JP3093736B2 - リステリア菌の検出 - Google Patents
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Description
ia)属に含まれる細菌を検出することに関する。本明細
書中で用いる“リステリア”なる用語は、Bergey's Manu
al of SystematicBacteriologyにおいて分類された細菌
を意味するが、但し分子および表現型を考慮して最近リ
ステリア属から除かれたL.デニトリフィカンス(L.den
itrificans)を含まないものとする[ロカート(Rocour
t)ら、(1987)InternationalJournal of Systemat
ic Bacteriology(提出済み)]。リステリア菌の検出
は医療および公衆衛生の面で重要である。リステリア感
染症はかぜ程度からインフルエンザまでの様々な症状を
呈するが、特に胎児にとって危険であって50%の死亡
率をもたらす。
(F.D.A.)によって推薦された方法によれば、環境
被検物または酪農被検物(例えば牛乳)中のリステリア
菌の存在は、これらの微生物の増殖に適した条件下に微
生物学的培地上で適当に調製したサンプルを培養するこ
とにより検出される。形成されたコロニーは、一般にサ
ンプル入手の48時間後に開始され完了するまでに9〜
19日を要する方法により、形態学的および生化学的特
性について試験される。
l Journal 8:1104−1118はrRNA配列に対
するプローブの作製方法を開示している。
(1971)Journal of Bacteriology 107:543
−547は異なった細菌種からのリボソームリボ核酸の
相同性並びにこれらの相同レベルを定量化するためのハ
イブリダイゼーション法を開示している。
ース(Woese)(1972)Journalof Molecular Evolut
ion 1:173−184は系統発生的関係を評価するた
めに、異なるリボソームRNA分子の一次構造の特性決
定を使用する理論的および実際的方法を開示している。
よびワース(Woese)(1977)International Journa
l of Systematic Bacteriology 27:44−57は原
核生物系統学への(16SリボソームRNAの)比較分
類法を開示している。
一層よく理解されるであろう:DNA−デオキシリボ核
酸、糖成分としてデオキシリボースを含む核酸。
を含み、最も一般的にはDNAから転写(複製)される
核酸。RNA分子は情報(例えばメッセンジャーRN
A)、触媒、または構造(例えばリボソームRNA、以
下参照)の諸細胞機能を果たす。rRNA−リボソーム
RNA(rRNA)分子はリボソーム、複合タンパク質
およびRNA含有“オルガネラ”(転移RNAと一緒に
なって翻訳装置を構成する)の重要な因子である。リボ
ソームは遺伝情報を生命の主な構造的および触媒的要素
である細胞タンパク質へ翻訳する唯一の既知的手段とし
て作用するので、全ての生物にとって非常に大切であ
る。
含み、大腸菌(E.coli)では5S、16Sおよび23S
rRNAと呼ばれている。これらの名称は歴史的に沈
降速度によって決定されたRNA分子の大きさに関係が
ある。しかしながら、これらのRNA分子の大きさは実
際上生物間で異なっている。5S、16Sおよび23S
rRNAは一般に細菌の相同なRNA分子に対する共
通の名称として用いられており、本明細書においてもそ
のように用いられる。
た反応条件下で、2本の部分的に又は完全に相補的な核
酸を逆平行状態に組み合わせて特異的かつ安定な水素結
合を形成させる方法。それぞれの組のハイブリダイゼー
ション条件のストリンジェンシー(stringency)は、プ
ローブ/標的2本鎖の塩基組成、並びに2本の核酸の誤
対合レベルおよびその形状によって定められる。ストリ
ンジェンシーはまたハイブリダイゼーション溶液中に存
在するイオン種の濃度および種類、存在する変性剤の種
類および濃度、そして/またハイブリダイゼーションの
温度のような反応パラメーターによって支配される。
ンシーのもとで、標的核酸配列と特異的に(すなわち優
先的に)ハイブリダイズする特定のヌクレオチド配列を
含むよう考案または選択された合成核酸、もしくは生物
学的に作られた核酸(DNAまたはRNA)。
ダイズし得る核酸配列。
の第一の用途として示される。
ブリッド形成条件下でリステリア・モノサイトゲネス
(Listeria monocytogenes)のリボソームRNA(rR
NA)分子の存在を検出し得るが、同一条件下で被検サ
ンプル中に存在しうる密接に関連した枯草菌(Bacillus
subtilis)のrRNAを検出し得ないDNAまたはRN
A配列から本質的に成る核酸プローブもしくは核酸プロ
ーブの組合せを提供する。
検定系を提供し、この検定系は上述した望ましいプロー
ブの作用を増強することができる。
た実施性能を示す: a)感度の増加、すなわち所定のサンプル中のリステリ
ア菌を現在使用されている方法よりも効率よく検出する
ことができる; b)生物学的に作られたプローブではなく、化学的に合
成されたプローブを使用するために、プローブ作製にお
いて大幅にコストダウンが可能である; c)rRNA配列の特性決定が同定の基礎をなすため
に、生化学的に異常なリステリア菌でさえも正確に同定
できる;および d)本発明の試験はさらに増殖させる必要のない培養細
胞上で行われるので結果がより速く得られ、たったの2
〜4日を要するのみである。
用は多くの利点をもたらし、なかでも (1)rRNAは細胞質量のかなりの部分を占める。細
胞リボソームの概算含有量は変化するが、活発に増殖し
つつあるリステリア菌は細胞あたり5.0×104個よ
り多くのリボソームを含み、それ故に5.0×104コ
ピー数の(リボソーム中に1:1:1の化学量論的比で
存在する)それぞれのrRNAを含有する。対照的に、
その他の細胞標的分子、遺伝子またはそのRNA転写物
は多くの場合比較的少ない量で存在する。
る遺伝子)は同時代の生物間で側方転移(lateral tran
sfer)を受けないと思われる。従って、rRNAの一次
構造は、同時代の生物間で側方伝播(lateral transmis
sion)を受けやすいプラスミド由来の遺伝子またはその
産物の場合のような遺伝子特異的標的ではなくてむしろ
生物特異的分子標的を提供する。
かに、本発明は、1本または数本のプローブが有意な数
のリステリア菌の標的領域とハイブリダイズし得る程度
にこれらのリステリア菌において十分に類似している
が、プローブがリステリアrRNAとハイブリダイズす
るのと同じ条件下で、それらが大部分の非リステリアr
RNAとハイブリダイズし得ないか、又は極めて少なく
ハイブリダイズするよう大部分の非リステリアrRNA
において十分に異なっているリステリアrRNA標的配
列に対するプローブを提供する。これらのプローブの特
性はそれぞれ包括性および排他性として定められる。さ
らに、本発明のプローブは通常の検定条件下でプローブ
に接近しやすくなりうる標的領域とハイブリダイズす
る。
ル中のリステリア菌を速やかに増殖させるが、密接に関
連したブロコトリックス(Brochothrix)種を増殖させな
い条件下でサンプル中の細菌を増殖させる検定法が用い
られる。この増殖期間後に、サンプルに関してハイブリ
ダイゼーション分析が行われる。このような検定におい
ては、プレハイブリダイゼーションによるリステリア菌
の選択的増幅ゆえに、プローブと関連ブロコトリックス
菌のrRNAとの若干の交差ハイブリダイゼーションを
許容することができる。
菌の検出方法は、リステリアrRNAと1本以上のプロ
ーブとを接触させる前に、サンプルをリステリア菌の一
次増殖段階に付し、続いて二次非特異的細菌増殖段階
(この段階は増殖させたサンプルのpHを6.5〜8.
0、最も好ましくは約7.2に維持するために緩衝液、
最も好ましくは3−[N−モルホリノ]プロパンスルホ
ン酸含有緩衝液中で実施される)に付すことを包含す
る。このpH制御はサンプル中のリステリア菌を二次増
殖の期間中に他の方法よりも速やかに増殖させることが
分かった。
リア菌の検出方法は、リステリアrRNAと1本以上の
プローブとを接触させる前に、サンプル中のリステリア
菌を、細胞溶解剤(例えばグアニジウムチオシアネー
ト)を用いて溶菌する前にリステリア菌の細胞壁を弱め
る酵素と接触させる段階を包含する。この酵素処理はハ
イブリダイゼーション反応を大いに改善することが分か
った。
好適な実施態様の以下の説明、および特許請求の範囲か
ら明らかになるであろう。
説明する。
特異的核酸プローブの標的部位として役立ちうる16S
および23S rRNAの領域を同定することである。
実際の事として、被検サンプル中にどの非リステリア菌
が存在するかを推定的に予告することは困難である。非
リステリア菌が多数存在しうるために、所定のプローブ
配列の排他性を証明することは極めて難しく、かつ労力
を要する。しかしながら、検索および開発の初期段階に
おいて、すべての被検サンプル(最終的にプローブを用
いてスクリーニングされるサンプル)中にどんな非リス
テリア菌が存在するのかを知る必要性を回避する比較的
厳密な基準を採用しうる。これはリステリア菌同士の、
およびリステリア菌と他の細菌群との、系統発生的関係
の知識を必要とする。詳細に述べれば、排他性の基準
は、進化論上近い代表的なリステリア関連菌(特に枯草
菌)とリステリア菌とがリステリア配列に特異的なプロ
ーブを用いるハイブリダイゼーションにより区別できる
ように、リステリアrRNAの特定の標的領域が関連菌
のrRNAの相同領域と十分に相違していることを決定
することによって満たされるということが1つの仮説と
して考えられる。その後、系統発生的原理に基づく一般
的規則として、比較的遠縁の関連菌のrRNA配列は、
たとえそれらの実際の正体が必ずしも知られていなくと
も、上記の進化論上近いリステリア関連菌(例えば枯草
菌)よりも特定の配列領域において少なくとも同程度に
相違していると推察することができる。
的部位として有用なリステリアrRNAの領域を同定す
る第一段階として、本発明者らは3種類のリステリア
菌:すなわちL.モノサイトゲネス(L.monocytogene
s)、L.イノクア(L.innocua)およびL.ミライ(L.murr
ayi)からの16S rRNAのほとんど完全なヌクレオ
チド配列を決定した。これらは主要なリステリアDNA
相同群を代表するものとして選ばれたものであり、従っ
てリステリア属の進化の幅を代表している。rRNAの
いろいろな部分のヌクレオチド配列はrRNAをコード
する遺伝子のクローニング[マニアチス(Maniatis)
ら、(1982)Molecular Cloning:A laboratory ma
nual.ニューヨーク:コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー,p.545]および塩基配列決定[マ
クサム(Maxam)ら、(1977)Proceedings of the
National Academy of Science,USA 74:560−
564;サンガー(Sanger)ら、(1977)Proceedin
gs of the National Academy ofScience, USA 7
4:5463−5467]、および/または逆転写酵素
を用いるrRNAそれ自体の直接的塩基配列決定[レー
ン(Lane)ら、(1985)Proceedings of the Nation
al Academy of Science,USA 82:6955−69
59]による標準的実験手法を用いて決定された。
れ、また他の利用しうるrRNAヌクレオチド配列、特に
密接に関連した土壌細菌である枯草菌(Bacillus subti
lis)のヌクレオチド配列と比較された。枯草菌のrRN
A配列に関して有用な排他性を示す領域(すなわち、リ
ステリア特異的配列を含む領域)が多数発見された。こ
れらのうちのいくつかを図面に示し、以下で説明する。
可能性の証明をもたらすにすぎない。それぞれの核酸プ
ローブの試験が上記の望ましい特性:すなわち1)大部
分の又は全部の密接に関連した細菌に関する十分な排他
性;2)リステリア菌に関する有用な包括性パターン;
および3)実際に用いられる種々の検定条件下での標的
領域の接近しやすさ;を厳密に立証するために更に必要
となる。被検プローブの排他性および包括性を定める際
に非常に多くの微生物が関与しうるので、本発明者らは
可能性のあるプローブの試験および改良に関して本明細
書中で述べる相互作用的計略を採用した。
テリア菌の標的領域において観察されたヌクレオチド配
列の変化を最大限に利用する原理に基づいてデザインさ
れる。その後、“ドット・ブロット”分析により一代目
のプローブ(標準的なオリゴヌクレオチド技法を用いて
合成されたもの)の排他性および包括性に関する予備試
験を実施する。ドット・ブロット分析は多くの異なった
方法で行うことができるが、一般に核酸または核酸集団
をフィルター(例えばニトロセルロース、ナイロン、ま
たはこの目的のために有効であって市販されているその
他の膜誘導体)上に固定することを包含する。RNAは
容易に固定化することができ、その後いろいろな核酸ハ
イブリダイゼーション条件(すなわち、ストリンジェン
シー)のもとで対象のヌクレオチド配列について検索さ
れる。対象の核酸を初めに精製しないで、粗製(未精
製)溶菌液中に含まれるRNAを固定化する手法も利用
できる。後者の方法は特定の微生物の核酸に存在しうる
特定のヌクレオチド配列をスクリーニングするのに要す
る労力を有意に軽減し、さらに多数の微生物の大量スク
リーニングに応用できる。従って、それは多数の微生物
に対する可能性のある核酸ハイブリダイゼーションプロ
ーブの排他性および包括性を試験するのに最適の方法で
ある。
細菌の型を記した非リステリア菌の一覧表を表1に示
す。これらはまたリステリア菌に最も密接に関連した属
の多くを代表している。先に論じたように、このような
広い表示の細菌に対して良好な排他性を示すプローブは
実際に試験したものよりもさらに広い一覧表の微生物に
対して同様にふるまうことが当然予想される。DNAプ
ローブ568、609および661(図面参照)は以下
の実施例に記載されるストリンジェンシー条件下で90
%以上のこれらの細菌とハイブリダイズしなかった。
(プローブ568、609および661、並びに図面の
他のプローブは所定のL.モノサイトゲネスrRNA配
列に対して相補的(3’RNA末端に対して5’プロー
ブ末端)であり、すなわちプローブはそれぞれRNAの
Gに対してC、RNAのAに対してT、RNAのUに対
してA、およびRNAのCに対してGを有する。)
面参照)はまた、実施例のストリンジェンシー条件下で
L.モノサイトゲネス、L.イノクア、L.ミライ、
L.イバノビ(L.ivanovii)、L.シーリゲリ(L.seeli
geri)、L.ウェルシメリ(L.Welshimeri)およびL.グ
レイ(L.grayi)のリステリア菌と結合することにより良
好な包括性を示した。
最適なデザインに影響を及ぼす。初めに考察すべき事柄
はプローブそれ自体の形状(すなわち、分子内の相互作
用)である。L.モノサイトゲネスの16S rRNA
の有用な標的領域は自己相補性(self complementarit
y)の大いなる可能性を示す領域に存在しうる。従って、
これらの領域に対するプローブも自己相補性を示すこと
ができる。プローブと標的配列との相互作用は標的また
はプローブ配列のそれら自体への分子内アニーリングを
支配する同じタイプの相互作用によって支配されるの
で、とりわけ溶液のハイブリダイゼーション条件下で
は、自己相補性プローブがハイブリダイゼーションのた
めにそれらの標的配列へ接近し難くなる可能性がある。
こうして、プローブデザインの1つの観点はこの種の自
己相補性を最小限に抑えることである。そのためにはリ
ステリア特異的配列の最大限の利用と許容しうるプロー
ブ形状との間で妥協する必要がある。
性の基準に関して生じる。好適なプローブは、適当な排
他性を示すが、所望のすべてのリステリア菌のrRNA
とハイブリダイズし得るものである。リステリア属それ
自体は表現型および遺伝子の有意な変異を示す細菌から
成るので、“理想的”なプローブをデザインする(また
は発見する)ことは不可能であるかもしれない。実際
に、“普遍的”なリステリアプローブが要求されるので
はなく、リステリア特異的プローブの組合せ(各プロー
ブが適当な排他性と有用な包括性レベルを示す)が捜し
求められる。全体として、プローブの組合せは大部分の
又は全部のリステリア菌を検出し、そして非リステリア
菌をほとんど又は全く検出しないであろう。このような
組合せでは、例えばあるプローブが1種または数種の重
要なリステリア菌を除いた全てのリステリア菌を検出す
ることができ、そして別のプローブが最初のプローブに
よって見落とされた数種のリステリア菌とのみ良好な排
他性でもってハイブリダイズすることができる。従っ
て、以下に記載のプローブは包括性に関して個別的に特
徴づけられるが、先に詳述した特定プローブの“組合
せ”の概念も個々のプローブの重要性を決定した上で考
慮されねばならないことを心に留めるべきである。
排他性の評価にも及ぶ。例えば、以下で述べる検出系に
おいて、プローブまたはプローブの組合せによる非リス
テリア菌への望ましくないハイブリダイゼーションは、
用いる検定の細心の計略を駆使することにより減少また
は排除することができる。
ト)に対して病原性であるただ1種のリステリア菌(特
にL.モノサイトゲネス)に特異的なプローブを使用す
ることが好適である。この種のプローブは、非病原性の
リステリア菌がサンプル中に含まれるとき偽陽性の結果
をもたらさず、従って陽性の結果が病原性リステリア菌
の存在を示すこととなるので都合がよい。
は実在するサンプル(例えば食品/臨床上のサンプル)
を試験することである。
リア菌を同定するのに有用な多数のプローブをもたらし
た。プローブ選択方法の第一段階は、先に示した3種の
リステリア菌の16S rRNAに対してヌクレオチド
配列分析を実施することであった。これらのリステリア
配列を非リステリアrRNA配列(特に枯草菌のrRN
A配列)と比較することにより、排他性の基準、すなわ
ち、本質的にリステリア特異的であるという基準を満た
す配列を同定した。これらの領域を図面に示す。
68の配列:5’TCGCGGCTTCGCGACCT
TTGTACTATCCA 3’;プローブ661の配
列:5’GGGAAAGCTCTGTCTCCAGAG
TGGTCAAAGG3’)を用いる液体ハイブリダイ
ゼーション検定は、異なるハイブリダイゼーション条件
下でこれらの領域への標的配列の良好な接近性を示す。
一般に、良好な感度も得られる。しかしながら、これら
のプローブは上記条件下でブロコトリックス(Brochoth
rix)とハイブリダイズするであろう。従って、これらの
細菌は検定の間に選択されねばならない。1つの方法は
ブロコトリックス菌を増殖させない条件下で、例えば3
2℃や35℃のような30℃以上の温度で、サンプル中
の細菌を培養することである。この方法では、ブロコト
リックス菌によるバックグラウンドレベルが極めて低い
ので偽陽性の結果が避けられる。
ックスとハイブリダイズせず、従って、このプローブを
唯一のプローブとして用いる場合リステリア菌の選択的
増幅は必要ない。
ローブは、16S rRNAの場合について先に記載し
た通りに誘導することができる。
いられ、その1つを以下に説明する。
酪農製品または環境サンプル中のリステリア菌を、培地
上で増殖させた後に検出すべく、ラジオアイソトープ(
32P、その他の標識も同様に使用できる、例えば蛍光ま
たは化学発光標識)で標識したリステリア特異的DNA
プローブを用いた。増殖後、被検サンプル中に存在する
細菌を真空濾過により膜フィルター上に集菌した。溶菌
後、放出された核酸を膜フィルターに固定した。短いプ
レハイブリダイゼーション工程後、32P−標識リステリ
ア特異的DNAプローブを添加したハイブリダイゼーシ
ョン溶液中でフィルターをインキュベートした。リステ
リア核酸(リボソームRNA)が被検サンプル中に存在
する場合、放射能標識DNAプローブはフィルター上に
存在する標的核酸配列とハイブリダイズするであろう。
未結合プローブを洗い流し、そしてフィルター上の放射
能をシンチレーションカウンターまたは他のβ粒子検出
器で計数することにより測定した。陰性対照検定に対し
て得られた結果より決定された閾値を越えるフィルター
上の放射能は、被検サンプル中にリステリア菌が存在す
ることを示す。この検定は食肉または酪農製品もしくは
環境サンプル中のリステリア菌の存在を調べるための定
性試験である。1分間あたりの放射能カウント数(cp
m)がこの検定で確立されたカットオフ値を越えない場
合、サンプルはリステリア菌の存在に対して非反応性で
あると考えられる。cpm値がこの検定で確立されたカ
ットオフ値より大きい場合は、サンプルがリステリア菌
の存在に対して反応性であると考えられる。
一次増殖であった。酪農製品サンプルの場合は、リステ
リア菌増殖培地(EB;トリプチカーゼ大豆培地粉末3
0g、酵母エキス6g、蒸留水1l、アクリフラビンH
Cl15mg/l、ナリジクス酸Na塩40mg/l、
およびシクロヘキシミド50mg/l)225mlに食
品サンプル25gを加えた。この混合物はそれぞれのサ
ンプルの種類により適宜にブレンダーまたはストマッカ
ーを用いて均質化し、その後フラスコまたはビンの中で
30〜50℃(好ましくは35℃)にて24±4時間イ
ンキュベートした。
l(または必要に応じてそれ以上)を含むフラスコまた
はビンの中にスワブ(swab)または他の環境サンプルを
入れ、30〜50℃(好ましくは35℃)で24±4時
間インキュベートした。
増殖であった。一次増殖培養物をインキュベーションか
ら取り出して十分に混合した。その一次増殖培養物1m
lを修飾リステリア増殖培地(MEB;トリプチカーゼ
大豆培地粉末30g、酵母エキス6g、3−[N−モル
ホリノ]プロパンスルホン酸−遊離酸(MOPS−遊離
酸)8.5g、3−[N−モルホリノ]プロパンスルホ
ン酸−Na塩(MOPS−Na塩(MOPS−Na塩)
13.7g、蒸留水1l、アクリフラビンHCl15m
g/l、ナリジクス酸Na塩40mg/l、およびシク
ロヘキシミド50mg/l)100mlを含むフラスコ
またはビンに移し、そして30〜50℃(好ましくは3
5℃)で24±4時間インキュベートした。
ルド・キット(GENE−TRAKSystemsカタ
ログ番号GT801)を利用する。培養細胞1mlは1
0×TE(トリス10mM、EDTA1mM、pH7.
6)緩衝液中の酵素溶液[ムタノリシン(Sigma社から
購入)3000単位およびリゾチーム(Sigma社から購
入)150mgを含む]0.5mlと共に室温(15〜
30℃)で15分間インキュベートすることにより処理
した。その後、各試験管の内容物をフィルターカップを
用いて真空濾過した。これは酵素によって細胞壁が弱め
られた培養細胞のフィルター上への集菌をもたらした。
にして変性した。リステリア溶菌/変性溶液(0.67
5Mグアニジンチオシアネート、1×TE)をフィルタ
ーが液体で覆われるまでフィルターカップへ吹きかけ、
2分後その溶液を真空濾過した。次に、リステリア中和
溶液(1MトリスpH8、0.6M NaCl)をフィ
ルターが溶体で覆われるまでフィルターカップへ吹きか
け、再び2分後にその溶液を真空濾過した。その後、リ
ステリア固定溶液(95%エタノール、5%水)をフィ
ルターが液体で覆われるまでフィルターカップへ吹きか
け、2分後その溶液を真空濾過した。
にしてハイブリダイズさせた。フィルターをカップから
取り出し、65℃に加温しておいたリステリアプレハイ
ブリダイゼーション溶液(6×SSC、0.5%SD
S、1×デンハート、1mMEDTA)25mlを含む
50mlの円錐底の試験管に入れた。その試験管と内容
物を65℃の水浴中に30分置いた。液体を試験管から
流出させ、そして65℃に加温しておいたリステリアハ
イブリダイゼーション溶液(6×SSC、0.5%SD
S、1×デンハート、1mM EDTAおよび12μC
iの標識リステリアプローブ)12mlを加えた。試験
管と内容物を65℃の水浴中に120分間置いた。
次のようにして洗った。試験管の内容物を捨て、予め6
5℃に加温しておいたリステリア洗液(0.5×SS
C、0.1%SDS、0.16%消泡剤B)25mlを
加えた。この試験管を振って65℃に5分間置いた。そ
の後再び試験管を振り、液体を流出させた。この方法を
5回以上繰り返した。
きれいな紙シート上に置いてβカウンターで30秒間計
数した。各フィルターのcpmを記録した。
非リステリア菌から調製したもの)の平均値を出し、こ
の値に500cpmを加えて、この数をカットオフ値と
して定めた。そのカットオフ値よりも大きいcpmを示
すフィルターはリステリア菌が存在すると思われ、より
小さいcpmを示すフィルターはリステリア菌の不在を
示す。
まれる。
れたリステリア16SrRNAの5つの領域のヌクレオ
チド配列を示し、枯草菌および他の細菌の対応するrR
NA配列をリステリア配列の下に示す。L.monは
L.モノサイトゲネス(医療上最も関心のあるリステリ
ア菌種である)を表し、L.innはL.イノクアを表
し、L.murはL.ムライを表し、B.S.は枯草菌を
表し、B.T.はブロコトリックス・サーモスファクタム
を表し、P.V.はプロテウス・ブルガリスを表し、E.
C.は大腸菌を表し、そしてH.V.はハロバクテリウム
・ボルカニを表す。
Claims (7)
- 【請求項1】細菌を含むサンプル中のリステリア菌を検
出するための方法であって、 細菌を30℃より高い温度で増殖させ、 リステリア菌のrRNAへのハイブリダイゼーションを
可能にする適当な条件下で核酸プローブを前記細菌のr
RNAと接触させ、そしてハイブリッド複合体を上記サ
ンプル中のリステリア菌の存在の指標として検出する、 ここにおいて、核酸プローブは以下の: プローブ564(5’−CTGTCTCCAGAGTG
GTCAAAG−3’)、 プローブ662(5’−GCTCTGTCTCCAGA
GTGGTCAAAGGATGTAA−3’)、 プローブ566(5’−TTTGTCCCCGAAGG
GAAAGCT−3’) プローブ661(5’−GGGAAAGCTCTGTC
TCCAGAGTGGTCAAAGG−3’)及び プローブ568(5’−TCGCGGCTTCGCGA
CCCTTTGTACTATCCA−3’) 並びに、これらに相補的な核酸鎖からなるグループから
選択される、前記検出方法。 - 【請求項2】温度を約32℃より高く維持する、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項3】温度を約35℃に維持する、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項4】核酸プローブが、プローブ568(5’−
TCGCGGCTTCGCGACCCTTTGTACT
ATCCA−3’)又はその相補的な核酸鎖である、請
求項1に記載の方法。 - 【請求項5】核酸プローブが、プローブ661(5’−
GGGAAAGCTCTGTCTCCAGAGTGGT
CAAAGG−3’)又はその相補的な核酸鎖である、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】核酸プローブが、プローブ564(5’−
CTGTCTCCAGAGTGGTCAAAG−3’)
又はその相補的な核酸鎖である、請求項1に記載の方
法。 - 【請求項7】核酸プローブが、プローブ662(5’−
GCTCTGTCTCCAGAGTGGTCAAAGG
ATGTAA−3’)又はその相補的な核酸鎖である、
請求項1に記載の方法。
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