JP3015034B2 - リステリア菌の検出 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はリステリア（Listeria）属に含まれる細菌を
検出することに関する。本明細書中で用いる“リステリ
ア”なる用語は、Bergey's Manual of Systematic Bact
eriologyにおいて分類された細菌を意味するが、但し分
子および表現型を考慮して最近リステリア属から除かれ
たL.デニトリフィカンス（L.denitrificans）を含まな
いものとする〔ロカート（Rocourt）ら、（1987）Inter
national Journal of Systematic Bacteriology
（提出済み）〕。リステリア菌の検出は医療および公衆
衛生の面で重要である。リステリア感染症はかぜ程度か
らインフルエンザまでの様々な症状を呈するが、特に胎
児にとって危険であって50％の死亡率をもたらす。
検出することに関する。本明細書中で用いる“リステリ
ア”なる用語は、Bergey's Manual of Systematic Bact
eriologyにおいて分類された細菌を意味するが、但し分
子および表現型を考慮して最近リステリア属から除かれ
たL.デニトリフィカンス（L.denitrificans）を含まな
いものとする〔ロカート（Rocourt）ら、（1987）Inter
national Journal of Systematic Bacteriology
（提出済み）〕。リステリア菌の検出は医療および公衆
衛生の面で重要である。リステリア感染症はかぜ程度か
らインフルエンザまでの様々な症状を呈するが、特に胎
児にとって危険であって50％の死亡率をもたらす。
（従来の技術） 標準的な実験方法および食品医薬品局（F.D.A.）によ
って推薦された方法によれば、環境被検物または酪農被
検物（例えば牛乳）中のリステリア菌の存在は、これら
の微生物の増殖に適した条件下に微生物学的培地上で適
当に調製したサンプルを培養することにより検出され
る。形成されたコロニーは、一般にサンプル入手の48時
間後に開始され完了するまでに９〜19日を要する方法に
より、形態学的および生化学的特性について試験され
る。
って推薦された方法によれば、環境被検物または酪農被
検物（例えば牛乳）中のリステリア菌の存在は、これら
の微生物の増殖に適した条件下に微生物学的培地上で適
当に調製したサンプルを培養することにより検出され
る。形成されたコロニーは、一般にサンプル入手の48時
間後に開始され完了するまでに９〜19日を要する方法に
より、形態学的および生化学的特性について試験され
る。
コーン（Kohne）ら（1968）Biophysical Journal 8:1
104−1118はrRNA配列に対するプローブの作製方法を開
示している。
104−1118はrRNA配列に対するプローブの作製方法を開
示している。
ペース（Pace）およびキャンベル（Campbell）（197
1）Journal of Bacteriology107:543−547は異なった
細菌種からのリボソームリボ核酸の相同性並びにこれら
の相同レベルを定量化するためのハイブリダイゼーショ
ン法を開示している。
1）Journal of Bacteriology107:543−547は異なった
細菌種からのリボソームリボ核酸の相同性並びにこれら
の相同レベルを定量化するためのハイブリダイゼーショ
ン法を開示している。
ソギン（Sogin）、ソギン（Sogin）およびワース（Wo
ese）（1972）Journal of Molecular Evolution1:17
3−184は系統発生的関係を評価するために、異なるリボ
ゾームRNA分子の一次構造の特性決定を使用する理論的
および実際的方法を開示している。
ese）（1972）Journal of Molecular Evolution1:17
3−184は系統発生的関係を評価するために、異なるリボ
ゾームRNA分子の一次構造の特性決定を使用する理論的
および実際的方法を開示している。
フォックス（Fox）、ベックマン（Pechman）およびワ
ース（Woese）（1977）International Journal of S
ystematic Bacteriology27:44−57は原核生物系統学へ
の（16SリボソームRNAの）比較分類法を開示している。
ース（Woese）（1977）International Journal of S
ystematic Bacteriology27:44−57は原核生物系統学へ
の（16SリボソームRNAの）比較分類法を開示している。
本発明は以下の定義を参照することにより一層よく理
解されるであろう： DNA−デオキシリボ核酸、糖成分としてデオキシリボ
ースを含む核酸。
解されるであろう： DNA−デオキシリボ核酸、糖成分としてデオキシリボ
ースを含む核酸。
RNA−リボ核酸、糖成分としてリボースを含み、最も
一般的にはDNAから転写（複製）される核酸。RNA分子は
情報（例えばメッセンジャーRNA）、触媒、または構造
（例えばリボソームRNA、以下参照）の諸細胞機能を果
たす。
一般的にはDNAから転写（複製）される核酸。RNA分子は
情報（例えばメッセンジャーRNA）、触媒、または構造
（例えばリボソームRNA、以下参照）の諸細胞機能を果
たす。
rRNA−リボソームRNA（rRNA）分子はリボソーム、複
合タンパク質およびRNA含有“オルガネラ”（転移RNAと
一緒になって翻訳装置を構成する）の重要な因子であ
る。リボソームは遺伝情報を生命の主な構造的および触
媒的要素である細胞タンパク質へ翻訳する唯一の既知的
手段として作用するので、全ての生物にとって非常に大
切である。
合タンパク質およびRNA含有“オルガネラ”（転移RNAと
一緒になって翻訳装置を構成する）の重要な因子であ
る。リボソームは遺伝情報を生命の主な構造的および触
媒的要素である細胞タンパク質へ翻訳する唯一の既知的
手段として作用するので、全ての生物にとって非常に大
切である。
リボソームは３種類の別個のRNA分子を含み、大腸菌
（E.coli）では5S、16Sおよび23SrRNAと呼ばれている。
これらの名称は歴史的に沈降速度によって決定されたRN
A分子の大きさに関係がある。しかしながら、これらのR
NA分子の大きさは実際上生物間で異なっている。5S、16
Sおよび23S rRNAは一般に細菌の相同なRNA分子に対す
る共通の名称として用いられており、本明細書において
もそのように用いられる。
（E.coli）では5S、16Sおよび23SrRNAと呼ばれている。
これらの名称は歴史的に沈降速度によって決定されたRN
A分子の大きさに関係がある。しかしながら、これらのR
NA分子の大きさは実際上生物間で異なっている。5S、16
Sおよび23S rRNAは一般に細菌の相同なRNA分子に対す
る共通の名称として用いられており、本明細書において
もそのように用いられる。
ハイブリダイゼーション−明確に定められた反応条件
下で、２本の部分的に又は完全に相補的な核酸を逆平行
状態に組み合わせて特異的かつ安定な水素結合を形成さ
せる方法。それらの組のハイブリダイゼーション条件の
ストリンジェンシー（stringency）は、プローブ／標的
２本鎖の塩基組成、並びに２本の核酸の誤対合レベルお
よびその形状によって定められる。ストリンジェンシー
はまたハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン
種の濃度および種類、存在する変性剤の種類および濃
度、そして／またハイブリダイゼーションの温度のよう
な反応パラメーターによって支配される。
下で、２本の部分的に又は完全に相補的な核酸を逆平行
状態に組み合わせて特異的かつ安定な水素結合を形成さ
せる方法。それらの組のハイブリダイゼーション条件の
ストリンジェンシー（stringency）は、プローブ／標的
２本鎖の塩基組成、並びに２本の核酸の誤対合レベルお
よびその形状によって定められる。ストリンジェンシー
はまたハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン
種の濃度および種類、存在する変性剤の種類および濃
度、そして／またハイブリダイゼーションの温度のよう
な反応パラメーターによって支配される。
プローブ−明確に定められたストリンジェンシーのも
とで、標的核酸配列と特異的に（すなわち優先的に）ハ
イブリダイズする特定のヌクレオチド配列を含むよう考
案または選択された合成核酸、もしくは生物学的に作ら
れた核酸（DNAまたはRNA）。
とで、標的核酸配列と特異的に（すなわち優先的に）ハ
イブリダイズする特定のヌクレオチド配列を含むよう考
案または選択された合成核酸、もしくは生物学的に作ら
れた核酸（DNAまたはRNA）。
標的−特定のプローブが優先的にハイブリダイズし得
る核酸配列。
る核酸配列。
その他の定義は本明細書中で現れるそれらの第一の用
途として示される。
途として示される。
（発明の要約） 本発明は、特定のハイブリッド形成条件下でリステリ
ア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のリ
ボソームRNA（rRNA）分子の存在を検出し得るが、同一
条件下で被検サンプル中に存在しうる密接に関連した枯
草菌（Bacillus subtilis）のrRNAを検出し得ないDNAま
たはRNA配列から本質的に成る核酸プローブもしくは核
酸プローブの組合せを提供する。
ア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のリ
ボソームRNA（rRNA）分子の存在を検出し得るが、同一
条件下で被検サンプル中に存在しうる密接に関連した枯
草菌（Bacillus subtilis）のrRNAを検出し得ないDNAま
たはRNA配列から本質的に成る核酸プローブもしくは核
酸プローブの組合せを提供する。
本発明はまたこれらのプローブを利用する検定系を提
供し、この検定系は上述した望ましいプローブの作用を
増強することができる。本発明は以下の増強された実施
性能を示す： ａ）感度の増加、すなわち所定のサンプル中のリステリ
ア菌を現在使用されている方法よりも効率よく検出する
ことができる； ｂ）生物学的に作られたプローブではなく、化学的に合
成されたプローブを使用するために、プローブ作製にお
いて大幅にコストダウンが可能である； ｃ）rRNA配列の特性決定が同定の基礎をなすために、生
化学的に異常なリステリア菌でさえも正確に同定でき
る；および ｄ）本発明の試験はさらに増殖させる必要のない培養細
胞上で行われるので結果がより速く得られ、たったの２
〜４日を要するのみである。
供し、この検定系は上述した望ましいプローブの作用を
増強することができる。本発明は以下の増強された実施
性能を示す： ａ）感度の増加、すなわち所定のサンプル中のリステリ
ア菌を現在使用されている方法よりも効率よく検出する
ことができる； ｂ）生物学的に作られたプローブではなく、化学的に合
成されたプローブを使用するために、プローブ作製にお
いて大幅にコストダウンが可能である； ｃ）rRNA配列の特性決定が同定の基礎をなすために、生
化学的に異常なリステリア菌でさえも正確に同定でき
る；および ｄ）本発明の試験はさらに増殖させる必要のない培養細
胞上で行われるので結果がより速く得られ、たったの２
〜４日を要するのみである。
標的分子としてのリステリアrRNAの使用は多くの利点
をもたらし、なかでも （１） rRNAは細胞質量のかなりの部分を占める。細胞
リボソームの概算含有量は変化するが、活発に増殖しつ
つあるリステリア菌は細胞あたり5.0×104個より多くの
リボソームを含み、それ故に5.0×104コピー数の（リボ
ソーム中に1:1:1の化学量論的比で存在する）それぞれ
のrRNAを含有する。対照的に、その他の細胞標的分子、
遺伝子またはそのRNA転写物は多くの場合比較的少ない
量で存在する。
をもたらし、なかでも （１） rRNAは細胞質量のかなりの部分を占める。細胞
リボソームの概算含有量は変化するが、活発に増殖しつ
つあるリステリア菌は細胞あたり5.0×104個より多くの
リボソームを含み、それ故に5.0×104コピー数の（リボ
ソーム中に1:1:1の化学量論的比で存在する）それぞれ
のrRNAを含有する。対照的に、その他の細胞標的分子、
遺伝子またはそのRNA転写物は多くの場合比較的少ない
量で存在する。
（２） rRNA（およびそれらをコードする遺伝子）は同
時代の生物間で側方転移（lateral transfer）を受け
ないと思われる。従って、rRNAの一次構造は、同時代の
生物間で側方電播（lateral transmission）を受けや
すいプラスミド由来の遺伝子またはその産物の場合のよ
うな遺伝子特異的標的ではなくてむしろ生物特異的分子
標的を提供する。
時代の生物間で側方転移（lateral transfer）を受け
ないと思われる。従って、rRNAの一次構造は、同時代の
生物間で側方電播（lateral transmission）を受けや
すいプラスミド由来の遺伝子またはその産物の場合のよ
うな遺伝子特異的標的ではなくてむしろ生物特異的分子
標的を提供する。
rRNA検出に付随する利点を提供するほかに、本発明
は、１本または数本のプローブが有意な数のリステリア
菌の標的領域とハイブリダイズし得る程度にこれらのリ
ステリア菌において十分に類似しているが、プローブが
リステリアrRNAとハイブリダイズするのと同じ条件下
で、それらが大部分の非リステリアrRNAとハイブリダイ
ズし得ないか、又は極めて少なくハイブリダイズするよ
う大部分の非リステリアrRNAにおいて十分に異なってい
るリステリアrRNA標的配列に対するプローブを提供す
る。これらのプローブの特性はそれぞれ包括性および排
他性として定められる。さらに、本発明のプローブは通
常の検定条件下でプローブに接近しやすくなりうる標的
領域とハイブリダイズする。
は、１本または数本のプローブが有意な数のリステリア
菌の標的領域とハイブリダイズし得る程度にこれらのリ
ステリア菌において十分に類似しているが、プローブが
リステリアrRNAとハイブリダイズするのと同じ条件下
で、それらが大部分の非リステリアrRNAとハイブリダイ
ズし得ないか、又は極めて少なくハイブリダイズするよ
う大部分の非リステリアrRNAにおいて十分に異なってい
るリステリアrRNA標的配列に対するプローブを提供す
る。これらのプローブの特性はそれぞれ包括性および排
他性として定められる。さらに、本発明のプローブは通
常の検定条件下でプローブに接近しやすくなりうる標的
領域とハイブリダイズする。
本発明の特に好適な実施態様では、サンプル中のリス
テリア菌を速やかに増殖させるが、密接に関連したブロ
コトリックス（Brochothrix）種を増殖させない条件下
でサンプル中の細胞を増殖させる検定法が用いられる。
この増殖期間後に、サンプルに関してハイブリダイゼー
ション分析が行われる。このような検定においては、プ
レハイブリダイゼーションによるリステリア菌の選択的
増幅ゆえに、プローブと関連ブロコトリックス菌のrRNA
との若干の交差ハイブリダイゼーションを許容すること
ができる。
テリア菌を速やかに増殖させるが、密接に関連したブロ
コトリックス（Brochothrix）種を増殖させない条件下
でサンプル中の細胞を増殖させる検定法が用いられる。
この増殖期間後に、サンプルに関してハイブリダイゼー
ション分析が行われる。このような検定においては、プ
レハイブリダイゼーションによるリステリア菌の選択的
増幅ゆえに、プローブと関連ブロコトリックス菌のrRNA
との若干の交差ハイブリダイゼーションを許容すること
ができる。
他の好適な実施態様において、リステリア菌の検出方
法は、リステリアrRNAと１本以上のプローブとを接触さ
せる前に、サンプルをリステリア菌の一次増殖段階に付
し、続いて二次非特異的細菌増殖段階（この段階は増殖
させたサンプルのpHを6.5〜8.0、最も好ましくは約7.2
に維持するために緩衝液、最も好ましくは３−〔Ｎ−モ
ルホリノ〕プロパンスルホン酸含有緩衝液中で実施され
る）に付すことを包含する。このpH制御はサンプル中の
リステリア菌を二次増殖の期間中に他の方法よりも速や
かに増殖させることが分かった。
法は、リステリアrRNAと１本以上のプローブとを接触さ
せる前に、サンプルをリステリア菌の一次増殖段階に付
し、続いて二次非特異的細菌増殖段階（この段階は増殖
させたサンプルのpHを6.5〜8.0、最も好ましくは約7.2
に維持するために緩衝液、最も好ましくは３−〔Ｎ−モ
ルホリノ〕プロパンスルホン酸含有緩衝液中で実施され
る）に付すことを包含する。このpH制御はサンプル中の
リステリア菌を二次増殖の期間中に他の方法よりも速や
かに増殖させることが分かった。
その他の好適な実施態様において、リステリア菌の検
出方法は、リステリアrRNAと１本以上のプローブとを接
触させる前に、サンプル中のリステリア菌を、細胞溶解
剤（例えばグアニジニウムチオシアネート）を用いて溶
菌する前にリステリア菌の細胞壁を弱める酵素と接触さ
せる段階を包含する。この酵素処理はハイブリダイゼー
ション反応を大いに改善することが分かった。
出方法は、リステリアrRNAと１本以上のプローブとを接
触させる前に、サンプル中のリステリア菌を、細胞溶解
剤（例えばグアニジニウムチオシアネート）を用いて溶
菌する前にリステリア菌の細胞壁を弱める酵素と接触さ
せる段階を包含する。この酵素処理はハイブリダイゼー
ション反応を大いに改善することが分かった。
本発明のその他の特徴および利点は、その好適な実施
態様の以下の説明、および特許請求の範囲から明らかに
なるであろう。
態様の以下の説明、および特許請求の範囲から明らかに
なるであろう。
（好適な実施態様の説明） 続いて本発明の好適な実施態様を説明する。
プローブの開発計画 本発明プローブの開発における第一段階は、リステリ
ア特異的核酸プローブの標的部位として役立ちうる16S
および23S rRNAの領域を同定することである。実際の
事として、被検サンプル中にどの非リステリア菌が存在
するかを推定的に予告することは困難である。非リステ
リア菌が多数存在しうるために、所定のプローブ配列の
排他性を証明することは極めて難しく、かつ労力を要す
る。しかしながら、検索および開発の初期段階におい
て、すべての被検サンプル（最終的にプローブを用いて
スクリーニングされるサンプル）中にどんな非リステリ
ア菌が存在するのかを知る必要性を回避する比較的厳密
な基準を採用しうる。これはリステリア菌同士の、およ
びリステリア菌と他の細菌群との、系統発生的関係の知
識を必要とする。詳細に述べれば、排他性の基準は、進
化論上近い代表的なリステリア関連菌（特に枯草菌）と
リステリア菌とがリステリア配列に特異的なプローブを
用いるハイブリダイゼーションにより区別できるよう
に、リステリアrRNAの特定の標的領域が関連菌のrRNAの
相同領域と十分に相違していることを決定することによ
って満たされるということが１つの仮説として考えられ
る。その後、系統発生的原理に基づく一般的規則とし
て、比較的遠縁の関連菌のrRNA配列は、たとえそれらの
実際の正体が必ずしも知られていなくとも、上記の進化
論上近いリステリア関連菌（例えば枯草菌）よりも特定
の配列領域において少なくとも同程度に相違していると
推察することができる。
ア特異的核酸プローブの標的部位として役立ちうる16S
および23S rRNAの領域を同定することである。実際の
事として、被検サンプル中にどの非リステリア菌が存在
するかを推定的に予告することは困難である。非リステ
リア菌が多数存在しうるために、所定のプローブ配列の
排他性を証明することは極めて難しく、かつ労力を要す
る。しかしながら、検索および開発の初期段階におい
て、すべての被検サンプル（最終的にプローブを用いて
スクリーニングされるサンプル）中にどんな非リステリ
ア菌が存在するのかを知る必要性を回避する比較的厳密
な基準を採用しうる。これはリステリア菌同士の、およ
びリステリア菌と他の細菌群との、系統発生的関係の知
識を必要とする。詳細に述べれば、排他性の基準は、進
化論上近い代表的なリステリア関連菌（特に枯草菌）と
リステリア菌とがリステリア配列に特異的なプローブを
用いるハイブリダイゼーションにより区別できるよう
に、リステリアrRNAの特定の標的領域が関連菌のrRNAの
相同領域と十分に相違していることを決定することによ
って満たされるということが１つの仮説として考えられ
る。その後、系統発生的原理に基づく一般的規則とし
て、比較的遠縁の関連菌のrRNA配列は、たとえそれらの
実際の正体が必ずしも知られていなくとも、上記の進化
論上近いリステリア関連菌（例えば枯草菌）よりも特定
の配列領域において少なくとも同程度に相違していると
推察することができる。
核酸ハイブリダイゼーションプローブの標的部位とし
て有用なリステリアrRNAの領域を同定する第一段階とし
て、本発明者らは３種類のリステリア菌：すなわちL.モ
ノサイトゲネス（L.monocytogenes）、L.イノクア（L.i
nnocua）およびL.ミライ（L.murrayi）からの16S rRNA
のほとんど完全なヌクレオチド配列を決定した。これら
は主要なリステリアDNA相同群を代表するものとして選
ばれたものであり、従ってリステリア属の進化の幅を代
表している。rRNAのいろいろな部分のヌクレオチド配列
はrRNAをコードする遺伝子のクローニング〔マニアチス
（Maniatis）ら、（1982）Molecular Cloning:A labo
ratory manual.ニューヨーク：コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー,p.545〕および塩基配列決定
〔マクサム（Maxam）ら、（1977）Proceedings of th
e National Academy of Science,USA74:560−564;
サンガー（Sanger）ら、（1977）Proceedings of the
National Academy of Science,USA 74:5463−546
7〕、および／または逆転写酵素を用いるrRNAそれ自体
の直接的塩基配列決定〔レーン（Lane）ら、（1985）Pr
oceedings of the National Academy of Scienc
e,USA 82:6955−6959〕による標準的実験手法を用いて
決定された。
て有用なリステリアrRNAの領域を同定する第一段階とし
て、本発明者らは３種類のリステリア菌：すなわちL.モ
ノサイトゲネス（L.monocytogenes）、L.イノクア（L.i
nnocua）およびL.ミライ（L.murrayi）からの16S rRNA
のほとんど完全なヌクレオチド配列を決定した。これら
は主要なリステリアDNA相同群を代表するものとして選
ばれたものであり、従ってリステリア属の進化の幅を代
表している。rRNAのいろいろな部分のヌクレオチド配列
はrRNAをコードする遺伝子のクローニング〔マニアチス
（Maniatis）ら、（1982）Molecular Cloning:A labo
ratory manual.ニューヨーク：コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー,p.545〕および塩基配列決定
〔マクサム（Maxam）ら、（1977）Proceedings of th
e National Academy of Science,USA74:560−564;
サンガー（Sanger）ら、（1977）Proceedings of the
National Academy of Science,USA 74:5463−546
7〕、および／または逆転写酵素を用いるrRNAそれ自体
の直接的塩基配列決定〔レーン（Lane）ら、（1985）Pr
oceedings of the National Academy of Scienc
e,USA 82:6955−6959〕による標準的実験手法を用いて
決定された。
これらのヌクレオチド配列は互いに比較され、また他
の利用しうるrRNAヌクレオチド配列、特に密接に関連し
た土壌細菌である枯草菌（Bacillus subtilis）のヌク
レオチド配列と比較された。枯草菌のrRNA配列に関して
有用な排他性を示す領域（すなわち、リステリア特異的
配列を含む領域）が多数発見された。これらのうちのい
くつかを図面に示し、以下で説明する。
の利用しうるrRNAヌクレオチド配列、特に密接に関連し
た土壌細菌である枯草菌（Bacillus subtilis）のヌク
レオチド配列と比較された。枯草菌のrRNA配列に関して
有用な排他性を示す領域（すなわち、リステリア特異的
配列を含む領域）が多数発見された。これらのうちのい
くつかを図面に示し、以下で説明する。
先に論じたように、この予備的分析は実行可能性の証
明をもたらすにすぎない。それぞれの核酸プローブの試
験が上記の望ましい特性：すなわち１）大部分の又は全
部の密接に関連した細胞に関する十分な排他性;2）リス
テリア菌に関する有用な包括性パターン；および３）実
際に用いられる種々の検定条件下での標的領域の接近し
やすさ；を厳密に立証するために更に必要となる。被検
プローブの排他性および包括性を定める際に非常に多く
の微生物が関与しうるので、本発明者らは可能性のある
プローブの試験および改良に関して本明細書中で述べる
相互作用的計略を採用した。
明をもたらすにすぎない。それぞれの核酸プローブの試
験が上記の望ましい特性：すなわち１）大部分の又は全
部の密接に関連した細胞に関する十分な排他性;2）リス
テリア菌に関する有用な包括性パターン；および３）実
際に用いられる種々の検定条件下での標的領域の接近し
やすさ；を厳密に立証するために更に必要となる。被検
プローブの排他性および包括性を定める際に非常に多く
の微生物が関与しうるので、本発明者らは可能性のある
プローブの試験および改良に関して本明細書中で述べる
相互作用的計略を採用した。
一代目のプローブはリステリア菌と非リステリア菌の
標的領域において観察されたヌクレオチド配列の変化を
最大限に利用する原理に基づいてデザインされる。その
後、“ドット・ブロット”分析により一代目のプローブ
（標準的なオリゴヌクレオチド技法を用いて合成された
もの）の排他性および包括性に関する予備試験を実施す
る。ドット・プロット分析は多くの異なった方法で行う
ことができるが、一般に核酸または核酸集団をフィルタ
ー（例えばニトロセルロース、ナイロン、またはこの目
的のために有効であって市販されているその他の膜誘導
体）上に固定することを包含する。RNAは容易に固定化
することができ、その後いろいろな核酸ハイブリダイゼ
ーション条件（すなわち、ストリンジェンシー）のもと
で対象のヌクレオチド配列について検索される。対象の
核酸を初めに精製しないで、粗製（未精製）溶菌液中に
含まれるRNAを固定化する手法も利用できる。後者の方
法は特定の微生物の核酸に存在しうる特定のヌクレオチ
ド配列をスクリーニングするのに要する労力を有意に軽
減し、さらに多数の微生物の大量スクリーニングに応用
できる。従って、それは多数の微生物に対する可能性の
ある核酸ハイブリダイゼーションプローブの排他性およ
び包括性を試験するのに最適の方法である。
標的領域において観察されたヌクレオチド配列の変化を
最大限に利用する原理に基づいてデザインされる。その
後、“ドット・ブロット”分析により一代目のプローブ
（標準的なオリゴヌクレオチド技法を用いて合成された
もの）の排他性および包括性に関する予備試験を実施す
る。ドット・プロット分析は多くの異なった方法で行う
ことができるが、一般に核酸または核酸集団をフィルタ
ー（例えばニトロセルロース、ナイロン、またはこの目
的のために有効であって市販されているその他の膜誘導
体）上に固定することを包含する。RNAは容易に固定化
することができ、その後いろいろな核酸ハイブリダイゼ
ーション条件（すなわち、ストリンジェンシー）のもと
で対象のヌクレオチド配列について検索される。対象の
核酸を初めに精製しないで、粗製（未精製）溶菌液中に
含まれるRNAを固定化する手法も利用できる。後者の方
法は特定の微生物の核酸に存在しうる特定のヌクレオチ
ド配列をスクリーニングするのに要する労力を有意に軽
減し、さらに多数の微生物の大量スクリーニングに応用
できる。従って、それは多数の微生物に対する可能性の
ある核酸ハイブリダイゼーションプローブの排他性およ
び包括性を試験するのに最適の方法である。
リステリア菌含有サンプル中に存在しうる細菌の型を
記した非リステリア菌の一覧表を表１に示す。これらは
またリステリア菌に最も密接に関連した属の多くを代表
している。先に論じたように、このような広い表示の細
菌に対して良好な排他性を示すプローブは実際に試験し
たものよりもさらに広い一覧表の微生物に対して同様に
ふるまうことが当然予想される。DNAプローブ568、609
および661（図面参照）は以下の実施例に記載されるス
トリンジェンシー条件下で90％以上のこれらの細胞とハ
イブリダイズしなかった。（プローブ568、609および66
1、並びに図面の他のプローブは所定のL.モノサイトゲ
ネスrRNA配列に対して相補的（３′RNA末端に対して
５′プローブ末端）であり、すなわちプローブはそれぞ
れRNAのＧに対してＣ、RNAのＡに対してＴ、RNAのＵに
対してＡ、およびRNAのＣに対してＧを有する。） プローブ568、609および661（図面参照）はまた、実
施例のストリンジェンシー条件下でL.モノサイトゲネ
ス、L.イノクア、L.ミライ、L.イバノビ（L.ivanovi
i）,L.シーリゲリ（L.seeligeri）、L.ウェルシメリ
（L.Welshimeri）およびL.グレイ（L.grayi）のリステ
リア菌と結合することにより良好な包括性を示した。
記した非リステリア菌の一覧表を表１に示す。これらは
またリステリア菌に最も密接に関連した属の多くを代表
している。先に論じたように、このような広い表示の細
菌に対して良好な排他性を示すプローブは実際に試験し
たものよりもさらに広い一覧表の微生物に対して同様に
ふるまうことが当然予想される。DNAプローブ568、609
および661（図面参照）は以下の実施例に記載されるス
トリンジェンシー条件下で90％以上のこれらの細胞とハ
イブリダイズしなかった。（プローブ568、609および66
1、並びに図面の他のプローブは所定のL.モノサイトゲ
ネスrRNA配列に対して相補的（３′RNA末端に対して
５′プローブ末端）であり、すなわちプローブはそれぞ
れRNAのＧに対してＣ、RNAのＡに対してＴ、RNAのＵに
対してＡ、およびRNAのＣに対してＧを有する。） プローブ568、609および661（図面参照）はまた、実
施例のストリンジェンシー条件下でL.モノサイトゲネ
ス、L.イノクア、L.ミライ、L.イバノビ（L.ivanovi
i）,L.シーリゲリ（L.seeligeri）、L.ウェルシメリ
（L.Welshimeri）およびL.グレイ（L.grayi）のリステ
リア菌と結合することにより良好な包括性を示した。
いくつかの他の考察もまたプローブ配列の最適なデザ
インに影響を及ぼす。初めに考察すべき事柄はプローブ
それ自体の形状（すなわち、分子内の相互作用）であ
る。L.モノサイトゲネスの16S rRNAの有用な標的領域
は自己相補性（self complementarity）の大いなる可能
性を示す領域に存在しうる。従って、これらの領域に対
するプローブも自己相補性を示すことができる。プロー
ブと標的配列との相互作用は標的またはプローブ配列の
それら自体への分子内アニーリングを支配する同じタイ
プの相互作用によって支配されるので、とりわけ溶液の
ハイブリダイゼーション条件下では、自己相補性プロー
ブがハイブリダイゼーションのためにそれらの標的配列
へ接近し難くなる可能性がある。こうして、プローブデ
ザインの１つの観点はこの種の自己相補性を最小限に抑
えることである。そのためにはリステリア特異的配列の
最大限の利用と許容しうるプローブ形状との間で妥協す
る必要がある。
インに影響を及ぼす。初めに考察すべき事柄はプローブ
それ自体の形状（すなわち、分子内の相互作用）であ
る。L.モノサイトゲネスの16S rRNAの有用な標的領域
は自己相補性（self complementarity）の大いなる可能
性を示す領域に存在しうる。従って、これらの領域に対
するプローブも自己相補性を示すことができる。プロー
ブと標的配列との相互作用は標的またはプローブ配列の
それら自体への分子内アニーリングを支配する同じタイ
プの相互作用によって支配されるので、とりわけ溶液の
ハイブリダイゼーション条件下では、自己相補性プロー
ブがハイブリダイゼーションのためにそれらの標的配列
へ接近し難くなる可能性がある。こうして、プローブデ
ザインの１つの観点はこの種の自己相補性を最小限に抑
えることである。そのためにはリステリア特異的配列の
最大限の利用と許容しうるプローブ形状との間で妥協す
る必要がある。
プローブデザインにおける別の考察は包括性の基準に
関して生じる。好適なプローブは、適当な排他性を示す
が、所望のすべてのリステリア菌のrRNAとハイブリダイ
ズし得るものである。リステリア属それ自体は表現型お
よび遺伝子の有意な変異を示す細胞から成るので、“理
想的”なプローブをデザインする（または発見する）こ
とは不可能であるかもしれない。実際に、“普遍的”な
リステリアプローブが要求されるのではなく、リステリ
ア特異的プローブの組合せ（各プローブが適当な排他性
と有用な包括性レベルを示す）が捜し求められる。全体
として、プローブの組合せは大部分の又は全部のリステ
リア菌を検出し、そして非リステリア菌をほとんど又は
全く検出しないであろう。このような組合せでは、例え
ばあるプローブが１種または数種の重要なリステリア菌
を除いた全てのリステリア菌を検出することができ、そ
して別のプローブが最初のプローブによって見落とされ
た数種のリステリア菌とのみ良好な排他性でもってハイ
ブリダイズすることができる。従って、以下に記載のプ
ローブは包括性に関して個別的に特徴づけられるが、先
に詳述した特定プローブの“組合せ”の概念も個々のプ
ローブの重要性を決定した上で考慮されねばならないこ
とを心に留めるべきである。
関して生じる。好適なプローブは、適当な排他性を示す
が、所望のすべてのリステリア菌のrRNAとハイブリダイ
ズし得るものである。リステリア属それ自体は表現型お
よび遺伝子の有意な変異を示す細胞から成るので、“理
想的”なプローブをデザインする（または発見する）こ
とは不可能であるかもしれない。実際に、“普遍的”な
リステリアプローブが要求されるのではなく、リステリ
ア特異的プローブの組合せ（各プローブが適当な排他性
と有用な包括性レベルを示す）が捜し求められる。全体
として、プローブの組合せは大部分の又は全部のリステ
リア菌を検出し、そして非リステリア菌をほとんど又は
全く検出しないであろう。このような組合せでは、例え
ばあるプローブが１種または数種の重要なリステリア菌
を除いた全てのリステリア菌を検出することができ、そ
して別のプローブが最初のプローブによって見落とされ
た数種のリステリア菌とのみ良好な排他性でもってハイ
ブリダイズすることができる。従って、以下に記載のプ
ローブは包括性に関して個別的に特徴づけられるが、先
に詳述した特定プローブの“組合せ”の概念も個々のプ
ローブの重要性を決定した上で考慮されねばならないこ
とを心に留めるべきである。
この組合せの概念はまた個々のプローブの排他的の評
価にも及ぶ。例えば、以下で述べる検出系において、プ
ローブまたはプローブの組合せによる非リステリア菌へ
の望ましくないハイブリダイゼーションは、用いる検定
の細心の計略を駆使することにより減少または排除する
ことができる。
価にも及ぶ。例えば、以下で述べる検出系において、プ
ローブまたはプローブの組合せによる非リステリア菌へ
の望ましくないハイブリダイゼーションは、用いる検定
の細心の計略を駆使することにより減少または排除する
ことができる。
いくつかの場合において、動物（特にヒト）に対して
病原性であるただ１種のリステリア菌（特にL.モノサイ
トゲネス）に特異的なプローブを使用することが好適で
ある。この種のプローブは、非病原性のリステリア菌が
サンプル中に含まれるとき偽陽性の結果をもたらさず、
従って陽性の結果が病原性リステリア菌の存在を示すこ
ととなるので都合がよい。
病原性であるただ１種のリステリア菌（特にL.モノサイ
トゲネス）に特異的なプローブを使用することが好適で
ある。この種のプローブは、非病原性のリステリア菌が
サンプル中に含まれるとき偽陽性の結果をもたらさず、
従って陽性の結果が病原性リステリア菌の存在を示すこ
ととなるので都合がよい。
プローブのデザインおよび分析の最終段階は実在する
サンプル（例えば食品／臨床上のサンプル）を試験する
ことである。
サンプル（例えば食品／臨床上のサンプル）を試験する
ことである。
プローブ 先に述べたプローブの選択計略は、サンプル中のリス
テリア菌を同定するのに有用な多数のプローブをもたら
した。プローブ選択方法の第一段階は、先に示した３種
のリステリア菌の16S rRNAに対してヌクレオチド配列
分析を実施することであった。これらのリステリア配列
を非リステリアrRNA配列（特に枯草菌のrRNA配列）と比
較することにより、排他性の基準、すなわち、本質的に
リステリア特異的であるという基準を満たす配列を同定
した。これらの領域を図面に示す。
テリア菌を同定するのに有用な多数のプローブをもたら
した。プローブ選択方法の第一段階は、先に示した３種
のリステリア菌の16S rRNAに対してヌクレオチド配列
分析を実施することであった。これらのリステリア配列
を非リステリアrRNA配列（特に枯草菌のrRNA配列）と比
較することにより、排他性の基準、すなわち、本質的に
リステリア特異的であるという基準を満たす配列を同定
した。これらの領域を図面に示す。
プローブ568および661（プローブ568の配列:5′TCGCG
GCTTCGCGACCTTTGTACTATCCA3′；プローブ661の配列:5′
GGGAAAGCTCTGTCTCCAGAGTGGTCAAAGG3′）を用いる液体ハ
イブリダイゼーション検定は、異なるハイブリダイゼー
ション条件下でこれらの領域への標的配列の良好な接近
性を示す。一般に、良好な感度も得られる。しかしなが
ら、これらのプローブは上記条件下でブロコトリックス
（Brochothrix）とハイブリダイズするであろう。従っ
て、これらの細菌は検定の間に選択されねばならない。
１つの方法はブロコトリックス菌を増殖させない条件下
で、例えば32℃や35℃のような30℃以上の温度で、サン
プル中の細菌を培養することである。この方法では、ブ
ロコトリックス菌によるバックグラウンドレベルが極め
て低いので偽陽性の結果が避けられる。
GCTTCGCGACCTTTGTACTATCCA3′；プローブ661の配列:5′
GGGAAAGCTCTGTCTCCAGAGTGGTCAAAGG3′）を用いる液体ハ
イブリダイゼーション検定は、異なるハイブリダイゼー
ション条件下でこれらの領域への標的配列の良好な接近
性を示す。一般に、良好な感度も得られる。しかしなが
ら、これらのプローブは上記条件下でブロコトリックス
（Brochothrix）とハイブリダイズするであろう。従っ
て、これらの細菌は検定の間に選択されねばならない。
１つの方法はブロコトリックス菌を増殖させない条件下
で、例えば32℃や35℃のような30℃以上の温度で、サン
プル中の細菌を培養することである。この方法では、ブ
ロコトリックス菌によるバックグラウンドレベルが極め
て低いので偽陽性の結果が避けられる。
プローブ609は上記条件下でブロコトリックスとハイ
ブリダイズせず、従って、このプローブを唯一のプロー
ブとして用いる場合リステリア菌の選択的増幅は必要な
い。
ブリダイズせず、従って、このプローブを唯一のプロー
ブとして用いる場合リステリア菌の選択的増幅は必要な
い。
リステリア23S rRNAに特異的なプローブは、16S rR
NAの場合について先に記載した通りに誘導することがで
きる。
NAの場合について先に記載した通りに誘導することがで
きる。
本発明のプローブは多種多様な検定系で用いられ、そ
の１つを以下に説明する。
の１つを以下に説明する。
（実施例） DNAハイブリダイゼーション試験は食肉、酪農製品ま
たは環境サンプル中のリステリア菌を、培地上で増殖さ
せた後に検出すべく、ラジオアイソトープ（32P、その
他の標識も同様に使用できる、例えば螢光または化学発
光標識）で標識したリステリア特異的DNAプローブを用
いた。増殖後、被検サンプル中に存在する細菌を真空
過により膜フィルター上に集菌した。溶菌後、放出され
た核酸を膜フィルターに固定した。短いプレハイブリダ
イゼーション工程後、32P−標識リステリア特異的DNAプ
ローブを添加したハイブリダイゼーション溶液中でフィ
ルターをインキュベートした。リステリア核酸（リボソ
ームRNA）が被検サンプル中に存在する場合、放射能標
識DNAプローブはフィルター上に存在する標的核酸配列
とハイブリダイズするであろう。未結合プローブを洗い
流し、そしてフィルター上の放射能をシンチレーション
カウンターまたは他のβ粒子検出器で計数することによ
り測定した。陰性対照検定に対して得られた結果より決
定された閾値を越えるフィルター上の放射能は、被検サ
ンプル中にリステリア菌が存在することを示す。この検
定は食肉または酪農製品もしくは環境サンプル中のリス
テリア菌の存在を調べるための定性試験である。１分間
あたりの放射能カウント数（cpm）がこの検定で確立さ
れたカットオフ値を越えない場合、サンプルはリステリ
ア菌の存在に対して非反応性であると考えられる。cpm
値がこの検定で確立されたカットオフ値より大きい場合
は、サンプルがリステリア菌の存在に対して反応性であ
ると考えられる。
たは環境サンプル中のリステリア菌を、培地上で増殖さ
せた後に検出すべく、ラジオアイソトープ（32P、その
他の標識も同様に使用できる、例えば螢光または化学発
光標識）で標識したリステリア特異的DNAプローブを用
いた。増殖後、被検サンプル中に存在する細菌を真空
過により膜フィルター上に集菌した。溶菌後、放出され
た核酸を膜フィルターに固定した。短いプレハイブリダ
イゼーション工程後、32P−標識リステリア特異的DNAプ
ローブを添加したハイブリダイゼーション溶液中でフィ
ルターをインキュベートした。リステリア核酸（リボソ
ームRNA）が被検サンプル中に存在する場合、放射能標
識DNAプローブはフィルター上に存在する標的核酸配列
とハイブリダイズするであろう。未結合プローブを洗い
流し、そしてフィルター上の放射能をシンチレーション
カウンターまたは他のβ粒子検出器で計数することによ
り測定した。陰性対照検定に対して得られた結果より決
定された閾値を越えるフィルター上の放射能は、被検サ
ンプル中にリステリア菌が存在することを示す。この検
定は食肉または酪農製品もしくは環境サンプル中のリス
テリア菌の存在を調べるための定性試験である。１分間
あたりの放射能カウント数（cpm）がこの検定で確立さ
れたカットオフ値を越えない場合、サンプルはリステリ
ア菌の存在に対して非反応性であると考えられる。cpm
値がこの検定で確立されたカットオフ値より大きい場合
は、サンプルがリステリア菌の存在に対して反応性であ
ると考えられる。
第一の段階はサンプル中のリステリア菌の一次増殖で
あった。酪農製品サンプルの場合は、リステリア菌増殖
培地（EB;トリプチカーゼ大豆培地粉末30g、酵母エキス
6g、蒸留水１、アクリフラビンHcl15mg/、ナリジク
ス酸Na塩40mg/、およびシクロヘキシミド50mg/）22
5mlに食品サンプル25gを加えた。この混合物はそれぞれ
のサンプルの種類により適宜にブレンダーまたはストマ
ッカーを用いて均質化し、その後フラスコまたはビンの
中で30〜50℃（好ましくは35℃）にて24±４時間インキ
ュベートした。
あった。酪農製品サンプルの場合は、リステリア菌増殖
培地（EB;トリプチカーゼ大豆培地粉末30g、酵母エキス
6g、蒸留水１、アクリフラビンHcl15mg/、ナリジク
ス酸Na塩40mg/、およびシクロヘキシミド50mg/）22
5mlに食品サンプル25gを加えた。この混合物はそれぞれ
のサンプルの種類により適宜にブレンダーまたはストマ
ッカーを用いて均質化し、その後フラスコまたはビンの
中で30〜50℃（好ましくは35℃）にて24±４時間インキ
ュベートした。
環境サンプルの試験の場合は、EB25ml（または必要に
応じてそれ以上）を含むフラスコまたはビンの中にスワ
ブ（swab）または他の環境サンプルを入れ、30〜50℃
（好ましくは35℃）で24±４時間インキュベートした。
応じてそれ以上）を含むフラスコまたはビンの中にスワ
ブ（swab）または他の環境サンプルを入れ、30〜50℃
（好ましくは35℃）で24±４時間インキュベートした。
次の段階はすべてのサンプルに対する二次増殖であっ
た。一次増殖培養物をインキュベーションから取り出し
て十分に混合した。その一次増殖培養物1mlを修飾リス
テリア増殖培地（MEB;トリプチカーゼ大豆培地粉末30
g、酵母エキス6g、３−〔Ｎ−モノホリノ〕プロパンス
ルホン酸−遊離酸（MOPS−遊離酸）8.5g、３−〔Ｎ−モ
ノホリノ〕プロパンスルホン酸−Na塩（MOPS−Na塩（MO
PS−Na塩）13.7g、蒸留水１、アクリフラビンHcl15mg
/、ナリジクス酸Na塩40mg/、およびシクロヘキシミ
ド50mg/）100mlを含むフラスコまたはビンに移し、そ
して30〜50℃（好ましくは35℃）で24±４時間インキュ
ベートした。
た。一次増殖培養物をインキュベーションから取り出し
て十分に混合した。その一次増殖培養物1mlを修飾リス
テリア増殖培地（MEB;トリプチカーゼ大豆培地粉末30
g、酵母エキス6g、３−〔Ｎ−モノホリノ〕プロパンス
ルホン酸−遊離酸（MOPS−遊離酸）8.5g、３−〔Ｎ−モ
ノホリノ〕プロパンスルホン酸−Na塩（MOPS−Na塩（MO
PS−Na塩）13.7g、蒸留水１、アクリフラビンHcl15mg
/、ナリジクス酸Na塩40mg/、およびシクロヘキシミ
ド50mg/）100mlを含むフラスコまたはビンに移し、そ
して30〜50℃（好ましくは35℃）で24±４時間インキュ
ベートした。
次の検定法はGENE−TRAKマニホールド・キット（GENE
−TRAK Systemsカタログ番号GT801）を利用する。培養
細胞1mlは10×TE（トリス10mM、EDTA1mM、pH7.6）緩衝
液中の酵素溶液〔ムタノリシン（Sigma社から購入）300
0単位およびリゾチーム（Sigma社から購入）150mgを含
む〕0.5mlと共に室温（15〜30℃）で15分間インキュベ
ートすることにより処理した。その後、各試験管の内容
物をフィルターカップを用いて真空過した。これは酵
素によって細胞壁が弱められた培養細胞のフィルター上
への集菌をもたらした。
−TRAK Systemsカタログ番号GT801）を利用する。培養
細胞1mlは10×TE（トリス10mM、EDTA1mM、pH7.6）緩衝
液中の酵素溶液〔ムタノリシン（Sigma社から購入）300
0単位およびリゾチーム（Sigma社から購入）150mgを含
む〕0.5mlと共に室温（15〜30℃）で15分間インキュベ
ートすることにより処理した。その後、各試験管の内容
物をフィルターカップを用いて真空過した。これは酵
素によって細胞壁が弱められた培養細胞のフィルター上
への集菌をもたらした。
その後、これらの細胞中の核酸を次のようにして変性
した。リステリア溶菌／変性溶液（0.675Mグアニジンチ
オシアネート、１×TE）をフィルターが液体で覆われる
までフィルターカップへ吹きかけ、２分後その溶液を真
空過した。次に、リステリア中和溶液（1MトリスpH
8、0.6M NaCl）をフィルターが溶体で覆われるまでフ
ィルターカップへ吹きかけ、再び２分後にその溶液を真
空過した。その後、リステリア固定溶液（95％エタノ
ール、５％水）をフィルターが液体で覆われるまでフィ
ルターカップへ吹きかけ、２分後その溶液を真空過し
た。
した。リステリア溶菌／変性溶液（0.675Mグアニジンチ
オシアネート、１×TE）をフィルターが液体で覆われる
までフィルターカップへ吹きかけ、２分後その溶液を真
空過した。次に、リステリア中和溶液（1MトリスpH
8、0.6M NaCl）をフィルターが溶体で覆われるまでフ
ィルターカップへ吹きかけ、再び２分後にその溶液を真
空過した。その後、リステリア固定溶液（95％エタノ
ール、５％水）をフィルターが液体で覆われるまでフィ
ルターカップへ吹きかけ、２分後その溶液を真空過し
た。
フィルター上の変性核酸はその後次のようにしてハイ
ブリダイズさせた。フィルターをカップから取り出し、
65℃に加温しておいたリステリアプレハイブリダイゼー
ション溶液（６×SSC、0.5％SDS、１×デンハート、1mM
EDTA）25mlを含む50mlの円錐底の試験管に入れた。そ
の試験管と内容物を65℃の水浴中に30分置いた。液体を
試験管から流出させ、そして65℃に加温しておいたリス
テリアハイブリダイゼーション溶液（６×SSC、0.5％SD
S、１×デンハート、1mM EDTAおよび12μCiの標識リス
テリアプローブ）12mlを加えた。試験管と内容物を65℃
の水浴中に120分間置いた。
ブリダイズさせた。フィルターをカップから取り出し、
65℃に加温しておいたリステリアプレハイブリダイゼー
ション溶液（６×SSC、0.5％SDS、１×デンハート、1mM
EDTA）25mlを含む50mlの円錐底の試験管に入れた。そ
の試験管と内容物を65℃の水浴中に30分置いた。液体を
試験管から流出させ、そして65℃に加温しておいたリス
テリアハイブリダイゼーション溶液（６×SSC、0.5％SD
S、１×デンハート、1mM EDTAおよび12μCiの標識リス
テリアプローブ）12mlを加えた。試験管と内容物を65℃
の水浴中に120分間置いた。
ハイブリダイゼーション後、フィルターを次のように
して洗った。試験管の内容物を捨て、予め65℃に加温し
ておいたリステリア洗液（0.5×SSC、0.1％SDS、0.16％
消泡剤Ｂ）25mlを加えた。この試験管を振って65℃に５
分間置いた。その後再び試験管を振り、液体を流出させ
た。この方法を５回以上繰り返した。
して洗った。試験管の内容物を捨て、予め65℃に加温し
ておいたリステリア洗液（0.5×SSC、0.1％SDS、0.16％
消泡剤Ｂ）25mlを加えた。この試験管を振って65℃に５
分間置いた。その後再び試験管を振り、液体を流出させ
た。この方法を５回以上繰り返した。
洗ったフィルターは試験管から取り出し、きれいな紙
シート上に置いてβカウンターで30秒間計数した。各フ
ィルターのcpmを記録した。
シート上に置いてβカウンターで30秒間計数した。各フ
ィルターのcpmを記録した。
一般に３つの陰性対照フィルター（所定の非リステリ
ア菌から調製したもの）の平均値を出し、この値に500c
pmを加えて、この数をカットオフ値として定めた。その
カットオフ値よりも大きいcpmを示すフィルターはリス
テリア菌が存在すると思われ、より小さいcpmを示すフ
ィルターはリステリア菌の不在を示す。
ア菌から調製したもの）の平均値を出し、この値に500c
pmを加えて、この数をカットオフ値として定めた。その
カットオフ値よりも大きいcpmを示すフィルターはリス
テリア菌が存在すると思われ、より小さいcpmを示すフ
ィルターはリステリア菌の不在を示す。
その他の実施態様は特許請求の範囲内に含まれる。
第１図はリステリア菌／枯草菌の差異が発見されたリス
テリア16S rRNAの５つの領域のヌクレオチド配列を示
し、枯草菌および他の細菌の対応するrRNA配列をリステ
リア配列の下に示す。L.monはL.モノサイトゲネス（医
療上最も関心のあるリステリア菌種である）を表し、L.
innはL.イノクアを表し、L.murはL.ムライを表し、B.S.
は枯草菌を表し、B.T.はブロコトリックス・サーモスフ
ァクタムを表し、P.V.はプロテウス・ブルガリスを表
し、E.C.は大腸菌を表し、そしてH.V.はハロバクテリウ
ム・ボルカニを表す。
テリア16S rRNAの５つの領域のヌクレオチド配列を示
し、枯草菌および他の細菌の対応するrRNA配列をリステ
リア配列の下に示す。L.monはL.モノサイトゲネス（医
療上最も関心のあるリステリア菌種である）を表し、L.
innはL.イノクアを表し、L.murはL.ムライを表し、B.S.
は枯草菌を表し、B.T.はブロコトリックス・サーモスフ
ァクタムを表し、P.V.はプロテウス・ブルガリスを表
し、E.C.は大腸菌を表し、そしてH.V.はハロバクテリウ
ム・ボルカニを表す。
Claims (11)
- 【請求項１】65℃、６×SSCのハイブリダイゼーション
条件下で、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria
monocytogenes）のrRNAにハイブリダイズしうるが、枯
草菌（Bacillus subtilis）のrRNAにはハイブリダイズ
しない核酸フラグメントを含む核酸プローブであって、
前記核酸フラグメントは、第１図に示されたプローブIG
563、IG565、662、661、564、566、568、567、610およ
び609のいずれか１つに対応する、L.モノサイトゲネス
の16S rRNAの領域に相補的な核酸配列からなるフラグ
メントであるか、または当該フラグメントに相補的であ
る、前記核酸プローブ。 - 【請求項２】前記核酸フラグメントが、上記条件下でア
エロモナス・ソブリア（Aeromonas sobria）、バシラ
ス・セレウス（Bacillus cereus）、枯草菌（Bacillus
subtilis）、ブロコトリックス・サーモスファクタ
（Brochothrix thermosphacta）、シトロバクター・フ
ロインド（Citrobacter freundii）、コリネバクテリ
ウム・キセロシス（Corynebacterium xerosis）、ジフ
テリア菌（Corynebacterium diptheriae）、エシェリ
キア・ブルネリス（Escerichia vulneris）、エンテロ
バクター・アグロメランス（Enterobacter agglomeran
s）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter clo
acae）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、クレブ
シェラ・オキシトカ（Klebsilla oxytoca）、カセイ菌
（Lactobacillus casei）、緑膿菌（Pseudomonas aer
uginosa）、ロドコッカス・エクイ（Rhodococcus equi
i）、サルモネラ・アリゾナ（Salmonella arizona
e）、豚コレラ菌（Salmonella cholerae−suis）、チ
フス菌（Salmonella typhi）、セラチア・オドリフェ
ラ（Serratia odorifera）、ボイド赤痢菌（Shigella
boydii）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexner
i）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、黄色ブドウ
球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（St
aphylococcus epidermis）、スタフィロコッカス・ホ
ミニス（Staphylococcus hominis）、スタフィロコッ
カス・サブフィチクス（Staphylococcus saprophyticu
s）、ストレプトコッカス・アガラクチカ（Streptococc
us agalacticae）、ストレプトコッカス・ボビス（Str
eptococcus bovis）、糞便連鎖球菌（Streptococcus
faecalis）、ストレプトコッカス・ファシウム（Strept
ococcus faecium）、乳連鎖球菌（Streptococcus lac
tis）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptoco
ccus mutans）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneum
oniae）、ストレプトマイセス・グロビスポラス（Strep
tococcus globisporus）およびエルシニア・エンテロ
コリチカ（Yersinia enterocolitica）のrRNAにハイブ
リダイズすることができない、請求項１記載のプロー
ブ。 - 【請求項３】前記核酸フラグメントが、プローブ568ま
たはその相補鎖に上記ハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイズすることができる、請求項１記載のプロ
ーブ。 - 【請求項４】前記核酸フラグメントが、プローブ661ま
たはその相補鎖に上記ハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイズすることができる、請求項１記載のプロ
ーブ。 - 【請求項５】前記核酸フラグメントが、プローブ609ま
たはその相補鎖に上記ハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイズすることができる、請求項１記載のプロ
ーブ。 - 【請求項６】請求項１記載の核酸プローブとサンプル中
の細菌とを、上記フラグメントを上記サンプル中のリス
テリア菌のrRNAにハイブリダイズさせてハイブリッド核
酸複合体を形成させる条件下で接触させ、そして 上記ハイブリッド複合体を上記サンプル中のリステリア
菌の存在の指標として検出する ことを含む、サンプル中のリステリア菌の検出方法。 - 【請求項７】リステリア菌を増殖させてブロコトリック
ス（Brochothrix）菌を増殖させない培養条件下で上記
サンプル中の細菌を培養することを含む、請求項６に記
載の方法。 - 【請求項８】上記培養条件が30℃以上の増殖温度であ
る、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】上記接触に先立って、上記サンプルをリス
テリア菌の一次増殖段階に付し、続いて二次の非特異的
細胞増殖段階に付し、該二次増殖段階を上記の増殖させ
たサンプルのpHを6.5−8.0に維持するために緩衝液中で
行う、請求項６に記載の方法。 - 【請求項１０】上記pHを約7.2に維持する、請求項９に
記載の方法。 - 【請求項１１】上記接触に先立って、サンプル中のリス
テリア菌をそれらの細胞壁を弱める酵素と接触させ、そ
の後溶菌する、請求項６に記載の方法。
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