JPH0284200A - カンピロバクターを検出するための核酸フラグメント、方法およびキット - Google Patents
カンピロバクターを検出するための核酸フラグメント、方法およびキットInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、カンピロバクタ−（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔ
ｅｒ）属に属する細菌を検出することに関し、より詳細
にはカンピロバクタ−のｒＲＮＡまたはｒＲＮ＾遺伝子
を特異的に検出するための核酸プローブおよび組成物、
並びにそれらの使用方法を提供する。
ｅｒ）属に属する細菌を検出することに関し、より詳細
にはカンピロバクタ−のｒＲＮＡまたはｒＲＮ＾遺伝子
を特異的に検出するための核酸プローブおよび組成物、
並びにそれらの使用方法を提供する。
（従来の技術、発明が解決しようとする課Ｂ）本明細書
中で用いる“カンピロバクタ−”ナル用語は、Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ、 １ （Ｎ、
Ｒ，ＫｒｉｅｇおよびＪ、Ｇ、ＩＩｏｌｔ［ｅｄｓ、］
１９８６、 ｐ、１１１〜１１８ 、Ｗｉｌｌｉａｍｓ
Ａ Ｗｉｌｋｉｎｓ）においてそれとして分類された
細菌を意味する。カンピロバクタ−の検出は種々の医学
的および公衆衛生の情況下において重要である。カンピ
ロバクタ−伊ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
ｊｅｊｕｎｉ）およびＣコーリ（Ｃ９ｃｏｌｉ）は２
つの最も重要な細菌種であり、ヒトにおける下痢（Ｂｌ
ａｓｅｒら、１９７９、Ａｎｎ、 ＩｎＴｅｒｎ。
中で用いる“カンピロバクタ−”ナル用語は、Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ、 １ （Ｎ、
Ｒ，ＫｒｉｅｇおよびＪ、Ｇ、ＩＩｏｌｔ［ｅｄｓ、］
１９８６、 ｐ、１１１〜１１８ 、Ｗｉｌｌｉａｍｓ
Ａ Ｗｉｌｋｉｎｓ）においてそれとして分類された
細菌を意味する。カンピロバクタ−の検出は種々の医学
的および公衆衛生の情況下において重要である。カンピ
ロバクタ−伊ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
ｊｅｊｕｎｉ）およびＣコーリ（Ｃ９ｃｏｌｉ）は２
つの最も重要な細菌種であり、ヒトにおける下痢（Ｂｌ
ａｓｅｒら、１９７９、Ａｎｎ、 ＩｎＴｅｒｎ。
Ｍｅｄ、］９ ： １７９）および腸炎（Ｇ、に０Ｍ
ｏｒｒｉＳ ら、Ａ１１ｆ集、Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏ
ｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシ
ントン。
ｏｒｒｉＳ ら、Ａ１１ｆ集、Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏ
ｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシ
ントン。
Ｄ、’Ｃ，）の原因菌である。その他のカンピロバクタ
一種はヒトや動物において流産、敗血症および増殖性回
腸炎のような疾病を起こすことに関係している。さらに
、カンピロバクタ−に似ている微生物が同性愛の男性の
ふん便から（Ｆｅｎｎｅｌｌ ら、１９８４、Ｊ、Ｉｎ
ｆｅｃ、Ｄｉｓ、、 ■Ｌ： ５８）および胃潰瘍の生
検材料から（Ｋａｓｐｅｒら、１９８４、Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ、ｌｉ ：１７９）分離されている。
一種はヒトや動物において流産、敗血症および増殖性回
腸炎のような疾病を起こすことに関係している。さらに
、カンピロバクタ−に似ている微生物が同性愛の男性の
ふん便から（Ｆｅｎｎｅｌｌ ら、１９８４、Ｊ、Ｉｎ
ｆｅｃ、Ｄｉｓ、、 ■Ｌ： ５８）および胃潰瘍の生
検材料から（Ｋａｓｐｅｒら、１９８４、Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ、ｌｉ ：１７９）分離されている。
従って、本発明の１つの面は、一般に環境、食品または
臨床サンプルに通用し得るカンピロバクタ−の迅速な新
規アッセイ系を提供することである。
臨床サンプルに通用し得るカンピロバクタ−の迅速な新
規アッセイ系を提供することである。
カンピロバクタ−は標準的な実験室手法に従って同定さ
れている（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｊ、八、 ［ｅｄ
、］ 、 Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅｓ ｉｎ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ＋第２版、ニューヨーク、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ＋ １９８５年、２１５〜２１７真に記載のＣ
ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ参照）。
れている（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、 Ｊ、八、 ［ｅｄ
、］ 、 Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅｓ ｉｎ Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ＋第２版、ニューヨーク、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ＋ １９８５年、２１５〜２１７真に記載のＣ
ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ参照）。
本発明の他の面は、慣例的な培養技術に伴う欠点を回避
し、核酸プローブを用いてカンピロバクタ−を検出する
ことである。
し、核酸プローブを用いてカンピロバクタ−を検出する
ことである。
本発明のさらに他の面は、通常のアンセイ条件下でプロ
ーブに接近しやすくなりうる標的領域にハイブリダイズ
し得るプローブを提供することである。
ーブに接近しやすくなりうる標的領域にハイブリダイズ
し得るプローブを提供することである。
Ｋｏｈｎｅら（１９６８、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ８ ：１１０４〜１１１８）はｒＲＮＡ
配列に対するプローブの作製方法を論じているが、彼ら
はカンピロバクタ−特異的プローブを作製するのに必要
な教示を与えていない。
ｏｕｒｎａｌ ８ ：１１０４〜１１１８）はｒＲＮＡ
配列に対するプローブの作製方法を論じているが、彼ら
はカンピロバクタ−特異的プローブを作製するのに必要
な教示を与えていない。
ＰａｃｅおよびＣａｍｐｂｅｌｌ （１９７１、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 削Ｌ：
５４３〜５４７）は別種の細菌からのリポソームリボ
核酸の相同性、およびそのような相同レベルを定量化す
るためのハイブリダイゼーシ四ン法を論じている。同様
に、Ｓｏｇｉｎ、 Ｓｏｇｉｎ＋および−ｏｅｓｅ
（１９７２、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、土： １７３〜１８４）は異
なるリポソームＲＮＡ分子の一次構造の特性決定を利用
して系統発生の関係を評価するための理論的かつ実際的
な手法を論じている。
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 削Ｌ：
５４３〜５４７）は別種の細菌からのリポソームリボ
核酸の相同性、およびそのような相同レベルを定量化す
るためのハイブリダイゼーシ四ン法を論じている。同様
に、Ｓｏｇｉｎ、 Ｓｏｇｉｎ＋および−ｏｅｓｅ
（１９７２、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、土： １７３〜１８４）は異
なるリポソームＲＮＡ分子の一次構造の特性決定を利用
して系統発生の関係を評価するための理論的かつ実際的
な手法を論じている。
Ｆａｘ、 ＰｅｃｈｍａｎおよびＷｏｅｓｅ （１９
７７、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ−ｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＲａｃＬｅｒｉｏｌｏ
ｇ）’＋ｆｉ ：４４〜５７）は原核生物系に対する１
つの研究法として１６Ｓ リポソームＲＮＡの比較目録
作成を論じている。しかしながら、これらの文献はカン
ピロバクタ−に関するＫｏｈｎｅの教示の不備を補うこ
とができない。
７７、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ−ｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ＲａｃＬｅｒｉｏｌｏ
ｇ）’＋ｆｉ ：４４〜５７）は原核生物系に対する１
つの研究法として１６Ｓ リポソームＲＮＡの比較目録
作成を論じている。しかしながら、これらの文献はカン
ピロバクタ−に関するＫｏｈｎｅの教示の不備を補うこ
とができない。
係属中の米国特許出願第６９２７７８号においてＲａ５
−ｈｔｃｈｉａｎおよびＦｉｔｔｓは、ゲノムＤＮＡ配
列を標的としたある種のカンピロバクタ−特異的核酸プ
ローブの作製を論しているが、開示された方法は小さい
オリゴヌクレオチドプローブの作製には適さないであろ
う。
−ｈｔｃｈｉａｎおよびＦｉｔｔｓは、ゲノムＤＮＡ配
列を標的としたある種のカンピロバクタ−特異的核酸プ
ローブの作製を論しているが、開示された方法は小さい
オリゴヌクレオチドプローブの作製には適さないであろ
う。
本発明のさらに他の面は、カンピロバクタ−を特異的に
検出しうる小型のオリゴヌクレオチドプローブを提供す
ることである。 Ｒｏｗａｎｉｕｋら（１９８７゜Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 ｉ！ｌＬＬ： ２１３７〜２
１４１） 、Ｒａ５ｈｔｃｈｉａｎら（１９８７、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ＋ Ｊｌ ： ３
１１〜３１７）、Ｌａｕ ら （１９８７、Ｓｙｓｔ
ｅｍ ａｎｄ Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋
ｉ：２３１〜２３８）、Ｐａｓ ｔｅｒおよびＤｅ
ｗｈｉｒｓｔ （１９８８，Ｉｎｔｎｌ。
検出しうる小型のオリゴヌクレオチドプローブを提供す
ることである。 Ｒｏｗａｎｉｕｋら（１９８７゜Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 ｉ！ｌＬＬ： ２１３７〜２
１４１） 、Ｒａ５ｈｔｃｈｉａｎら（１９８７、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ＋ Ｊｌ ： ３
１１〜３１７）、Ｌａｕ ら （１９８７、Ｓｙｓｔ
ｅｍ ａｎｄ Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋
ｉ：２３１〜２３８）、Ｐａｓ ｔｅｒおよびＤｅ
ｗｈｉｒｓｔ （１９８８，Ｉｎｔｎｌ。
Ｊ、５ｙｓｔｅＩ＋、Ｂａｃｔｅｒｊｏｌ、１３Ｊｌ
： ５６〜６２） 、、並びにＴｈ。
： ５６〜６２） 、、並びにＴｈ。
ｍｐｓｏｎら（１９８Ｂ＋ Ｉｎｔｎｌ、 Ｊ、Ｓｙｓ
ｔｅｍ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
ｔｅｍ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
３８ ： １９０〜２００）はカンピロバクタ−リポソ
ームＲＩＩＡの遺伝子機構を論じており、種々のカンピ
ロバクタ−に由来する１６ｓｒＲＮＡ配列を提示してい
る。しかしながら、これらの文献は最も興味のあるター
ゲット領域を検索して同定するのに役立たない。
ームＲＩＩＡの遺伝子機構を論じており、種々のカンピ
ロバクタ−に由来する１６ｓｒＲＮＡ配列を提示してい
る。しかしながら、これらの文献は最も興味のあるター
ゲット領域を検索して同定するのに役立たない。
ＲｏｍａｎｉｕｋおよびＴｒｕｓｔ （１９８７ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
Ｌｅｔｔ、、Ｑ ： ３３１〜３３５）はカンピロバク
タ−１６ｓ ｒＲＮＡの領域にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチドプローブを開、示しており、さらに電気
泳動分離したカンピロバクタ−ゲノムＤＮＡの制限フラ
グメントへのサザンハイプリダイゼーションによるカン
ピロバクタ−株の同定におけるそのプローブの使用を証
明している。このプローブは、この限定された情況にお
いて有用であるが、カンピロバクタ−菌と非カンピロバ
クター菌の混合集団を含むサンプル中のカンピロバクタ
−を同定するのに十分な特異性をもち合わせていない。
タ−１６ｓ ｒＲＮＡの領域にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチドプローブを開、示しており、さらに電気
泳動分離したカンピロバクタ−ゲノムＤＮＡの制限フラ
グメントへのサザンハイプリダイゼーションによるカン
ピロバクタ−株の同定におけるそのプローブの使用を証
明している。このプローブは、この限定された情況にお
いて有用であるが、カンピロバクタ−菌と非カンピロバ
クター菌の混合集団を含むサンプル中のカンピロバクタ
−を同定するのに十分な特異性をもち合わせていない。
リポソームは、遺伝情報を細胞タンパク質（生命の主な
構造的および触媒的成分である）へ翻訳する唯一の既知
装置として役立つので、全ての生物にとって極めて重要
である。この重要性は全ての細胞がリポソームをもつと
いう観測により証明される。
構造的および触媒的成分である）へ翻訳する唯一の既知
装置として役立つので、全ての生物にとって極めて重要
である。この重要性は全ての細胞がリポソームをもつと
いう観測により証明される。
リポソームは３種の別個のＲＮ＾分子を含み、少なくと
も大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）では、それらの分子は５Ｓ、
１６ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡと呼ばれている。これら
の名称の由来は沈降速度により測定されたＲＮＡ分子の
大きさに関係している。しかしながら、実際には、それ
らは生物間で大きさが実質的に変化する。それにもかか
わらず、５Ｓ、 １６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡは細菌
の相同ＲＮＡ分子のための一般名として普通に用いられ
ており、ここでもこの慣例に従うことにする。
も大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）では、それらの分子は５Ｓ、
１６ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡと呼ばれている。これら
の名称の由来は沈降速度により測定されたＲＮＡ分子の
大きさに関係している。しかしながら、実際には、それ
らは生物間で大きさが実質的に変化する。それにもかか
わらず、５Ｓ、 １６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡは細菌
の相同ＲＮＡ分子のための一般名として普通に用いられ
ており、ここでもこの慣例に従うことにする。
ハイブリダイゼーションは、予め決められた反応条件下
で、２つの部分的に又は完全に相補的な１本鎖核酸が逆
平行状態で一緒になって、特異的で安定した水素結合に
より２本鎖核酸を形成する方法として、一般に理解され
ている。特定の組のハイブリダイゼーション条件のスト
リンジエンシー （ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）はプローブ
／ターゲット２本鎖の塩基組成、並びに２つの核酸間の
誤対合（ｍｉｓｐａｉｒｉｎｇ）のレベルおよび形状に
よって定められる。
で、２つの部分的に又は完全に相補的な１本鎖核酸が逆
平行状態で一緒になって、特異的で安定した水素結合に
より２本鎖核酸を形成する方法として、一般に理解され
ている。特定の組のハイブリダイゼーション条件のスト
リンジエンシー （ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）はプローブ
／ターゲット２本鎖の塩基組成、並びに２つの核酸間の
誤対合（ｍｉｓｐａｉｒｉｎｇ）のレベルおよび形状に
よって定められる。
ストリンジエンシーはまたハイブリダイゼーション溶液
中に存在するイオン種の濃度および種類、存在する変性
剤の種類および濃度、ハイブリダイゼーション温度のよ
うな反応パラメーターによっても支配される。一般に、
ハイブリダイゼーション条件がよりストリンジェントに
なるにつれて、安定したハイブリッドを形成するために
、より長いプローブが好適になる。結果的に、ハイブリ
ダイゼーションが行われる条件のストリンジエンシー（
例えば、実施しようとするアンセイの型に基づく）は使
用する好適なプローブの条件を指定するであろう、この
ような関係は当業者によく理解されており、容易に操作
することができる。−船釣な事として、プローブの長さ
に応じて、当業者はストリンジェント条件を約０．９モ
ルの塩溶液中約３５〜６５°Ｃであると理解している。
中に存在するイオン種の濃度および種類、存在する変性
剤の種類および濃度、ハイブリダイゼーション温度のよ
うな反応パラメーターによっても支配される。一般に、
ハイブリダイゼーション条件がよりストリンジェントに
なるにつれて、安定したハイブリッドを形成するために
、より長いプローブが好適になる。結果的に、ハイブリ
ダイゼーションが行われる条件のストリンジエンシー（
例えば、実施しようとするアンセイの型に基づく）は使
用する好適なプローブの条件を指定するであろう、この
ような関係は当業者によく理解されており、容易に操作
することができる。−船釣な事として、プローブの長さ
に応じて、当業者はストリンジェント条件を約０．９モ
ルの塩溶液中約３５〜６５°Ｃであると理解している。
本明細書中で用いる“プローブとは、予め定められたス
トリンジエンシーの条件下でターゲット核酸配列に特異
的に（すなわち、優先的に）ハイブリダイズされる特定
のヌクレオチド配列を含む、考案または選別によって、
合成されたあるいは生物学的につくられた酢酸（ＤＮＡ
またはＲＮＡ）を意味する。ターゲット核酸配列とは特
定のプローブが優先的にハイブリダイズし得るものであ
る。
トリンジエンシーの条件下でターゲット核酸配列に特異
的に（すなわち、優先的に）ハイブリダイズされる特定
のヌクレオチド配列を含む、考案または選別によって、
合成されたあるいは生物学的につくられた酢酸（ＤＮＡ
またはＲＮＡ）を意味する。ターゲット核酸配列とは特
定のプローブが優先的にハイブリダイズし得るものであ
る。
その他の存用な定義は、それらが以下の説明文中で最初
に出てきたときに、説明されるであろう。
に出てきたときに、説明されるであろう。
ここに引用した文献はすべて参照によりここに包含され
る。
る。
（課題を解決するための手段）
本発明の種々の原理および側面によれば、特定のハイブ
リダイゼーション条件下で、カンピロバクタ−１ジエジ
ｓ 二（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）
、Ｃ。
リダイゼーション条件下で、カンピロバクタ−１ジエジ
ｓ 二（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）
、Ｃ。
コーリ（Ｃ，ｃｏｉｌ）およびＣ，ラリディス（Ｃ，Ｉ
ａｒｉｄｉｓ）のリポソームＲＮＡ （ｒＲＮＡ）分子
の存在を検出できるが、被検サンプル中に存在しうる他
の関連細菌のｒＲＮＡを同一条件下で検出できないＤＮ
ＡまたはＲＮＡ配列から成る核酸プローブおよびプロー
ブセットが提供される。適切な被検サンプルには例えば
ふん便、血液、他の体液または組織、並びに食品および
動物からの生物学的サンプルもしくは物質が含まれる。
ａｒｉｄｉｓ）のリポソームＲＮＡ （ｒＲＮＡ）分子
の存在を検出できるが、被検サンプル中に存在しうる他
の関連細菌のｒＲＮＡを同一条件下で検出できないＤＮ
ＡまたはＲＮＡ配列から成る核酸プローブおよびプロー
ブセットが提供される。適切な被検サンプルには例えば
ふん便、血液、他の体液または組織、並びに食品および
動物からの生物学的サンプルもしくは物質が含まれる。
本発明のプローブは多数の遺伝子学的に異なるグループ
のカンピロバクタ−を同定するために用いられる。これ
らは表１に示され、主なグループはボックスで囲むこと
によって分類されている。
のカンピロバクタ−を同定するために用いられる。これ
らは表１に示され、主なグループはボックスで囲むこと
によって分類されている。
これらのグループの中でいくつかの再分割が可能であり
、それ、はサブグループ間の間隔をあけることによって
示される。 Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，ｃｏｌｉおよび
Ｃ３ｔａｒ！ｄｉｓ−臨床（ふん便）被検物および汚染
食品からの単離物の大部分を占めるカンピロバクタ−種
−は別個のグループを形成する。それらは互いに密接な
関係があり、他のカンピロバクタ一種とは（１６ｓ ｒ
ＲＮ＾ヌクレオチド配列の変異のパターンおよび程度に
おいて）区別される。他の３つのカンピロバクタ−グル
ープにはウオリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌ １ａ）属、バタ
テロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、チオフ゛ラ
ム（Ｔｈｉｏｖｕｌｕ醜）属およびフレキジスピラ（Ｆ
ｌ−ｅｘｉｓｐｉｒａ）属の代表菌を含む非カンピロバ
クター菌が多数混在している（表１参照）。
、それ、はサブグループ間の間隔をあけることによって
示される。 Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，ｃｏｌｉおよび
Ｃ３ｔａｒ！ｄｉｓ−臨床（ふん便）被検物および汚染
食品からの単離物の大部分を占めるカンピロバクタ−種
−は別個のグループを形成する。それらは互いに密接な
関係があり、他のカンピロバクタ一種とは（１６ｓ ｒ
ＲＮ＾ヌクレオチド配列の変異のパターンおよび程度に
おいて）区別される。他の３つのカンピロバクタ−グル
ープにはウオリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌ １ａ）属、バタ
テロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、チオフ゛ラ
ム（Ｔｈｉｏｖｕｌｕ醜）属およびフレキジスピラ（Ｆ
ｌ−ｅｘｉｓｐｉｒａ）属の代表菌を含む非カンピロバ
クター菌が多数混在している（表１参照）。
ここに記載のプローブは主にＣ，ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，
ｃｏｌｉおよび（：、 １ａｒｉｄｉｓグループの細菌
とハイブリダイズする。対象となる臨床、食品および環
境サンプル中の他のカンピロバクタ一種と比較して、そ
れらは圧倒的に広く行き渡っており、且つそれらは遺伝
学的に区別し得るので、このカンピロバクタ−グループ
に特異的なプローブが最も重要となる。
ｃｏｌｉおよび（：、 １ａｒｉｄｉｓグループの細菌
とハイブリダイズする。対象となる臨床、食品および環
境サンプル中の他のカンピロバクタ一種と比較して、そ
れらは圧倒的に広く行き渡っており、且つそれらは遺伝
学的に区別し得るので、このカンピロバクタ−グループ
に特異的なプローブが最も重要となる。
本発明はまたこれらのプローブを利用するアッセイ系を
特徴としており、その好適な方式は上記の望ましいプロ
ーブの挙動を有利に増強することができる０本発明のア
ッセイ系は、カンピロバクタ−を検出するための現在利
用されている他の方法に対して、有利にも次の増強され
た性能を示す：ａ） 感度の増加；すなわち、現在用い
られている方法よりも頻繁に所定のサンプル中のカンピ
ロバクタ−を検出しうる； ｂ） 安価な試薬の使用および労力の軽減により有意な
アッセイコストの低下が見込まれる；Ｃ） 生化学的に
まれなカンピロバクタ−でさえも正確に同定できる；お
よび ｄ） 試験がそれ以上増殖させる必要のない非培養サン
プルに対して実施されるので、結果がより迅速に得られ
る。従って、本発明の好適な試験は、有利にも結果を得
るのにたった１日かかるだけである。
特徴としており、その好適な方式は上記の望ましいプロ
ーブの挙動を有利に増強することができる０本発明のア
ッセイ系は、カンピロバクタ−を検出するための現在利
用されている他の方法に対して、有利にも次の増強され
た性能を示す：ａ） 感度の増加；すなわち、現在用い
られている方法よりも頻繁に所定のサンプル中のカンピ
ロバクタ−を検出しうる； ｂ） 安価な試薬の使用および労力の軽減により有意な
アッセイコストの低下が見込まれる；Ｃ） 生化学的に
まれなカンピロバクタ−でさえも正確に同定できる；お
よび ｄ） 試験がそれ以上増殖させる必要のない非培養サン
プルに対して実施されるので、結果がより迅速に得られ
る。従って、本発明の好適な試験は、有利にも結果を得
るのにたった１日かかるだけである。
本発明プローブをｒＲＮＡに向けることによって生じる
他の利点には、検出されるｒＲＮＡが細胞塊の重要な成
分を構成するという事実が含まれることが判明した。細
胞のリポソーム含量の概算は変化するが、活発に増殖し
ているカンピロバクタ−菌ハ細胞当り５．０Ｘ１０Ｅ＋
３より多いリポソームを含み、それ故に５．０ｘｌＯＥ
＋３コピー数のそれぞれのｒＲＮＡ（リポソーム中に１
：１：１の化学を論量で存在する）を含みうる。対照的
に、遺伝子またはそのＲＮ＾転写物のような他の細胞タ
ーゲット分子は、それらが比較的少ない量で存在するの
で、あまり望ましくない。
他の利点には、検出されるｒＲＮＡが細胞塊の重要な成
分を構成するという事実が含まれることが判明した。細
胞のリポソーム含量の概算は変化するが、活発に増殖し
ているカンピロバクタ−菌ハ細胞当り５．０Ｘ１０Ｅ＋
３より多いリポソームを含み、それ故に５．０ｘｌＯＥ
＋３コピー数のそれぞれのｒＲＮＡ（リポソーム中に１
：１：１の化学を論量で存在する）を含みうる。対照的
に、遺伝子またはそのＲＮ＾転写物のような他の細胞タ
ーゲット分子は、それらが比較的少ない量で存在するの
で、あまり望ましくない。
別の予期しない利点は、ｒＲＮＡ （およびそれらをコ
ードする遺伝子）が同時に存在する生物間で側方転移（
ｌａｔｅｒａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を受けないように
思われる点である。従って、ｒＲＮＡの一次構造は、遺
伝子特異的ターゲット（例えば、同時に存在する生物間
で側方伝達を受けやすいプラスミド由来の遺伝子または
その産物の場合でありうる）ではなく、生物特異的分子
ターゲットを与える。
ードする遺伝子）が同時に存在する生物間で側方転移（
ｌａｔｅｒａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を受けないように
思われる点である。従って、ｒＲＮＡの一次構造は、遺
伝子特異的ターゲット（例えば、同時に存在する生物間
で側方伝達を受けやすいプラスミド由来の遺伝子または
その産物の場合でありうる）ではなく、生物特異的分子
ターゲットを与える。
さらに、本発明は多数のカンピロバクタ−（上記のもの
）を識別しうるカンピロバクタ−ｒＲＮＡターゲント配
列に対するプローブを提供する。臨床、食品および環境
サンプルから最も普通に分離されるカンピロバクタ一種
のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉＣ，ｃｏ
ｌｉおよびＣ，ＩａｒｉｄｉｓのｒＲＮＡターゲット９
Ｍ域にハイブリダイズしうる２種のプローブの好適な混
合物も提供される。有利には、これらのｒＲＮ＾ターゲ
ット配列は、本発明の好適なアッセイ条件下で、本発明
プローブがカンピロバクタ−ｒＲＮＡとハイブリダイズ
するが、非カンピロバクタ−ｒＲＮＡとは一般にハイブ
リダイズしないように、大部分の非カンピロバクタ−ｒ
ＲＮＡと十分に異なるものである。
）を識別しうるカンピロバクタ−ｒＲＮＡターゲント配
列に対するプローブを提供する。臨床、食品および環境
サンプルから最も普通に分離されるカンピロバクタ一種
のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉＣ，ｃｏ
ｌｉおよびＣ，ＩａｒｉｄｉｓのｒＲＮＡターゲット９
Ｍ域にハイブリダイズしうる２種のプローブの好適な混
合物も提供される。有利には、これらのｒＲＮ＾ターゲ
ット配列は、本発明の好適なアッセイ条件下で、本発明
プローブがカンピロバクタ−ｒＲＮＡとハイブリダイズ
するが、非カンピロバクタ−ｒＲＮＡとは一般にハイブ
リダイズしないように、大部分の非カンピロバクタ−ｒ
ＲＮＡと十分に異なるものである。
これらのプローブの特徴は包括性および排他性としてそ
れぞれ定義される。カンピロバクタ−に関して本発明プ
ローブの驚くべき包括性および排他性の特徴を有するプ
ローブが形成され得るという発見は意外なことであって
、予測できないことであった。
れぞれ定義される。カンピロバクタ−に関して本発明プ
ローブの驚くべき包括性および排他性の特徴を有するプ
ローブが形成され得るという発見は意外なことであって
、予測できないことであった。
本発明の特に好適な実施Ｂ様では、ふん便被検物中のＣ
ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，ｃｏ
ｌｉおよびＣ１ＩａｒｉｃｌＬｓを検出するアッセイ法
が提供される。この試験は迅速であり、感度がよく、非
放射性であり、ハイブリダイゼーシ式ン工程に先立って
サンプル中の細菌を培養する必要がなく、しかも上記の
カンピロバクタ−に対し非常に特異的である。
ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，ｃｏ
ｌｉおよびＣ１ＩａｒｉｃｌＬｓを検出するアッセイ法
が提供される。この試験は迅速であり、感度がよく、非
放射性であり、ハイブリダイゼーシ式ン工程に先立って
サンプル中の細菌を培養する必要がなく、しかも上記の
カンピロバクタ−に対し非常に特異的である。
表ｐ」冒創覧設朋−
本発明の原理および側面は表を参照することによりさら
に理解されるであろう： １土 カンピロバクタ−１６Ｓ ｒＲＮＡに存在する配
列変異のパターンの分析に基づいて発見されたカンピロ
バクタ一種のサブグループ間の関係を示す、この表はこ
こに記載のプローブおよびプローブセットの変異性（包
括性）を理解するための有用な枠組みを提供する；ｌａ
！−カンピロバクタ−１６３ｒＲＮＡのヌクレオチドタ
ーゲット配列、および本発明プローブのヌクレオチド配
列（Ｅ．Ｃｏｌｉの位置ナンバリング協定を使用、Ｂｒ
ｏｓｉｕｓ ら、１９７８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ： ＩＪｉ４ ： ４８０１〜４
８０５）並びにＷｏｌｌｉｎｅｌｌａ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ ５Ｆｌｅｘｉ−ｓｐｉｒａおよび７１１ｉ
０ｖｕｌｕ＋ｓを含む他の関連細菌からの１６ｓ ｒＲ
ＮＡの関連部分の整列を示す。
に理解されるであろう： １土 カンピロバクタ−１６Ｓ ｒＲＮＡに存在する配
列変異のパターンの分析に基づいて発見されたカンピロ
バクタ一種のサブグループ間の関係を示す、この表はこ
こに記載のプローブおよびプローブセットの変異性（包
括性）を理解するための有用な枠組みを提供する；ｌａ
！−カンピロバクタ−１６３ｒＲＮＡのヌクレオチドタ
ーゲット配列、および本発明プローブのヌクレオチド配
列（Ｅ．Ｃｏｌｉの位置ナンバリング協定を使用、Ｂｒ
ｏｓｉｕｓ ら、１９７８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ： ＩＪｉ４ ： ４８０１〜４
８０５）並びにＷｏｌｌｉｎｅｌｌａ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ ５Ｆｌｅｘｉ−ｓｐｉｒａおよび７１１ｉ
０ｖｕｌｕ＋ｓを含む他の関連細菌からの１６ｓ ｒＲ
ＮＡの関連部分の整列を示す。
Ｅ．Ｃｏｌｉ配列もターゲット部位の位置を確認するた
めに示される。 ＲＮＡ配列は５′→３′の方向に書か
れており、プローブ配列はＤＮＡであって３′→５′の
方向に書かれている。い（つかのプローブに含まれる小
文字Ｃは修飾されたシトシン残基（用いるアンセイの型
に応じて、そのシトシン残基にリポータ−基が結合され
うる）を示す； １↓ サイトドツト（ｃｙｔｏｄｏｔ）法で試験したカ
ンピロバクタ−および非カンピロバクター株の代表的サ
ンプルに対する好適なプローブの包括性および排他性挙
動を示す。
めに示される。 ＲＮＡ配列は５′→３′の方向に書か
れており、プローブ配列はＤＮＡであって３′→５′の
方向に書かれている。い（つかのプローブに含まれる小
文字Ｃは修飾されたシトシン残基（用いるアンセイの型
に応じて、そのシトシン残基にリポータ−基が結合され
うる）を示す； １↓ サイトドツト（ｃｙｔｏｄｏｔ）法で試験したカ
ンピロバクタ−および非カンピロバクター株の代表的サ
ンプルに対する好適なプローブの包括性および排他性挙
動を示す。
本発明プローブの開発において取られた第一工程は、カ
ンピロバクタ−特異的核酸プローブのターゲット部位と
して役立ちうる１６ｓ ｒＲＮＡの領域を同定すること
を含んでいた。実際のこととして、被検サンプル中にど
の非カンピロバクター菌が存在するかを推論的に予知す
ることは困難である。
ンピロバクタ−特異的核酸プローブのターゲット部位と
して役立ちうる１６ｓ ｒＲＮＡの領域を同定すること
を含んでいた。実際のこととして、被検サンプル中にど
の非カンピロバクター菌が存在するかを推論的に予知す
ることは困難である。
このような非カンピロバクター菌が非常に多く存在しう
るため、に、所定のプローブの十分な排他性を証明する
ことは極めて困難であり、多大の労力を要し、しかも予
測できない結果のものである。
るため、に、所定のプローブの十分な排他性を証明する
ことは極めて困難であり、多大の労力を要し、しかも予
測できない結果のものである。
プローブを用いて最終的にスクリーニングされる全ての
被検サンプル中にどのような非カンピロバクター菌が存
在しうるかを、検索および開発の初期段階において、知
る必要性を回避するために、より厳格な基準が採用され
た。これはカンピロバクタ−間の、およびカンピロバク
タ−と他の細菌グループとの間の、系統発生的関係の知
識を必要とした。排他性の基準は、もしも代表的な発生
上近縁のカンピロバクタ−類縁菌のｒＲＮＡの相同領域
と十分に異なるカンピロバクタ−ｒＲＮＡ中の特定のタ
ーゲット領域が同定されるならば、このような配列に対
するプローブは、カンピロバクタ−と類縁菌とをハイブ
リダイゼーション検定により識別するために使用できる
であろうと定めることにより満たされる、という操作上
のしかし以前には証明されていない仮説が採用された。
被検サンプル中にどのような非カンピロバクター菌が存
在しうるかを、検索および開発の初期段階において、知
る必要性を回避するために、より厳格な基準が採用され
た。これはカンピロバクタ−間の、およびカンピロバク
タ−と他の細菌グループとの間の、系統発生的関係の知
識を必要とした。排他性の基準は、もしも代表的な発生
上近縁のカンピロバクタ−類縁菌のｒＲＮＡの相同領域
と十分に異なるカンピロバクタ−ｒＲＮＡ中の特定のタ
ーゲット領域が同定されるならば、このような配列に対
するプローブは、カンピロバクタ−と類縁菌とをハイブ
リダイゼーション検定により識別するために使用できる
であろうと定めることにより満たされる、という操作上
のしかし以前には証明されていない仮説が採用された。
系統発生的観察に基づいて、その後、より遠縁の生物の
ｒＲにＡ配列は、たとえそれらの実際の本性が必ずしも
知られていなくても、上記の発生上近縁のカンピロバク
タ−類縁菌よりも配列の特定領域が予想どおりに異なる
であろうと推定された。しかしながら、そのような領域
が存在するかどうか、またそれらが存在するとしても、
このような領域がｒＲＮＡのどこに位置するのか、につ
いて准論的に予知することはできない。
ｒＲにＡ配列は、たとえそれらの実際の本性が必ずしも
知られていなくても、上記の発生上近縁のカンピロバク
タ−類縁菌よりも配列の特定領域が予想どおりに異なる
であろうと推定された。しかしながら、そのような領域
が存在するかどうか、またそれらが存在するとしても、
このような領域がｒＲＮＡのどこに位置するのか、につ
いて准論的に予知することはできない。
核酸ハイブリダイゼーションプローブの有用なターゲッ
ト部位として役立ちうるカンピロバクタ−ｒＲＮ＾の領
域を同定するための第一工程として、多数のカンピロバ
クタ一種からの１６ｓ ｒＲＮＡのほぼ完全なヌクレオ
チド配列が決定された（表２参照）。
ト部位として役立ちうるカンピロバクタ−ｒＲＮ＾の領
域を同定するための第一工程として、多数のカンピロバ
クタ一種からの１６ｓ ｒＲＮＡのほぼ完全なヌクレオ
チド配列が決定された（表２参照）。
これらはカンピロバクタ−属の系統発生幅を代表するも
のとして選ばれた。 ｒＲＮＡのいろいろな部分のヌク
レオチド配列は、クローニング（Ｍａｎｉａｔｉｓら、
１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉｎｇ： Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌコールド・スプリ
ング・バーバー研究所、ニューヨーク、ρ、５４５）、
およびｒＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列決定＜Ｍ
ａｘａｍ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、１９７７、Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ、ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃ
ａｄｅａ＋ｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ 、 ＵＳＡ ］
： ５６０〜５６４ ； Ｓａｎｇｅｒら、１９７
７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５Ｃｆｅｉｃｅ 、
ＵＳＡ ７４ ： ５４６３〜５４６７） 、および
／または逆転写酵素を用いるｒＲＮＡ自体の直接的塩基
配列決定（Ｌａｎｅら、１９８５、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＡｒ、ａｄｅａ
ｒｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ、 ｌｌ５Ａ ８１． ：
６９５５〜６９５９）により標準実験室プロトコール
を用いて決定された。
のとして選ばれた。 ｒＲＮＡのいろいろな部分のヌク
レオチド配列は、クローニング（Ｍａｎｉａｔｉｓら、
１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＩｏｎｉｎｇ： Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌコールド・スプリ
ング・バーバー研究所、ニューヨーク、ρ、５４５）、
およびｒＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列決定＜Ｍ
ａｘａｍ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、１９７７、Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ、ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃ
ａｄｅａ＋ｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ 、 ＵＳＡ ］
： ５６０〜５６４ ； Ｓａｎｇｅｒら、１９７
７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ５Ｃｆｅｉｃｅ 、
ＵＳＡ ７４ ： ５４６３〜５４６７） 、および
／または逆転写酵素を用いるｒＲＮＡ自体の直接的塩基
配列決定（Ｌａｎｅら、１９８５、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮａｔｉｏｎａｌＡｒ、ａｄｅａ
ｒｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ、 ｌｌ５Ａ ８１． ：
６９５５〜６９５９）により標準実験室プロトコール
を用いて決定された。
このようにして得られたヌクレオチド配列は相互に、お
よび他の入手しうるｒＲＮ＾ヌクレオチド配列と、特に
表１に示した細菌から誘導されたものと、比較した０表
２に示した配列の好適な領域は、これらの種に対して有
用な包括性および排他性を示しうるちのとして同定され
た。
よび他の入手しうるｒＲＮ＾ヌクレオチド配列と、特に
表１に示した細菌から誘導されたものと、比較した０表
２に示した配列の好適な領域は、これらの種に対して有
用な包括性および排他性を示しうるちのとして同定され
た。
それぞれの核酸プローブは、先に論じた望ましい特徴が
実際に得られたかどうかを厳密に立証するために別の実
験を行った：すなわち、ｌ）近縁種を含めた全ての非カ
ンピロバクター菌に対する十分な排他性；２）カンピロ
バクタ−株に対する有用な包括性パターン；および３）
実際に用いられる種々のアッセイ条件下でのターゲッＨ
１域の接近容易性、これらのプローブの排他性（特に掻
めて多種類の非カンピロバクター菌が豊富に存在するふ
ん便サンプルにおける排他性）および包括性（カンピロ
バクタ−の１５種およびバイオグループ、並びに多数の
“カンピロバクタ−様細菌°゛程度の包括性）を定める
のに関係しうる生物が極めて多数存在するので、使用可
能なプローブを検定して選別するために反復戦略が採用
された。培養生物のパネルを検定するほかに、適当な排
他性挙動をより厳密に証明すべく、約７５のカンピロバ
クタ−培養陰性ふん便被検物がプローブを用いてスクリ
ーニングされた（実施例１−特異的）。プローブはＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ｓｓ装置で標準ホスホ
ルアミダイト法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、 Ｍ、Ｈ，ら、
１９８３、Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、 ｇ集Ｉ’ａｐａｓ、Ｔ、Ｓ
、、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ 、 Ｍ、＋ Ｃｈａｒｉｋｊ
ｊａｎ、 Ｊ、Ｇ、＋発行Ｅｌｓｅｖｔｅｒ、 ニュー
ヨーク、３巻、１〜２６頁）により都合よく合成できた
。
実際に得られたかどうかを厳密に立証するために別の実
験を行った：すなわち、ｌ）近縁種を含めた全ての非カ
ンピロバクター菌に対する十分な排他性；２）カンピロ
バクタ−株に対する有用な包括性パターン；および３）
実際に用いられる種々のアッセイ条件下でのターゲッＨ
１域の接近容易性、これらのプローブの排他性（特に掻
めて多種類の非カンピロバクター菌が豊富に存在するふ
ん便サンプルにおける排他性）および包括性（カンピロ
バクタ−の１５種およびバイオグループ、並びに多数の
“カンピロバクタ−様細菌°゛程度の包括性）を定める
のに関係しうる生物が極めて多数存在するので、使用可
能なプローブを検定して選別するために反復戦略が採用
された。培養生物のパネルを検定するほかに、適当な排
他性挙動をより厳密に証明すべく、約７５のカンピロバ
クタ−培養陰性ふん便被検物がプローブを用いてスクリ
ーニングされた（実施例１−特異的）。プローブはＡｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋ｓｓ装置で標準ホスホ
ルアミダイト法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、 Ｍ、Ｈ，ら、
１９８３、Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、 ｇ集Ｉ’ａｐａｓ、Ｔ、Ｓ
、、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ 、 Ｍ、＋ Ｃｈａｒｉｋｊ
ｊａｎ、 Ｊ、Ｇ、＋発行Ｅｌｓｅｖｔｅｒ、 ニュー
ヨーク、３巻、１〜２６頁）により都合よく合成できた
。
°“ドツトプロット（ｄｏｔ ｂｌｏｔ）”分析は、公
知方法に従って１．これらの第一作製プローブの包括性
および排他性を予備的に試験するために用いられた。知
られているように、ドントブロッＩ・分析は−Ｃにこの
目的のために特別に市販されているニトロセルロース、
ナイロンまたはその他の誘導体化膜のようなフィルター
上に核酸もしくは核酸集団を固定化することを包含する
。 ＤＮＡまたはＲＮＡはこのようなフィルター上に容
易に固定され、その後いろいろな核酸ハイブリダイゼ−
ンヨン条件（すなわち、ストリンジエンシー）下で対象
の核酸プローブによるハイブリダイゼーションについて
調べられる。ターゲット配列に対してヌクレオチド配列
の相補性がより大きいプローブは、相補性がより小さい
プローブよりも、高レベルのハイブリダイゼーションを
起こすであろう、ここに記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブ（すなわち３０〜３６ヌクレオチド）の場合、６０
°Ｃで１４〜１６時間（０，９Ｍ ＨａＣｌ ０．１２
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，８，６ｓ＋Ｍ ＥＤＴ
Ａ、０．１ＶＩＫＰＯ，，０，１ｙ、ＳＤＳ 、 ０．
１χピロホスフエート、０．００２χフイ：ｌ−ル、０
．０２ＸＢｓＡおよび０．００２’！ボリビＱＪＩ／ピ
ロリドンを含むハイブリダイゼーション溶液中）ｒＲＮ
Ａターゲットにハイブリダイズさせ、続いて未結合プロ
ーブを除くために６０°Ｃで（０，０３Ｍ ＮａＣ１゜
０．００４Ｍ 丁ｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，８，０，２
ｔＭ ＥＤＴＡおよび０．１χＳＤＳを含む溶液中）１
５分間ずつ３回ボストーハイプリダイゼーシジン洗浄を
行うことが、表および実施例に示した特異性および感度
のレベルを得るのに十分なストリンジエンシーであるだ
ろう。
知方法に従って１．これらの第一作製プローブの包括性
および排他性を予備的に試験するために用いられた。知
られているように、ドントブロッＩ・分析は−Ｃにこの
目的のために特別に市販されているニトロセルロース、
ナイロンまたはその他の誘導体化膜のようなフィルター
上に核酸もしくは核酸集団を固定化することを包含する
。 ＤＮＡまたはＲＮＡはこのようなフィルター上に容
易に固定され、その後いろいろな核酸ハイブリダイゼ−
ンヨン条件（すなわち、ストリンジエンシー）下で対象
の核酸プローブによるハイブリダイゼーションについて
調べられる。ターゲット配列に対してヌクレオチド配列
の相補性がより大きいプローブは、相補性がより小さい
プローブよりも、高レベルのハイブリダイゼーションを
起こすであろう、ここに記載のオリゴヌクレオチドプロ
ーブ（すなわち３０〜３６ヌクレオチド）の場合、６０
°Ｃで１４〜１６時間（０，９Ｍ ＨａＣｌ ０．１２
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，８，６ｓ＋Ｍ ＥＤＴ
Ａ、０．１ＶＩＫＰＯ，，０，１ｙ、ＳＤＳ 、 ０．
１χピロホスフエート、０．００２χフイ：ｌ−ル、０
．０２ＸＢｓＡおよび０．００２’！ボリビＱＪＩ／ピ
ロリドンを含むハイブリダイゼーション溶液中）ｒＲＮ
Ａターゲットにハイブリダイズさせ、続いて未結合プロ
ーブを除くために６０°Ｃで（０，０３Ｍ ＮａＣ１゜
０．００４Ｍ 丁ｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，８，０，２
ｔＭ ＥＤＴＡおよび０．１χＳＤＳを含む溶液中）１
５分間ずつ３回ボストーハイプリダイゼーシジン洗浄を
行うことが、表および実施例に示した特異性および感度
のレベルを得るのに十分なストリンジエンシーであるだ
ろう。
粗製（未精製）溶菌液中に存在するＯＮ＾またはＲＮＡ
が対象の核酸を初めに精製しないで固定化され得る技法
（ここではサイトドツトと呼ぶ、例えばＭａｎｉａｔｉ
ｓ＋Ｔ、、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、およびＳａｍｂ
ｒｏｏｋ、Ｊ、１９８２＋ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌを参照）も利用できる。この後者の手
法は特定の核酸中に存在しうる特定の生物の ヌクレオ
チド配列をスクリーニングするのに要する労力を相当に
低減させ、さらに多数の生物のマススクリーニングを有
利に行わせしめる。従ってそれは多数の生物に対する核
酸ハイブリダイゼーションプローブの排他性および包括
性スクリーニングのための最適な方法である。
が対象の核酸を初めに精製しないで固定化され得る技法
（ここではサイトドツトと呼ぶ、例えばＭａｎｉａｔｉ
ｓ＋Ｔ、、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、およびＳａｍｂ
ｒｏｏｋ、Ｊ、１９８２＋ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌを参照）も利用できる。この後者の手
法は特定の核酸中に存在しうる特定の生物の ヌクレオ
チド配列をスクリーニングするのに要する労力を相当に
低減させ、さらに多数の生物のマススクリーニングを有
利に行わせしめる。従ってそれは多数の生物に対する核
酸ハイブリダイゼーションプローブの排他性および包括
性スクリーニングのための最適な方法である。
カンピロバクタ−を含むサンプル中に存在しうる細菌の
型を示す非カンピロバクター菌の一覧表を実施例４に示
す、先に諭したように、このように広い表示の細菌に対
して良好な排他性を示すプローブは、より広い表示のよ
り遠縁の腸内細菌に対して同様にふるまうことが予測さ
れる。この予測は実施例１−特異的（ここでは好適なプ
ローブ（好適なアッセイ系を使用）がＥＭした７５のカ
ンピロバクタ−培養陰性ふん便の被検物のうち７５に存
在する非カンピロバクター菌のいずれとも交差反応しな
かった）に示すデータによって裏付けられる。
型を示す非カンピロバクター菌の一覧表を実施例４に示
す、先に諭したように、このように広い表示の細菌に対
して良好な排他性を示すプローブは、より広い表示のよ
り遠縁の腸内細菌に対して同様にふるまうことが予測さ
れる。この予測は実施例１−特異的（ここでは好適なプ
ローブ（好適なアッセイ系を使用）がＥＭした７５のカ
ンピロバクタ−培養陰性ふん便の被検物のうち７５に存
在する非カンピロバクター菌のいずれとも交差反応しな
かった）に示すデータによって裏付けられる。
いくつかの他の事柄もプローブの最適なデザイン特性に
影響を及ぼす、第一の考慮すべき事柄はプローブ自体に
関するプローブの形状（すなわち、分子内相互作用）で
ある、 １６ｓおよび２３ｓ ｒＲＮＡの有用なターゲ
ット配列は、大抵の場合、自己相補性の多大の可能性を
示す領域に位置することが見出された。その結果、これ
らの領域に対するプローブは十分に長くなければならず
、またターゲット分子それ自体の二次構造と競うに適し
た形状をしていなければならない。第二に、このようよ
な（明確な構造をもつ）ターゲットＨ域に対するプロー
ブもまた自己相補性を示すことがある。プローブとター
ゲット配列との起こりうる相互作用は、ターゲットまた
はプローブ配列のそれら自体への分子内アニーリングを
支配するパラメーターと同し型のパラメーターによって
支配されるので、自己相補的プローブは、特に溶液ハイ
ブリダイゼーション条件下で、それらのターゲット配列
へのハイブリダイゼーションのために接近し難くなるか
もしれない。従って、プローブデザインの１つの重要な
面はこのような自己相補性を最小限度に抑えることであ
る。それにはカンピロバクタ−特異的配列の最大利用と
許容しうるプローブ形状との間で妥協することが必要に
なる。
影響を及ぼす、第一の考慮すべき事柄はプローブ自体に
関するプローブの形状（すなわち、分子内相互作用）で
ある、 １６ｓおよび２３ｓ ｒＲＮＡの有用なターゲ
ット配列は、大抵の場合、自己相補性の多大の可能性を
示す領域に位置することが見出された。その結果、これ
らの領域に対するプローブは十分に長くなければならず
、またターゲット分子それ自体の二次構造と競うに適し
た形状をしていなければならない。第二に、このようよ
な（明確な構造をもつ）ターゲットＨ域に対するプロー
ブもまた自己相補性を示すことがある。プローブとター
ゲット配列との起こりうる相互作用は、ターゲットまた
はプローブ配列のそれら自体への分子内アニーリングを
支配するパラメーターと同し型のパラメーターによって
支配されるので、自己相補的プローブは、特に溶液ハイ
ブリダイゼーション条件下で、それらのターゲット配列
へのハイブリダイゼーションのために接近し難くなるか
もしれない。従って、プローブデザインの１つの重要な
面はこのような自己相補性を最小限度に抑えることであ
る。それにはカンピロバクタ−特異的配列の最大利用と
許容しうるプローブ形状との間で妥協することが必要に
なる。
プローブデザインにおける第二の考慮すべき事柄は包括
性の基準に関して生起する。好適なプローブは、適当な
排他性挙動を示すが、全ての希望するカンピロ１バクタ
ー閑のｒＲＮＡにハイブリダイズし得るものである。カ
ンピロバクタ−属それ自体は様々な表現型および遺伝子
型（後述するように、ｒＲＮＡを含む）を示す細菌から
成るので、“理想的“なプローブのデザインは非常に困
難なことである。
性の基準に関して生起する。好適なプローブは、適当な
排他性挙動を示すが、全ての希望するカンピロ１バクタ
ー閑のｒＲＮＡにハイブリダイズし得るものである。カ
ンピロバクタ−属それ自体は様々な表現型および遺伝子
型（後述するように、ｒＲＮＡを含む）を示す細菌から
成るので、“理想的“なプローブのデザインは非常に困
難なことである。
実際に、単一の“普遍的パなカンピロバクタ−プローブ
を検索するよりもむしろ、それぞれのプローブが有用な
水準の包括性と共に適当な排他性を示す一組のカンピロ
バクタ−特異的プローブを検索する方が好ましい、全体
として、好適なプローブセットは理想的には大部分また
は全部のカンピロバクタ−を検出するが、非カンピロバ
クター菌を検出しないであろう、このようなプローブセ
ットでは、例えば、一方のプローブが１つまたは２３の
重要なカンピロバクタ−株以外の全部を検出でき、他方
のプローブが第一プローブによって検出されなかった２
、３のカンピロバクタ−株にのみハイブリダイズできる
。こうして、下記のプローブは包括性に関して個々に特
徴づけられるが、先に詳述した特異的プローブの“セッ
ト”の概念は好ましくは、個々のプローブの重要性を定
める際に、およびアッセイキットを作製する際に考慮さ
れることが理解されるであろう。
を検索するよりもむしろ、それぞれのプローブが有用な
水準の包括性と共に適当な排他性を示す一組のカンピロ
バクタ−特異的プローブを検索する方が好ましい、全体
として、好適なプローブセットは理想的には大部分また
は全部のカンピロバクタ−を検出するが、非カンピロバ
クター菌を検出しないであろう、このようなプローブセ
ットでは、例えば、一方のプローブが１つまたは２３の
重要なカンピロバクタ−株以外の全部を検出でき、他方
のプローブが第一プローブによって検出されなかった２
、３のカンピロバクタ−株にのみハイブリダイズできる
。こうして、下記のプローブは包括性に関して個々に特
徴づけられるが、先に詳述した特異的プローブの“セッ
ト”の概念は好ましくは、個々のプローブの重要性を定
める際に、およびアッセイキットを作製する際に考慮さ
れることが理解されるであろう。
プローブのデザインおよび分析の層材工程は、実際の（
例えば、食品／臨床／環境）サンプルを試験し、その後
望ましい性質が実際のアッセイ条件下で最適化されるよ
うに、最終的なプローブセット用の適当なプローブを選
択することから成っている。
例えば、食品／臨床／環境）サンプルを試験し、その後
望ましい性質が実際のアッセイ条件下で最適化されるよ
うに、最終的なプローブセット用の適当なプローブを選
択することから成っている。
プローブ
前記のプローブ選択の戦略はサンプル中のカンピロバク
タ−菌を同定するのに有用なプローブを数多くもたらし
た０表の筒車な説明の項で概説したように、表２は代表
的なカンピロバクタ−株のｒＲＮＡ中のそれらのターゲ
ット部位において整列されたプローブ配列を示す０表２
Ａ〜２Ｄは好適なプローブを詳述するものである。
タ−菌を同定するのに有用なプローブを数多くもたらし
た０表の筒車な説明の項で概説したように、表２は代表
的なカンピロバクタ−株のｒＲＮＡ中のそれらのターゲ
ット部位において整列されたプローブ配列を示す０表２
Ａ〜２Ｄは好適なプローブを詳述するものである。
表３は種々のカンピロバクタ−および非カンピロバクタ
ー菌の“サイトプロッピに対するプローブのハイブリダ
イゼーション挙動を示す。この実験では、プローブは検
出および定量化のために３２ｐで放射性ｐＪ議された。
ー菌の“サイトプロッピに対するプローブのハイブリダ
イゼーション挙動を示す。この実験では、プローブは検
出および定量化のために３２ｐで放射性ｐＪ議された。
ハイブリダイゼーション条件は上述したハイブリダイゼ
ーション溶液中６０’Ｃで１４〜１６時間ハイブリダイ
ズさせることがら成っていた。
ーション溶液中６０’Ｃで１４〜１６時間ハイブリダイ
ズさせることがら成っていた。
しかしながら、より高度なストリンジエンシーのアッセ
イ系を用いる場合は、同程度の感度（ハイブリダイゼー
ション効率）を維持するために、より長いプローブの使
用が望ましいことは容易に理解されるであろう。
イ系を用いる場合は、同程度の感度（ハイブリダイゼー
ション効率）を維持するために、より長いプローブの使
用が望ましいことは容易に理解されるであろう。
表２Ａはカンピロバクタ−１６Ｓ ｒＲＮＡの１２４〜
２２５’Ｊ域（Ｅ．Ｃｏｌｉの位置の番号付けを使用）
をターゲットとした４種のプローブを示す、３４５およ
び３４６と呼ばれるプローブはまたそれぞれＡｌ１１９
７およびＡＲ１９６という名称のもとで同定された０両
方のプローブはカンピロバクタ−属の細菌由来のｒＲＮ
Ａに特異的にハイブリダイズすることが立証された。
２２５’Ｊ域（Ｅ．Ｃｏｌｉの位置の番号付けを使用）
をターゲットとした４種のプローブを示す、３４５およ
び３４６と呼ばれるプローブはまたそれぞれＡｌ１１９
７およびＡＲ１９６という名称のもとで同定された０両
方のプローブはカンピロバクタ−属の細菌由来のｒＲＮ
Ａに特異的にハイブリダイズすることが立証された。
いくつかの高感度アッセイ系において、プローブ３４５
および３４６は通常のふん便サンプル中に存在する若干
の非カンピロバクター菌に対して望ましくない交差ハイ
ブリダイゼーションを示し、従ってこれらのプローブは
あまり好ましくない。別の配列分析に基づいて、プロー
ブ９９９および７３２が考案されて、試験された。これ
らは“親”プローブよりも短かく （プローブ３４５お
よび３４６が５０ヌクレオチド長であるのに対して、そ
れぞれ３１および３５ヌクレオチド長である）、またそ
れらは１６ＳｒＲＮＡ １２４〜２２５領域に存在する
カンピロバクタ−特異的配列位置の異なる部分を利用し
ているために、このターゲット領域の熱力学的に有利な
二次構造に対してプローブ３４５および３４６とはやや
異なる関係を有している。全体として、プローブ９９９
および７３２は有利にもカンピロバクタ−のターゲット
種（Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ 、 Ｃ，ｃｏｌｉおよびＣ，１
ａｒｉｄｉｓ）に対して等しい（すなわち、完全な）包
括性を示し、かつプローブ３４５および３４６によって
示されたものに比べて改良された排他性を示す、プロー
ブ９９９および７３２は非−Ｃ，ｊｅｊｕｎｉＳＣ，ｃ
ｏｌｉおよびＣ，ｊａｒｉｄｉｓへの存意に少ないハイ
ブリダイゼーションを示すが、これは目下好適なアッセ
イ系において改良された排他性を与える許容しうる妥協
のため（また、ふん便中の種々のカンピロバクタ一種の
相対的発生率−Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ ＞Ｃ，ｃｏｌｉ ＞
Ｃ，１ａｒｉｄｉｓ＞＞＞他の全てのカンピロバクター
−のため）であると考えられる。
および３４６は通常のふん便サンプル中に存在する若干
の非カンピロバクター菌に対して望ましくない交差ハイ
ブリダイゼーションを示し、従ってこれらのプローブは
あまり好ましくない。別の配列分析に基づいて、プロー
ブ９９９および７３２が考案されて、試験された。これ
らは“親”プローブよりも短かく （プローブ３４５お
よび３４６が５０ヌクレオチド長であるのに対して、そ
れぞれ３１および３５ヌクレオチド長である）、またそ
れらは１６ＳｒＲＮＡ １２４〜２２５領域に存在する
カンピロバクタ−特異的配列位置の異なる部分を利用し
ているために、このターゲット領域の熱力学的に有利な
二次構造に対してプローブ３４５および３４６とはやや
異なる関係を有している。全体として、プローブ９９９
および７３２は有利にもカンピロバクタ−のターゲット
種（Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ 、 Ｃ，ｃｏｌｉおよびＣ，１
ａｒｉｄｉｓ）に対して等しい（すなわち、完全な）包
括性を示し、かつプローブ３４５および３４６によって
示されたものに比べて改良された排他性を示す、プロー
ブ９９９および７３２は非−Ｃ，ｊｅｊｕｎｉＳＣ，ｃ
ｏｌｉおよびＣ，ｊａｒｉｄｉｓへの存意に少ないハイ
ブリダイゼーションを示すが、これは目下好適なアッセ
イ系において改良された排他性を与える許容しうる妥協
のため（また、ふん便中の種々のカンピロバクタ一種の
相対的発生率−Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ ＞Ｃ，ｃｏｌｉ ＞
Ｃ，１ａｒｉｄｉｓ＞＞＞他の全てのカンピロバクター
−のため）であると考えられる。
それ故に、プローブ７３２および９９９は前記の包括性
および排他性挙動のために、そしてまたそれらの見掛は
感度のために、ここに記載された最適なプローブである
。プローブ７３２および９９９のハイブリダイゼーシジ
ン挙動は表３および実施例１〜４に詳述される０表３は
サイトドツト法での個々のプローブの挙動を示す、実施
例１〜４は最適の二重特異的液体ハイブリダイゼーショ
ンにおいて併用されたプローブのハイブリダイゼーショ
ン挙動を詳述している。
および排他性挙動のために、そしてまたそれらの見掛は
感度のために、ここに記載された最適なプローブである
。プローブ７３２および９９９のハイブリダイゼーシジ
ン挙動は表３および実施例１〜４に詳述される０表３は
サイトドツト法での個々のプローブの挙動を示す、実施
例１〜４は最適の二重特異的液体ハイブリダイゼーショ
ンにおいて併用されたプローブのハイブリダイゼーショ
ン挙動を詳述している。
二重特異的アッセイ系（以下で詳述する一実施例１）で
は、ポジティブの結果を得るために両方のプローブのハ
イブリダイゼーションが必要であることに気づく、従っ
て、このアッセイ系においては、いずれかのプローブ単
独による望ましくないハイブリダイゼーシぢン（すなわ
ち、非カンピロバクタ−へのハイブリダイゼーション）
の影響が無くならないにしても、有意に減ぜられる。
は、ポジティブの結果を得るために両方のプローブのハ
イブリダイゼーションが必要であることに気づく、従っ
て、このアッセイ系においては、いずれかのプローブ単
独による望ましくないハイブリダイゼーシぢン（すなわ
ち、非カンピロバクタ−へのハイブリダイゼーション）
の影響が無くならないにしても、有意に減ぜられる。
表２Ｂはカンピロバクタ−１６３ｒＲＮＡの３９１〜５
０１領域（Ｅ．Ｃｏｌｉの位置の番号付けを使用）をタ
ーゲットとした、１１０４および１１０５と呼ばれる２
つのプローブを記述している。プローブ１１０４はこれ
までに試験した全てのＣ，Ｌｅｊｕｎｉ（５）、Ｃ，ｃ
ｏｌｉ（３１およびＣ０Ｉａｒｉｄｉｓ （５）にハイ
ブリダイズし、さらに部分的に同定された臨床単離物（
主としてＣ，ｊｅｊｕｎｉ）６２のうち５８にハイブリ
ダイズする。それはまた全てではないにしても多数の他
のカンピロバクタ一種にもハイブリダイズする。試験し
た非カンピロバクタ−のうち、Ｗ、ｃｕｒｖａのみがプ
ローブ１１０４によって有意な程度に検出される。プロ
ーブ１１０５はこれまでに試験した全てのカンピロバク
タ−株および種にハイブリダイズする。それはまた表１
および２に示したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよび−ｏｌ
ｉｎｅｌｌａ株にもハイブリダイズするが、腸内細菌株
の［！．Ｃｏｌｉ、 Ｓ。
０１領域（Ｅ．Ｃｏｌｉの位置の番号付けを使用）をタ
ーゲットとした、１１０４および１１０５と呼ばれる２
つのプローブを記述している。プローブ１１０４はこれ
までに試験した全てのＣ，Ｌｅｊｕｎｉ（５）、Ｃ，ｃ
ｏｌｉ（３１およびＣ０Ｉａｒｉｄｉｓ （５）にハイ
ブリダイズし、さらに部分的に同定された臨床単離物（
主としてＣ，ｊｅｊｕｎｉ）６２のうち５８にハイブリ
ダイズする。それはまた全てではないにしても多数の他
のカンピロバクタ一種にもハイブリダイズする。試験し
た非カンピロバクタ−のうち、Ｗ、ｃｕｒｖａのみがプ
ローブ１１０４によって有意な程度に検出される。プロ
ーブ１１０５はこれまでに試験した全てのカンピロバク
タ−株および種にハイブリダイズする。それはまた表１
および２に示したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓおよび−ｏｌ
ｉｎｅｌｌａ株にもハイブリダイズするが、腸内細菌株
の［！．Ｃｏｌｉ、 Ｓ。
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ＋ｗ （ネズミチフス菌）など
にはハイブリダイズしない、プローブ１１０５またはそ
の誘導体は、そのハイブリダイゼーション挙動により、
表１に示したカンピロバクタ−および”類縁菌”の全グ
ループの同定／検出に最も役立つ°°広範囲特異的”プ
ローブでありうる。この全グループは、いろいろな遺伝
子および生化学的基準によって、他の全ての細菌から完
全に区別されることに留意されたい、天然サンプル（例
えば臨床、食品または環境サンプル）中のそのグループ
の細菌の存在を検出するのに有用なプローブまたはプロ
ーブセントは、これらのまだ十分には解明されていない
細菌の発生および疫学を研究する上で、価値ある検索手
段となるだろう。非−Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，ｃｏｌ
ｉおよびＣ，Ｉａｒｉｄｉｓの多くは分離または培養す
るのが非常に困難であるので、環境中でのそれらの伝播
またはヒトや動物の病気とそれらとの関係についてはあ
まり知られていない。これらのプローブはこのような理
解を得るのにを用な道具として役立つであろう。
にはハイブリダイズしない、プローブ１１０５またはそ
の誘導体は、そのハイブリダイゼーション挙動により、
表１に示したカンピロバクタ−および”類縁菌”の全グ
ループの同定／検出に最も役立つ°°広範囲特異的”プ
ローブでありうる。この全グループは、いろいろな遺伝
子および生化学的基準によって、他の全ての細菌から完
全に区別されることに留意されたい、天然サンプル（例
えば臨床、食品または環境サンプル）中のそのグループ
の細菌の存在を検出するのに有用なプローブまたはプロ
ーブセントは、これらのまだ十分には解明されていない
細菌の発生および疫学を研究する上で、価値ある検索手
段となるだろう。非−Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，ｃｏｌ
ｉおよびＣ，Ｉａｒｉｄｉｓの多くは分離または培養す
るのが非常に困難であるので、環境中でのそれらの伝播
またはヒトや動物の病気とそれらとの関係についてはあ
まり知られていない。これらのプローブはこのような理
解を得るのにを用な道具として役立つであろう。
表２０はカンピロバクタ−１６３ｒＲＮＡの９７３−１
０４９ｅＪ域（［！．Ｃｏｌｉの位置の番号付けを使用
）をターゲットとした、１１３０．１１３２および１１
３３と呼ばれる３種のプローブを記述している。全ての
プローブは試験したＣ、ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，ｃｏｌｉ
およびＣ，Ｉａｒｊｄｉｓに対して十分な包括生を示し
く表３）、さらに６２全部の臨床単離物を検出する。少
数の非−ｊｅｊｕｎｉ、 ｃｏｌｉマタは１ａｒｉｄｉ
ｓカンピロバクタ−株への限定されたハイブリダイゼー
ションが使用したハイブリダイゼーション条件下でこの
領域に対して３種のプローブすべてによって示される。
０４９ｅＪ域（［！．Ｃｏｌｉの位置の番号付けを使用
）をターゲットとした、１１３０．１１３２および１１
３３と呼ばれる３種のプローブを記述している。全ての
プローブは試験したＣ、ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，ｃｏｌｉ
およびＣ，Ｉａｒｊｄｉｓに対して十分な包括生を示し
く表３）、さらに６２全部の臨床単離物を検出する。少
数の非−ｊｅｊｕｎｉ、 ｃｏｌｉマタは１ａｒｉｄｉ
ｓカンピロバクタ−株への限定されたハイブリダイゼー
ションが使用したハイブリダイゼーション条件下でこの
領域に対して３種のプローブすべてによって示される。
これらのプローブはすべて優れた排他性挙動を示し、カ
ンピロバクタ−特異的プローブとして極めて有用である
ように思われる。
ンピロバクタ−特異的プローブとして極めて有用である
ように思われる。
プローブ１１３２および１１３３は１つの位置でのみ相
違することに注意されたい。この相違はこの位置でのタ
ーゲットカンピロバクタ−間に観察された異質性（ｈｅ
ｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を反映している。
違することに注意されたい。この相違はこの位置でのタ
ーゲットカンピロバクタ−間に観察された異質性（ｈｅ
ｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を反映している。
表２Ｃの説明文中で最初に言及した類似体−〇は、その
Ｃ−４位置が１，３−プロパンジアミン側鎖で修飾され
た２′−デオキシシチジンである（ＳｃｈｕｌｍａｎＬ
、ｌ＋、 ら、 １９８１． Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓ
Ｒｅｓ、、ｉ、 １２０３〜１２１７）。
Ｃ−４位置が１，３−プロパンジアミン側鎖で修飾され
た２′−デオキシシチジンである（ＳｃｈｕｌｍａｎＬ
、ｌ＋、 ら、 １９８１． Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓ
Ｒｅｓ、、ｉ、 １２０３〜１２１７）。
この化合物はＣａｒｕ ｔｈｅｒｓによって開発された
固相合成法を用いてＤＮＡプローブに組み込むことので
きるホスホルアミダイトに転化される（Ｃａｒｕ ｔｈ
ｅｒｓ？１．Ｈ，ら、１９８２、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 、、５ｅｔｉｏｉｉ、Ａ。
固相合成法を用いてＤＮＡプローブに組み込むことので
きるホスホルアミダイトに転化される（Ｃａｒｕ ｔｈ
ｅｒｓ？１．Ｈ，ら、１９８２、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ 、、５ｅｔｉｏｉｉ、Ａ。
およびＨｏ１ｌａｅｎｄｅｒ、Ｊ、に、 （４９集）
、Ｖｏｌ、４ 、ｐ、 １〜１７、ＰｌｅｎｕＴ＠Ｐ
ｒｅｓｓ、 Ｑニーヨーク）。その後この第一アミンは
、例えば合成オリゴヌクレオチドの検出に用いられるビ
オチンまたはフルオレセインリガンドにより、選択的に
誘導体化される（Ｒａｓｈｔｃｈｌａｎ、 Ａ、ら、１
９８７、Ｃｌ１ｎ、 Ｃｈｅｓ＋、＋ ３３／！Ｌ１５
２６〜１５３０） 。
、Ｖｏｌ、４ 、ｐ、 １〜１７、ＰｌｅｎｕＴ＠Ｐ
ｒｅｓｓ、 Ｑニーヨーク）。その後この第一アミンは
、例えば合成オリゴヌクレオチドの検出に用いられるビ
オチンまたはフルオレセインリガンドにより、選択的に
誘導体化される（Ｒａｓｈｔｃｈｌａｎ、 Ａ、ら、１
９８７、Ｃｌ１ｎ、 Ｃｈｅｓ＋、＋ ３３／！Ｌ１５
２６〜１５３０） 。
表２ＤはプローブＡＲ３５１として先に記載された３５
１を含む２種のプローブを記述している。他方のプロー
ブ１１３４はプローブ３５１から誘導されたものであっ
てプローブ３５１より短いが、カンピロバクタ−１６Ｓ
ｒＲＮＡ中の同一の新規構造要素を利用している。３５
１および１１３４は両方ともカンピロバクタ−１６ｓ
ｒＲＮＡの１４２４−１４８ＨＩ域をターゲットとして
いる０表２Ｄにおいて、プローブ３５１および１１３４
のターゲット分子の中央付近に、カンピロバクタ−ｒＲ
ＮＡはこの領域のＥ．Ｃｏｌｉ配列に対して６ヌクレオ
チドの保存的欠失をもつことに注目されたい、ε。
１を含む２種のプローブを記述している。他方のプロー
ブ１１３４はプローブ３５１から誘導されたものであっ
てプローブ３５１より短いが、カンピロバクタ−１６Ｓ
ｒＲＮＡ中の同一の新規構造要素を利用している。３５
１および１１３４は両方ともカンピロバクタ−１６ｓ
ｒＲＮＡの１４２４−１４８ＨＩ域をターゲットとして
いる０表２Ｄにおいて、プローブ３５１および１１３４
のターゲット分子の中央付近に、カンピロバクタ−ｒＲ
ＮＡはこの領域のＥ．Ｃｏｌｉ配列に対して６ヌクレオ
チドの保存的欠失をもつことに注目されたい、ε。
ｃｏｌｉの構造は大多数の真正細菌によって示される構
造を代表しており、従ってプローブ１１３４をカンピロ
バクタ−に対し特異的なものにしている。カンピロバク
タ−間およびカンピロバクタ−とＢａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓＳＷｏｌｉｎｅｌｌａなどとの間に見られるこの欠失
部位近辺の更なるヌクレオチド変異は、プローブ１１３
４および３５１のハイブリダイゼーションをカンピロバ
クタ−のＣ，ｊｅｊｕｎｉｓ Ｃ，ｃｏｌｉおよびＣ１
Ｉａｒｉｄｉｓグループに限定するのに役立っている。
造を代表しており、従ってプローブ１１３４をカンピロ
バクタ−に対し特異的なものにしている。カンピロバク
タ−間およびカンピロバクタ−とＢａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓＳＷｏｌｉｎｅｌｌａなどとの間に見られるこの欠失
部位近辺の更なるヌクレオチド変異は、プローブ１１３
４および３５１のハイブリダイゼーションをカンピロバ
クタ−のＣ，ｊｅｊｕｎｉｓ Ｃ，ｃｏｌｉおよびＣ１
Ｉａｒｉｄｉｓグループに限定するのに役立っている。
２．３の他のカンピロバクタ−への若干の限定されたハ
イブリダイゼーションがドツトプロットにおいて検出さ
れるが（表３）、非カンピロバクタ−へのハイブリダイ
ゼーションは全く検出されない。
イブリダイゼーションがドツトプロットにおいて検出さ
れるが（表３）、非カンピロバクタ−へのハイブリダイ
ゼーションは全く検出されない。
実施例Ｉ−全体的：ホモポリマー捕獲、二重プローブ液
体ハイブリダイゼーション法 カンピロバクタ−および／または非カンピロバクター菌
を含む培養物を適当を培地で増着させ、次いで多数、の
適当な溶菌剤（例えば、Ｎａ０ｌｌ、グアニジン塩、洗
剤、酵素処理、またはそれらのいくつかの組合せ）のう
ちいずれかを用いて核酸を放出させる。ハイブリダイゼ
ーションは２つの異なるプローブまたはプローブセット
（そのうちの少なくとも１つは、両方である必要はない
が、検出しようとする生物に特異的でなければならない
）を用いて実施される０本実施例において、カンピロバ
クタ−特異的゛捕獲”プローブ７３２はその３′末端に
２０〜２００デオキシアデノシン（ｄＡ）残基を酵素的
に付加され、そしてリポータ−プローブ９９９は捕獲さ
れたターゲット分子を検出するための放射性リン（ｆｆ
！ｐ）または他の小型リガンド（例えば、フルオレセイ
ンまたはビオチン、この実験では前者を用いる）で化学
的または酵素的に標識される。
体ハイブリダイゼーション法 カンピロバクタ−および／または非カンピロバクター菌
を含む培養物を適当を培地で増着させ、次いで多数、の
適当な溶菌剤（例えば、Ｎａ０ｌｌ、グアニジン塩、洗
剤、酵素処理、またはそれらのいくつかの組合せ）のう
ちいずれかを用いて核酸を放出させる。ハイブリダイゼ
ーションは２つの異なるプローブまたはプローブセット
（そのうちの少なくとも１つは、両方である必要はない
が、検出しようとする生物に特異的でなければならない
）を用いて実施される０本実施例において、カンピロバ
クタ−特異的゛捕獲”プローブ７３２はその３′末端に
２０〜２００デオキシアデノシン（ｄＡ）残基を酵素的
に付加され、そしてリポータ−プローブ９９９は捕獲さ
れたターゲット分子を検出するための放射性リン（ｆｆ
！ｐ）または他の小型リガンド（例えば、フルオレセイ
ンまたはビオチン、この実験では前者を用いる）で化学
的または酵素的に標識される。
一般的に、培養／純化後、被検サンプル中に存在する細
菌は少量のアリコートに分けて試験管に移す。溶菌した
後、捕獲および検出用プローブを加え、以下（実施例１
−特異的）に示すような適当な溶液中適当な温度でハイ
ブリダイゼーションを進行させる。その後、ターゲット
／プローブ複合体を含む溶液は１５〜３０００ヌクレオ
チド長のデオキシチミジン（ｄＴ）を結合させた表面に
、ｄＡとｄＴをハイブリダイズさせる条件下で接触させ
る０本実施例では、ターゲット／プローブ溶液中に浸漬
させるプラスチック製の゛浸漬片（ｄｌｐｓｔｉｃｋ）
’にｄＴを結合させた。カンピロバクタ−リポソームｌ
？ＮＡが被検サンプル中に存在する場合、ｄＡ付加した
カンピロバクタ−特異的捕獲プローブは存在するターゲ
ットｒＲＮＡ配列にハイブリダイズし、続いて浸漬片上
に捕獲されるであろう、ハイブリダイズされなかった核
酸および細胞破片は以下で述べるように洗い落とされ、
ｄＡ−ｄ？２本鎖定本って表面に結合された捕ｌＤＮＡ
−ＲＮＡ複合体が残る。リポータ−プローブもまた、正
しいターゲット分子が存在するときだけ、相互作用の鎖
−捕獲表面−ｄＴ ： ｄＡ捕獲プローブ：ターゲット
：リポータ−プローブ−を介して浸漬片に結合される。
菌は少量のアリコートに分けて試験管に移す。溶菌した
後、捕獲および検出用プローブを加え、以下（実施例１
−特異的）に示すような適当な溶液中適当な温度でハイ
ブリダイゼーションを進行させる。その後、ターゲット
／プローブ複合体を含む溶液は１５〜３０００ヌクレオ
チド長のデオキシチミジン（ｄＴ）を結合させた表面に
、ｄＡとｄＴをハイブリダイズさせる条件下で接触させ
る０本実施例では、ターゲット／プローブ溶液中に浸漬
させるプラスチック製の゛浸漬片（ｄｌｐｓｔｉｃｋ）
’にｄＴを結合させた。カンピロバクタ−リポソームｌ
？ＮＡが被検サンプル中に存在する場合、ｄＡ付加した
カンピロバクタ−特異的捕獲プローブは存在するターゲ
ットｒＲＮＡ配列にハイブリダイズし、続いて浸漬片上
に捕獲されるであろう、ハイブリダイズされなかった核
酸および細胞破片は以下で述べるように洗い落とされ、
ｄＡ−ｄ？２本鎖定本って表面に結合された捕ｌＤＮＡ
−ＲＮＡ複合体が残る。リポータ−プローブもまた、正
しいターゲット分子が存在するときだけ、相互作用の鎖
−捕獲表面−ｄＴ ： ｄＡ捕獲プローブ：ターゲット
：リポータ−プローブ−を介して浸漬片に結合される。
結合されたリガンド誘導体化（例えば、フルオレセイン
化）リボ−タープリープはその後、リガンド結合性酵素
複合体（例えば、本実施例では西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合抗フルオレセイン抗体）の添加により検出され
る。検出複合体の特異的結合を可能にする条件下でイン
キエベーションし、未結合酵素を洗い落とし、発色性基
質を添加し、その結果として発色させ（一般には２０〜
３０分）、場合により発色終止液を加えた後、色の濃さ
を比色定置法により測定する。この読取り（一般には０
．１→２．０吸光単位の範囲）はネガティブ対照レベル
と比較し、闇値またはカットオフ値を定め、そして実験
レベルの“有意性”の決定を行う。
化）リボ−タープリープはその後、リガンド結合性酵素
複合体（例えば、本実施例では西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ結合抗フルオレセイン抗体）の添加により検出され
る。検出複合体の特異的結合を可能にする条件下でイン
キエベーションし、未結合酵素を洗い落とし、発色性基
質を添加し、その結果として発色させ（一般には２０〜
３０分）、場合により発色終止液を加えた後、色の濃さ
を比色定置法により測定する。この読取り（一般には０
．１→２．０吸光単位の範囲）はネガティブ対照レベル
と比較し、闇値またはカットオフ値を定め、そして実験
レベルの“有意性”の決定を行う。
２隻班土ニ立異句
臨床ふん便被検物の場合、サンプル１ｇをカンピロバク
タ−ふん便処理緩衝液（３，２５１１グアニジンチオシ
アネート、０．４Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＺ（７，５）
、０．０８ＭＥＤＴＡ、 １３χデキストラン硫酸５０
００．０．３２５χサルコシル）３ｄに加えて、サンプ
ルが均質になるまでボルデノクス混合した。
タ−ふん便処理緩衝液（３，２５１１グアニジンチオシ
アネート、０．４Ｍ Ｔｒｉｓ−１１ＣＺ（７，５）
、０．０８ＭＥＤＴＡ、 １３χデキストラン硫酸５０
００．０．３２５χサルコシル）３ｄに加えて、サンプ
ルが均質になるまでボルデノクス混合した。
それぞれのハイブリダイゼーションのために処理済みサ
ンプル０．７０ａＮを使用した。各サンプルから放出さ
れた核酸は０．０５−の特異的な捕獲／検出プローブ（
１，０ｔｓ／ｌｔｄの好適な捕獲プローブ７３２および
０．５ｎ／ｄの検出プローブ９９９−ＦＩＴＣを含む）
の添加により検出した。捕獲用浸漬片をそれぞれの試験
管（溶菌液と特異的プローブを含む）に入れた。内容物
は３７°Ｃの水浴中で６０分間インキュベーションして
、特異的捕獲／リポータ−プローブのターゲット核酸へ
のハイブリダイゼーション、およびこれらの特異的［Ｉ
Ｎ八へｒＲＮＡハイブリッドの上記浸漬片への捕獲を行
わせた。
ンプル０．７０ａＮを使用した。各サンプルから放出さ
れた核酸は０．０５−の特異的な捕獲／検出プローブ（
１，０ｔｓ／ｌｔｄの好適な捕獲プローブ７３２および
０．５ｎ／ｄの検出プローブ９９９−ＦＩＴＣを含む）
の添加により検出した。捕獲用浸漬片をそれぞれの試験
管（溶菌液と特異的プローブを含む）に入れた。内容物
は３７°Ｃの水浴中で６０分間インキュベーションして
、特異的捕獲／リポータ−プローブのターゲット核酸へ
のハイブリダイゼーション、およびこれらの特異的［Ｉ
Ｎ八へｒＲＮＡハイブリッドの上記浸漬片への捕獲を行
わせた。
ハイブリダイゼーション後、浸漬片はその活性ｄＴ被覆
部分をおおうのに十分な洗液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ。
部分をおおうのに十分な洗液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ。
ｐＨ７，５，１５０ｍＭ ＮａＣ１ｈＭ ＥＤＴＡおよ
び０．１χ↑−ｅｅｎ２０、室温）を含む洗浄浴中に１
分間浸漬することにより洗った。
び０．１χ↑−ｅｅｎ２０、室温）を含む洗浄浴中に１
分間浸漬することにより洗った。
洗浄した浸漬片は洗浄浴から取り出し、吸収紙で吸い取
って乾かし、０．７５ｄの抗体−酵素複合体（抗フルオ
レセインー西洋ワサビペルオキシダーゼを洗浄媛街液で
希釈したもの）を含む１組の試験管に入れ１、その後室
温で２０分間インキュベーションを行った。
って乾かし、０．７５ｄの抗体−酵素複合体（抗フルオ
レセインー西洋ワサビペルオキシダーゼを洗浄媛街液で
希釈したもの）を含む１組の試験管に入れ１、その後室
温で２０分間インキュベーションを行った。
抗原−抗体反応を起こさせた後、浸漬片を試験管から取
り出し、先の２つの段落において記載した方法と同じ方
法で洗浄し、乾かした。その浸漬片は基質−色原体混合
物（尿素−ペルオキシド：テトラメチルベンジジン〔ν
ｅｎｔｒｅｘ １．メイン州ポートランド）、２１）を
含む１＆Ｉｌのレベルを付けた試験管に入れ、室温で２
０分間インキュベーションした。その後浸漬片を取り出
し、０．２５＃Ｉｌ＋の４Ｎ硫酸を加えて発色段階を終
わらせた。サンプルの吸光度は波長４５０ｎｍの光線を
用んて比色定量法により測定した。
り出し、先の２つの段落において記載した方法と同じ方
法で洗浄し、乾かした。その浸漬片は基質−色原体混合
物（尿素−ペルオキシド：テトラメチルベンジジン〔ν
ｅｎｔｒｅｘ １．メイン州ポートランド）、２１）を
含む１＆Ｉｌのレベルを付けた試験管に入れ、室温で２
０分間インキュベーションした。その後浸漬片を取り出
し、０．２５＃Ｉｌ＋の４Ｎ硫酸を加えて発色段階を終
わらせた。サンプルの吸光度は波長４５０ｎｍの光線を
用んて比色定量法により測定した。
００（ｆｉが０．１以上のサンプルはカンピロバクタ−
に対し陽性であると見なされ、それより低い吸光度をも
つサンプルはカンピロバクタ−の不在を示していた。上
記のように試験した１４８のふん便被検物から得られた
結果を以下に示す： 培養物 （＝は′と定義される”という意味である）実遣［２ 異なる濃度のＣ，ｊｅｊｕｎｉを播種した陰性採集ふん
便に対して上記方法を繰り返した。次の結果が得られた
； 本発明はｒＲＮＡの検出について記載されたが、ここに
記載のプローブおよびそれらに相補的なプローブはｒＲ
ＮＡを・コードする遺伝子（ＤＮＡ）を検出する際にも
有用であることが容易に理解されるであろう。従うて、
このようなプローブはここに記載のプローブの均等物で
あると考えられ、本発明の精神および範囲並びに特許請
求の範囲に含まれるものである。
に対し陽性であると見なされ、それより低い吸光度をも
つサンプルはカンピロバクタ−の不在を示していた。上
記のように試験した１４８のふん便被検物から得られた
結果を以下に示す： 培養物 （＝は′と定義される”という意味である）実遣［２ 異なる濃度のＣ，ｊｅｊｕｎｉを播種した陰性採集ふん
便に対して上記方法を繰り返した。次の結果が得られた
； 本発明はｒＲＮＡの検出について記載されたが、ここに
記載のプローブおよびそれらに相補的なプローブはｒＲ
ＮＡを・コードする遺伝子（ＤＮＡ）を検出する際にも
有用であることが容易に理解されるであろう。従うて、
このようなプローブはここに記載のプローブの均等物で
あると考えられ、本発明の精神および範囲並びに特許請
求の範囲に含まれるものである。
皇止■主
実施例１の方法に従って、カンピロバクタ−単離物を陰
性の採集ふん便に１０７ＣＦＵ／ｍ１の濃度で”播種”
し、好適な液体ハイブリダイゼーション法で捕獲プロー
ブ７３２および検出プローブ９９９ＦＩＴＣを用いて試
験した。掲載した細菌株の供給源は表３に示す通りであ
る。得られた結果は次の通りであったニ ブ９９９−ＦＩＴＣを用いて好適な液体ハイブリダイゼ
ーション法により試験した。ｌ！！載した細菌株の供給
源は表３に示した通りであり、さらに（６）は５ｉｌｌ
ｉｋｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （イリノイ州シ
カゴ）である。
性の採集ふん便に１０７ＣＦＵ／ｍ１の濃度で”播種”
し、好適な液体ハイブリダイゼーション法で捕獲プロー
ブ７３２および検出プローブ９９９ＦＩＴＣを用いて試
験した。掲載した細菌株の供給源は表３に示す通りであ
る。得られた結果は次の通りであったニ ブ９９９−ＦＩＴＣを用いて好適な液体ハイブリダイゼ
ーション法により試験した。ｌ！！載した細菌株の供給
源は表３に示した通りであり、さらに（６）は５ｉｌｌ
ｉｋｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （イリノイ州シ
カゴ）である。
観察された結果は次の通りであった：
実施例３の方法に従って、非カンピロバクタ−単離物を
陰性の採集ふん便に１０”ＣＰｔ１／−の濃度で゛°播
種”し、捕獲プローブ７３２および検出ブローに班 １
６５ ｒＲＮＡは５′→３′方向に書かれており、プロ
ーブ配列はＤＮＡとして３→５′方向に書かれている。
陰性の採集ふん便に１０”ＣＰｔ１／−の濃度で゛°播
種”し、捕獲プローブ７３２および検出ブローに班 １
６５ ｒＲＮＡは５′→３′方向に書かれており、プロ
ーブ配列はＤＮＡとして３→５′方向に書かれている。
１６５ ｒＦＩＮ＾配列はＥ．Ｃｏｌｉ配列（プローブ
ターゲット領域を確認するための基準として用いられる
）に対して整列させである。 Ｅ．Ｃｏｌｉ配列の上の
数字はＥ．Ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮ八配列配列′末
端から数えたヌクレオチド残基の番号を意味する。Ｃ１
＾、Ｇ、ｔｌはそれぞれリボヌクレオチド塩基のシトシ
ン、アデノシン、グアノシンおよびウリジンを表す、
ＲＮＡ配列中の文字Ｗ、Ｙ、Ｍ、ＨおよびＮは不確定の
ヌクレオチドの指定を表す：すなわち一＝Ａまたはｕ、
ｙ＝ｃまたはＵＳＭ・Ｃまた。はＡ、ｉｄ、Ｃまたは
１１ＳＮ＝＾、Ｃ，ＧまたはＵ 、 ＲＮＡ配列中の小
文字はその位置でのヌクレオチドの存在の不確定を示す
。破線はヌクレオチドがその配列のその位置に存在しな
いことを示す整列ギャップである。プローブ３４５は米
国特許出願第８２１３９３号に記載されるプローブＡＲ
１９７に相当し、そしてプローブ３４６はプローブＡＲ
１Ｑ６に相当する。
ターゲット領域を確認するための基準として用いられる
）に対して整列させである。 Ｅ．Ｃｏｌｉ配列の上の
数字はＥ．Ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮ八配列配列′末
端から数えたヌクレオチド残基の番号を意味する。Ｃ１
＾、Ｇ、ｔｌはそれぞれリボヌクレオチド塩基のシトシ
ン、アデノシン、グアノシンおよびウリジンを表す、
ＲＮＡ配列中の文字Ｗ、Ｙ、Ｍ、ＨおよびＮは不確定の
ヌクレオチドの指定を表す：すなわち一＝Ａまたはｕ、
ｙ＝ｃまたはＵＳＭ・Ｃまた。はＡ、ｉｄ、Ｃまたは
１１ＳＮ＝＾、Ｃ，ＧまたはＵ 、 ＲＮＡ配列中の小
文字はその位置でのヌクレオチドの存在の不確定を示す
。破線はヌクレオチドがその配列のその位置に存在しな
いことを示す整列ギャップである。プローブ３４５は米
国特許出願第８２１３９３号に記載されるプローブＡＲ
１９７に相当し、そしてプローブ３４６はプローブＡＲ
１Ｑ６に相当する。
Ｗ Ｅ．Ｃｏｌｉ −ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａ Ｂ
ａ５ｅからのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ配列；
Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ １−Ｃａ＋ｌ１ｐｙｌ。
ａ５ｅからのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ配列；
Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ １−Ｃａ＋ｌ１ｐｙｌ。
ｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｎ９４１株、マサチュー
センタ大学メディカルセンター（マサチューセッツ州ウ
スター）、Ｇａｒｙ Ｄｏｅｒｎからの臨床単離物；
Ｃ０ｊｅｊｕｎｉ ２およびＣ，ｊｅｊｕｎｉ３はそれ
ぞれアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
ＩＴｃｃ）から供給された２９４２８株および３３５６
０株である；Ｃ，ｃｏｌｉ＝Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒｃｏｌｉ ＡＴＣＣ３３５５９株； Ｃ，１ａｒｉｄ
ｉｓ ＝ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒＩａｒｉｄｉｓ
ＡＴＣＣ３５２２３株：Ｃ，ｆｅｔｕｓ ｆ ＝ＣａＩ
ｌｐｙｌｏｂａ−ｃｔｅ ｆｅｔｕｓのｆｅｔｕｓ亜種
５３９６株（フランス、パリ、パスツール研究所のコレ
クション）、個人的関係のＰ、Ｒｏｍａｎｉｕｋからの
配列； Ｃ，ｈｙｏｉｎｔ−Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒ ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＡＴＣＣ３５２
１７株； Ｃ，ｃｒｙａｅｒ。
センタ大学メディカルセンター（マサチューセッツ州ウ
スター）、Ｇａｒｙ Ｄｏｅｒｎからの臨床単離物；
Ｃ０ｊｅｊｕｎｉ ２およびＣ，ｊｅｊｕｎｉ３はそれ
ぞれアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
ＩＴｃｃ）から供給された２９４２８株および３３５６
０株である；Ｃ，ｃｏｌｉ＝Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒｃｏｌｉ ＡＴＣＣ３３５５９株； Ｃ，１ａｒｉｄ
ｉｓ ＝ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒＩａｒｉｄｉｓ
ＡＴＣＣ３５２２３株：Ｃ，ｆｅｔｕｓ ｆ ＝ＣａＩ
ｌｐｙｌｏｂａ−ｃｔｅ ｆｅｔｕｓのｆｅｔｕｓ亜種
５３９６株（フランス、パリ、パスツール研究所のコレ
クション）、個人的関係のＰ、Ｒｏｍａｎｉｕｋからの
配列； Ｃ，ｈｙｏｉｎｔ−Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒ ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＡＴＣＣ３５２
１７株； Ｃ，ｃｒｙａｅｒ。
＝Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙａｅｒｏｐｈｉ
ｌａ ＡＴＣＣ４３１５７株；Ｔｈ１ｏｖｕｌｕｓ細胞
はり、５ｔａｈｌによって増菌培養物から単離され（Ｓ
ｔａｈｌ ら、１９８７、Ｉｎｔｎ’ｌ Ｊ、Ｓｙｓ
ｔｅｍ。
ｌａ ＡＴＣＣ４３１５７株；Ｔｈ１ｏｖｕｌｕｓ細胞
はり、５ｔａｈｌによって増菌培養物から単離され（Ｓ
ｔａｈｌ ら、１９８７、Ｉｎｔｎ’ｌ Ｊ、Ｓｙｓ
ｔｅｍ。
Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、、 ３７ ： １１６〜１２２を
参照） 、 Ｄ、５Ｌａｈｌおよびり、Ｌａｎｅによっ
て塩基配列が決定された（Ｒｏ＋ｗａｎｌｕｋら、１９
８７． Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １６９ ：
２１３７〜２１４１に報告されている） ；Ｗ、５ｕ
ｃｃｉｎｏ −Ｗｏｌｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎ
ｏｇｅｎｅｓ （Ｌａｕ ら、 １９８７、 Ｓｙ
ｓｔｅｍ、 ＆Ａｐｐ１．旧ｃｒｏｂｉｏ１．． ９
： ２３１〜２３８からの配列）；Ｆ、ｒａｐｐｉｎ
ｉ ＝Ｆｌｅｘｉｓｐｉｒａ ｒａｐｐｉｎｉ １
９３７−３８２６４株、ナショナル・アニマル・ディズ
イーズ・センター（アイオワ州アメス） 、Ｊ、Ｂｒｙ
ｎｅｒによって提供された細胞； Ｃ，ｐｙｌｏｒｉ
＝Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉＡＴＣＣ
４３５０４株。
参照） 、 Ｄ、５Ｌａｈｌおよびり、Ｌａｎｅによっ
て塩基配列が決定された（Ｒｏ＋ｗａｎｌｕｋら、１９
８７． Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １６９ ：
２１３７〜２１４１に報告されている） ；Ｗ、５ｕ
ｃｃｉｎｏ −Ｗｏｌｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎ
ｏｇｅｎｅｓ （Ｌａｕ ら、 １９８７、 Ｓｙ
ｓｔｅｍ、 ＆Ａｐｐ１．旧ｃｒｏｂｉｏ１．． ９
： ２３１〜２３８からの配列）；Ｆ、ｒａｐｐｉｎ
ｉ ＝Ｆｌｅｘｉｓｐｉｒａ ｒａｐｐｉｎｉ １
９３７−３８２６４株、ナショナル・アニマル・ディズ
イーズ・センター（アイオワ州アメス） 、Ｊ、Ｂｒｙ
ｎｅｒによって提供された細胞； Ｃ，ｐｙｌｏｒｉ
＝Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉＡＴＣＣ
４３５０４株。
１１ 微生物の説明および配列の表記法は表２八と同
じであるが、次の説明を追加する： ｃ、ｊｅｊｕｎｉ
５＝Ｃａａｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ
ＵＶＩＣ株（ブリティッシュ・コロンビア大学（ブリテ
ィッシュ・コロンビア州バンクーバー） 、Ｐ、Ｒｏ翔
ａｎｉｕｋから個人的関係により提供された） ；
Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ ６ ＝Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１３９２株（Ｐ、ＲｏＩＩａ
ｎｉｕｋ） ｉ Ｃ，ｃｏｌｉ ２−ＣａＩＩＩｐｙｌ
ｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉＮｃＴｃ １１３６６株（Ｐ
、Ｒｏｍａｎｉｕｋ） ；Ｃ，１ａｒｉｄｉｓ２ ＝Ｃ
ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ Ｉａｒｉｄｉｓ ＡＴＣＣ
３５２２１（Ｒｏｍａｎｉｕｋら、１９８７およびＴｈ
ｏｍｐｓｏｎら、１９８８からの配列のり、Ｌａｎｅに
よる混成物） ：Ｃ−ｆｅｔｕｓ ｌ −Ｃａｍｐ
ｙｌｏｂａｃｔｅ、ｒ ｆｅｔｕｓのｆｅｔｕｓ亜種Ｖ
ＰＩ １１６４１株（Ｐａｓｔｅｒ ＆ Ｄｅｗｈｉｒ
ｓｔ、１９８８）、ＡＴＣＣ２７３７４（Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎら、１９８８） 、およびＣＩＰ５３９６ （Ｒｏ
ｍａｎｉｕｋ ら、１９８７）からの逆転写配列のり、
Ｌａｎｅによる混合物； Ｃ，ｆｅｔｕｓ２ ＝Ｃａｍ
ｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓのｖｅｎｅｒｉａｌ
ｉｓ亜種＾ＴＣＣ１９４３８株（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、
１９８８）および未同定株（Ｐ、Ｒｏｅ＋ａｎｉｕｋ、
個人的関係）の混成物； Ｃ，ｃｏｎｃｉｓｕｓ＝ＦＤ
Ｃ（Ｆｏｒｓｙｔｈ Ｄｅｎｔａｌ Ｃｅ−ｎｔｅｒ）
２８８株、ＦＤＣ４８４株（マサチューセソッ州ボスト
ン、ホーサイス・デンタル・センター、Ｂ、Ｐａ５−ｔ
ｅｒ ＆ Ｆ、Ｄｅｗｈｉｒｓｔ、個人的関係）および
ＡＴＣＣ１３０８６株（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８８
）から誘導されたＣａ５ｐｙｌｏ−ｂａｃｔｅｒ ｃｏ
ｎｃｉｓｕｓ混成物；Ｗ、ｃｕｒｖａ −Ｗｏｌｌｉｎ
ｅｌｌａｃｕｒｖａ ＡＴＣＣ３５２２４；Ｗ、ｒｅｃ
Ｌａ ＝Ｗｏｌｌｉｎｅｌｌａ ｒｅｃｔａＡＴＣＣ
３３２３８； Ｂ、ｇｒａｃｉ１ｉｓ＝Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｓ ｇｒａｃｉｌｉｓＡＴＣＣ３３２３６； Ｂ
、ｕｒｅ−ｏ１ｙｔ＝Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｒｅ
ｏｌｙｔ−４ｃｕｓ ＡＴＣＣ３３３８７； Ｃ。
じであるが、次の説明を追加する： ｃ、ｊｅｊｕｎｉ
５＝Ｃａａｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ
ＵＶＩＣ株（ブリティッシュ・コロンビア大学（ブリテ
ィッシュ・コロンビア州バンクーバー） 、Ｐ、Ｒｏ翔
ａｎｉｕｋから個人的関係により提供された） ；
Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ ６ ＝Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１３９２株（Ｐ、ＲｏＩＩａ
ｎｉｕｋ） ｉ Ｃ，ｃｏｌｉ ２−ＣａＩＩＩｐｙｌ
ｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉＮｃＴｃ １１３６６株（Ｐ
、Ｒｏｍａｎｉｕｋ） ；Ｃ，１ａｒｉｄｉｓ２ ＝Ｃ
ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ Ｉａｒｉｄｉｓ ＡＴＣＣ
３５２２１（Ｒｏｍａｎｉｕｋら、１９８７およびＴｈ
ｏｍｐｓｏｎら、１９８８からの配列のり、Ｌａｎｅに
よる混成物） ：Ｃ−ｆｅｔｕｓ ｌ −Ｃａｍｐ
ｙｌｏｂａｃｔｅ、ｒ ｆｅｔｕｓのｆｅｔｕｓ亜種Ｖ
ＰＩ １１６４１株（Ｐａｓｔｅｒ ＆ Ｄｅｗｈｉｒ
ｓｔ、１９８８）、ＡＴＣＣ２７３７４（Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎら、１９８８） 、およびＣＩＰ５３９６ （Ｒｏ
ｍａｎｉｕｋ ら、１９８７）からの逆転写配列のり、
Ｌａｎｅによる混合物； Ｃ，ｆｅｔｕｓ２ ＝Ｃａｍ
ｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓのｖｅｎｅｒｉａｌ
ｉｓ亜種＾ＴＣＣ１９４３８株（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、
１９８８）および未同定株（Ｐ、Ｒｏｅ＋ａｎｉｕｋ、
個人的関係）の混成物； Ｃ，ｃｏｎｃｉｓｕｓ＝ＦＤ
Ｃ（Ｆｏｒｓｙｔｈ Ｄｅｎｔａｌ Ｃｅ−ｎｔｅｒ）
２８８株、ＦＤＣ４８４株（マサチューセソッ州ボスト
ン、ホーサイス・デンタル・センター、Ｂ、Ｐａ５−ｔ
ｅｒ ＆ Ｆ、Ｄｅｗｈｉｒｓｔ、個人的関係）および
ＡＴＣＣ１３０８６株（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８８
）から誘導されたＣａ５ｐｙｌｏ−ｂａｃｔｅｒ ｃｏ
ｎｃｉｓｕｓ混成物；Ｗ、ｃｕｒｖａ −Ｗｏｌｌｉｎ
ｅｌｌａｃｕｒｖａ ＡＴＣＣ３５２２４；Ｗ、ｒｅｃ
Ｌａ ＝Ｗｏｌｌｉｎｅｌｌａ ｒｅｃｔａＡＴＣＣ
３３２３８； Ｂ、ｇｒａｃｉ１ｉｓ＝Ｂａｃｔｅｒｏ
ｉｄｅｓ ｇｒａｃｉｌｉｓＡＴＣＣ３３２３６； Ｂ
、ｕｒｅ−ｏ１ｙｔ＝Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｒｅ
ｏｌｙｔ−４ｃｕｓ ＡＴＣＣ３３３８７； Ｃ。
５ｐｕｔｏｒｕｓｌ ＝ＡＴＣＣ３３５６２株（表２Ａ
で定義されたＣ０５ｐｕｔｏｒｕ＋ｗ）およびＡＴＣＣ
３３４９１株から誘導されたＣａｍｐｙｌｏｂａｃＬｅ
ｒ ５ｐｕｔｏｒｕ＋ｍのｂｕｂ−ｕｌｕｓ亜種の混成
物ｉ Ｃ，５ｐｕｔｏｒｕ＊ ２−３−１７株（Ｔｈｏ
−ｓｐｓｏｎ ら、１９８８）および（Ｒｏｍａｎｌｕ
ｋら、個人的関係）から誘導されたＣａｍｐｙｌｏｂａ
ｃｔｅｒ ｓｐｕｔｏｒｕｍの５ｐｕｔｏｒｕｓｌ亜種
の混成物； Ｃ，ｃｒｙａｅｒｏ ２ ＝Ｃａ＊ｐｙｌ
ｏ−ｂａｃｔｅｒ ｃｒｙａｅｒｏｐ−ｈｉｌａ Ａ
ＴＣＣ１１８８５（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ら、 １９８
８）；Ｃ，ｃｉｎａｅｄｉ＝Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒ ｃｉｎａｅｄｉ ＡＴＣＣ３５６８３（Ｔｈｏ
ｍｐｓｏｎら、１９８Ｂ） ；Ｃ，ｆｅｎｎｅｌｌ ＝
Ｃａ＋ｗｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｎｎｅｌｌｉａｅ
ＡＴＣＣ３５６８４（↑ｈｏａ＋ｐｓｏｎ ら、１９８
８） ；Ｓ、ＣまたはＧ（ヌクレオチド指定における
不確定）。
で定義されたＣ０５ｐｕｔｏｒｕ＋ｗ）およびＡＴＣＣ
３３４９１株から誘導されたＣａｍｐｙｌｏｂａｃＬｅ
ｒ ５ｐｕｔｏｒｕ＋ｍのｂｕｂ−ｕｌｕｓ亜種の混成
物ｉ Ｃ，５ｐｕｔｏｒｕ＊ ２−３−１７株（Ｔｈｏ
−ｓｐｓｏｎ ら、１９８８）および（Ｒｏｍａｎｌｕ
ｋら、個人的関係）から誘導されたＣａｍｐｙｌｏｂａ
ｃｔｅｒ ｓｐｕｔｏｒｕｍの５ｐｕｔｏｒｕｓｌ亜種
の混成物； Ｃ，ｃｒｙａｅｒｏ ２ ＝Ｃａ＊ｐｙｌ
ｏ−ｂａｃｔｅｒ ｃｒｙａｅｒｏｐ−ｈｉｌａ Ａ
ＴＣＣ１１８８５（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ら、 １９８
８）；Ｃ，ｃｉｎａｅｄｉ＝Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒ ｃｉｎａｅｄｉ ＡＴＣＣ３５６８３（Ｔｈｏ
ｍｐｓｏｎら、１９８Ｂ） ；Ｃ，ｆｅｎｎｅｌｌ ＝
Ｃａ＋ｗｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｎｎｅｌｌｉａｅ
ＡＴＣＣ３５６８４（↑ｈｏａ＋ｐｓｏｎ ら、１９８
８） ；Ｓ、ＣまたはＧ（ヌクレオチド指定における
不確定）。
説亙 微生物の説明および配列の表記法は表２Ａおよ
び２Ｂと同じであるが、次の説明を追加する：Ｃ，５ｐ
ｕＬｏｒｕｔａ−ＣａｔａｐｙｌｏｂａｃＬｅｒ ｓｐ
ｕｔｏｒｕｍのｂｕｂｕｌｕｓら亜種ＡＴＣＣ３３５６
２、オリゴヌクレオチドブローフのいくつかは一方の末
端または両方の末端に小文字Ｃをもっている。これは種
々の°°検出”リガンド（例えば、ビオチン、フルオレ
セイン）を容易に結合することができる″類似体Ｃｎ残
基を示す。
び２Ｂと同じであるが、次の説明を追加する：Ｃ，５ｐ
ｕＬｏｒｕｔａ−ＣａｔａｐｙｌｏｂａｃＬｅｒ ｓｐ
ｕｔｏｒｕｍのｂｕｂｕｌｕｓら亜種ＡＴＣＣ３３５６
２、オリゴヌクレオチドブローフのいくつかは一方の末
端または両方の末端に小文字Ｃをもっている。これは種
々の°°検出”リガンド（例えば、ビオチン、フルオレ
セイン）を容易に結合することができる″類似体Ｃｎ残
基を示す。
それらは他の点でプローブの挙動に影響を及ぼすことは
ない。直接合成により類似体Ｃを３末端に付加する場合
、初めに便宜上Ｔ残基がしばしばカンブリングさ・れる
、その′ｒ残基はそれがブローフ゛とターゲット配列と
のハイブリダイゼーションに必ずしも関与しないという
点で、°“厳密な意味”でプローブの不可欠な部分では
ない。
ない。直接合成により類似体Ｃを３末端に付加する場合
、初めに便宜上Ｔ残基がしばしばカンブリングさ・れる
、その′ｒ残基はそれがブローフ゛とターゲット配列と
のハイブリダイゼーションに必ずしも関与しないという
点で、°“厳密な意味”でプローブの不可欠な部分では
ない。
説泗〜 微生物の説明および配列の表記法は表２Ａ、２
Ｂおよび２Ｃと同じであるが、次の説明を追加する：Ｃ
，ｊｅｊｕｒ＋ｉ ４ ＝ＣＡＭＰＭＥＲＧ、多数の（
：、ｊｅｊｕｎｉ株からの１６３ ｒＲＮＡ部分的逆転
写配列の混成物（Ｌａｕ ら、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
＆ Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。１９８７、ｉ：
２３１〜２３８）、 Ｃ０ｈｙｏｉｎｔ配列中のＣＧジ
ヌクレオチドをはさむかっこは、これらの２つのヌクレ
オチドを同定するバンドがシーフェンシングゲル上をや
や変則的に泳動したことを示す。
Ｂおよび２Ｃと同じであるが、次の説明を追加する：Ｃ
，ｊｅｊｕｒ＋ｉ ４ ＝ＣＡＭＰＭＥＲＧ、多数の（
：、ｊｅｊｕｎｉ株からの１６３ ｒＲＮＡ部分的逆転
写配列の混成物（Ｌａｕ ら、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
＆ Ａｐｐｌ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。１９８７、ｉ：
２３１〜２３８）、 Ｃ０ｈｙｏｉｎｔ配列中のＣＧジ
ヌクレオチドをはさむかっこは、これらの２つのヌクレ
オチドを同定するバンドがシーフェンシングゲル上をや
や変則的に泳動したことを示す。
表３＝サイトドツトハイブリダイゼーションＣ，ｓｐρ
、（６２単離物） 臨床 （２，３，４） ６２＋ ６２＋ ５８＋ ６２＋ ６２＋ ６２＋ ６２÷ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ）ａｌｌｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ＋Ｉｌ＋ｕｒ＋ｕｍ ３ｂｂｂ （ｌ］ Ｒ所 それぞれの苗株のサイトドツトによるハイブリ
ダイゼーションは各プローブを陽性（＋）または陰性（
−）としておおざっばにふりわけた。
、（６２単離物） 臨床 （２，３，４） ６２＋ ６２＋ ５８＋ ６２＋ ６２＋ ６２＋ ６２÷ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ）ａｌｌｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ＋Ｉｌ＋ｕｒ＋ｕｍ ３ｂｂｂ （ｌ］ Ｒ所 それぞれの苗株のサイトドツトによるハイブリ
ダイゼーションは各プローブを陽性（＋）または陰性（
−）としておおざっばにふりわけた。
陽性信号は最強（すなわち、Ｃ，ｊｅｊｕｎｉ、 Ｃ，
ｃｏｌｉおよびＣ，１ａｒｉｄｉｓ株）から変動（例え
ば、非−ｊｅｊ−ｕｎｉ 、 ｃｏｌｉまたはＩａｒｉ
ｄｉｓカンピロバククー株）または微弱（すなわち、非
カンピロバクタ−）まで変化する。６２の臨床単離物は
全てを種レベルまで決定したわけではない、恐らく大部
分はＣ，ｊｅｊｕｎｉ 、 Ｃ，ｃｏｌｉまたはＣ，Ｉ
ａ″ｒｉ ｄ ｉ ｓ株である。
ｃｏｌｉおよびＣ，１ａｒｉｄｉｓ株）から変動（例え
ば、非−ｊｅｊ−ｕｎｉ 、 ｃｏｌｉまたはＩａｒｉ
ｄｉｓカンピロバククー株）または微弱（すなわち、非
カンピロバクタ−）まで変化する。６２の臨床単離物は
全てを種レベルまで決定したわけではない、恐らく大部
分はＣ，ｊｅｊｕｎｉ 、 Ｃ，ｃｏｌｉまたはＣ，Ｉ
ａ″ｒｉ ｄ ｉ ｓ株である。
掲載した細菌株の供給源は次の通りである＝（１）
アメリ、カン・タイプ・カルチャー・コレクション（メ
リーランド州ロックビル） （２） マサチューセンタ大学、メディカルセンター
（マサチューセンツ州ウスター）、 Ｇａｒｙ Ｄｏｅｒｎ （３）νＡメディカルセンター（コロラド州デンバ）
、Ｍ、Ｊ、Ｄｌａｓｅｒ （４）ハーモント保ｆｉｌ省（バーモント州バーリント
ン） 、Ｔａｎｙａ ５ａｎｄｅｒｏｓイン−ハウス単
離物 （外４名）
アメリ、カン・タイプ・カルチャー・コレクション（メ
リーランド州ロックビル） （２） マサチューセンタ大学、メディカルセンター
（マサチューセンツ州ウスター）、 Ｇａｒｙ Ｄｏｅｒｎ （３）νＡメディカルセンター（コロラド州デンバ）
、Ｍ、Ｊ、Ｄｌａｓｅｒ （４）ハーモント保ｆｉｌ省（バーモント州バーリント
ン） 、Ｔａｎｙａ ５ａｎｄｅｒｏｓイン−ハウス単
離物 （外４名）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、予め定められたストリンジェンシー条件下でカンピ
ロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コーリ（Ｃａｍｐ
ｙｌｏｂ−ａｃｔｅｒｃｏｌｉ）およびカンピロバクタ
ー・ラリディス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｌａｒｉ
ｄｉｓ）のｒＲＮＡまたはｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダ
イズし得る核酸フラグメント。 ２、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏ
ｓａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはネズミチフス菌
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｒ
ＲＮＡまたはｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズしない、
請求項１記載の核酸フラグメント。 ３、領域１２４−２２５、領域３９１−５０１、領域９
７３−１０４９、および領域１４２４−１４８９（Ｅ．
Ｃｏｌｉの位置ナンバリング協定を使用）、並びにそれ
らの組合せより成る領域から選ばれた少なくとも１０個
の連続ヌクレオチドの少なくとも９５％に相補的である
、請求項１記載の核酸フラグメント。 ４、領域１２４−２２５に相補的なフラグメントから成
る、請求項３記載の核酸フラグメント。 ５、領域３９１−５０１に相補的なフラグメントから成
る、請求項３記載の核酸フラグメント。 ６、領域９７３−１０４９に相補的なフラグメントから
成る、請求項３記載の核酸フラグメント。 ７、領域１４２４−１４８９に相補的なフラグメントか
ら成る、請求項３記載の核酸フラグメント。 ８、プローブ３４５、プローブ３４６、プローブ９９９
およびプローブ７３２より成る群から選ばれる、請求項
４記載の、フラグメント。 ９、プローブ１１０４およびプローブ１１０５より成る
群から選ばれる、請求項５記載のフラグメント。 １０、プローブ１１３２、プローブ１１３３およびプロ
ーブ１１３０より成る群から選ばれる、請求項６記載の
フラグメント。 １１、プローブ３５１およびプローブ１１３４より成る
群から選ばれる、請求項７記載のフラグメント。 １２、プローブ７３２配列、その相補的配列、およびス
トリンジェント条件下で前記のものにハイブリダイズし
得る配列より成る群から選ばれる配列を有する第一の核
酸フラグメント；およびプローブ９９９配列、その相補
的配列、およびストリンジェント条件下で前記のものに
ハイブリダイズし得る配列より成る群から選ばれる配列
を有する第二の核酸フラグメントから成る、請求項３記
載の核酸フラグメント。 １３、プローブ１１０４配列、その相補的配列、および
ストリンジェント条件下で前記のものにハイブリダイズ
し得る配列より成る群から選ばれる配列を有する第一の
核酸フラグメント；およびプローブ１１０５配列、その
相補的配列、およびストリンジェント条件下で前記のも
のにハイブリダイズし得る配列より成る群から選ばれる
配列を有する第二の核酸フラグメントから成る、請求項
３記載の核酸フラグメント。 １４、プローブ１１３２、１１３３の配列、その相補的
配列、およびストリンジェント条件下で前記のものにハ
イブリダイズし得る配列より成る群から選ばれる配列を
有する第一の核酸フラグメント；およびプローブ１１３
０配列、その相補的配列、およびストリンジェント条件
下で前記のものにハイブリダイズし得る配列より成る群
から選ばれる配列を有する第二の核酸フラグメントから
成る、請求項３記載の核酸フラグメント。 １５、プローブ３４５、３４６、９９９、７３２、１１
０４、１１０５、１１３２、１１３３、１１３０、３５
１、１１３４および前記のもののいずれかに相補的なプ
ローブ全部より成る群から選ばれるプローブにハイブリ
ダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、請求項
１記載の核酸フラグメント。 １６、サンプル中のカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂ−ａｃｔｅｒ）の存在を検出する方法であって：ａ）
請求項３記載の核酸フラグメントとサンプルとを、該サ
ンプル中に存在するならば、カンピロバクター・ジェジ
ュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）、カ
ンピロバクター・コーリ（Ｃａｍｐ−ｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒｃｏｌｉ）および／またはカンピロバクター・ラリデ
ィス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｌａｒｉｄｉｓ）の
ｒＲＮＡに該フラグメントをハイブリダイズさせる条件
下で接触させて、ハイブリッド核酸複合体を形成させ；
そして ｂ）該ハイブリッド複合体を、サンプル中のカンピロバ
クター・ジェジュニ、カンピロバクター・コーリおよび
／またはカンピロバクター・ラリディスの存在の指標と
して検出することから成る上記方法。 １７、核酸フラグメントはプローブ３４５、３４６、９
９９、７３２、１１０４、１１０５、１１３２、１１３
３、１１３０、３５１、１１３４および前記のもののい
ずれかに相補的なプローブ全部より成る群から選ばれる
プローブにハイブリダイゼーション条件下でハイブリダ
イズし得る、請求項１６記載の方法。 １８、核酸フラグメントはプローブ７３２、９９９およ
び前記のもののいずれかに相補的なプローブ全部より成
る群から選ばれるプローブにストリンジェント条件下で
ハイブリダイズし得る少なくとも１つのフラグメントと
；プローブ７３２、９９９および前記のもののいずれか
に相補的なプローブ全部より成る群から選ばれるプロー
ブにストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る少
なくとも１つの他のフラグメントと；の混合物から成る
、請求項１６記載の方法。 １９、核酸フラグメントはプローブ１１０４、１１０５
および前記のもののいずれかに相補的なプローブ全部よ
り成る群から選ばれるプローブにストリンジェント条件
下でハイブリダイズし得る少なくとも１つのフラグメン
トと；プローブ１１０４、１１０５および前記のものの
いずれかに相補的なプローブ全部より成る群から選ばれ
るプローブにストリンジェント条件下でハイブリダイズ
し得る少なくとも１つの他のフラグメントと；の混合物
から成る、請求項１６記載の方法。 ２０、プローブ１１３２、１１３３、１１３０および前
記のもののいずれかに相補的なプローブ全部より成る群
から選ばれる１以上のプローブにストリンジェント条件
下でハイブリダイズし得る少なくとも１つのフラグメン
トと；プローブ１１３２、１１３３、１１３０および前
記のもののいずれかに相補的なプローブ全部より成る群
から選ばれるプローブにストリンジェット条件下でハイ
ブリダイズし得る少なくとも１つの他のフラグメントと
；の混合物から成る、請求項１６記載の方法。 ２１、少なくとも１つの容器に収容された請求項１記載
の核酸フラグメント、およびサンプル中のカンピロバク
ター・ジェジュニ、カンピロバクター・コーリおよび／
またはカンピロバクター・ラリディスのグループの少な
くとも１種の細菌の存在を検出すべく該核酸フラグメン
トを利用するための説明書を含む、カンピロバクター・
ジェジュニ、カンピロバクター・コーリおよびカンピロ
バクター・ラリディス検出用のアッセイキット。 ２２、少なくとも１つの容器に収容された請求項３記載
の核酸フラグメント、およびサンプル中のカンピロバク
ター・ジェジュニ、カンピロバクター・コーリおよびカ
ンピロバクター・ラリディスのグループの少なくとも１
種の細菌の存在を検出すべく該核酸フラグメントを利用
するための説明書を含む、カンピロバクター・ジェジュ
ニ、カンピロバクター・コーリおよびカンピロバクター
・ラリディス検出用のアッセイキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/216,679 US5447848A (en) | 1986-01-22 | 1988-07-07 | Detection of campylobacter with nucleic acid probes |
| US216679 | 1988-07-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0284200A true JPH0284200A (ja) | 1990-03-26 |
| JP3030034B2 JP3030034B2 (ja) | 2000-04-10 |
Family
ID=22808062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1177003A Expired - Fee Related JP3030034B2 (ja) | 1988-07-07 | 1989-07-07 | カンピロバクターを検出するための核酸フラグメント、方法およびキット |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5447848A (ja) |
| EP (1) | EP0350205B1 (ja) |
| JP (1) | JP3030034B2 (ja) |
| AT (1) | ATE125872T1 (ja) |
| DE (1) | DE68923665T2 (ja) |
Cited By (5)
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|---|---|---|---|---|
| JP2008029350A (ja) * | 2007-09-10 | 2008-02-14 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 新規微生物 |
| JP2008118906A (ja) * | 2006-11-10 | 2008-05-29 | Canon Inc | プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法 |
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| US8586327B2 (en) | 2007-08-31 | 2013-11-19 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
| US9200330B2 (en) | 2007-08-24 | 2015-12-01 | Osaka Prefecture University | Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin |
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|---|---|---|---|---|
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| US7087742B1 (en) | 1986-11-24 | 2006-08-08 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| US5541308A (en) * | 1986-11-24 | 1996-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| US6150517A (en) | 1986-11-24 | 2000-11-21 | Gen-Probe | Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| US7138516B1 (en) | 1986-11-24 | 2006-11-21 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms |
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| GB9313437D0 (en) * | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Smith Andrew W | Pathogenicity sequences in helicobacter pylori |
| US5585238A (en) * | 1994-04-25 | 1996-12-17 | Ciba-Geigy Corporation | Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction |
| US6048688A (en) * | 1996-11-12 | 2000-04-11 | Kimberly-Clark Corporation | Method for detection of Pseudomonas aeruginosa using polymerase chain reaction |
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| US7455771B2 (en) | 2002-05-14 | 2008-11-25 | Hepa Wash Gmbh | Means for removing protein-bound substances |
| JP2012508586A (ja) | 2008-11-14 | 2012-04-12 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）核酸を検出するための組成物、キットおよび方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0155360B1 (en) * | 1981-09-25 | 1988-12-14 | John A. Webster, Jr. | Method for identifying and characterizing organisms |
| EP0531798B2 (en) * | 1983-01-10 | 2003-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Method for detecting, identifying, and quantitating organisms and viruses |
| US4689295A (en) * | 1983-01-20 | 1987-08-25 | Integrated Genetics, Inc. | Test for Salmonella |
| US4785086A (en) * | 1985-01-17 | 1988-11-15 | Integrated Genetics, Inc. | Test for Campylobacter |
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-
1988
- 1988-07-07 US US07/216,679 patent/US5447848A/en not_active Expired - Lifetime
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1989
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