JPH01304899A - リステリア菌の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はリステリア（Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　）属に含まれ
る細菌を検出することに関する。本明細書中で用いる“
リステリア“なる用語は、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕ
ａｌｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙにおいて分類された細菌を意味するが、但し
分子および表現型を考慮して最近リステリア属から除か
れたり、デニトリフィカンス（Ｌ、　　ｄｅｎｉｔｒｉ
ｆｉｃａｎｓ）を含まないものとする〔ロカート（Ｒｏ
ｃｏｕｒｔ　）ら、（１９，８７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｎ
ｌａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　（提出済み）
〕。リステリア菌ノ検出は医療および公衆衛生の面で重
要である。リステリア感染症はかぜ程度からインフルエ
ンザまでの様々な症状を呈するが、特に胎児にとって危
険であって５０％の死亡率をもたらす。

（従来の技術） 標準的な実験方法および食品医薬品局（Ｆ、Ｄ、Ａ、）
によって推薦された方法によれば、環境被検物または酪
農被検物（例えば牛乳）中のリステリア菌の存在は、こ
れらの微生物の増殖に適した条件下に微生物学的培地上
で適当に調製したサンプルを培養することにより検出さ
れる。形成されたコロニーは、一般にサンプル入手の４
８時間後に開始され完了するまでに９〜１９日を要する
方法により、形態学的および生化学的特性について試験
される。

コーン（Ｋｏｈｎｅ　）ら（１９６８）　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ　　８　：’１１０４−１１
１８はｒＲＮＡ配列に対するプローブの作製方法を開示
している。

ペース（Ｐａｃｅ　）およびキャ７ペル（Ｃａｍｐｂｅ
ｌｌ　）（１９７１）Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１０７：５４３−５４７は異なっ
た細菌種からのリボンームリボ核酸の相同性並びにこれ
らの相同レベルを定量化するための・・イブリダイゼー
ション法を開示している。

ソギン（Ｓｏｇｉｎ　）、ソギン（Ｓｏｇｉｎ　）およ
びワース（Ｗｏｅｓｅ　）　（１９７２）　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　　ｏｆ　　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　　Ｅｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ　１　：　１７３−１８４は系統発生的関係を
評価するために、異なるリポソームＲＮＡ分子の一次構
造の特性決定を使用する理論的および実際的方法を開示
している。

フォックス（Ｆａｘ　）、ペック７　：ｙ　（Ｐｅｃｈ
ｍａｎ　）およびワース（Ｗｏｅｓｅ　）　（１９７７
）　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌ　　ｏ
ｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ　２７　：４４−５７は原核生物系統学への（１６
Ｓ　ＩＪボソームＲＮＡの）比較分類法を開示している
。

本発明は以下の定義を参照することにより一層よく理解
されるであろう： ＤＮＡ−デオキシリボ核酸、糖成分としてデオキシリボ
ースを含む核酸。

ＲＮＡ−ＩＪボ核酸、糖成分としてリボースを含み、最
も一般的にはＤＮＡから転写（複製）される核酸。ＲＮ
Ａ分子は情報（例えばメツセンジャーＲＮＡ）、触媒、
または構造（例えばリポソームＲＮＡ、以下参照）の諸
細胞機能を果たす。

ｒＲＮＡ−リポソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子はリポソ
ーム、複合タンパク質およびＲＮＡ含有’“オルガネラ
°゛（転移ＲＮＡと一緒になって翻訳装置を構成する）
の重要な因子である。リポソームは遺伝情報を生命の主
な構造的および触媒的要素である細胞タンパク質へ翻訳
する唯一の既知的手段として作用するので、全ての生物
にとって非常に大切である。

リポソームは６種類の別個のＲＮＡ分子を含み、大腸菌
（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）では５Ｓ、１６Ｓおよび２３Ｓｒ
　ＲＮＡと呼ばれている。これらの名称は歴史的に沈降
速度によって決定されたＲＮＡ分子の大きさに関係があ
る。しかしながら、これらのＲＮＡ分子の大きさは実際
上生物間で異なっている。５Ｓ、１６Ｓおよび２３　Ｓ
　　ｒＲＮＡは一般に細菌の相同なＲＮＡ分子に対する
共通の名称として用いられており、本明細書においても
そのように用いられろ。

ハイブリダイゼーション−明確に定められた反応条件下
で、２本の部分的に又は完全に相補的な核酸を逆平行状
態に組み合わせて特異的かつ安定な水素結合を形成させ
る方法。それぞれの組の・・イブリダイゼーション条件
のストリンジエンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　）は、
プローブ／標的２本鎖の塩基組成、並びに２本の核酸の
誤対合レベルおよびその形状によって定められる。スト
リンジエンシーはまたハイブリダイゼーション溶液中に
存在するイオン種の濃度および種類、存在する変性剤の
種類および濃度、そして／またノ・イブリダイゼーショ
ンの温度のような反応パラメーターによって支配される
。

プローブ−明確に定められたストリンジエンシーのもと
で、標的核酸配列と特異的に（すなわち優先的に）ハイ
ブリダイズする特定のヌクレオチド配列を含むよう考案
または選択された合成核酸、もしくは生物学的に作られ
た核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）。

標的−特定のグローブが優先的にハイブリダイズし得る
核酸配列。

その他の定義は本明細書中に現れるそれらの第一の用途
として示される。

（発明の要約） 本発明は、特定のハイブリッド形成条件下でリステリア
・モノサイトゲネス（Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏ　−
ｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　）のリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮ
Ａ　）分子の存在を検出し得るが、同一条件下で被検サ
ンプル中に存在しうる密接に関連した枯草菌（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　）のｒ　ＲＮＡを検出し得
ないＤＮＡまたはＲＮＡ配列から本質的に成る核酸プロ
ーブもしくは核酸プローブの組合せを提供する。

本発明はまたこれらのプローブを利用する検定系を提供
し、この検定系は上述した望ましいプローブの作用を増
強することができる。本発明は以下の増強された実施性
能を示す： ａ）感度の増加、すなわち所定のサンプル中のリステリ
ア菌を現在使用されている方法よりも効率よく検出する
ことができる； ｂ）生物学的に作られたプローブではなく、化学的に合
成されたプローブを使用するために、プローブ作製にお
いて大幅にコストダウンが可能である； ｃ）ｒＲＮＡ配列の特性決定が同定の基礎をなすために
、生化学的に異常なリステリア菌でさえも正確に同定で
きる；および ｄ）本発明の試験はさらに増殖させる必要のない培養細
胞上で行われるので結果がより速く得られ、たったの２
〜４日を要するのみである。

標的分子としてのリステリアｒＲＮＡの使用は多くの利
点をもたらし、なかでも （１）　　ｒ　ＲＮＡは細胞質量のかなりの部分を占め
る。

細胞リポソームの概算含有量は変化するが、活発に増殖
しつつあるリステリア菌は細胞あたり５．０×１０４個
より多くのリポソームを含み、それ故に５．０Ｘ１０’
コピー数の（リポソーム中に１：１：１の化学量論的比
で存在する）それぞれのｒＲＮＡを含有する。対照的Ｋ
、その他の細胞標的分子、遺伝子またはそのＲＮＡ転写
物は多くの場合比較的少ない量で存在する。

（２）　　ｒＲＮＡ　（およびそれらをコードする遺伝
子）は同時代の生物間で側方転移（１ａｔｅｒａｌ　ｔ
ｒａｎｓｆｅｒ）を受けないと思われる。従って、ｒＲ
ＮＡの一次構造は、同時代の生物間で側方伝播（ｌａｔ
ｅｒａｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を受けやすいプラ
スミド由来の遺伝子またはその産物の場合のような遺伝
子特異的標的ではな（てむしろ生物特異的分子標的を提
供する。

ｒ　ＲＮＡ検出に付随する利点を提供するほかに、本発
明は、１本または数本のプローブが有意な数のリステリ
ア菌の標的領域とハイブリダイズし得る程度にこれらの
リステリア菌において十分に類似しているが、プローブ
がリステリアｒ　ＲＮＡとハイブリダイズするのと同じ
条件下で、それらが大部分の非リステリアｒＲＮＡとハ
イブリダイズし得ないか、又は極めて少な（ハイブリダ
イズするよ５犬部分の非リステリアｒＲＮＡにおいて十
分に異なっているリステリアｒＲＮＡ標的配列に対する
プローブを提供する。これらのプローブの特性はそれぞ
れ包括性および排他性として定められる。さらに、本発
明のグローブは通常の検定条件下でグローブに接近しや
すくなりうる標的領域とハイブリダイズする。

本発明の特に好適な実施態様では、サンプル中のリステ
リア菌を速やかに増殖させるが、密接に関連したブロコ
トリックス（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ　）　ｆｆ１ヲ増
殖させない条件下でサンプ／ｌ＜中の細菌を増殖させる
検定法が用いられる。この増殖期間後に、サンプルに関
してハイブリダイゼーション分析が行われる。このよう
な検定においては、プレハイブリダイゼーシコンによる
リステリア菌の選択的増幅ゆえに、プローブと関連ブロ
コトリックス菌のｒＲＮＡとの若干の交差ハイブリダイ
ゼーションを許容することができる。

他の好適な実施態様において、リステリア菌の検出方法
は、リステリアｒ　ＲＮＡと１本以上のプロ−プとを接
触させる前に、サンプルをリステリア菌の一次増殖段階
に付し、続いて二次非特異的細菌増殖段階（この段階は
増殖させたサンプルのｐＨを６．５〜８．０、最も好ま
しくは約７２に維持するために緩衝液、最も好ましくは
ろ−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸含有緩衝液
中で実施される）に付すことを包含する。このｐＨ制御
はサンプル中のリステリア菌を二次増殖の期間中に他の
方法よりも速やかに増殖させることが分かった。

その他の好適な実施態様において、リステリア菌の検出
方法は、リステリアｒＲＮＡと１本以上のプローブとを
接触させる前に、サンプル中のリステリア菌を、細胞溶
解剤（例えばグアニジニウムチオシアネート）を用いて
溶菌する前にリステリア菌の細胞壁を弱める酵素と接触
させる段階を包含する。この酵素処理はハイブリダイゼ
ーション反応を大いに改善することが分かった。

本発明のその他の特徴および利点は、その好適な実施態
様の以下の説明、および特許請求の範囲から明らかにな
るであろう。

（好適な実施態様の説明） 続いて本発明の好適な実施態様を説明する。

プローブの開発計画 本発明グローブの開発における第一段階は、リステリア
特異的核酸グローブの標的部位として役立ちうる１６Ｓ
および２３　Ｓ　　ｒＲＮＡの領域を同定することであ
る。実際の事として、被検サンプル中にどの非すステリ
ア菌が存在するかを推定的に予告することは困難である
。非すステリア菌が多数存在しうるために、所定のプロ
ーブ配列の排他性を証明することは極めて難しく、かつ
労力を要する。しかしながら、検索および開発の初期段
階において、すべての被検サンプル（最終的にプローブ
を用いてスクリーニングされるサンプル）中にどんな非
すステリア菌が存在するのかを知る必要性を回避する比
較的厳密な基準を採用しうろ。

これはリステリア菌同士の、およびリステリア菌と他の
細菌群との、系統発生的関係の知識を必要とする。詳細
に述べれば、排他性の基準は、進化論上近い代表的なリ
ステリア関連菌（特に枯草菌）とリステリア菌とがリス
テリア配列に特異的なプローブを用いるハイブリダイゼ
ーションにより区別できろように、リステリアｒ　ＲＮ
Ａの特定の標的領域が関連菌のｒ　ＲＮＡの相同領域と
十分に相違していることを決定することによって満たさ
れるということが１つの仮説として考えられる。その後
、系統発生的原理に基づく一般的規則として、比較的遠
縁の関連菌のｒ　ＲＮＡ配列は、たとえそれらの実際の
正体が必ずしも知られていなくとも、上記の進化論上近
いリステリア関連菌（例えば枯草菌）よりも特定の配列
領域において少なくとも同程度に相違していると推察す
ることができる。

核酸ハイブリダイゼーションプローブの標的部位として
有用なリステリアｒＲＮＡの領域を同定する第一段階と
して、本発明者らは６種類のリステリア菌：すなわちり
、モノサイトゲネス（Ｌ、　ｍｏｎｏ　−ｃｙｔｏｇｅ
ｎｅｓ　）、Ｌ、イノクア（Ｌ、　　１ｎｎｏｃｕａ　
）およびＬ６ミライ（Ｌ、　ｍｕｒｒａｙｉ　）からの
１６　Ｓ　　ｒＲＮＡのほとんど完全なヌクレオチド配
列を決定した。これらは主要なリステリアＤＮＡ相同群
を代表するものとして選ばれたものであり、従ってリス
テリア属の進化の幅を代表している。ｒＲＮＡのいろい
ろな部分のヌクレオチド配列はｒＲＮＡをコードする遺
伝子のクローニング〔マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
　ラ、（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎ
ｉｎ、ｇ　：　Ａ　　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａ
ｌ、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−１ｐ、５４５〕および塩基配列決定〔マク
サム（Ｍａｘａｍ　）ら、（１９７７）Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ　　　ｏｆ　　　ｔｈｅ　　　Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　　　Ａｃａｄｅｍｙ　　　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ、　
ＵＳＡ　７４°５６０−５６４　；サンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ）ら、（１９７７）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏ
ｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏ
ｆ　　５ｃｉｅｎｃｅ、　ＵＳＡ　　７４　：５４６３
−５４６７〕、および／または逆転写酵素を用いるｒＲ
ＮＡそれ自体の直接的塩基配列決定〔レーン（Ｌａｎｅ
）ら、（１９８５）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　　
ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ
　　５ｃｉｅｎｃｅ。

ＵＳＡ　　８２　：　６９５５−６９５９１による標準
的実験手法を用いて決定された。

これらのヌクレオチド配列は互いに比較され、また他の
利用しうろｒＲＮＡヌクレオチド配列、特に密接に関連
した土壌細菌である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ　）のヌクレオチド配列と比較された。枯草菌
のｒ　ＲＮＡ配列に関して有用な排他性を示す領域（す
なわち、リステリア特異的配列を含む領域）が多数発見
された。これらのうちのいくつかを図面に示し、以下で
説明する。

先に論じたように、この予備的分析は実行可能性の証明
をもたらすにすぎない。それぞれの核酸プローブの試験
が上記の望ましい特性；すなわち１）大部分の又は全部
の密接に関連した細菌に関する十分な排他性；２）リス
テリア菌に関する有用な包括性パターン；および６）実
際に用いられる種々の検定条件下での標的領域の接近し
ゃすさ；を厳密に立証するために更に必要となる。被検
プローブの排他性および包括性を定める際に非常に多く
の微生物が関与しうるので、本発明者らは可能性のある
プローブの試験および改良に関して本明細書中で述べる
相互作用的計略を採用した。

−伏目のプローブはリステリア菌と非リステリア菌の標
的領域において観察されたヌクレオチド配列の変化を最
大限に利用する原理に基づいてデザインされる。その後
、“ドツト・プロット°”分析により一伏目のプローブ
（標準的なオリゴヌクレオチド技法を用いて合成された
もの）の排他性および包括性に関する予備試験を実施す
る。ドツト・プロット分析は多（の異なった方法で行う
ことができるが、一般に核酸または核酸集団をフィルタ
ー（例エバニトロセルロース、ナイロン、マたはこの目
的のために有効であって市販されているその他の膜誘導
体）上に固定することを包含する。ＲＮＡは容易に固定
化することができ、その後いろいろな核酸ハイブリダイ
ゼーション条件（すなわち、ストリンジエンシー）のも
とで対象のヌクレオチド配列について検索される。対象
の核酸を初めに精製しないで、粗製（未精製）溶菌液中
に含まれるＲＮＡを固定化する手法も利用できる。後者
の方法は特定の微生物の核酸に存在しうる特定のヌクレ
オチド配列をスクリーニングするのに要する労力を有意
に軽減し、さらに多数の微生物の大量スクリーニングに
応用できる。従って、それは多数の微生物に対する可能
性のある核酸ハイブリダイゼーションプローブの排他性
および包括性を試験するのに最適の方法である。

リステリア菌含有サンプル中に存在しうる細菌の型を記
した非リステリア菌の一覧表を表１に示す。これらはま
たリステリア菌に最も密接に関連した属の多くを代表し
ている。先に論じたように、このような広い表示の細菌
に対して良好な排他性を示すプローブは実際に試験した
ものよりもさらに広い一覧表の微生物に対して同様にふ
るまうことが当然予想される。ＤＮＡプローブ５６８．
６０９および６６１（図面参照）は以下の実施例に記載
されるストリンジエンシー条件下で９０％以上のこれら
の細菌とハイブリダイズしなかった。

（プローブ５６８．６０９および６６１、並びに図面の
他のプローブは所定のり、モノサイトゲネスｒＲＮＡ配
列に対して相補的（３’ＲＮＡ末端に対して５′プロー
ブ末端）であり、すなわちプローブはそれぞれＲＮＡの
Ｇに対してＣ，ＲＮＡのＡに対してＴ、ＲＮＡのＵに対
してＡ、およびＲＮＡのＣに対してＧを有する。） 表　　　１ プローブをスクリーニングする際に用いた非リステリア
菌の部分的−覧表 アエロモナス・ツブリア　　（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　　
５ｏｂｒｉａ）バシラスセセレウス　　　　（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ）枯草菌　　　　　　　（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）ジフテリア菌　　
　　　（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｔｈ
ｅｒｉａｅ）エシェリキア・プルネリス（Ｅｓｃｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｖｕｌｎｅｒｉｓ）肺炎杆菌　　　　　（Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）クレブ
シェラ・オキシトカ　（Ｋｌ　ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘ
ｙｔｏｃａ　）カセイ菌　　　　　　（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　）緑膿菌　　　　　　　（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）ロ
ドコッカス・エクイ　　　　（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
　　ｅｑｕｉｉ　）サルモネラ・アリゾナ　　　（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｒｉｚｏｎａｅ　）豚コレラ菌　
　　　　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｃｈｏｌｅｒａｅ−
ｓｕｉｓ）チフス菌　　　　　　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ　ｔｙｐｈｉ　）セラチア・オドリフエラ　　（Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）ボイド赤痢菌　　
　　（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｂｏｙｄｉｉ　）フレクスナ
ー赤痢菌　　（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ）
リンネ赤痢菌　　　　　（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　５ｏｎｎ
ｅｉ　）黄色ブドウ球菌　　　（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）表皮ブドウ球菌　　　（
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓ）リチカ グローブ５６８．６０９および６６１（図面参照）はま
た、実施例のストリンジエンシー条件下でり、モノサイ
トゲネス、Ｌ、イノクア、Ｌ、ミライ、Ｌ、イバノピ（
Ｌ、　１ｖａｎｏｖｉｉ　）　、Ｌ、シーリゲリ（Ｌ。

ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ　　）　、Ｌ、ウェルシメリ（Ｌ、
　Ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）およびり、グレイ（Ｌ、　ｇ
ｒａｙｉ　）のリステリア菌と結合することにより良好
な包括性を示した。

いくつかの他の考察もまたプローブ配列の最適なデザイ
ンに影響を及ぼす。初めに考察すべき事柄はプローブそ
れ自体の形状（すなわち、分子内の相互作用）である。

Ｌ、モノサイトゲネスの１６８　　ｒＦｔＮＡの有用な
標的領域は自己相補性（ｓｅｌｆｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
ａｒｉｔｙ　）の大いなる可能性を示す領域に存在しう
る。従って、これらの領域に対するプローブも自己相補
性を示すことができる。プローブと標的配列との相互作
用は標的またはプローブ配列のそれら自体への分子内ア
ニーリングを支配する同じタイプの相互作用によって支
配されるので、とりわけ溶液のノ・イブリダイゼーショ
ン条件下では、自己相補性プローブがハイブリダイゼー
ションのためにそれらの標的配列へ接近し難（なる可能
性がある。こうして、プローブデザインの１つの観点は
この種の自己相補性を最小限に抑えることである。その
ためにはリステリア特異的配列の最大限の利用と許容し
うるグローブ形状との間で妥協する必要がある。

プローブデザインにおける別の考察は包括性の基準に関
して生じろ。好適なプローブは、適当な排他性を示すが
、所望のすべてのリステリア菌のｒＲＮＡとハイブリダ
イズし得るものである。リステリア属それ自体は表現型
および遺伝子の有意な変異を示す細菌から成るので、“
理想的パなプローブをデザインする（または発見する）
ことは不可能であるかもしれない。実際に、“普遍的′
”なリステリアプローブが要求されるのではなく、リス
テリア特異的プローブの組合せ（各プローブが適当な排
他性と有用な包括性レベルを示す）が捜し求められる。

全体として、プローブの組合せは大部分の又は全部のリ
ステリア菌を検出し、そして非リステリア菌をほとんど
又は全く検出しないであろう。このような組合せでは、
例えばあるプローブが１種または数種の重要なリステリ
ア菌を除いた全てのリステリア菌を検出することができ
、そして別のプローブが最初のプローブによって見落と
された数種のリステリア菌とのみ良好な排他性でもって
ハイブリダイズすることができろ。従って、以下に記載
のプローブは包括性に関して個別的に特徴づけられるが
、先に詳述した特定プローブの組合せ°′の概念も個々
のプローブの重要性を決定した上で考慮されねばならな
いことを心に留めろべきである。

この組合せの概念はまた個々のプローブの排他性の評価
にも及ぶ。例えば、以下で述べる検出系において、プロ
ーブまたはプローブの組合せによる非リステリア菌への
望ましくない／・イブリダイゼーションは、用いろ検定
の細心の計略を駆使することにより減少または排除する
ことができろ。

いくつかの場合において、動物（特にヒト）に対して病
原性であるただ１種のリステリア菌（特にり、モノサイ
トゲネス）に特異的なプローブな使用することが好適で
ある。この種のプローブは、非病原性のリステリア菌が
サンプル中に含まれるとき偽陽性の結果をもたらさず、
従って陽性の結果が病原ａＩＪステリア菌の存在を示す
こととなるので都合がよい。

プローブのデザインおよび分析の最終段階は実在するサ
ンプル（例えば食品／臨床上のサンプル）を試験するこ
とである。

プローブ 先に述べたプローブの選択計略は、サンプル中のリステ
リア菌を同定するのに有用な多数のプローブをもたらし
た。プローブ選択方法の第一段階は、先に示した３種の
リステリア菌の１６ＳｒＲＮＡに対してヌクレオチド配
列分析を実施することであった。これらのリステリア配
列を非すステリアｒＲＮＡ配列（特に枯草菌のｒＲＮＡ
配列）と比較することにより、排他性の基準、すなわち
、本質的にリステリア特異的であるという基準を満たす
配列を同定した。これらの領域を図面に示す。

プローブ５６８および６６１（プローブ５６８の配列：
　５’ＴＣＧＣＧＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＴＡ
ＣＴＡＴＣＣＡ　３’；プローブ６６１の配列：　５’
ＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴ
ＣＡＡＡＧＧ６′）を用いる液体ハイブリダイゼーショ
ン検定は、異なるハイブリダイゼーション条件下でこれ
らの領域への標的配列の良好な接近性を示す。一般に、
良好な感度も得られる。しかしながら、これらのプロー
ブは上記条件下でプロコトリノクス（Ｂｒｏｃｈｏｔｈ
ｒｉｘ　）とハイブリダイズするであろう。従って、こ
れらの細菌は検定の間に選択されねばならない。１つの
方法はプロコトワックス菌を増殖させない条件下で、例
えば３２℃や６５℃のような３０℃以上の温度で、サン
プル中の細菌を培養することである。この方法では、プ
ロコトリソクス菌によるバックグラウンドレベルが極め
て低いので偽陽性の結果が避けられる。

プローブ６０９は上記条件下でプロコトリノクスとハイ
ブリダイズせず、従って、このプローブな唯一のプロー
ブとして用いる場合リステリア菌の選択的増幅は必要な
い。

リステリア２３　Ｓ　　ｒＲＮＡに特異的なプローブは
、１６　Ｓ　　ｒＲＮＡの場合について先に記載した通
りに誘導することができる。

本発明のプローブは多種多様な検定系で用いられ、その
１つを以下に説明する。

（実施例） ＤＮＡハイブリダイゼーション試験は食肉、酪餐製品ま
たは環境サンプル中のリステリア菌を、培地上で増殖さ
せた後に検出すべ（、ラジオアイソトープ（，３２，Ｐ
、その他の標識も同様に使用できる、例えば螢光または
化学発光標識）で標識したリステリア特異的ＤＮＡプロ
ーブを用いた。増殖後、被検サンプル中に存在する細菌
を真空濾過により模フィルター上に集菌した。溶菌後、
放出された核酸を膜フィルターに固定した。短いプレハ
イプリダイモーション工程後、３２ｐ−標ｆｉ　リステ
リア特異的ＤＮＡプローブを添加したハイブリダイゼー
ション溶液中でフィルターをインキュベートした。リス
テリア核酸（リボソームＲＮＡ）が被検サンプル中に存
在する場合、放射能標！ＤＮＡプローブはフィルター上
に存在する標的核酸配列とハイブリダイズするであろう
。未結合プローブを洗い流し、そしてフィルター上の放
射能をシンチレーションカウンターまたは他のβ粒子検
出器で計数することにより測定した。陰性対照検定に対
して得られた結果より決定された閾値を越えるフィルタ
ー上の放射能は、被検サンプル中にリステリア菌が存在
することを示す。この検定は食肉または酪農製品もしく
は環境サンプル中のリステリア菌の存在を調べるための
定性試験である。１分間あたりの放射能カウント数（ｃ
ｐｍ）がこの検定で確立されたカットオフ値を越えない
場合、サンプルはリステリア菌の存在に対して非反応性
であると考えられる。ｃｐｍ値がこの検定で確立された
カットオフ値より大きい場合は、サンプルがリステリア
菌の存在に対して反応性であると考えられる。

第一の段階はサンプル中のリステリア菌の一次増殖であ
った。酪農製品サンプルの場合は、リステリア菌増殖培
地（ＥＢ；）！Ｊブチカーゼ大豆培地粉末３０．Ｆ、酵
母エキス６ｇ、蒸留水１１、アクリフラビンＨＣｌ１５
■／ｌ、ナリジクス酸Ｎａ塩４０ｍ９／ｌ、およびシク
ロへキシミド５０ｍ９／１）２２５ｒｎｌに食品サンプ
ル２５ｇを加えた。この混合物はそれぞれのサンプルの
種類により適宜にプレンダーまたはストマノカーを用い
て均質化し、その後フラスコまたはビンの中で６０〜５
０℃（好ましくは３５°Ｃ）にて２４±４時間インキュ
ベー１−　した。

環境サンプルの試験の場合は、ＥＢ２５ｍｌ（または必
要に応じてそれ以上）を含むフラスコまたはビンの中に
スワブ（ｓｗａｂ）または他の環境サンプルを入れ、６
０〜５０°Ｃ（好ましくは３５°Ｃ）で２４±４時間イ
ンキーベートした。

次の段階はすべてのサンプルに対する二次増殖であった
。−次増殖培養物をインキーペーションから取り出して
十分に混合した。その−次増殖培養物１ｍｌを修飾リス
テリア増殖培地（ＭＥＢ；トリブチカーゼ犬豆培地粉末
３０ｇ、酵母エキス６Ｌ３−ＩＮＮ−モルホリノ〕プロ
パンスルホン酸−遊離酸（Ｍ　ＯＰ　Ｓ−遊離酸）８．
５！９．６−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸−
Ｎａ塩（ＭＯＰＳ−Ｎａ塩（ＭＯＰ　５−Ｎａ塩）１３
．７＆、蒸留水１１、アクリフラビンＨＣ１１５ｍ’；
ｌ／　ｌ、ナリジクス酸Ｎａ塩４０■／ｌ、およびシク
ロヘキシミド５０ｍ９／１）１００Ｉｎｌを含むフラス
コまたはビンに移し、そして６０〜５０°Ｃ（好ましく
は６５°Ｃ）で２４±４時間インキュベートした。

次の検定法はＧＥＮＥ−ＴＲＡＫマニホールド、キット
（ＧＥＮ　Ｅ−Ｔ　ＲＡＫ　Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番
号ＧＴ８０１）を利用する。培養細胞１ｍｌは１０ＸＴ
Ｅ（）リス１０　ｍＭ、ＥＤＴＡ　１　ｍＭ、ｐＨ７，
６）緩衝液中の酵素溶液〔ムタノリシン（Ｓｉｇｍａ社
から購入）３０００単位およびリゾチー　ム（Ｓｉｇｍ
ａ社から購入）１５０ｍ９を含む〕０５ｍ１と共に室温
（１５〜６０°Ｃ）で１５分間インキュベートすること
により処理した。その後、１各試験管の内容物をフィル
ターカップを用いて真空濾過した。これは酵素によって
細胞壁が弱められた培養細胞のフィルター上への集菌を
もたらした。

その後、これらの細胞中の核酸を次のようにして変性し
た。リステリア溶菌／変性溶液（０，６７５Ｍグアニジ
ンチオシアネート、１ＸＴＥ）をフィルターが液体で覆
われるまでフィルターカップへ吹きかけ、２分後その溶
液を真空沢過した。次に、リステリア中和溶液（１Ｍト
リスｐＨ８，０，６ＭＮａＣ１１）をフィルターが溶体
で覆われるまでフィルターカップへ吹きかけ、再び２分
後にその溶液を真空濾過した。その後、リステリア固定
溶液（９５％エタノール、５％水）をフィルターが液体
で覆われるまでフィルターカップへ吹きかげ、２分後そ
の溶液を真空濾過した。

フィルター上の変性核酸はその後人のようにしてハイブ
リダイズさせた。フィルターをカップから取り出し、６
５°Ｃに加温しておいたリステリアプレハイブリダイゼ
ーション溶液（６×５ＳＣ１０，５％ＳＤＳ、１×デン
ハート、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）２５ｍｌを含む５０ｍ１
の円錐底の試験管に入れた。

その試験管と内容物を６５℃の水浴中に３０分装いた。

液体を試験管から流出させ、そして６５℃に加温してお
いたリステリアハイブリダイゼー・／ヨン溶液（６ＸＳ
ＳＣ１０，５％ＳＤＳ、１×デンハート、１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡおよび１２　ｐＣｌの標識リステリアプローブ）
１２ｍｌを加えた。試験管と内容物を６５℃の水浴中に
１２０分間置装た。

ハイブリダイゼーション後、フィルターを次のようにし
て洗った。試験管の内容物を捨て、予め６５°Ｃに加温
しておいたリステリア洗液（０，５ＸＳＳＣ，０，１％
ＳＤＳ、０．１６％消泡剤Ｂ）２５ｍｌを加えた。この
試験管を振って６５℃に５分間置いた。その後再び試験
管を撮り、液体を流出させた。この方法を５回以上繰り
返した。

洗ったフィルターは試験管から取り出し、きれいな紙シ
ート上に置いてβカウンターで３０秒間計数した。各フ
ィルターのＣｐｍを記録した。

一般に６つの陰性対照フィルター（所定の非すステリア
菌から調製したもの）の平均値を出し、この値に５００
　ｃｐｍを加えて、この数をカットオフ値として定めた
。そのカットオフ値よりも大きいｃｐｍを示すフィルタ
ーはリステリア菌が存在すると思われ、より小さいｃｐ
ｍを示すフィルターはリステリア菌の不在を示す。

その他の実施態様は特許請求の範囲内に含°まれる。

【図面の簡単な説明】 図面はリステリア菌／枯草菌の差異が発見されたリステ
リア１６Ｓ　　ｒＲＮＡの５つの領域のヌクレオチド配
列を示し、枯草菌および他の細菌の対応するｒＲＮＡ配
列をリステリア配列の下に示す。 Ｌ、ｍｏｎはり、モノサイトゲネス（医療上量も関心の
あるリステリア菌種である）を表し、Ｌ、　ｉｎｎはり
。 イノクアを表し、Ｌ、ｍａｒはり、ムライを表し、Ｂ。 Ｓ、は枯草菌を表し、Ｂ、Ｔ、はブロコトリックス・サ
ーモスフアクタムを表し、ｐ、　ｖ、はプロテウス・ブ
ルガリスを表し、Ｅ、　Ｃ，は大腸菌を表し、そしてＨ
０■、はハロバクテリウム・ポルカニを表す。 （外４名） ち （レ ー６へ只 手続補正書（方式） 昭和６３年特許願第２２８３１２号 ２、発明の名称 リステリア菌の検出 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所 名　称　　シーン−トラック・システムス４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　　昭和６３年ココ。月２０日　（
発送臼）２補正の内容 （１）明細書第６５頁第６行目の「図面」を「第１図」
に訂正します。 （２）図面は別紙の通り、第１図と記載いたします。 以　　上 −Ｉｌｏ口山に）工 鳴 一 １０ｃｏ　ＣＯＱｌ悶工　　　　　　−一一口中山国＝
−一一口山山国手続補正Ｎ（５句 平成　元年　３月／印 昭和６３年特許願第２２８３１２号 ２、発明の名称 リステリア菌の検出 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所 名　称　　シーン−トラック・システムス４、代理人 住　所　　東京都千代田区大丁町二丁目２番１号新大手
町ビル　２０６区 ５、補止命令の日付　　昭和６３年１２月２０日　（発
送臼）３、補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、予め定められたストリンジエンシー （Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件下で、リステリア・モノ
   サイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇ
   ｅｎｅｓ）のｒＲＮＡにハイブリダイズし得るが、枯草
   菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）のｒＲＮ
   Ａにハイブリダイズし得ない核酸フラグメント。 ２、上記フラグメントは上記条件下でアエロモナス・ソ
   ブリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｏｂｒｉａ）、バシラ
   ス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、枯
   草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブロコ
   トリックス・サーモスファクタ（Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉ
   ｘ　ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｃｔａ）、シトロバクター・
   フロインド（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉ
   ｉ）、 コリネバクテリウム・キセロシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
   ｔｅｒｉｕｍ　ｘｅｒｏｓｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏ
   ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）
   、エシェリキア・ブルネリス（Ｅｓｃｅｒｉｃｈｉａ　
   ｖｕｌｎｅｒｉｓ）、エンテロバクター・アグロメラン
   ス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎ
   ｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａ
   ｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅ
   ｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシェラ・オキ
   シトカ（Ｋｌｅｂｓｉｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ）、 カセイ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ）
   、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏ
   ｓａ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
   ｓ　ｅｑｕｉｉ）、サルモネラ・アリゾナ（Ｓａｌｍｏ
   ｎｅｌｌａ　ａｒｉｚｏｎａｅ）、豚コレラ菌（Ｓａｌ
   ｍｏｎｅｌｌａ　ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、チフス
   菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、セラチア・
   オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ
   ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｂｏｙｄｉｉ）
   、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎ
   ｅｒｉ）、リンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｏｎｎ
   ｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
   ｓ　ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌ
   ｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィ
   ロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
   　ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィ
   チクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｐｒｏｐ
   ｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アグラクチカ
   （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉｃａ
   ｅ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
   ｏｃｃｕｓ　ｂｏｖｉｓ）、 糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃ
   ａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒ
   ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）、乳連鎖球菌
   （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）、スト
   レプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
   ｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔ
   ｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプト
   マイセス・グロビスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
   　ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）、エルジニア・エンテロコ
   リチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉ
   ｃａ）、のｒＲＮＡにハイブリダイズすることができな
   い。請求項１記載の核酸フラグメント。 ３、第一のリステリア菌種のｒＲＮＡにハイブリダイズ
   し得るが、枯草菌または第二のリステリア菌種のｒＲＮ
   Ａにハイブリダイズし得ない第一の核酸フラグメント、
   および 上記の第二リステリア菌種のｒＲＮＡにハイブリダイズ
   し得るが、枯草菌のｒＲＮＡにハイブリダイズし得ない
   第二の核酸フラグメント から成る核酸フラグメントの組合せ。 ４、上記の第一および第二核酸フラグメントは一緒にな
   って少なくとも８０％のリステリア菌株にハイブリダイ
   ズすることができる、請求項３記載の核酸フラグメント
   の組合せ。 ５、上記フラグメントはプローブ５６８またはその相補
   鎖にハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
   ることができる、請求項１記載の核酸フラグメント。 ６、上記フラグメントはプローブ６６１またはその相補
   鎖にハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
   ることができる、請求項１記載の核酸フラグメント。 ７、上記フラグメントは図面に示した５つのリステリア
   １６ＳｒＲＮＡ領域のうちの１つの１０ヌクレオチドま
   たはそれ以上の領域の少なくとも７５％と相同である、
   請求項１記載の核酸フラグメント。 ８、請求項１記載の核酸フラグメントとサンプル中の細
   菌とを、上記フラグメントを上記サンプル中のリステリ
   ア菌のｒＲＮＡにハイブリダイズさせてハイブリッド核
   酸複合体を形成させる条件下で接触させ、そして 上記ハイブリッド複合体を上記サンプル中のリステリア
   菌の存在の指標として検出することから成る、サンプル
   中のリステリア菌の検出方法。 ９、リステリア菌を増殖させてブロコトリックス（Ｂｒ
   ｏｃｈｏｔｈｒｉｘ）菌を増殖させない培養条件下で上
   記サンプル中の細菌を培養することを含む、請求項８記
   載の方法。 １０、上記培養条件が３０℃以上の増殖温度である、請
   求項９記載の方法。 １１、サンプル中の細菌を３０℃以上の温度で増殖させ
   、その後ハイブリダイゼーション条件下で上記細菌のｒ
   ＲＮＡを、Ｌ．モノサイトゲネスのｒＲＮＡおよびブロ
   コトリックス菌のｒＲＮＡとハイブリダイズし得るが枯
   草菌のｒＲＮＡとはハイブリダイズし得ない核酸プロー
   ブと接触させ、そしてハイブリッド複合体を上記サンプ
   ル中のリステリア菌の存在の指標として検出することか
   ら成る、サンプル中のリステリア菌の検出方法。 １２、上記接触に先立って、上記サンプルをリステリア
   菌の一次増殖段階に付し、続いて二次の非特異的細菌増
   殖段階に付し、該二次増殖段階を上記の増殖させたサン
   プルのｐＨを６．５〜８．０に維持するために緩衝液中
   で行う、請求項８記載の方法。 １３、上記ｐＨを約７．２に維持する、請求項１２記載
   の方法。 １４、上記接触に先立って、サンプル中のリステリア菌
   をそれらの細胞壁を弱める酵素と接触させ、その後溶菌
   する、請求項８記載の方法。