체 생산 및 분리
상기 실시예 2에서 얻어진 각 항체별 양성 클론을 이용하여 마우스 복강 배양액을 제조하고, 이로부터 항체를 분리하였다. 각 항체별로 생산 하이브리도마 세포만 다를 뿐 복강 배양액 제조 및 분리방법은 동일하게 수행하였다.
상기 실시예 2에서 구별된 항체의 복강 배양액을 얻기 위해서, ELISA 방법 및 웨스턴 블롯 방법으로 확인된 단클론 항체를 각각 생성하는 양성 클론 3x106 세포를 1 주일 전에 프레스틴을 미리 처리한 BALB/C 마우스의 복강내로 주사하였다. 10 내지 15일 후에 3 내지 10ml의 복수를 추출하였다. 단클론 항체 p6007 및 p6017 모두 동일한 방법으로 제조하였고, 다만 최종 검증단계에서 다섯 가지로 나누어졌으며 각각의 항체를 만들기 위해 독립적으로 복강 배양액을 수득하였고 각 항체를 포함하는 복강 배양액으로부터 항체의 분리를 다음과 같은 방법으로 수행하였다.
상기 수득한 복수를 단백질 A 친화성 칼럼(Amersham Bioscience, HiTrap rProtein A FF)을 통해 정제하였다. 즉, 단백질 A 칼럼을 10 배 부피의 DPBS로 1 ml/분의 속도로 균질화시킨 후 복수를 통과시켰다. 이때 속도는 AKTA 정제기(Amersham Bioscience)에 의해 1 ml/분으로 통과시키고 용출은 100 mM 글리신(pH 3.0)으로 한 후, 1/10 배 양의 2M Tris(pH 8.0)로 중성화시켰다. 이때 용출 속도는 1 ml/분으로 하여 각각의 항체를 정제 및 분리하였다.
실시예 4: 단클론 항체를 사용한 ELISA 및 웨스턴 블롯 시험
상기 실시예 3에서 분리된 단클론 항체 p6007 및 p6017에 대해 ELISA 및 웨스턴 블롯을 수행하고, 이들 항체가 공지의 펩타이드 pepA(Ser-Thr-Pro-Val-Ala-Pro-Thr-Gln-Glu-Val-Lys-Lys) (서열 3) 및 pepD(Gln-Gln-Gln-Thr-Ala-Pro-Lys-Ala-Pro-Thr-Glu) (서열 4)를 인지하는 가를 관측하였다.
포획 항체로서 다클론 항체 100ng을 사용한 직접적 ELISA 분석결과, 총 19개의 리스테리아 균들 중 1개의 리스테리아 그레이를 제외한 리스테리아 균종 모두를 검출하는 다클론 항체가 리스테리아 모노사이토게네스를 검출하는 샌드위치 ELISA에서 제2 항체로써 사용 가능하다는 것을 확인하였다.(도 1a). 또한, 다클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 검정한 결과, 마찬가지로 리스테리아 균들중에서 리스테리아 그레이를 제외한 리스테리아 균종 모두를 검출함을 확인하였다(도 1a).
포획 항체로서 200ng의 단클론 항체 p6007을 사용하고 제2 항체로서 100ng의 다클론 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 분석 결과, 총 19개의 리스테리아 균들중 리스테리아 모노사이토게네스를 제외한 6개의 리스테리아 균들은 블랭크의 OD 값이 0.3과 비슷한 수준이었으며 14개의 리스테리아 모노사이토게네스의 경우 OD 값이 0.9 이상 수준이었다. 이러한 결과로부터 단클론 항체 p6007가 리스테리아 모노사이토게네스를 특이적으로 검출하는데 적합하다는 것이 확인되었다(도 1b). 또한, 단클론 항체 p6007을 사용하여 웨스턴 블롯 검정한 결과, 마찬가지로 리스테리아 균들중에서 리스테리아 모노사이토게네스 균주만을 검출함을 확인하였다(도 1b).
또한, 포획 항체로서 리스테리아 균종 모두를 검출하는 200ng의 단클론 항체 p6017를 사용하고 제2 항체로서 100ng의 다클론 항체를 사용한 샌드위치 ELISA 분석 결과, p6017의 단클론 항체는 리스테리아 그라이, 리스테리아 웰쉬메리, 리스테리아 이노쿠아, 리스테리아 이바노비, 리스테리아 모노사이토게네스, 리스테리아 시일리게리 모두를 검출하였다(도 1c). 이러한 결과는 p6017이 p6007에 대한 제2 항체로서 적합함을 나타낸다. 또한, 단클론 항체 p6017을 사용하여 웨스턴 블롯 검정한 결과, 마찬가지로 단클론 항체 p6017은 리스테리아 모노사이토게네스 뿐만 아니라 리스테리아 이바노비까지도 검출하였으므로 p6007에 대한 제2 항체로서 적합함을 확인하였다(도 1c).
또한, 식품에서 분리된 총 33개의 리스테리아 모노사이토게네스 균주들에 대해 포획 항체로서 다클론 항체 100ng을 사용한 직접적 ELISA 분석결과, 총 33개의 리스테리아 모노사이토게네스 균들을 모두 검출하였으므로 도 1a와 마찬가지로 다클론 항체가 리스테리아 모노사이토게네스를 검출하는 샌드위치 ELISA에 제2 항체로써 사용가능하다는 것을 확인하였다(도 2a). 또한, 다클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 검정한 결과, 마찬가지로 모든 리스테리아 모노사이토게네스 균들 모두를 검출함을 확인하였다(도 2a).
또한, 포획 항체로서 200ng의 p6007과 p6017 및 제2 항체로서 100ng의 다클론 항체 사용하고, 식품에서 분리된 총 33개의 리스테리아 모노사이토게네스 균주들을 BHI 브로쓰에서 37℃에서 밤새 배양한 후 원심분리(3000 rpm, 15min)하고 그 상등액을 끓는 물에 10분 동안 처리한 균액을 100㎕/well 씩 접종하여 수행한 샌드위치 ELISA 분석한 결과, 식품 균주 모두에 대해 양성이었으며 100%의 감도와 특이성을 나타내었다(도 2b 및 2c).
한편, 단클론항체 p6007과 p6017이 pepA 및 pepD를 인지하는지의 여부를 직접적 ELISA 방법으로 알아보았다. 코팅 항원으로는 100ng의 리스테리아 모노사이토게네스의 재조합 p60, 100ng의 리스테리아 이노쿠아의 재조합 p60, 500ng의 pepA, 500ng의 pepD, 500ng의 음성 대조군 펩타이드를 사용하고, 포획 항체로는 500ng의 다클론 항체, 500ng의 단클론 항체 p6007, 500ng의 p6017을 사용하였다. 그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이 다클론 항체만이 pepA와 결합하였으며 단클론 항체p6007과 p6017 모두 pepA 및 pepD와 결합하지 않으므로 단클론 항체 p6007과 p6017은 pepA와 pepD의 에피토프를 이용하지 않는 것으로 확인되었다.
또한, 포획 항체로서 200ng의 단클론 항체 p6007를 사용하고, 샘플로서 100ng의 리스테리아 모노사이토게네스의 재조합 p60을 사용하며, 제2 항체로서, 도 4b의 경우 다클론 항체를 사용하면서 각각 1μg 내지 1ng 의 pepA 및 pepD를 음성 조절 펩타이드를 첨가하고 펩타이드 Gly Asn Thr Phe Ser Leu Glu Glu Val Asp Lys Leu Gly Cys Arg Asp Thr Arg Leu Leu (서열 5)를 대조 펩타이드로서 사용하며, 도 4c의 경우 바이오티닐화된 단클론 항체 p6017에 각각 1μg 내지 1ng 의 pepA 및 pepD를 음성 조절 펩타이드로서 첨가하고 펩타이드 Gly Asn Thr Phe Ser Leu Glu Glu Val Asp Lys Leu Gly Cys Arg Asp Thr Arg Leu Leu (서열 5)를 대조 펩타이드로서 사용하여, pepA/pepD의 경쟁(competition)을 샌드위치 ELISA로 검증하였다. 그 결과, 단클론 항체 p6007이 pepA와 pepD의 에피토프를 이용한다면 pepA와 pepD의 첨가량 변화에 따라 OD 값이 변해야하나 도 4b 및 4c에 나타난 바와 같이 펩타이드 첨가량의 변화에 대해 차이 없이 포화된 OD 값을 나타내었으므로 도 4a에서와 마찬가지로 단클론 항체 p6007은 pepA와 pepD의 에피토프를 이용하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 샌드위치 ELISA 키트에 적용시 단클론 항체 p6007 및 p6017 및 다클론 항체는 pepA와 pepD를 에피토프로 사용하지 않는 것으로 보인다.
실시예 5: 리스테리아 모노사이토게네스 검출 ELISA 키트
리스테리아 모노사이토게네스를 검출하기 위한 ELISA 검정 키트를 제조하기 위해 리스테리아 모노사이토게네스에 특이적인 p6007 단클론 항체와 리스테리아 종들에 특이적인 p6017 단클론 항체를 이용하였다.
구체적으로 다음과 같이 수행하였다.
포획 항체로서 정제한 p6007 단클론 항체를 50mM 탄산염 완충용액(pH 9.6)에 5μg/ml로 희석하여 100μl씩 96 웰 플레이트(0.5μg/well)에 분주하고 하룻밤 동안 4℃에서 반응시켰다. 반응액을 버리고 0.05% Tween 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다.
플레이트의 빈 공간을 차단하기 위해서 0.05% Tween 20과 1% BSA가 포함된 PBS 200ul를 각 웰에 넣고 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 다시 3번 세척하였다.
샘플은 리스테리아 증균 배지에서 밤새 증균하여 1ml을 3000rpm에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상등액을 10분 동안 끓인 것을 사용하였다. 차단한 플레이트에 준비된 샘플을 각 웰에 100ul씩 가하였다. 이때 실험의 유효성을 평가하기 위해서 양성 대조군과 음성 대조군을 같이 실시하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 버리고, 3번 세척하였다.
2차 항체로서 단클론 항체 p6017을 0.1% BSA가 포함된 PBS에 1ug/ml로 희석하여 각 웰에 100ul씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 3번 세척하였다.
흡광도를 측정하여, 양성 대조군이 1.5 내지 2.0가 나오고 음성 대조군이 0.1이하가 나오면 정상적인 반응으로 간주하였다. 샘플의 값이 1.5 이상 나오면 양성으로 보고 리스테리아 모노사이토게네스의 균을 분리 및 동정하고, 0.1 이하가 나오면 음성으로 보고 샘플에 리스테리아 모노사이토게네스가 오염되지 않은 것으로 간주하였다.
포획 단클론 항체의 양을 달리하여 샌드위치 ELISA를 수행한 결과가 도 3a에 나타나 있다. 구체적으로, 도 3a는 포획 항체로서 단클론 항체 p6007의 양을 200ng, 500ng, 1ug, 2ug으로 변화시켜 수행한 샌드위치 ELISA 결과를 나타낸다. 이때, 제 2 항체로는 100ng의 바이오티닐화된 단클론 항체 p6017의 반응조건(검출 표지물: 스트렙트아비딘-HRP)하에서 사용하였다. 리스테리아 모노사이토게네스를 선별적으로 인지하는 p6007을 포획 항체로서 사용했으므로 리스테리아 모노사이토게네스만을 검출하였으며 단클론 항체 p6007 양이 증가함에 따라 OD 값이 증가하였다. 그 결과에 따르면, 샌드위치 ELISA 키트에 포획 항체 p6007을 500 ng 내지 2 ug의 양으로 사용하였을 때 높은 OD 값이 나왔다.
리스테리아 모노사이토게네스만을 선별적으로 인지하는 것으로 확인된 단클론 항체 p6007은, 상기 리스테리아 균주이외의 다른 균주, 즉 에스케리키아, 엔테로코쿠스, 엔테로박터, 클렙시엘라, 슈도모나스, 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 비브리오 및 살로넬라 균주들은 인지하지 못하였다(도 3b).
실시예 6: 면역크로마토그라피를 이용한 리스테리아 모노사이토게네스의 신속진단
주요 식중독 원인균인 리스테이라 모노사이토게네스를 신속히 스크리닝하기 위한 면역크로마토그래피를 이용한 딥-스틱을 제조하기 위해 단클론 항체 p6007을 콜로이드상 금(40nm)과 결합시키고, 단클론 항체 p6017을 포획 항체로 사용하며, 항-마우스 IgG를 대조 항체로 사용하였다. 대조선에 밴드가 생기면 유효한 실험으로 간주하였으며, 2개의 밴드 즉, 포획선과 대조선에 밴드가 생기면 양성으로 보고 리스테리아 모노사이토게네스 균을 분리 및 동정하고, 대조선에만 밴드가 생기면 음성으로 보고 리스테리아 모노사이토게네스가 없는 것으로 판단하였다.
구체적으로, 리스테리아 모노사이토게네스의 재조합 p60을 시료로 적용시킨 결과가 도 5a에 나타나 있다. 스트립 1 내지 7은 각각 p60을 1000ng, 500ng, 250mg, 125ng, 60ng, 30ng, 15ng 사용한 결과이며, 스트립 8은 음성 대조군이다. 한편, 음성 대조물로서 p60 대신 리스테리아 모노사이토게네스(스트립 0) 및 다양한 균주들(스트립 1 내지 12)의 배양 상등액을 시료로 적용시킨 결과가 도 5b에 나타나 있다. 스트립 1 내지 12는 각각 스트렙토코쿠스 파이오게네스(Streptococus pyogenes), 쉬겔라 플렉네리(Shigella flexneri), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 애루기노사(Pseudonomas aeruginosa), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 콜레래(Vibrio cholerae), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)를 사용하였다.
재조합 p60 및 리스테리아 모노사이토게네스의 배양 상등액의 경우 포획선에 밴드가 나타났으나, 음성 대조군의 상등액의 경우에는 포획선에 어떠한 밴드가 나타나지 않았다. 따라서, 상기 제조된 딥-스틱이 p60만을 선별적으로 인지할 수 있음을 확인 하였다.
상기한 결과로부터, 단클론 항체 p6007과 p6017의 쌍이 리스테리아 사이토게네스의 p60을 선별적으로 인지하는 딥-스틱에 바람직하게 적용될 수 있다.
본 발명의 단클론 항체 p6007은 리스테리아 모노사이토게네스만을 선별적으로 인지함으로써 이러한 항체를 사용하여 사람에게 병원성인 상기 균으로 오염된 식품의 오염 여부를 신속하게 판단할 수 있다.
도 1a는 다클론 항체(래비트)를 사용하여 다양한 리스테리아 종들에 대해 직접적 ELISA 및 웨스턴 블롯 시험한 그래프이다.
도 1b는 단클론 항체 p6007을 사용하여 다양한 리스테리아 종들에 대해 샌드위치 ELISA 및 웨스턴 블롯 시험한 그래프이다.
도 1c는 단클론 항체 p6017을 사용하여 다양한 리스테리아 종들에 대해 샌드위치 ELISA 및 웨스턴 블롯 시험한 그래프이다.
도 2a는 식품에서 분리된 33개의 리스테리아 모노사이토게네스에 대해 다클론 항체(래비트)를 사용하여 직접적 ELISA 시험 및 웨스턴 블롯 시험한 그래프이다.
도 2b는 식품에서 분리된 33개의 리스테리아 모노사이토게네스에 대해 단클론 항체 p6007을 사용하여 샌드위치 ELISA 시험 및 웨스턴 블롯 시험한 그래프이다.
도 2c는 식품에서 분리된 33개의 리스테리아 모노사이토게네스에 대해 단클론 항체 p6017을 사용하여 샌드위치 ELISA 시험 및 웨스턴 블롯 시험한 그래프이다.
도 3a는 단클론 항체 p6007의 양을 변화시키면서 리스테리아 종들에 대해 샌드위치 ELISA 시험한 그래프이다.
도 3b는 단클론 항체 p6007를 사용하여 리스테리아 균주 이외의 다른 균주들에 대해 샌드위치 ELISA 시험한 그래프이다.
도 4a는 다클론 항체, 단클론 항체 p6007 및 단클론 항체 p6017에 의한 pepA 및 pepD 펩타이드 인지 여부를 직접적 ELISA 시험한 그래프이다.
도 4b는 단클론 항체 p6007을 포획항체로 사용하고 제2 항체로서 다클론 항체를 사용하여 pepA/pepD의 경쟁을 샌드위치 ELISA로 검증한 그래프이다.
도 4c는 단클론 항체 p6007을 포획항체로서 사용하고 제2 항체로서 단클론 항체 p6017을 사용하여 pepA/pepD의 경쟁을 샌드위치 ELISA로 검증한 그래프이다.
도 5는 리스테리아 딥-스틱의 전개를 나타내는 사진이다.
<110> KOMED CO., LTD. <120> Monoclonal antibody selectively recognizing Listeria monocytogenes, hybridoma producing the antibody, test kit comprising the antibody and detection method using the antibody <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gggaattcca tatgagcact gtagtagtcg aagct 35 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gccgctcgag tacgcgaccg aagccaac 28 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> pepA <400> 3 Ser Thr Pro Val Ala Pro Thr Gln Glu Val Lys Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> pepD <400> 4 Gln Gln Gln Thr Ala Pro Lys Ala Pro Thr Glu 1 5 10 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> control <400> 5 Gly Asn Thr Phe Ser Leu Glu Glu Val Asp Lys Leu Gly Cys Arg Asp 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu 20

Claims (11)

  1. 수탁번호 KCTC 10431BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
  2. 수탁번호 KCTC 10432BP의 하이브리도마에 의하여 생산되는, 리스테리아 종(Listeria spp.)의 p60 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
  3. 제1항의 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포.
  4. 제2항의 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포.
  5. 제1항의 단클론 항체를 시료 샘플과 접촉시켜 리스테리아 모노사이토게네스의 p60 단백질과 단클론 항체의 항원-항체 복합체 존재를 조사함을 특징으로 하여, 리스테리아 모노사이토게네스 오염을 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 항원-항체 복합체를 RIA, ELISA, 면역형광법, 색체입자결합법, 또는 화학발광물질결합법으로 검출하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 제1항의 단클론 항체에 포획된 항원에 결합하는 제2 항체로서 제2항의 단클론 항체를 사용하여 검출하는 방법.
  8. 제1항의 단클론 항체를 포함함을 특징으로하는, 리스테리아 모노사이토게네스 오염를 검출하기 위한 시험 키트.
  9. 제8항에 있어서, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay) 키트.
  10. 제8항에 있어서, 면역크로마토그래피를 이용한 딥-스틱 키트.
  11. 제8항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 단클론 항체에 포획된 항원에 결합하는 제2 항체로서 제2항의 단클론 항체를 사용하는 키트.
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