NO874837L - Fremgangsmaate ved evaluering av orale mikrober. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen gjelder fremgangsmåter for evaluering av orale prøver med hensyn på nærvær av orale mikrober for å undersøke periodontale lidelser som skyldes mikrober. I et annet aspekt gjelder denne oppfinnelsen materialer egnet til bruk ved slike fremgangsmåter.

Periodontal sykdom er et generelt uttrykk brukt for å beskrive en rekke tilstander hvorved støttevevet som omgir tennene blir betent og/eller angrepet av sykdom. De fleste angrepne individer blir først rammet av en form for periodontal lidelse kjent som gingivitt, som vanligvis er en mild, kronisk, reversibel betennelse i tannkjøttet. I sin mer alvorlige form, kan sykdomsprosessen være så omfattende at det nærliggende tannkjøttvev blir ødelagt, og en lomme dannes rundt tannen. Med tiden kan dette resultere i øket dybde på lommen, tap av benvev og tap av tannen.

Et stort skritt fremover når det gjelder forståelsen av periodontal sykdom er de siste års forståelse av at mange former av sykdommen er tilstander som skyldes mikrober, og derfor at det kan være mulig å skille friske individer fra syke, og å skille mellom angrepne steder hos et individ ved å vurdere mirkobeflo-raen på disse steder. Forskjellige mikrober har blitt forbundet med slike former for periodontal sykdom som gingivitt, barne- og ungdomsperiodontose, periodontitt hos voksne og nekrotiserende og sårdannende gingivitt hos voksne. Se generelt, R.C. Page. J. Clin. Periodontol. 13:345-355 (1986) og D.H. Fine et al., Clin. Periodontol. 13:533-546 (1986).

Til dags dato er ikke den nøyaktige etiologiske eller patogene rolle, om det er noen, til noen spesiell mikrobe fullstendig belyst. Heller ikke har forskere til nå fullstendig definert den innbyrdes forbindelse mellom forskjellige arter eller endringer i det orale miljø. For den største del skyldes denne mangel på kunnskap vanskelighetene som møtes ved bruk av tradisjonelle teknikker når det gjelder å identifisere systema-tisk, nøyaktig og reproduserbart de forskjellige arter og underarter som kan være innblandet.

Denne vanskelighet skyldes for en stor del det faktum at mikrobene av interesse om de i det hele tatt kan dyrkes, bare kan dyrkes ved hjelp av kompliserte og besværlige strengt anaerobe dyrkningsteknikker. Dessuten, er de orale prøver, f.eks. plakk, hvorfra disse mikrober generelt isoleres, et vanskelig objekt for mirkobiologisk analyse ettersom det er utsatt for feil og problemer med oppsamling og preparering (f.eks. ved å holde sterile og anaerobe forhold), og hyppig kan inneholde substanser som kan forstyrre visse tradisjonelle analyser.

De mange arter som er blitt trukket inn som forbundet med periodontal lidelse er oftest påvist (og noen ganger adskilt) ved teknikker såsom anaerobe dyrkningsmetoder, mørkefeltmikroskopi og mer nylig, ved fasekontrastmikroskopi. Foreslåtte fremgangsmåter for evaluering av mikrobene selv har også omfattet strøm-ningscytometri og DNA-undersøkelser. Andre fremstøt når det gjelder å evaluere mikrobefloraen omfatter bestemmelse av mikrobeprodukter, vertscellereaksjoner og produkter, immun-reaksjoner og intracellulære enzymer.

Tradisjonelle immunologiske teknikker er også brukt, såsom fluorescerende-antistoffmikroskopi, som innebærer dannelse av antistoffer mot visse orale mikrober (se. f.eks., Jacob et al,

J. Clin. Microbiol., 10:934-936 (1979)). Disse teknikkene,

selv om de egner seg til forskningsformål, er vanligvis for omstendelige, tidkrevende og dyre til rask og rutinemessig klinisk evaluering av flere lokaliteter.

I de senere år har teknologien når det gjelder monoklonale antistoffer vokst og tillater dannelse av antistoffer som er spesifikke for en rekke mikrober og antigendeterminanter for mikrober. Se f.eks. Mutharia et al., "Use of Monoclonal Antigens in the Study of Common Antigens of Gram-Negative Bacteria", i Monoclonal Antibodies Against Bacteria, 6:131-142, Acad. Press,

(1985) og Macario et al., American Society of Microbiology News 49:1-7 (1983). Likevel, har bruken av denne teknologien når det gjelder undersøkelse av mikrobiell patogenese bare nylig blitt utforsket. Monoklonale antistoffer er rapportert, f.eks., mot noen orale Bacteroides-arter (se f.eks., Ebersole et al., J. Clin. Mikrobiol., 19:639-644 (1984)).

Monoklonale antistoffer er etter sigende også dannet mot endotoksinkjernen av lipopolysakkaridet i gram-negative bakterier, en struktur som sies å være meget analog og immunologisk kryss-reaktiv mellom de fleste gram-negative bakterier (se, f.eks. publisert PCT patentanmeldelse nr. WO84/04458). Likevel var imidlertid en annen forskergruppe ute av stand til å isolere et antistoff som viser kryssreaktivitet overfor en gruppe på tre gram-negative orale arter. (Se Dahlen et al., Inf. Immun. 39:466-468 (1983)).

En annen årsak til at den nøyaktige rolle av en spesiell art ikke ér klart belyst, og hvorfor, dernest evaluering av mikrobefloraen ikke vanlig benyttes for å undersøke lidelsen, er p.g.a. de signifikante problemer når det gjelder tolkning av data som er møtt historisk. Tatt i betraktning forskjellige eksperi-mentelle fremstøt og fremgangsmåter, og den rene foranderlighet av lidelsen selv mellom angrepspunkter og stadier, samt individer, er ingen fremgangsmåte til dags dato vist å være enkel, reproduserbar, spesifikk og effektiv nok til å bli et bredt akseptert middel til å påvise en brukbar sammenheng mellom tilstedeværelsen eller mengden av noen spesiell art og tilstand, forløp eller alvor av lidelsen.

Ulik mer vanlige lidelser som skyldes mikrober, der bare tilstedeværelsen av en spesiell organisme svært ofte kan brukes til å diagnostisere og/eller undersøke den medfølgende lidelse, er de orale arter som forbindes med periodontal sykdom tallrike, varierte, og mest vesentlig, utgjør ofte deler av den normale flora i munnen, samt deler av sykdomsfloraen.

Antall og typer av de orale arter synes å variere uavhengig på hittil ikke forutsigelige og forvirrende måter, både innbyrdes (f.eks. over tid), samt mellom spesielle arter og tilstedeværelse eller stadium av sykdom. Ytterligere, er lidelsen kronisk og endringer i floraen skjer meget sakte over tid, og viser seg i sin tur enda langsommere, om i det hele tatt, ved kliniske symptomer.

Derfor, forblir evaluering av periodontal sykdom nesten utelukkende basert på bruk av standard kliniske, anatomiske og morfologiske funn, betraktninger av parametere såsom plakk-indeks, sonderingsdybde, festenivå, tannkjøttfarge, blødningsten-dens o.l.. Disse fremgangsmåter måler imidlertid symptomer på lidelsen, og er relativt subjektive. Videre, er de ikke meget nyttige når det gjelder å bestmeme forløpet eller mønstere ved sykdomsaktiviteten, f.eks. eksaserbasjon eller remisjon ved individuelle lokaliteter, eller når det gjelder samtidig å anslå virkning av terapeutiske forholdsregler.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Undersøkelsen av periodontal sykdom, og derfor diagnose og behandling av denne, har kommet etter undersøkelsen av mange andre sykdommer påført ved mikrober, hovedsakelig p.g.a. mangel på redskap og tolkningsmidler som er nødvendige for rask, reproduserbar og nøyaktig analyse av mikrobefloraen. Den foreliggende oppfinnelse gir et slikt redskap.

Oppsummert, gir oppfinnelsen en fremgangsmåte for å evaluere en oral prøve med hensyn på nærvær av mikrobeflora forbundet med periodontal sykdom som består av trinnene: (a) bestemme, ved bruk av antistoffer, mengden i nevnte prøve av én eller flere spesifikke orale mikrober, (b) bestemme, ved bruk av antistoffer, mengden i nevnte prøve av en referansegruppe av gram-negative orale mikrober, og (c) sammenligne mengden av nevnte spesifikke orale mikrober med mengden av nevnte referansemikrober.

I et annet aspekt gir den foreliggende oppfinnelse antistoffer og utstyr som inneholder disse antistoffer, som er nyttige når det gjelder å utføre fremgangsmåten i oppfinnelsen, og gir også hybridoma cellelinjer som danner slike antistoffer.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Denne fremgangsmåten gjør mulig evaluering av mikrobefloraen i en oral prøve såsom plakk eller væske fra tannkjøttet, på en måte som er rask, presis, enkel og gir signifikante og nyttige resultater, dvs. at resultatene korrelerer godt med de som oppnås ved den lengre og mer arbeidskrevende prosess ved anaerob dyrkning av mikrober. Ved å benytte antistoffer, gir denne fremgangsmåten vesentlige fordeler fremfor mere tradisjonelle fremstøt, såsom de som krever dyrkning, farging eller på annen måte identifisering av slike mikrober ved arbeidskrevende eller kostbare teknikker. Ved å gi en sammenligning av individuelle mikrober med en referansegruppe gram-negative mikrober, i stedet for bare andre individuelle mikrober, gir fremgangsmåten mer nøyaktige og/eller dramatiske evalueringsresultater enn de som oppnås hvis individuelle mikrober bare sammenlignes med seg selv (f.eks. over tid eller mellom lokaliteter), eller med en større gruppe som omfatter alle identifiserbare eller dyrkbare mikrober (f.eks., inkludert gram-positive mikrober).

Uttrykket "periodontal sykdom" brukt som her, refererer seg til enhver inflammasjon, lidelse eller annen tilstand på ethvert stadium eller punkt i pattedyrs orale miljø som forårsakes av eller forbindes med mikrober.

Uttrykket "oral mikrobe" brukt som her, refererer seg til enhver av de forskjellige mikrobeordener, familier, slekter, arter, underarter og stammer, og produkter derav som kan eksis-tere i munnen under utvikling og forløp av periodontal sykdom, enten den spesielle mikrobe selv er den som forårsaker sykdommen eller ikke.

Ordet "mengde" brukt som her, refererer seg til en bestemmelse som er tilstrekkelig kvantitativ og/eller semikvantitativ til dens tilsiktede formål, f.eks. kvantitativ som i bestemmelse av konsentrasjonen av en oral mikrobe eller gruppe av orale mikrober, eller semikvantitativ i betydningen av en sammenlig-nende bestemmelse som viser tilstedeværelse av den orale mikrobe eller gruppe på et nivå over eller under et på forhånd bestemt nivå.

Uttrykket "spesifikk oral mikrobe" brukt som her, refererer seg til én eller flere slekter, arter, underarter eller stammer av orale mikrober som kan bestemmes med et enkelt antistoff.

Ordet "gruppe" brukt som her, refererer seg til en gruppe på to eller flere spesifikke orale mikrober.

Ordet "referanse" brukt som her, refererer seg til én eller flere slekter av gram-negative orale mikrober, og kan omfatte alle gram-negative orale mikrober, eller delmengder av disse. Gruppen av referansemikrober som bestemmes i trinn (b), bør imidlertid ikke være identisk med noen spesifikke orale mikrober som bestemmes i trinn (a) på fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, dvs. referansemikrobene bør omfatte minst noen mikrober som er forskjellige fra noen spesiell bestemmelse i trinn (a). Fortrinnsvis kan tilstedeværelsen av slike referansemikrober bestemmes samtidig, som ved bruk av et enkelt antistoff. Fortrinnsvis også, omfatter referansemikrobene alle de spesifikke orale mikrober som er bestemt i trinn (a) på fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukket utforming, er de spesifikke orale mikrober som bestemmes i trinn (a) gram-negative orale mikrober, og mest foretrukket de som hører til de følgende slekter: Actinobacillus, Bacteroides, Fusobacterium, Haemophilus, og Treponema. I en særlig foretrukket utforming, bestemmes mengden av hver spesifikke orale mikrobe i en gruppe, gruppen omfatter to eller flere av de følgende gram-negative orale mikrobearter: Actinobacillus actinomycetumcommitans, Bacteroides qingivalis, Bacteroides intermedius, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus aphrophilus, Treponema denticola og Treponema vincentii. Videre foretrukket er den kvantitative bestemmelse av disse spesifikke orale mikrober ved bruk av monoklonale antistoffer som er spesifikke for antigener gitt av lipopolysakkarid-("LPS") komponenten til hver av disse mikrober.

En foretrukket fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelsen innebærer også sammenligning av mengden av disse spesifikke orale mikrober i forhold til mengden av referansemikrober ved bruk av monoklonale antistoffer som er spesifikke for et antigen gitt av en LPS-komponent som er felles for alle slike referansemikrober.

Oppfinnelsen benytter seg av tilstedeværelsen av antigener som gjør mulig adskillelse mellom spesifikke orale mikrober og referansemikrober. Antistoffer kan fremstilles for å påvise slike antigener, de resulterende antistoffer er nyttige i en analyse med hensyn på nærvær av slike antigener i det komplekse miljø som er typisk for orale prøver såsom plakk og væske fra tannkjøttet. Ved bruk av oppfinnelsen, kan mengden av individuelle spesifikke orale mikrober bestemmes i en oral prøve paral-lelt med bestemmelsen av mengden av referansemikrober og kan sammenlignes på en nyttig og signifikant måte.

Den følgende diskusjon vil fremsette betraktninger til hjelp ved fremstilling av materialer som er nyttige ved gjennomføring av fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen.

Den foretrukne fremgangsmåte ifølge den foreliggende oppfinnelse krever, som et minium, et antistoff til en spesifikk oral mikrobe og et antistoff til referansemikrober.

Ordet "antistoff" brukt som her, refererer seg til ethvert antistoff som er tilstrekkelig fintmerkende til å gjøre mulig dens bruk i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, f.eks. monospe-sifikke polyklonale antistoffer, samt monoklonale antistoffer. Foretrukne antistoffer til bruk i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er monoklonale antistoffer.

Mens ethvert immunoglobulin kan benyttes, foretrekkes IgG. Enten hele antistoffer eller deler av disse kan benyttes. Enkle monoklonale antistoffer kan benyttes, eller blandinger av disse, inkludert blandinger av monoklonale antistoffer eller blandinger av polyklonale antistoffer. Antall og type antistoffer som benyttes vil avhenge av antigenposisjon og antall forskjellige antigener som skal påvises. Antistoffpreparatet er fortrinnsvis fritt for ikke-spesifikke antistoffer, dvs. antistoffer som binder seg til andre antigener enn de ønskede antigener.

Antistoffene som er nyttige i den foreliggende oppfinnelse kan dannes ved en rekke fremgangsmåter som vil være kjent for de som har fagkunnsakp, inkludert in vitro stimulering av lymfocyt-ter med mitogener og/eller antigener, miltfragmentkultur, virustransformering av lymfocyttkloner eller rekombinante DNA-teknikker.

Monoklonale antistoffer dannes fortrinnsvis ved en fremgangsmåte for fremstilling av hybridomer tilsvarende den som er diskutert av Milstein og Kohler og rapportert i Nature, 256: 495-497, 1975. Denne fremgangsmåte omfatter at en mus (eller annet egnet dyr) injiseres med det ønskede immunogene materialet. I den foreliggende oppfinnelse kan dette materialet være en kultur av delvis eller fullstendig rensede orale mikrober. Dette materialet kan også være en renset eller delvis renset komponent av organismene, såsom enzymer eller toksiner, eller LPS som er renset, f.eks. ved ultralydbehandling og ekstraksjonsmetoden beskrevet i WO84/04458, eller andre fremgangsmåter omtalt deri, hvis omtale er innlemmet her ved referanse.

For å fremstille monoklonale antistoffer, blir egnede verter såsom mus, immunisert med suspensjoner av celler eller cellefrak-sjoner som muligens inneholder antigener, ifølge immuniseringsmå-ter, ruter og skjemaer generelt i overensstemmelse med etablerte teknikker for stimulering og dannelse av antistoffer. Etter immunisering, isoleres de immune lymfoide celler, fortrinnsvis fra miltene, og smeltes sammen med egnede myelom-, plasmacytom-eller hybridomceller, for å danne hybride cellelinjer (dvs., hybridomer) som produserer monoklonale antistoffer til de valgte antigener og som kan dyrkes og dyrkes videre uendelig.

Populasjonen av hybridomer dannet ved fusjon kan deretter undersøkes med hensyn på immunoglobulinproduksjon. Enhver av de mange kjente fremgangsmåter for undersøkelse med hensyn på immunoglobuliner kan benyttes, såsom "enzym-linked immunoassay"

(ELISA) med bruk av renset antigen, ifølge kjente teknikker. Immunoglobulinene tilstede i cellekulturvæskene undersøkes videre med hensyn på deres evne til å reagere med mikrobecellene eller fraksjonene som benyttes til immuniseringen. Dette kan gjennom-føres ved å modifisere den ovenfornevnte immunoanalyse på en måte som er kjent innen faget.

Hvis hybridomkulturer finnes å danne monoklonale antistoffer som reagerer med det immuniserende antigen, blir de videre undersøkt for å bestemme om de er spesifikke. Kulturene blir klonet ved begrenset fortynning for å sikre monoklonalitet ved bruk av teknikker som er godt kjent for de som har fagkunnskap, f.eks. Thomas J. McKearn, "Cloning of Hybridoma Cells by Limiting Dilution in the Fluid Phase" in Monoclonal Antibodies, s. 374, Rennett, R. H., McKearn, T. J. and K. B. Bechtol, eds. Plenum Press, N.Y. (1980).

De monoklonale antistoffer dannet av disse klonede hybridomer blir testet for å bestemme deres kryss-reaktivitet med andre antigener enn de fra den immuniserende stamme eller antigen ved en ELISA-analyse. I tillegg, blir antistoffene analysert med hensyn på deres evne til å binde mikrobielle cellekomponenter skilt ved elektroforese (f.eks., "Western Blots" og immunoutfel-ling) kjent for dem som har fagkunnskap (se f.eks., Tobin, et al. Proe. Nat. Acad. Sei. 76:4350-4354 (1979)).

Hvis noen linjer av hybridomceller finnes å danne monoklonale antistoffer som er spesifikke som ønsket, kan de deretter dyrkes og videredyrkes for å etablere kontinuerlig dannelse av antistoffer, f.eks. ved tradisjonell vevskultur av museascites-væskeproduksjonsteknikker som er vel kjent for dem som har fagkunnskap. Disse cellelinjer kan lagres og konserveres ved vanlige teknikker, inkludert lyofilisering eller frysing.

Antistoffene brukt i analysen isoleres ved vanlige teknikker såsom ionebytterkromatografi eller utfelling, f. eks. ved å behandle vevskulturvæske eller klaret ascitesvæske med 50% ammoniumsulfat. Denne behandlingen resulterer i utfelling av antistoffer. Bunnfallet suspenderes eventuelt (og fortrinnsvis)

i en bufret saltoppløsning (fosfatbufret saltoppløsning, "PBS", pH 7,5) for videre bruk. Gjenvunnede antistoffer kan lagres, f.eks. lyofiliseres, fryses eller avkjøles ifølge kjente teknikker .

Antigener egnet til bruk i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter ethvert cellulært eller ekstracellulært molekyl som gjør det mulig å skille mellom de spesifikke orale mikrober og referansemikrober, og fortrinnsvis gjøre det mulig å videre skille mellom individuelle spesifikke orale mikrober.

Cellekomponenter eller produkter egnet til å gi antigenlo-kaliteter (dvs. epitoper), omfatter alle som er i stand til å tjene som antigener, dvs., er immunogene alene eller som hapte-ner, og som er i stand til å være immunologisk reaktive overfor monoklonale antistoffer i orale prøver evaluert i samsvar med fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen.

Egnede antigener omfatter de som er lokalisert i, f.eks. flagellene, cellehylster, kapsel eller cytoplasma, eller antigener dannet av den orale mikrobe og funnet i dens ekstracellulære omgivelser såsom ekstracellulære faktorer, toksiner eller enzymer.

Foretrukne antigener er de som viser optimale adskillelses-og bindeegenskaper med hensyn på den valgte mikrobe eller gruppe, samt de antigener som kan påvises med minimale fysikalske endringer av prøven eller cellen, f.eks. ekstracellulære eller lett tilgjengelige cellevegg- eller hylsterantigener. Særlig foretrukket er antigener som dannes av de samme eller lignende molekylære komponenter, slik at direkte sammenligning kan gjøres trygt i tro på at antigenene påvirkes på samme måte ved de valgte fremgangsmåter for behandling, ekstraksjon og analyse.

En foretrukket kilde til antigener er lipopolysakkarid ("LPS"). For en oversikt over LPS, se generelt, R.J. Elin et al., CRC Handbook of Microbiology Laskin et al., eds., Vol. II, 215-239 (1973) og I.W. Sutherland, Ann. Rev. Microbiol. 39:243-270 (1985).

LPS er en ideell kilde til antigener av en rekke grunner. LPS eir en celleveggbestanddel som er tilstede i store mengder i de fleste om ikke alle gram-negative orale mikrober. Patentsøke-ren har vært i stand til å identifisere LPS-antigener i arter, hvori tilstedeværelse av LPS hittil har vært ukjent eller omdiskutert, f.eks. i T. vincentii. Dessuten, består LPS både av relativt "vanlige" områder (dvs. kjernen og lipid A-områdene) som kan tjene som kilden til antigener for referansemikrober i fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse, samt relativt "variable" områder (dvs. "O-antigen"-området) som kan tjene som kilde til antigener for å skjelne mellom spesifikke orale mikrober og referansemikrober.

Dessuten, synes LPS å vise en stor grad av motstand, både

i dets vanlige og variable områder, overfor endringer forårsaket av mange fysiske og kjemiske behandlinger som benyttes ved ekstraksjon av denne og tillaging for analyse.

Enda en annen fordel ved bruk av LPS, er at som et endotok-sin, samt som celleveggkomponent, kan noe LPS ventes å bli funnet i en oral prøve i ekstracellulær form, samt i sin cellulære form, se f.eks., C.G. Daly et al., J. Oral Pathol. 9:1-15 (1980). Som et resultat, eksisterer det en større påviselig beholdning av LPS enn det som kan være tilfellet for antigener som er tilstede bare ekstracellulært eller bare i den cellulære form. Muligheten til å påvise samtidig begge former av LPS som vist her, gir på en måte de beste trekk ved både en endotoksinanalyse og en hel celleanalyse.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse benytter spesifikke orale mikrober, fortrinnsvis i form av en gruppe. Egnede spesifikke orale mikrober omfatter slekter, arter, underarter og stammer av orale mikrober som kan påvises.

Spesifikke orale mikrober egnet til bruk i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til mikrober fra én eller flere av de følgende slekter:

Foretrukket er spesifikke orale mikrober som varierer raskt og stigende i antall godt før noen medfølgende fysiske endringer assosiert med periodontal lidelse. Foretrukket er også spesifikke orale mikrober som virkelig spiller en rolle i de patogene prosesser ved periodontal sykdom, i motsetning til de som bare påvirkes av den. Videre foretrukket er gram-negative spesifikke orale mikrober. Fortrinnsvis består en gruppe av to til tyve,

og mer foretrukket to til ti spesifikke orale mikrober.

Egnede referansemikrober omfatter enhver kombinasjon av gram-negative orale mikrober som kan påvises som en gruppe (dvs. alle gram-negative orale mikrober eller undergrupper derav som omfatter individuelle eller multiple familier, ordener eller slekter som gir en meningsfull sammenligning i trinn (c) av fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen.

Foretrukne referansemikrober kan bestemmes ved hjelp av et enkelt antistoff. Som angitt ovenfor, omfatter referansemikrober fortrinnsvis alle de spesifikke orale mikrober som er bestemt i trinn (a) på fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Særlig foretrukne referansemikrober er alle gram-negative orale mikrober som påvist ved et enkelt antistoff.

Antistoffer overfor spesifikke orale mikrober og referansemikrober kan lages til som et sett for å muligjøre deres bruk i en rekke immunoanalysetyper kjent for dem som har fagkunnskap. Fortrinnsvis er antistoffene innen det spesielle sett monoklonale antistoffer som er spesifikke for antigener gitt av en enkel molekylkomponent av de spesifikke orale mikrober og referansemikrober. Mest foretrukket er den molekylkomponenten LPS.

Den spesielle immunoanalysetype, hvori tilstedeværelsen av spesifikke orale mikrober og referansemikrober bestemmes, er ikke vesentlig i denne oppfinnelse, så lenge typen gir den ønskede grad av følsomhet og pålitelighet. En rekke forskjellige typer analyser eksisterer med en rekke forskjellige fremgangsmåter og merkinger. For den største del, er de vanlige tilgjengelige analyser for å påvise spesifikke determinantlokaliteter, sammen-lignende proteinbindingsanalyser, hvori antistoffer eller fragmenter av disse benyttes. Som illustrasjon på de forskjellige analyser, se U.S. patent nr. 3.654.090, 3.817.837, 4.233.402, 4.275.149 og 4.584.268. Generelt, dannes en reagens-oppløsning som inneholder merket antistoff eller merket antigen. Reagensoppløsningen kan inneholde, i tillegg til den merkede komponent, andre tilsetningsstoffer såsom buffere,

f.eks. fosfat, tris, barbital e.l., vanligvis i konsentrasjoner i området fra ca. 0,01 til ca. 10 mM, med konsentrasjon tilstrekkelig til å holde en pH i området fra ca. 6 til ca. 9, mer vanlig 7 til 8 under analysen. Andre tilsetningsstoffer omfatter konserveringsmidler, f.eks. natriumazid, inert protein, f.eks. serumalbumin, natriumklorid, vaskemidler e.l., som hjelper til å holde ved like den merkede komponent, øke dannelse av antigen-antistoffkompleks, forhindre ikke-spesifikk binding e.l..

Den følgende diskusjon betrakter bruken av materialer såsom de som er beskrevet ovenfor for å gjennomføre fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Ideelt, utdeles analysen på en måte som muliggjør deres bruk på en rask og lett måte av tannpersonnell, og gir brukbare resultater uten unødig tid, utgifter eller instrumentering. I en foretrukket utforming, kan fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse benyttes på følgende måte: Orale prøver kan tas på enhver måte, og fra enhver kilde eller lokalisering som gjør en i stand til å omsette immunologisk det eller de antigener som er av interesse. Prøvene trenger ikke å inneholde de orale mikrober selv, f.eks., hvis antigenet finnes ekstracellulært. Prøver kan tas direkte fra det orale miljø, men kan også fremstilles kunstig, f.eks. fra dyrknings- eller konserveringsmedier, hvorfra orale mikrober kan renses eller på annen måte påvises.

I det orale miljø kan prøvene tas fysisk, f.eks. fra spytt, tungen eller tannoverflåtene, supragingivalt plakk og subgingivalt plakk.

Undersøkelser indikerer at de foretrukne orale lokaliteter for prøvetaging er tannkjøttlommer og subgingivalt plakk. Prøver kan også analyseres in vivo, f.eks. ved å bruke monoklonale antistoffer til å påvise, lokalisere eller på annen måte omsettes immunologisk med orale mikrober i de orale omgivelser.

Orale prøver kan tas på en rekke forskjellige måter kjent innen faget, inkludert bruk av en steril "periodontal sealer", gass-skylt sprøyte, filtrerpapirstrimmel, glasskyvette eller pipette osv.. Det er generelt ikke nødvendig for å benytte denne oppfinnelsen å arbeide under anaerobe eller en gang sterile forhold ettersom mikrobene i prøvene generelt ikke trenger å isoleres eller dyrkes. Prøvene kan analyseres samtidig med prøvetaging eller kan lagres i henhold til fremgangsmåter kjent innen faget.

Som angitt ovenfor, evalueres prøven for å bestemme mengden av én eller flere spesifikke orale mikrober og sammenligne den bestemmelse med mengden av referansemikrober. Trinnene (a) og (b) i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres i begge rekkefølger og gjennomføres fortrinnsvis samtidig med bruk av alikvoter av den samme orale prøve.

Resultatene av sammenligningen kan presenteres ved bruk av en rekke teknikker. F.eks. kan resultatene uttrykkes i form av ett eller flere forhold som sammenligner mengden av spesifikke orale mikrober og mengden av referansemikrober. Slike forhold kan benyttes sammen med instruksjoner, f.eks. standardkurver, til å korrelere forholdet med sykdom. Forholdet kan også beregnes, samt tolkes ved hjelp av dataassistert analyse for å indikere en forbindelse med periodontal sykdom.

Resultatene av denne oppfinnelsen trenger ikke presenteres bare i form av et forhold. Resultatene kan, om ønsket, bestemmes og presenteres i en form så enkel som en pluss eller minus indikering på hvorvidt en spesiell sammenligning er innen en spesiell grense eller område. Tilsvarende, kan andre gyldige sammenligninger være i form av f.eks. en multivariant analyse-bearbeidelse.

Det er også mulig å korrelere resultatene som fås ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen med resultater av andre observasjoner eller målinger som gjelder prøven (såsom sonderingsdybde, mikroskopiske evalueringer, proteinbestemmelser og telling av levende celler) eller som gjelder pasienten, såsom de kliniske parametere diskutert ovenfor, samt immunrespons, temperatur, ernæringstilstand, hygiene osv.. På denne måten kan periodontal sykdom og behandling av denne bedre defineres og forstås og følges mer omhyggelig.

Utstyr som er fremstilt hvor det brukes antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan omfatte antistoffene alene eller kan inkludere en rekke muligheter til pakking av anordnin-ger og utstyr, inkludert filtere og reagenser, som for tiden er kommersielt tilgjengelige og kjent for dem som har fagkunnskap. Nyttige eventuelle ingredienser er for det andre, enzym-tilknyt-tede antistoffer overfor de spesifikke orale mikrobeantistoffer og referansemikrobeantistoffer i analysen, som utgjør en del av påvisningssystemet, samt buffere, enzymsubstrater o.l..

Antistoffer merket med fluorescerende forbindelser eller radioisotoper kan også benyttes i en utgave av denne analysen.

De følgende eksempler gis for å hjelpe forståelsen av den foreliggende oppfinnelse om å ikke tolkes som noen begrensning av dennes omfang. Hvis ikke annet er angitt, er alle prosent-deler i vekt, og volumene av monoklonale antistoffer som er tilsatt representerer volumet av oppsamlet ascitesvæske fortynnet med fosfatbufret saltoppløsning for å oppnå en konsentrasjon på ca. 100 ug/ml.

Eksempel 1

Fremstilling av monoklonale antistoffer mot intakt treponema dentikola og treponema vincentii.

Dannelsen av monoklonale antistoffer mot to orale spirochætarter, T. denticola og T. vincentii, beskrives for å illustrere visse hensyn involvert ved fremstilling av adskillende monoklonale antistoffer til to nær beslektede orale mikrobearter.

Rene kulturer av denticola eller vincentii kom fra hhv. American Type Culture Collection, Rockwell (ATCC 3520) og Dr. R.C. Johnson, University of Minnesota. T. vincentii-kulturene (og andre naturlige typer av Treponema-stammer beskrevet nedenfor) ble isolert og identifisert i henhold til fremgangsmåten beskrevet i R.C. Johnson, Ann. Rev. Microbiol. 31:89-106

(1977), og dyrket som beskrevet av R.M. Smibert, i The Prokaryo-tes (M.P. Starr, et al., eds.) s. 564-577, Springer-Verlag Berlin Heidelberg (1981), hvis omtaler begge er innlemmet her ved referanse. Cellene ble skilt fra sitt dyrkningsmedium ved gradientsentrifugering i kolloidalt polyvinylpyrrolidin-overtruk-ket silisiumoksyd ("Percoll", Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.). Hver kultur ble fortynnet med 90% Percoll i fosfatbufret saltoppløsning ("PBS", pH 7,4) (0,39 ml Percoll/ml kultur) og sentrifugert ved 31.000 x g i 20 min. ved 4°C. Spirochætes-båndet ble samlet opp med en pipette og sentrifugert på nytt ved 100.000 x g i 1 time ved 4°C for å forsterke Percol-len. De pelleterte spirochæter ble på ny suspendert i PBS til 10<8>celler /ml og frosset ved -70°C.

For å immunisere mus med T^denticola, ble 5 uker gamle balb/C hunnmus (Chas. Rivers, Wilmington, MA) immunisert med 5

x 10<6>vaskede spirochæter i PBS ved intraperitoneal injisering. Over en periode på 2 måneder ble dyrene injisert seks ganger. Fire dager før fusjonen ble musene injisert med IO<6>spirochæter via halevenen. Et tilsvarende immuniseringsskjerna ble brukt med T. vincentii.

For å få hybridomer som danner antistoffer overfor T. denticola, ble milten på tre immuniserte mus fjernet og behandlet for å isolere leukocyttene. Leukocyttene ble forenet med NS-1 legemiddelmerket musemyelomer (tilgjengelige fra ATCC-T1B18) i et forhold på 4 miltceller for hver myelomcelle og sammensmeltet i 35% polyetylenglykol ved bruk av sammensmeltningsteknikken beskrevet i Galfre et al., Nature 266:550-552 (1977) hvis omtale er innlemmet her ved referanse. Den resulterende cellesuspensjon ble klonet i vevskulturmedium (Dulbecco's Modified Eagles Medium (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) med 4500 mg/l glukose og 20mM N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre ("HEPES", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) felt opp med HAT (0,136 mg/100 ml thymidin, pH 7,2-7,4, alle kommersielt tilgjengelig fra Sigma Chemical Co.)-I dette medium drepes selektivt alle ikke-sammensmeltede myelomceiler, og videre vekst tillates bare av hybridcellene.

Etter 10 dagers vekst, testés kulturene med hybridomer med hensyn på dannelse av antistoffer overfor T. denticola. ved en ELISA-immunoanalyse som følgende.

IO<6>Spirochæter ( T. denticola) ble kryssbundet til bunnen av mikrotiterplater (Immulon II, Dynatech, Alexandria, Va.) med bruk av glutaraldehyd, først ved å overtrekke platene med 0,1% glutaraldehyd i vann i 1 time, deretter rense platene 3 ganger

i vann. Spirochætene ble deretter tilsatt i 100 1 PBS, og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble deretter blokkert med 1% okseserumalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) og vasket 3 ganger med PBS. Moderluten (50 1) fra hybridom-kulturene ble tilsatt i 1 time ved romtemperatur, deretter fjernet og brønnene renset med PBS. 100 ml peroksydase-merket anti-mus immunoglobulin fra geit, (50 ng/ml) (Kirkegarrd and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) ble tilsatt og blandingen inkbuert i ytterligere én time ved romtemperatur. Det ubundne antistoff ble fjernet, platene vasket som før og 100 1 perok-sydasesubstratoppløsning (ortofenylendiamin (Sigma Chemical Co.), 50 mg/100 ml; H202, 0,03%, citratbuffer, pH 4,5) ble tilsatt. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 50 1 2,5 M H2SO4etter 10 min. og optisk tetthet (490 nm) for hver brønn ble bestemt spektrofotometrisk. Hybridomkulturer representert ved positive analyseresultater ble valgt til videreutvikling og resten kastet.

Hybridomer som danner antistoffer overfor vincentii ble laget og undersøkt på tilsvarende måte, bortsett fra at SP2/0 musemyelom (ATCC-CRL1581) ble brukt i stedet for NS-1, og kulturene ble undersøkt med bruk av T. vincentii immobilisert på mikrotiterplatene. Igjen, ble kulturer som viste positive analyseresultater valgt til videreutvikling og resten kastet.

Eksempel 2

Monoklonale antistoffers evne til å være spesifikke

For å bestemme deres evne til å være spesifikke, ble videreutviklede kulturer (se ovenfor) testet med hensyn på deres evne til å binde fem arter eller biotyper treponema og seks andre bakterier. Alle typebestemte eller naturlige orale mikrober brukt for å bestemme de monoklonale antistoffers evne til å være spesifikke, kom enten fraATCCeller ble isolert fra lokale kliniske prøver og typebestemt i henhold til vanlige teknikker og er angitt nedenfor i tabell 1. Monoklonale antistoffer ble også testet overfor LPS ekstrahert fra de følgende mikrober ved fremgangsmåten beskrevet i Westphal et al., Biochem. Rev. 9:191-195 (1981) og Westphal et al., Progress Aller<q>y 33:9-39 (1983), hvis omtale er innlemmet her ved referanse: A. actinomycetumcommitans. B. qingivalis. B. intermedius. E. corrodens. F. nucleatum. H. aphrophilus. T. denticola. T. vincentii. Ekstrahert LPS fra E. coli (LPS 055:BS, 0127B8 og 0111:B4), Pseudomonas aeruqinosa (F-D, type 1) og Salmonella minnesota (Re595) ble anskaffet fra Calbiochem, San Diego, CA. Ekstrahert LPS fra Vibrio cholerae ble anskaffet fra Sigma Chemical Co., "Purified Lipid A" (fra S. minnesota) ble anskaffet fra Calbiochem. "Lipid A" ble også syreekstrahert og renset fra B.<q>in<g>ivalis ved fremgangsmåter kjent for dem som har fagkunnskap .

Alle bakterier ble kryssbundet med mikrotiterplater med bruk av gluteraldehyd som ovenfor. Moderlut fra hybridomkulturer ble tilsatt og binding ble påvist med bruk av anti-mus lg fra geiter som beskrevet i eksempel 1. Tabell 2 beskriver resultatene av disse eksperimentene for førti-fem antistoffer som binder T. denticola (betegnet "TDE", eller alternativt "TDF", her) og tolv antistoffer som binder T. vincentii ("TVC"). Tallet etter TDE-(eller TDF-) ellerTVC-betegnelsen indikerer klonnummeret, og tallet etter bindestreken, hvis det er tilstede, indikerer tallet på underklonen. I tabell 2, betyr et "+" tegn at en positiv immunologisk reaksjon ble påvist mellom det indikerte monoklonale antistoff og bakteriestammen, et "-" indikerer at ingen slik reaksjon ble påvist, og "ND" indikerer at det ikke eksisterer data for den spesielle reaksjonen.

Data i tabell 2 indikerer at det kan fåes monoklonale antistoffer som er spesifikke for en spesiell T. denticola biotype (f.eks., TDE 01), eller for T. denticola-artene som et hele, i motsetning til T. vincentii (f.eks., TDE 09), eller for T. vincentii i motsetning til T. denticola (f.eks., TVC 01). Hybrideellei injer som produserer monoklonale antistoffer overfor hhv. T. denticola og T. vincentii er deponert i den permanente samling til the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA 20852, og gitt ATCC Aksesjonsnr.

(patentsøkers betegnelsesnummere TDF01549 og TVC02E14-01, deponert 18. november 1986).

Eksempel 3

Antistoffbindin<q>til pattedyrceller

Det er rapportert at noen spirochætarter kan fremkalle antistoffer overfor antigener av pattedyrsopprinnelse. Ettersom reaksjon av denne type kan gi uønsket bakgrunn i en immunoanalyse hvis prøven inneholdt slike antigener fra pattedyr, var det viktig å bestemme om dette var tilfellet for noen av de antistoffene som var dannet.

Hep-2-celler (epitheltumorceller fra mennseker, American Type Culture Collection nr. CCL 23, Rockville, MD) ble dyrket på preparatglass, fiksert med aceton og lufttørket. Dyrkningsvæsker fra hybridomer som danner antistoffer overfor spirochæter ble plassert oppe på cellene, inkubert én time, og vasket. Fluorescerende antimus IgG fra geit (Cappel Laboratories, Cockney-ville, PA) ble deretter tilsatt, inkubert i ytterligere én time, og vasket for å fjerne ubundne antistoffer. Cellene ble prepa-rert i fosfatbufret glyserol og undersøkt med et invertert fluorescerende mikroskop. Antistoffer som bandt seg til disse cellene, ble deretter eliminert fra videre betraktning med hensyn på mikrobeanalyser.

Eksempel 4

Antistoffbindinq til bakteriecellebestanddeler

For videre å karakterisere binding av antistoffer til spirochæter, ble de undersøkt ved "Western Blots" i henhold til fremgangsmåten til Tobin et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 76:4350

(1979) , hvis omtale er innlemmet her ved referanse. Ved denne fremgangsmåten, blir molekylene som utgjør mikrobene denaturert, redusert og separert ved elektroforese i polyakrylamidgel. De separerte molekyler skiller seg fra hverandre ved molekylvekt. De overføres deretter kvantitativt til nitrocellulosepapir som binder dem på en måte som er egnet for undersøkelse med de monoklonale antistoffer. Binding av antistoffer til det immobiliserte antigen, påvises med et enzym-merket anti-mus IgG fra geit, og indikerer molekylvekten til antigenet. Antistoffenes spesifikke karakter overfor sine respektive antigener blir derved fastslått.

Hele vaskede spirochæter ( T. denticola eller T. vincentii) ble løst opp i en minimumsmengde av elektroforesebuffer (4% natriumdodecylsulfat ("SDS", BioRad Laboratories, Richmond, CA); 10% 2-merkaptoetanol, 20% glyserol, 0,125M Tris pH 6,8) og plassert i kokende vannbad i 2 min.. Prøver av begge ble behandlet med elektroforese i 10% polyakrylamidgel ved 25 mA i 2-3 timer inntil en fargemarkør forlot gelen. Gelen ble plassert på en firkant av nitrocellulose (størrelse 15x15 cm, BioRad Laboratories) og overført i tris-metanolbuffer over natten ved 30 mA i henhold til fremgangsmåten til Laemmli, U.K., Nature 227:680-685 (1970), hvis arbeid er innlemmet her ved referanse. De overførte antigener ble vasket i fosfatbufret saltoppløsning som inneholdt 0,05% "Tween 20" (Fisher Diagnostics, Orangebury, NY) overflateaktivt stoff ("PBS-Tween 20"), pH 7,4 og plassert i 3 ml moderlut som inneholdt antistoff. Etter 1 time ved romtemperatur, ble antigenene vasket for å fjerne ikke-bundet antistoff og dekket med 3 ml peroksydasemerket anti-mus lg fra geit. Etter ytterligere 1 times inkubering og enda en vask, ble flekkene overført til peroksydasesubstratoppløsning for å utvikle reaksjonen. Antall og plassering av båndene som ble utviklet, ble avmerket og sammenlignet med molekylvektstandarder. "The Western Blots" indikerte at klon TDE 01-01 ga et monoklonalt antistoff som ikke bandt seg med flekken, noe som antyder at det binder seg til et antigen som ble denaturert ved "the Western blotting technique". TDE 54-04 bandt seg til en 67.000 dalton molekylvektart, som er et vanlig Treponem antigen, og øyensynlig ikke er LPS. TVC 02-01 bandt seg med en rekke forskjellige molekylvektarter på en måte som er i samsvar med det mønsteret som ventes av LPS.

Eksempel 5

Antistoffbindin<q>til ytre hylster på treponema

I tillegg til den vanlige cellevegg og membranstrukturene til de fleste gram-negative bakterier, har medlemmer av ordenen Spirocheatales et ytre hylster. Mange av antigenene som forbindes med disse organismene kan være i disse strukturene. Det ytre hylster kan fjernes selektivt fra organismene med rensemidler (Johnson et al., Infect. Immun. 7:249-258 (1973)), deretter fjernes fra andre komponenter ved differensialsentrifugering. Preparater av det ytre hylster fra T. denticola og T. vincentii ble adsorbert til mikrotiterplater og testet med hensyn på deres evne til å binde antistoffer. Preparater av det ytre hylster ble fortynnet i karbonatbuffer (0,1 M Na bikarbonat; 0,1 M Na karbonat, pH 9,5) til 20 g/ml, og 50 1 alikvoter pipettert i hver mikrotiterbrønn. Etter inkubering over natten ved 4°C, ble platene vasket med PBS-Tween 20, og 50 1 antistoffoppløsning (TDE 54-04 og TVC 02-01) av forskjellige konsentrasjoner ble tilsatt. Etter inkubering i 1 time ved romtemperatur, ble platene vasket og 50 1 peroksydasemerket anti-mus lg fra geit ble tilsatt. Platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur, vasket med PBS-Tween 20, og 10 1 peroksydasesubstratoppløsning ble tilsatt. Antistoffbindingen ble påvist med bruk av en spektrofotometrisk plateleser ved 490 nm. Resultatene er angitt i tabell 3.

TDE54-04 binder tydelig et felles treponema antigen til det ytre hylster på begge mikrober.

Eksempel 6

Immunofiltrerin<g>med treponemer

Treponemer faller i en uhensiktsmessig kategori når det gjelder den vanlige bruk av filtreringsanalyser. Mens organismene er lange (6-20 m) har de relativt små diametere (0,15-0,25 m), et faktum som brukes til å skille dem fra andre bakterier ved den første isolering. Det var derfor nødvendig å bestemme den lengste membranporestørrelse (for å lette vasking av de kliniske prøver) som ville holde tilbake spirochætene. Tilgjengelig membrantetthet var: 0,10 m; 0,22 m; 0,45 m og 5,0 m. Ti millioner T. denticola organismer i PBS-Tween 20 ble tilsatt til hvert filter. Mikrobene ble immobilisert ved å dra suspensjonen gjennom filteret med vakuum. Suspensjonene ble vasket 2 ganger med PBS-Tween 20, hvoretter antistoff til spirochætene ble tilsatt. Etter 1 times inkubasjon, ble platene vasket igjen og peroksydasemerket anti-mus IgG fra geiter, ble tilsatt. Etter en ytterligere inkubering og vasking, ble enzymsubstratet tilsatt (100 1) og den optiske tetthet ved 490 nm bestemt. Overraskende, holdt 0,45 m filteret spirochætene tilbake med samme virkning som 0,22 m filtrene. Filtere på 0,10 m og 5 m ble bedømt som uegnede.

For å bestemme den beste porestørrelse for å muliggjøre vasking av kliniske materialer, ble 24 plakkprøver tilsatt forskjellige mengder mikrober plassert i mikrotiterbrønner med 0,45 m og 0,22 m filtere ("Millititer", Millipore Co., Bedford, MA). Prøvene ble trukket på filtrene som beskrevet ovenfor og vasket. Filtrene ble observert med henblikk på tetting. 0,22

m filtrene ble tettet med alle bortsett fra de laveste nivåer av mikrober, mens 0,45 m filtrene beholdt sin evne til å slippe gjennom buffer etter felling med alle plakkprøver. Anti-mus IgG fra geit ble tilsatt til alle celler, vasket 3 ganger og perok-sydasesubstratoppløsning ble tilsatt for å bestemme ikke-spesifikke bakgrunnsnivåer forbundet med det immobiliserte plakk. Alle brønner med 0,22 m filtere viste seg ikke tilfredsstil-lende, dvs., hadde for høy bakgrunn. Alle brønner med 0,4 5 m filtere ble bestemt til å gi bare liten eller ingen bakgrunn.

Det lave bakgrunnsnivået funnet i noen brønner ble ikke forbundet med antall mikrober som var immobilisert i brønnene (korrela-sjonskoeffisient = 0,089).

For å bestemme nytten av immunofiltreringsanalysen med spirochæter, ble IO<6>bakterier i 100 1 PBS-Tween 20 inkubert 15 min. ved romtemperatur med 100 1 av forskjellige fortynninger av anti-spirochæt monoklonale antistoffer. Blandingen ble deretter tilsatt til brønnene i 0,45 m Millititerplater og vasket 3 ganger med PBS-Tween 20. En 50 1 alikvot anti-mus IgG fra geit ble tilsatt og fikk inkuberes i 15 min. ved romtemperatur. Platene ble vasket 3 ganger som ovenfor, 100 1 peroksy-dasesubstratoppløsning ble tilsatt og den optiske tetthet ved 490 nm ble målt. Fortynningskurver med plotting av OD490 mot log bakteriekonsentrasjon ble opptatt og indikerte at analysen viste optimal følsomhet mel lom 5xl03 og 1, 5xl05 bakterier pr. prøve.

Eksempel 7

Immunofiltrerin<g>sanalyse med prøver av plakk med tilsetnin<g>Plakkprøver fra individer uten påviselig periodontal sykdom ble tatt ved fremgangsmåten til Listgarten et al. ( J. Periodontol . 8:122 (1981)) og ble tilsatt forskjellige antall T. denticola og vincentii. 100 1 anti-spirochæt monoklonale antistoffer ble tilsatt og prøvene inkubert 1 time ved romtemperatur. Materialene ble overført til brønner i 0,45 m Millititerplater og immobilisert som i eksempel 6. Det immobiliserte plakk ble vasket 3 ganger med PBS-Tween 20 og 100 1 peroksydase-merket anti-mus IgG fra geit ble tilsatt. Etter ytterligere 1/2 times inkubering, ble det ikke-bundne merkede antistoff fjernet og brønnene vasket 3 ganger som ovenfor. En 100 1 alikvot peroksydasesubstratoppløsning ble tilsatt og den optiske tetthet ved 490 nm bestemt. Korrelasjonskoeffisienter mellom antall spirochæter i prøver med tilsetning bestemt ved optisk tetthet og antall spirochæter bestemt ved fasekontrastmikroskopi ble bestemt til 0,873, dvs. godt innenfor akseptable grenser.

Eksempel 8

Påvisnin<g>av spirochæter i plakkprøver

524 plakkprøver ble tatt med bruk av fremgangsmåten til Listgarten et al. og evaluert med hensyn på antall spirochæter. Disse prøvene ble deretter testet i en immunofiltreringsanalyse med bruk av TDE 01-01-antistoffet beskrevet ovenfor.

Plakkprøver ble immobilisert i Mikrotiterplater med membran-filtere og vasket 3 ganger med PBS-Tween 20. Monoklonalt antistoff TDE 01-01 (50 1) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter ytterligere vasker som ovenfor, ble peroksydase-merket anti-mus IgG fra geit tilsatt (50 1) og inkubert i ytterligere en time. Brønnene ble vasket igjen og enzymsubstrat ble tilsatt. Den optiske tetthet i hver brønn ble bestemt og prøvene ble bedømt positive når O.D. overskred den for en gruppe kjente negative prøver (middelverdi av OD4g0+ 2 standardavvik). Resultatene vist i tabell 4 nedenfor indikerer at immunofiltreringsanalyse gir resultater som korrelerer godt med den mye lengre og mye mer arbeidskrevende fremgangsmåte ved mørkefeltmikroskopi.

Eksempel 9

Monoklonale antistoffer ble fremstilt som beskrevet ovenfor, og var spesifikke for hver av de følgende spesier: Actinobacillus actinomycetumcommitans.Bacteroides<q>in<g>ivalis. Bacteroides intermedius. Fusobacterium nucleatum og Haemophilus aphrophilus. Bakteriekildene og ATCC aksesjonsnummere for hybridomcellelinjer som danner slike antistoffer er angitt nedenfor i tabell 5. Monoklonale antistoffer til hver art som har spesifikk virkning overfor LPS, ble bestemt ved alle de tre fremgangsmåter beskrevet ovenfor: 1) immunoreaktivitet med kjente stammer, naturlige stammer, ekstrahert LPS og Lipid A som beskrevet i eksempel 1, enten ved en immunofiltreringsanalyse som beskrevet i eksempel 6 eller ved telling av partikler i fluorescerende immunoanalyse med bruk av en "Pandex" immunoanalyseplate, (Katalog nr. 22-010-1, Pandex Laboratories, Inc., Chicago, IL) som beskrevet i Dawson, M., Research Report nr. 6, juli, 1984, Pandex Laboratories, Inc., og Masson, P.L. et al., i Methods in Enzymolo<q>y. Langone et al., eds., Vol 74:106-139 (1981) hvis arbeider er innlemmet her ved referanse; 2) "Western blot"-analyse av lysat fra hele celler;

og

3) ELISA-immunoanalyse som beskrevet i eksempel 1 ved bruk av renset LPS.

Eksempel 10

Monoklonale antistoffer ble fremstilt og valgt ut for å være immunologisk reaktive overfor alle gram-negative orale mikrober som er evaluert. Slike antistoffer ble fremstilt som beskrevet ovenfor med bruk av B.<q>ingivalis (ATCC 33277) som den immunogene mikrobe. En hybridomcellelinje som danner slike antistoffer er deponert og gitt ATCC Aksesjonsnr. (patentsøkers betegnelse BGN58F43, deponert 18. november 1986).

Det monoklonale antistoff dannet av denne cellelinje ble funnet å være kryssreaktiv med alle gram-negative orale mikrober som er testet, inkludert de typebestemte stammer, naturlige stammer, ekstrahert LPS og Lipid A som er beskrevet i eksempel 1.

Epitopen som disse monoklonale antistoffer reagerer med ble bestemt å være LPS ved "Western Blot"-analyse som beskrevet ovenfor.

Eksempel 11

Monoklonale antistoffer som er beskrevet ovenfor ble brukt for å korrelere fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen med både en klinisk bedømmelse av periodontal sykdom hos 20 pasienter og en bedømmelse av mikrobefloraen ved anaerobe dyrkningsteknikker for de samme pasienter.

Plakkprøver ble tatt som beskrevet og dispergert i på forhånd redusert anaerobt sterilisert ("PRAS") fortynningsmiddel, fremstilt som beskrevet nedenfor, og fortynnet 1:100 i sterilt PBS. En halv milliliter av den fortynnede prøve ble deretter spredd ut på overflaten av en 150 mm dyrkningsplate med bruk av en steril politimann av glass. "Anaerobe Medium I" (DiMed, Inc., Minneapolis, Minnesota) ble brukt for å dyrke Actinobacillus. Bacteroides. og Fusobacterium. "Modified Chocolate Agar" (DiMed, Inc., Minneapolis, Minnesota) ble brukt for å dyrke Haemophilus. Plater med "Anaerobic Medium I" ble inkubert 10 dager anaerobt ved en temperatur på 3 7°C. Plater med "Chocolate Agar" ble inkubert 3-4 dager under 10% C02(90% luft) ved en temperatur på 37°C. All bekreftelse av arter ble gjort på den måte som er beskrevet i Wolff et al., J. Perio. Res. 20:237-250 (1985) hvis arbeid er innlemmet her ved referanse. Treponemer ble ikke kjørt p.g.a. vanskelighetene som en møter ved å dyrke disse mikrober.

PRAS fortynningsmiddel ble fremstilt på følgende måte:

Tilsett sakte til 200 ml vannr-

ør g CaCl2

0,2 g MgS04.7H20

Tilsett sakte til 500 ml vann;

1,0 g K2HP04

1,0 g KH2P04

2,0 g NaCl

10,0 g NaHC03

Bland begge oppløsninger og tilsett 200 ml vann.

Ta 400 ml av de blandede oppløsninger og tilsett

400 ml vann

1,6 g gelatin (Difco, Detroit, MI)

3,2 ml oksygenindikator (0,025% Resazurin™, Difco)

0,4 g cystein HC1

Juster pH til 6,6 med konsentrert HCl. Plasser oppløsningen i anaerobt avtrekk i 24 timer, og fordel aseptisk 20 ml i hver av flere sterile apotekflasker og sett kork på.

Prøver fra 2 0 pasienter gjennomgikk "colony blot"-analyse som beskrevet i McArthur et al, J. Clin. Periodontol. 13:684-690

(1986) , og gjennomgikk også immunofiltreringsanalyse som beskrevet i eksempel 6. Andelen av hver av de fem orale mikrober som ble testet i "colony blot"-analysen er angitt som en prosent av de totale LPS-inneholdende celler, beregnet ved formelen:

Antall spesifikke LPS-kolonier

x 100%

Totalt antall LPS-positive kolonier

For hvert antistoff ble disse forhold bestemt på begge måter (dvs., "colony blotting" og immunofiltrering) og de to forhold ble plottet mot hverandre. Den beste kurvetilpasning ble bestemt ved lineær regresjonsanalyse. Korrelasjonskoeffisienten mellom disse verdiene ble deretter bestemt ifølge fremgangsmåten til Piazza et al., Immunological Methods (Lefkovits et al., eds.) Vol., I, s. 419-456 (1979), og er gitt nedenfor i tabell 6.

Disse resultatene indikerer at fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse korrelerer meget godt (P > 0,005) med en tradisjonell dyrkningsmetode når det gjelder identifisering og sammenligning av orale mikrober.

Forskjellige modifikasjoner og endringer vil være åpenbare for dem som har fagkunnskap, uten å avvike fra denne oppfinnelses område og mening, og det må være klart at denne oppfinnelsen ikke unødig er begrenset til de illustrerende utforminger som er gitt her.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for evaluering av oral prøve med hensyn på nærvær av mikrobeflora i forbindelse med periodontal sykdom, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter trinnene: (a) bestemmelse ved bruk av antistoffer av mengden i nevnte prøve av én eller flere spesifikke orale mikrober, (b) bestemmelse, ved bruk av antistoffer, av mengden i nevnte prøve av en referansegruppe av gram-negative orale mikrober, og (c) sammenligning av mengden av nevnte spesifikke orale mikrober og mengden av nevnte referansemikrober.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at nevnte spesifikke orale mikrober velges fra gruppen som består av slektene Actinobacillus , Bacteroides, Fusobacterium. Haemophilus og Treponema. og nevnte antistoffer fra trinn (a) er monoklonale antistoffer.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 2, karakterisert ved at nevnte spesifikke orale mikrober velges fra gruppen som består av artene Actinobacillus actinomvcetumcommitans, Bacteroides qingivalis. Bacteroides intermedius. Fusobacterium nucleatum. Haemophilus aphrophilus. Treponema denticola og Treponema vincentii. og nevnte spesifikke orale mikrober påvises med monoklonale antistoffer dannet av hybridcellelinjer som har ATCC aksesjonsnr. hhv. HB 9268, HB 9269, HB 9270, HB 9271, HB 9272, HB 9273 og HB 9274.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 2, videre karakterisert ved at nevnte monoklonale antistoffer er spesifikke for lipopolysakkarider.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, videre karakterisert ved at nevnte referansemikrober omfatter alle gram-negative mikrober i nevnte prøve og mengden av nevnte referansemikrober bestemmes ved bruk av et enkelt monoklonalt antistoff.

6. Sett for evaluering av en oral prøve med hensyn på tilstedeværelsen av mikrobeflora assosiert med periodontal sykdom, karakterisert ved at nevnte utstyr omfatter (a) ett eller flere antistoffer mot spesifikke orale mikrober, og (b) ett eller flere antistoffer mot en referansegruppe av gram-negative orale mikrober.

7. Sett i henhold til krav 6, karakterisert ved at nevnte spesifikke orale mikrober velges fra gruppen som består av slektene Actinobacill-lus, Bacteroides. Fusobacterium. Haemophilus og Treponema. og nevnte antistoffer mot nevnte spesifikke orale mikrober og nevnte referansemikrober er monoklonale antistoffer.

8. Sett i henhold til krav 7, karakterisert ved at nevnte spesifikke orale mikrober velges fra gruppen som består av artene Actinobacillus actinomvcetumcommitans. Bacteroides qingivalis. Bacteroides intermedius. Fusobacterium nucleatum. Haemophilus aphro <p> hilus. Tre <p> onema denticola og Treponma vincentii og nevnte monoklonale antistoffer mot nevnte spesifikke orale mikrober dannes av hybridcellelinjer som har ATCC tilgjengelikhetsnr. HB 9268, HB 9269, HB 9270, HB 9271, HB 9272, HB 9273 og HB 9274.

9. Sett karakterisert ved at nevnte sett omfatter ett eller flere monoklonale antistoffer som er spesifikke for én eller flere arter av gram-negative orale mikrober, og videre ett eller flere monoklonale antistoffer som er spesifikke for alle gram-negative orale mikrober.

10. Sett i henhold til krav 6, videre karakterisert ved at nevnte sett omfatter enzymbundne antistoffer mot nevnte antistoffer fra del (a) og mot nevnte antistoffer fra del (b), og substrat for nevnte enzym fra nevnte enzym-bundne antistoffer.