NO883248L - Nukleinsyreprober for paavisning og/eller kvantifisering av ikke-virale organismer. - Google Patents

Description

NUKLEINSYREPROBER FOR PÅVIRKNING OG/ELLER

KVANTIFISERING AV IKKE-VIRALE ORGANISMER.

Continuation-In-Part av Hogan et al., App. Ser. No.

083.542 innsendt august 7, 1987, som er en Continuation-In-Part av Hogan et al., App. Ser. No. 934.244 innsendt november 24, 1986.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

1. OppfinneIses- område

Oppfinnelsen som er beskrevet heri vedrører prober og analyser basert på anvendelsen av genetisk material slik som RNA. Mer spesielt, vedrører oppfinnelsen utformingen og oppbygningen av nukleinsyreprober og hybridisering av slike prober til genetisk material fra ikke-virale målorganismer i analyser for påvisning og/eller kvantifisering derav i testprøver av, f.eks. spytt, urin, blod, vevsdeler, matvarer, jord og vann.

2 . Introduks jon

To enkle nukleinsyre-kjeder, omfattende nukleotider,

kan assosiere ("hybridisere") til å danne en dobbel spiralformet struktur hvori de to polynukleotidkjedene som går i motsatte retninger holdes sammen ved hjelp av hydrogenbindinger (en svak form for kjemisk binding) mellom par av tilpassede, sentralt plasserte forbindelser kjent som "baser". Generelt, i den doble spiralformede struktur av nukleinsyrer, er f.eks.basen adenin (A) hydrogenbundet til basen thymin (T) eller uracil (U) mens basen gu_^anin (G) er hydrogenbundet til basen cytosin (C). I ethvert punkt langs kjeden, vil man derfor finne base» parene AT eller AU, TA eller UA, GC eller CG. Man vil også finne AG og GU basepar i tillegg til de vanlige ("vedtatte") baseparene. Idet man antar

at en første enkelnukleinsyrekjede er tilstrekkelig komplementær til en andre kjede og at de to bringes sammen under betingelser som vil fremme deres hybridisering, vil man oppnå dobbeltkjedete nukleinsyrer. Under passende betingelser, vil DNA/DNA, RNA/DNA eller RNA/RNA hybrider dannes.

Stort sett, har man to vesentlige nukleinsyre--• hybridiseringsprosedyrer. I den ene, kjent som "i løsning" hybridisering, er både en "probe" nukleinsyre-sekvens og nukleinsyre-molekyler fra en testprøve, frie i løsning. I en annen metode, er nukleinsyreprøven vanligvis mobilisert på en fast bærer og probe-sekvensen er fri i løsning.

En probe kan bære en enkelkjedet nukleinsyre-sekvens som er komplementær, i en viss grad, til nukleinsyre-sekvensene som man ønsker å påvise ("target sekvenser"). Den kan også være merket. En bakgrunnsbeskrivelse av anvendelsen av nukleinsyre-hybridisering som en prosedyre for påvisning av spesielle nukleinsyre-sekvenser, er beskrevet i US patentansøkning med serienummer 456.729, med tittel "Metode for påvisning, identifisering og kvantifisering av ikke-virale organismer", innsendt 10. januar 1983 (Kohne I), og US patentansøkning, med serienr. 655.365, med tittel "metode for påvisning, identifisering og kvantifisering av organismer og viruser", innsendt 4. september 1984 (Kohne II), som begge er innlemmet som referanser, sammen med alle andre ansøkninger gitt heri.

I disse ansøkninger er det også beskrevet metoder for bestemmelsen av nærværet av RNA-innholdende organismer i en prøve som kan inneholde slike organismer, omfattende trinnene med å bringe sammen alle nukleinsyrene fra en prøve og en probe omfattende nukleinsyremolekyler som er kortere enn RNA subenhetsekvensen hvorfra den ble avledet og som er tilstrekkelig komplementær til å hybridisere til rRNA fra en eller flere ikke-virale organismer eller grupper av ikke-virale organismer, idet blandingen inkuberes under spesifiserte hybridiserings-betingelser og den oppnådde blanding måles for hybridisering av prøven og enhver testprøve rRNA. Oppfinnelsen omfatter anvendelse av en probe som kun påviser rRNA subenhet-subsekvenser som er de samme eller tilstrekkelig like i spesielle organismer eller grupper av organismer og som påviser tilstedeværelsen eller fraværet av en eller flere av disse spesielle organismer i en prøve, selv i nærvær av mange ikke-relaterte organismer.

I den foreliggende oppfinnelse har man oppdaget og beskrevet en ny metode og midler for konstruering og oppbygning av DNA-prober for anvendelse ved påvisning av unike rRNA-sekvenser i en test for påvisning og/eller kvantifisering av en hvilken som helst gruppe av ikke-virale organismer. Noen av probene i henhold til oppfinnelsen kan anvendes for å påvise og/eller kvantifisere en eneste art eller stamme av ikke-virale organismer og andre kan anvendes for å påvise og/eller kvantifisere medlemmer av en hel slekt eller ønsket polygenetisk gruppering.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I en metode for probe-fremstilling og anvendelse, anvendes et enkelkjedet deoksyoligonukleotid med spesiell sekvens og definert lengde, i et hybridiseringsforsøk for å bestemme tilstedeværelsen eller mengden rRNA fra spesielle target ikke-virale organismer, for å skille dem fra deres kjente og mest nærliggende polygenetiske naboer. Probesekvenser som er spesifikke for henholdsvis 16S rRNA variable subsekvenser av Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare og Mycobacterium tubercolosis-kompleksbakterier, og som ikke kryssreagerer med nukleinsyrer fra hverandre eller andre bakteriearter eller respiratorisk infeksiøst middel, under den rette strenghet, er beskrevet og krevd patent for heri. En probe som er spesifikk for tre 23S rRNA variable område-sekvenser fra Mycobacterium tuberculosis-kompleks-bakterier er også beskrevet og krevet patent for heri, likeledes som rRNA variable område-prober som er nyttige

hybridiseringsforsøk for slekten Mycobacterium (16S 23S rRNA-spesifikk), Mycoplasma pneumonia (5S og 16S rRNA-spesifikk), Chlamydia trachomatis (16S og 23S rRNA-spesif ikk) Enterobacter cloacae (23S rRNA-spesifikk), Escherichia coli (16S rRNA-spesifikk), Legionella (16S og 23S rRNA-spesifikk), Salmonella (16S og 23S rRNA-spesif ikk) , Enterococci (16S rRNA-spesifikk), Neisseria gonorrhoeae (16S rRNA-spesifikk), Campylobacter (16S rRNA-spesifikk), Proteus mirabilis (23S rRNA-spesifikk), Pseudomonas (23S rRNA-spesifikk), sopp (18S og 28S rRNA-spesif ikk), og bakterier (16S og 23S rRNA-spesifikk).

I en utførelsesform av forsøks-metoden, underkastes først en testprøve betingelser som frigjør rRNA fra enhver ikke-viral organisme som er tilstede i denne prøven. rRNA er enkelkjedet og derfor tilgjengelig for hybridisering med passende komplementært genetisk material som er frigjort. Kontakt mellom en probe, som kan være merket, og rRNA-targeten kan gjennomføres i løsning under betingelser som fremmer hybridisering mellom de to kjeder. Reaksjonsblandingen måles deretter for tilstedeværelsen av hybridisert probe. En rekke fordeler med den foreliggende metode for påvisning av ikke-virale organismer i forhold til tidligere kjente teknikker, omfattende nøyaktighet, enkelhet, økonomisk fordelaktighet og hurtighet, vil fremkomme fra den detaljerte beskrivelsen som følger.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 er et kart for den primære struktur av bakteriell 16S rRNA for Escherichia coli, og avbilder standard-referansenummer for basene. Figur 2 er et kart for den primære struktur av bakteriell 23S rRNA for Escherichia coli, og avbilder standard-referansenummer for basene. Figur 3 er et kart av den primære struktur for bakteriell 5S rRNA for Escherichia coli, og avbilder standard-referansenummer for basene. Figur 4 er et kart av den primære struktur for 18S rRNA for Saccharomyces cervisiae, og avbilder standard-ref eransenummer for basene. Figur 5 er et kart av den primære struktur for 28S rRNA for Saccharomyces cervisiae, og avbilder standard-ref eransenummer for basene. Figur 6 er et diagram som viser plasseringene i 16S rRNA (ved anvendelse av E. coli referansenummere) som utgjør en forskjell mellom 12 forskjellige grupper av beslektede organismer. I eksempel 1, refererer f.eks. 99,7 til forskjellen i 16S rRNA mellom Clostridium botuliniumg og Clostridium subterminale. Figur 7 er et diagram som viser plasseringene i de første 1500 baser av 23S rRNA (ved anvendelse av E. coli referansetall) som utgjør en forskjell mellom 12 forskjellige grupper av beslektede organismer. Figur 8 er et diagram som viser plasseringene i de terminale baser av 23S rRNA (ved anvendelse av E. coli referansetall) som utgjør en forskjell mellom 12

forskjellige grupper av beslektede organismer.

Figur 9 er en skjematisk fremstilling av plasseringen av prober som er i stand til å hybridisere til 16S rRNA. Figur 10 er en skjematisk fremstilling av plasseringen av prober som er i stand til å hybridisere til de første 1500 baser av 23S rRNA. Figur 11 er en skjematisk fremstilling av plasseringen av prober som er i stand til hybridisering til de terminale baser av 23S rRNA.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Definisjoner

Følgende uttrykk, som anvendt i foreliggende beskrivelse og krav, er definert som: nukleotid: en subenhet av en nukleinsyre bestående av en fosfat-gruppe, et 5' karbon-sukker og en nitrogen-inneholdende base. I RNA, er 5' karbon-sukkeret ribose.

I DNA, er det 2-deoksyribose. Uttrykket inkluderer også analoger av slike subenheter.

nukleotid- polymer: minst to nukleotider bundet sammen ved hjelp av fosfodiester-bindinger.

oligonukleotid: et nukleotid-polymer, med generelt en lengde på omtrent 10 til omtrent 100 nukleotider, men som kan ha en lengde som er større enn 100 nukleotider.

nukleinsyre- probe: en enkelt-kjedet nukleinsyre-sekvens som vil kombinere med en komplementær enkel-kjedet target-nukleinsyre-sekvens til å danne et dobbel-kjedet molekyl (hybrid). En nukleinsyre-probe kan være et oligo-nukleotid eller en nukleotid-polymer.

hybrid: komplekset dannet mellom to enkel-kjedete nukleinsyre-sekvenser ved hjelp av Watson-Crick base-parringer eller ikke-vedtatte base-parringer mellom de komplementære baser.

hybridisering: prosessen hvorved to komplementære nukleinsyre-kjeder kombinerer til å danne dobbel-kjedete molekyler (hybrider).

komplementaritet: en egenskap som er gitt ved hjelp av base-sekvensen av en enkel-kjede av DNA eller RNA som kan danne et hybrid eller dobbel-kjedet DNA:DNA, RNA:RNA

eller DNA:RNA gjennom hydrogen-binding mellom Watson-Crick-basepar på de respektive kjeder. Adenin (A) komplementer vanligvis thymin (T) eller Uracil (U), mens guanin (G) vanligvis komplementerer cytosin (C).

stringens: uttrykk anvendt for å beskrive temperaturen og løsningsmiddel-sammensetningen som er tilstede under hybridisering og de påfølgende prosesstrinn. Under høy stringens-betingelser vil kun ytterst homologe nukleinsyre-hybrider dannes; hybrider uten en tilstrekkelig grad av komplementaritet vil ikke dannes. Følgelig, vil stringensen for forsøks-betinelsene

bestemme mengden komplementaritet som er nødvendig mellom to nukleinsyre-kjeder som danner et hybrid. Stringens er valgt for å maksimalisere differansen i stabilitet mellom hybridet dannet med targeten og ikke-target-nukleinsyren.

probe- spesifisitet: egenskap for en probe som beskriver dens evne til å sjeldne mellom target og ikke-traget-sekvenser. Avhengig av sekvens og forsøks-betingelser. Probe-spesifisitet kan være absolutt (dvs. probe i stand til å sjeldne mellom target-organismer og enhver ikke-target-organisme), eller den kan være funskjonell (dvs. probe som er i stand til å sjeldne mellom target-organismen og enhver annen organisme som normalt er tilstede i en

spesiell prøve). Mange probe-sekvenser kan anvendes for enten en bred eller snever spesifisitet avhengig av betingelsene for anvendelse.

variabelt område: nukleotid-polymer som differensierer med minst en base mellom target-organismen og ikke-target-organismene inneholdt i en prøve.

bevart område: et område som ikke er variabelt.

sekvens- divergens: prosess hvorved nukleotid-polymerene blir mindre like i løpet av utviklingen.

sekvens- konvergens: prosess hvorved nukleotid- polymerene blir mer like i løpet av utviklingen.

bakteria: medlemmer av den fylogenetiske gruppe bakteria, som er å betrakte som et av de tre primære riker.

Tm: temperatur hvorved 50% av proben omdannes fra den hybridiserte til den ikke-hybridiserte form.

termisk stabilitet: temperatur hvorved 50% av probe-target-hybridene omdannes til den enkjedete form. Faktorer som innvirker på den termiske stabilitet kan innvirke på probe-spesifisitet og må derfor kontrolleres. Om en probe-sekvens er nyttig for å påvise bare en spesifikk type av organisme, avhenger meget av den termiske stabilitets-forskjell mellom probe:target-hybrider ("P:T") og probe:ikke-target-hybrider

("P:NT"). Ved formgivning av prober, bør Tm P:T minus

Tm P:NT være så stor som mulig.

I tillegg til en ny metode for utvelgelse av probe-sekvenser, har man oppdaget at det er mulig å danne en DNA-probe som er komplementær til en spesiell rRNA-sekvens oppnådd fra en enkel type target-mikroorganisme og anvende denne proben med hell i et ikke-kryss-reagerende forsøk for påvisning av den eneste mikroorganisme, selv i nærvær av dens kjente, mest nærliggende taksonomiske eller fylogenetiske naboer. Med unntak av viruser, inneholder alle prokaryotiske organismer rRNA-molekyler omfattende 5S rRNA, 16S rRNA og et stort rRNA-molekyl som er kjent som 23S rRNA. Eukaryoter er kjent for å ha 5,OS, 5,8S, 18S og 28S rRNA-molekyler eller analoge strukturer. (Uttrykket "16S lignende" er noen ganger anvendt for å referere til rRNA funnet i den lille ribosomale subenhet, omfattende 18S og 17S rRNA. Likeledes uttrykket "23S lignende" rRNA anvendes noen ganger for å referere til rRNA funnet i den store ribosomale subenhet. 5,8S rRNA er ekvivalent til 5' enden av 23S lignende rRNA.) Disse rRNA-molekyler inneholder nukleotid-sekvenser som opprettholdes i sterk grad blant alle organismene som hittil er undersøkt.

Man har kjente metoder som tillater bestemmelse av en signifikant del av disse rRNA-sekvenser. F.eks., kan komplementære oligo-nukleotid-primere med lengde på omtrent 20 til 30 baser, hybridiseres til universelle biholdte områder i renset rRNA som er spesifikke til 5S, 16S eller 23S subenhetene og uttrekkes med enzymet revers transkriptase. Kjemisk nedbrytning eller dideoksynukleotid-terminerte sekvens-reaksjoner kan anvendes for å bestemme nukleotid-sekvensen i det utstrakte produkt. Lane, D.J. et al., Proe. Nati. Acad.

Sei., USA 82, 6955-6959 (1985). -

I henhold til oppfinnelsen, er sammenligning av en eller flere sekvenserte rRNA-variable områder fra en target-organisme med en eller flere rRNA-variable områder sekvensert fra en nær beslektet bakterieart, anvendt for å velge en sekvens som er entydig til rRNA av target-organismen. rRNA er foretrukket fremfor DNA som en probe-target på grunn av dens releative rikelighet og stabilitet i cellen og på grunn av dens mønster av

fylogenetisk konservering.

Til tross for den sterkt opprettholdte natur av rRNA,

har man oppdaget at en rekke områder i rRNA-molekylet som kan variere i sekvens, kan variere til og med mellom nært beslektede arter og kan derfor anvendes for å sjeldne mellom slike organismer. Forskjeller i rRNA-molekylet er ikke fordelt tilfeldig over hele molekylet, men er heller samlet i spesifikke områder. Graden av konservering varierer også, og danner et enestående konserverings-mønster over de ribosomale RNA subenheter. Variasjons-graden og fordelingen derav kan analyseres for lokalisere target-seter for diagnostiske prober. Denne metode for probe-utvelgelse kan anvendes for å utvelge mer enn en sekvens som er enestående til rRNA av en target-organisme.

Man har identifisert variable områder ved hjelp av sammenligningsanalyser av rRNA-sekvenser, begge publisert i litteraturen, og sekvenser som man har bestemt ved anvendelse av prosedyrer som er kjent innen teknikkens stand. Man anvender en Sun-Microsystems (TM) computer for sammenlignings-analyser. Computeren kan manipulere mange data-sekvenser samtidig. Computere av denne type og computer-programmer som kan anvendes eller tilpasses formålene gitt heri, er kommersielt tilgjengelige.

Generelt er bare noen få områder anvendbare for å sjeldne mellom nær beslektede arter av en fylogenetisk konservert slekt, f.eks. området-400 til 500 baser fra 5' enden av 16S rRNA-molekylet. En analyse av nær beslektede organismer (fig. 6, 7 og 8) viser de spesifikke stillinger (variable områder) som kan variere mellom nær beslektede organismer. Disse variable områder av rRNA-molekyler er de sannsynlige kandidater for probe-utforming.

Fig. 5, 6 og 7 viser variasjonene i 16S og 23S rRNA mellom to forskjellige bakterier med avtagende mengde samsvarighet mellom dem. Nærmere analyser av disse figurer viser enkelte subtile mønstre mellom disse nær beslektede organismer. I alle de tilfeller som er undersøkt, har man sett tilstrekkelig variasjon mellom target-organismen og den nærmeste fylogeneetiske slektning som er funnet i samme prøve, til å utforme proben av interesse.

Dessuten, i alle de tilfeller som studert til nå, har

prosent likhet mellom target-organismen (eller

- organismene) og de nærmest fylogenetiske beslektede organismer som er funnet i den samme prøve, vært mellom 90% og 99%. Interessant nok, var der nok variasjon selv mellom rRNA fra Neisseria gonorrhoeae og Meningitidis (se eksempel 21) til å utforme prober; til tross for det faktum at DNA-.DNA homolog-studier foreslo at disse to arter faktisk kunne være den samme.

Disse figurene viser også at forskjellene er fordelt over hele 16S og 23S rRNA. Mange av forskjellene, samler seg ikke dessto mindre i noen få områder. Disse områder i rRNA er gode kandidater for probe-utforming, med de aktuelle forsøksbetingelser. Man legger også merke til at plasseringene av disse økte variasjons-tettheter er vanligvis plassert i de samme områder av 16S og 23S rRNA for sammenlignbare likhetsverdier i prosent. På denne måte, har man observert at visse områder i 16S og 23S rRNA er de mest sannsynlige seter hvori signifikant variasjon eksisterer mellom target-organismen og de nærmeste fylogenetiske slektninger funnet i en prøve. Oppfinnelsen vedrører art- spesifikke prober som hybridiserer i disse områder med signifikant variasjon mellom target-organismen og den nærmeste fylogenetiske slektning funnet i en prøve.

Figurene 9, 10 og 11 er en skjematisk fremstilling av plasseringen av prober i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Forde 16S og 23S RNA som en regel ikke inneholder dupliserings-sekvenser som er lengre enn omtrent 6 nukleotider, er prober som er utformet ved hjelp av disse metoder spesifikke overfor en eller noen få posisjoner på target-nukleinsyren.

Sekvens-utviklingen i hver av de variable områder (f.eks. som strekker seg over et minimum på 10 nukleotider) er for det meste divergent, ikke-konvergent. Således kan man trygt utforme prober basert på noen få rRNA-sekvenser som differensierer mellom target-organismen og den fylogenetiske nærmeste slektninger. Biologiske og strukturelle begrensninger på rRNA-molekylet som opprett-holder homolog primær, sekundær og tertiær struktur under utvikling, og påleggingen av slike begrensninger på probe-diagnostika, er formålet for det pågående studium. Dessto større utviklingsavstanden mellom organismer er, dessto større er antall variable områder som kan anvendes for å sjeldne organismene.

Når de variable områder er identifisert, rettes sekvensene inn for å åpenbare områder med maksimal homologi eller "overensstemmelse". På dette punkt undersøkes sekvensene for å identifisere potensielle probe-områder. To viktige formål ved utforming av en probe er å maksimalisere homologi til target-sekvensen (sekvenser) (større enn 90% homologi anbefales) og å minimalisere homologi til ikke-target-sekvens (sekvenser) (mindre enn 90% homologi til ikke-targeter anbefales). Man har nå identifisert de følgende anvendbare retningslinjer for utforming av prober med ønskede egenskaper.

Først bør probene anbringes på en slik måte at stabiliteten av probe:ikke-target nukleinsyre-hybridet minimaliseres. Dette kan gjennomføres ved å minimalisere lengden av perfekt komplementaritet til ikke-target-organismer, idet man unngår G og C rike områder med homologi til ikke-target-sekvenser, og ved å anbringe proben for å strekke seg over så mange destabiliserende ikke-overensstemmelser som mulig, (f.eks. dG:rU basepar

mindre destabiliserende enn enkelte andre).

For det andre, bør stabiliteten av proben:target-nukleinsyre-hybridet maksimaliseres. Dette kan gjennomføres ved å unngå lange A- og T-rike sekvenser, ved å terminere hybridene med G:C basepar og ved å utforme proben med en passende Tm. Begynnelses- og slutt-punktene for proben bør velges slik at lengden og prosent G og prosent C resulterer i en Tm omtrent 2 til 10°C høyere enn temperaturen hvorved det endelige forsøk vil gjennomføres. Viktigheten og effekten av forskjellige forsøks betingelser vil bli forklart ytterligere heri. For det tredje, er områder av rRNA som er kjent for å danne sterke sturkturer som virker inhiberende på hybridisering mindre foretrukket. Til slutt, bør prober med omfattende selv-komplementaritet unngås.

I noen tilfeller, vil man ha en rekke sekvenser fra et spesielt område som vil gi prober med ønskede hybridiserings-egenskaper. I andre tilfeller, kan en sekvens være betydelig bedre enn en annen og som har en forskjell på bare en eneste base.

Følgende kart indikerer hvordan, for en utførelsesform av oppfinnelsen som er nyttig i påvisning av en nukleinsyre i nærvær av nær beslektede nukleinsyre-sekvenser, unike sekvenser kan utvelges. I dette eksempel, har rRNA-sekvenser blitt bestemt for organismer A-E og deres sekvenser, representert numerisk-, er rettet inn som vist. Man vil se at sekvens 1 er vanlig for alle organismer A-E. Sekvensene 2-6 er bare funnet i organismer A, B og C, mens sekvensene 8, 9 og 10 er unike for organisme A. Derfor vil en probe som er komplementær til sekvensen 8, 9 eller 10 spesifikt hybridisere til organisme A.

Illustrativt mønster av sekvenssammenhenger mellom beslektede bakterier

I de tilfeller hvori variasjonsmønstrene for et makro-molekyl er kjent, f.eks. rRNA, kan man fokusere på spesifikke områder som sannsynlige kandidater for probe-utformingen. Det er imidlertid ikke alltid nødvendig å bestemme hele nukleinsyre-sekvensen for å oppnå en probe-sekvens. Utvidelse fra enhver enkel oligonukleotid-primer kan gi opp til 300-400 baser i sekvens. Når en enkel primer anvendes for delvis å sekvensere rRNA fra target-organismen og organismer nær beslektet med targeten, kan en innretting gjennomføres som beskrevet over. Dersom en anvendbar probe-sekvens er funnet, er det ikke nødvendig å fortsette rRNA-sekvensering ved anvendelse av andre primere. Dersom, på den andre side, det ikke er oppnådd noen anvendbar probe-sekvens fra sekvenseringen med den første primer, eller dersom en høyere sensitivitet ønskes, kan andre primere anvendes for å oppnå mere sekvenser. I de tilfeller hvori variasjonsmønstrene for et molekyl ikke er særlig bra forstått, vil flere sekvens-data kunne være nødvendig før probe-utformingen.

Således, i følgende eksempler 1-3, anvendes to 16S-avledede primere. Den første primer ga ikke probe- sekvenser som imøtegår kriteriene som er gitt heri. Den andre primer ga probe-sekvenser som ble bestemt å være anvendbare etter karakterisering og utprøving for spesifitet som beskrevet. I eksempel 4, ble seks 23S primere anvendt før lokalisering av den fremsatte probe-sekvensen.

Når en sannsynlig unik sekvens er blitt identifisert, syntetiseres en komplementær DNA oligonukleotid. Denne enkel-kjedete oligonukleotid vil tjene som proben i DNA/rRNA-forsøket med hybridiseringsreaksjon. Definerte oligonukleotider kan syntetiseres ved hjelp av flere kjente metoder, omfattende automatisert fast-fase kjemisk syntese ved anvendelse av cyanoetylfosforamidit forløpere. Barone, A.D. et al., Nucleic Acids Research 12, 4051-4060 (1984). I denne metode syntetiseres deoksyd-oligonukleotider på faste polymerbærere. Frigjøring av oligonukleotidene fra bæreren gjennomføres ved behandling med ammoniumhydroksyd ved 60°C i 16 timer. Løsningen tørkes og råproduktet oppløses i vann og separeres på polyakrylamidgeler som generelt kan varieres fra 10 til 20% avhengig av lengden av fragmentet. Det bredeste bånd, som visualiseres ved hjelp av ultrafiolett lys, puttes fra gelen med et barberblad og ekstraheres med 0,1M ammoniumacetat, pH 7,0, ved romtemperatur i 8-12 timer. Etter sentrifugering, filtreres supernatanten gjennom et 0,4 mikron filter og avsaltes på en P-10 kolonne (Pharmacia). Andre kjente metoder for oppbygning av syntetiske oligonukleotider kan selvfølgelig anvendes.

Alminnelig utbredte DNA-syntetiserere kan fremstille store mengder syntetisk DNA. Etter syntese, undersøkes størrelsen på den nylig fremstilte DNA ved hjelp av gel-filtrering og molekyler med varierende størrelse påvises generelt. Noen av disse molekylene representerer mislykkede syntese-innslag som skjer under syntese-prosessen. Som en del av post-syntese-rensing, fraksjoner-es den syntetiske DNA vanligvis etter størrelse og bare de molekyler som har den rette lengde beholdes. Det er således mulig å oppnå en populasjon av syntetiske DNA-molekyler med lik størrelse.

Man har imidlertid generelt antatt at syntetisk DNA er naturlig oppbygd av en uniform populasjon av molekyler hvori alle har samme størrelse og basesekvens, og at hybridiserings-egenskapene for hvert molekyl i preparatet bør være de samme. I realiteten, er preparater av syntetisk DNA-molekyler heterogene og er sammensatt av en rekke molekyler som, skjønt de har samme størrelse, er på noen måte forskjellige fra hverandre og har forskjellige hybridiserings-egenskaper. Selv forskjellige preparater av samme sekvens kan noen ganger ha forskjellige hybridiserings-egenskaper.

Følgelig, kan preparater av samme syntetiske probe-sekvens ha forskjellige hybridiserings-egenskaper. På grunn av dette, kan spesifisiteten av probe-molekylet fra forskjellige preparater være forskjellige. Hybridiserings-egenskapene for hvert preparat bør undersøkes for å bestemme hybridiseringsbetingelsene som må anvendes for å oppnå den ønskede probe-spesifisitet. F.eks., har den syntetiske probe som er beskrevet i eksempel 4 under, en spesifisitets-profil som er beskrevet i tabell 14. Disse data ble oppnådd ved anvendelse av hybridiseringen og forsøks-betingelsene som er beskrevet. Et separat preparat av denne probe som har forskjellige hybridiserings-egenskaper vil eventuelt ikke ha nøyaktig den samme spesifisitetsprofil når den testes under de betingelser som er vist i eksempel 4. Slike probe-preparater er blitt fremstilt. For å oppnå den ønskede spesifisitet, kan disse prober hybridiseres og testes ved forskjellige betingelser, omfattende salt-konsentrasjon og/eller temperatur. De aktuelle betingelser hvorunder proben skal anvendes må bestemmes, eller tilpasses til eksisterende betingelser, for hver probe-batch da kunsten med.- DNA-syntese er litt ufullstendig.

Etter syntese og rensing av en spesiell oligonukleotid-sekvens, kan en rekke prosedyrer anvendes for å bestemme tilgjengeligheten av det endelige produkt. Den første er polyakrylamid-gel-elektroforese, som anvendes for å bestemme størrelse. Oligonukleotidet merkes ved

32

anvendelse av f.eks. p-ATP og T. polynukleotid-kmase.

Den merkede probe precipiteres i etanol, sentrifugeres og den tørkede pellet resuspenderes i påførings-bufferen (80% formamid, 20 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0,1% bromfenol-blått og 0,1% xylen-cyanol). Prøvene oppvarmes i 5 min. ved 90°C og påføres på en denaturerende polyakrylamid-gel. Elektroforesen gjennomføres i TBE-buffer (0,1M tris-HCl pH 8,3, 0,08M borsyre, 0,002M EDTA) i 1-2 timer ved 1.000 volt. Etter elektroforese av oligonukleotiden eksponeres gelen for røntgenstråle-film. Størrelsen av oligonukleotidet beregnes deretter ut fra vandringen av oligonukleotid-standardene kjørt samtidig.

Sekvensen av det syntetiske oligonukleotid kan også undersøkes ved å merke det ved 5'-enden med 3 2P-ATP

og T^polynukleotid-kinase, underkaste det for kjemiske nedbrytningsteknikker av standard type, Maxam, A.M. og Gilbert, W., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 650-564

(1980), og analysere produktene på polyakrylamid-geler.

Foretrukket er nukleotid-sekvensen av proben nøyaktig komplementær til den tidligere identifiserte unike rRNA-sekvens, skjønt den ikke behøver å være det.

Smelte-profilen, omfattende smelte-temperaturen (Tm)

av oligonukleotiden/rRNA-hybridene bør også bestemmes. En måte å bestemme Tm på er å hybridisere en<32>P-oligonukleotid til dens komplementære target-nukleinsyre ved 50°C i 0,1M fosfat-buffer, pH 6,8. Hybridiserings-blandingen fortynnes og føres gjennom en 2 cm hydroksy-

apatitt-kolonne ved 50°C. -Kolonnen vaskes med 0,1N fosfat-buffer, 0,02% SDS for å eluere alle uhybridiserte enkel-kjedete prober. Kolonne-temperaturen nedsettes deretter til 15°C og økes med en tilvekst på 5°C inntil hele proben er enkel-kjedet. Ved hver temperatur, elueres uhybridisert probe og tellinger pr. minutt (cpm) i hver fraksjon bestemmes. Antall cpm som er vist å

være bundet til hydroksyapatitt dividert med total cpm tilsatt til kolonnen, er lik prosent hybridisering av proben til target-nukleinsyren.

En alternativ metode for å bestemme termisk stabilitet av et hybrid er gitt i det følgende. En prøve av hybrid-nukleinsyre fortynnes i 1 ml av enten 0,12M fosfat-buffer, 0,2% SDS, ImM EDTA, ImM EGTA eller en passende hybridiserings-buffer. Denne løsningen på 1 ml oppvarmes til 45°C i 5 min. og plasseres i et vannbad med romtemperatur for avkjøling i 5 min. Denne hybrid-inneholdende løsning på 1 ml måles i en hydroksyapatitt-kolonne, som beholder hydridet og vasker bort ubundet probe. Dersom det anvendes en hybridiseringsløsning som er forskjellig fra 0,12M fosfat-bufferen, vil en fortynning av hybridiseringsløsningen gi 0,12M fosfat-buffer være nødvendig for binding. man fortsetter med å ta ut prøver av hybrid og fortynne dem i 1 ml hybridiserings-løsning eller i standard 0,12M fosfat-bufferen som er beskrevet over, idet oppvarmingstemperaturen økes 5°C av gangen. Dette fortsettes inntil alt hybridiet er dissosiert. Det punkt hvori halvparten av hybridet er omdannet til dissosiert form, betraktes som Tm. Et Tm for et gitt hybrid vil variere avhengig av hybridiserings-løsningen som anvendes, fordi den termiske stabilitet avhenger av konsentrasjonen av forskjellige salt, detergenter og andre oppløste forbindelser som innvirker på den

relative hybridstabilitet under den termiske denaturering.

Fordi graden og spesifisiteten av hybridiserings-reaksjoner slik som det beskrevet heri, er påvirket av en rekke faktorer, vil manipulering av en eller flere av disse faktorer bestemme den nøyaktige sensitivitet og spesifisitet av en spesiell probe, enten den er nøyaktig komplementær til dens target eller ikke. F.eks., kan base-sammensetningen av proben være signifikant, fordi G-C-basepar utviser større termisk stabilitet sammenlignet med A-T-basepar, noe som skyldes ytterligere hydrogen-bindinger.

Således, vil hybridisering som omfatter komplementære nukleinsyrer med større G-C-innhold, være stabil ved høeyre temperaturer.

Man har oppdaget at lengden av target-nukleinsyre-sekvensen og følgelig lengden av probe-sekvensen kan også være viktig. Idet det er mulig for nukleinsyre og hybridiseres som ikke nøyaktig komplementære, vil den lengste utstrekning av nøyaktig homolog basesekvens normalt primært bestemme hybrid-stabilitet. Idet oligonukleotid-prober med forskjellige lengder og base-sammensetninger kan anvendes, har oligonukleotid-prober som er foretrukne i henhold til oppfinnelsen en lengde på mellom omtrent 15 og omtrent 50 baser og er minst omtrent 75 - 100% homologe til target-nukleinsyren. For de fleste anvendelser, er 95-100% homologi til target-nukleinsyren foretrukket.

Ione-styrke og inkubasjons-temperatur bør også tas med i betraktning ved oppbygning av en probe. Det er kjent at graden aav hybridisering vil øke når ionestyrken i reaksjonsblandingen øker og at den termiske stabilitet for hybrider vil øke med økende ionestyrke. Generelt skjer optimal hybridisering for syntetiske oligonukleotid-prober med en lengde på omtrent 15 til 50 baser, ved omtrent 5°C under smeltetemperatur for en gitt dupleks. Inkubering ved temperaturer under det optimale kan tillate at uoverensstemmende base-sekvenser hybridiserer

og kan derfor resultere i redusert spesifisitet.

Når det gjelder nukleinsyre-konsentrasjon, er det kjent at graden av hybridisering er proporsjonal med konsentrasjonen av de to nukleinsyre-artene som virker på hverandre. Således, synes tilstedeværelsen av forbindelser slik som dekstran og dekstran-sulfat å øke

den lokale konsentrasjon av nukleinsyre-arter og dermed resultere i en økt grad av hybridisering. Andre midler som vil gi økte grader av hybridisering, er spesifisert i US patentansøkning, serie nr. 627.795, med tittel

"Accelerated Nucleic Acid Reassociation Method", innsendt 5. juli 1984, Continuation-in-Part derav, serie nr.

(ikke tildelt ennå), innsendt 4. juni 1987 og US patent-ansøkning, serie nr. 816.711, med tittel "Accelerated Nucleic Acid Reassosiation Method", innsendt 7. januar 1986, idet begge er gitt som referanser heri. På den annen side, vil kjemiske reagenser som ødelegger hydrogenbindinger slik som formamid, urea, DMSO og alkoholer, øke stringensen av hybridisering.

Utvalgte oligonukleotid-prober kan merkes ved hjelp av en rekke vel kjente metoder. Anvendbare midler for merking omfatter radioisotoper såvel som ikke-radioaktive meddelende grupper. Isotoper for merking omfatter<3>H, 35S,32P, 125I, kolbolt og<14>C. De fleste metoder med isotopmerking omfatter anvendelse av enzymer og omfatter kjente metoder av nick-translasjon, ende-merking, syntese av en andre kjede og revers transkripsjon. Når man anvender radio-merkede prover, kan hybridisering påvises ved autoradiografi, scintillasjonstelling eller gamma-telling. Påvisningsmetoden som velges vil avhenge av hybridiserings-betingelsene og den spesielle radioisotop som er anvendt for merking.

Ikke-isotope materialer kan også anvendes for merking, og kan innføres ved innlemmelse av modifiserte nukleotider gjennom anvendelsen av enzymer eller ved kjemisk modifisering av proben, f.eks. ved anvendelse av ikke-nukleotid binde-grupper. Ikke-isotop merking omfatter fluorescerende molekyler, kjemiluminescerende molekyler, enzymer, kofaktorer, enzymsubstanser, haptener eller andre ligander. Man foertrekker nå å anvende akridium-estere.

I en utførelsesform av oppfinnelsen med DNA/rRNA

hybridiseringsforsøk, omsettes en merket probe og

- bakterielle target-nukleinsyrer i løsningen. rRNA kan være frigjort fra bakterielle celler ved hjelp av den soniske nedbrytningsmetode som er beskrevet i Murphy, K.A. et al., US patentansøkning, serie nr. 841.860, med tittel "Method for Releasing RNA and DNA From Cells", innsendt 20. mars. 1986, som er innlemmet heri som referanse. Andre kjente metoder for nedbryting av celler omfatter anvendelse av enzymer, osmotisk sjokk, kjemisk behandling og omrøring med glassperler. Etter eller samtidig med frigjøringen av rRNA, kan merket probe tilsettes i nærvær av akselleratorer og inkuberes ved optimale hybridiserings-temperatur i en tidsperiode som er nødvendig å oppnå signifikant reaksjon. Etter denne inkubasjonsperioden, kan hydroksyapatitt tilsettes til reaksjonsblandingen for å separere proben/rRNA-hybridene fra de ikke-hybridiserte probemolekyler. Hydroksyapatitt-pelleten vasket, resentrifigures og hybrider påvises ved hjelp av midler i henhold til den merking som anvendes.

Enogtyve utførelsesformer som illustrerer den foreliggende oppfinnelse er gitt i det følgende, hvori en syntetisk probe eller prober komplementær til en unik rRNA-sekvens fra en target-organisme, eller gruppe av organismer bestemmes, oppbygges og anvendes i et hybridiserings-forsøk.

BESKRIVELSE AV SÆRLIGE UTFØRELSESFORMER

Mycobakterium er syrefaste, alkoholfaste, aerobe, ikke-bevegelige bacilli. Deres lipid-innhold er høyt og de intracellulare (5); Mycobacterium scrofulaceum (6); Mycobacterium chelonae (12); og Mycobacterium fortuitum (10) .

Følgende cDNA-sekvens blekarakterisert vedkriteriene lengde, Tm og sekvens-analyser som beskrevet på sidene 7-8 over, og ble bestemt å være spesifikke for rRNA.

Mycobacterium avium:

Denne sekvens er komplementær til et unikt segment funnet i 16S rRNA i Mycobacterium avium. Størrelsen av proben er 38 baser. Proben har en Tm på 74°C og sekvens-analyser ved hjelp av metoden etter Maxam & Gilbert

(1980), supra, bekreftet at proben var riktig syntetisert. Proben er i stand til å hybridisere til rRNA fra M.

avium i området som tilsvarer basene 185-225 i E. coli 16S rRNA.

For å demonstrere reaktiviteten av denne sekvens for Mycobacterium avium, ble den testet som en probe i hybridiserings-reaksjoner under følgende betingelser.

32

P-ende-merkede oligonukleotid-prober ble blandet med

1 mikrogram (7x10 -1, 3 mol) renset rRNA fra Mycobacterium avium og omsatt i 0,12M PB hybridiseringsbuffer (ekvimolare mengder av Na2HP04og NaP^PO^, 1 mM EDTA og 0,02% SDS (natrium-dodecyl-sulfat) ved 65°C i 60 min.

i et sluttvolum på 50 mikroliter. I separate rør ble proben blandet med hybridiseringsbufferen, med både target tilstede og ikke tilstede. Etter separering på hydroksyapatitt som gitt i patentansøkningen som er identifisert på side 2, supra, ble hybridene kvantisert ved scintillasjonstelling. Disse resultatene er vist i tabell 1, som viser at proben i stor grad reagerer med homolog target og har svært liten ikke-spesifikk binding til hydroksyapatitt.

vokser sent. Mycobacterium avium og Mycobacterium intracellulare omtales sammen som M. avium-intracellulare fordi det er så vanskelig å differensiere dem. Nylig, ble M. avium komplekset, som omfatter M. intracellulare vist å være den andre mest vanlige isolerte, klinisk signifikante Mycobacterium. Good, R.C. et al., J. Infect. Dis. 146, 829-833 (1982). Nyere bevis indikerer at disse organismer er en vanlig årsak til opportunistisk infeksjon hos pasienter med AIDS (acquired immune deficiency syndrome). Gill, V.J. et al., J. Clin. Microbio. 22, 543-546 (1985). Behandling av slike infeksjoner hos aids-pasienter er vanskelig, fordi disse organismene er resistente overfor de fleste anti-tuberkuløse legemidler. Ofte blir en kombinasjon av fem legemidler anvendt i terapi. Alvorligheten av disse infeksjoner krever også hurtig diagnose som, før den foreliggende oppfinnelse, ikke var tilgjengelig.

Medlemmer av Mycobacterium tuberculosis komplekset

(Mtb) omfatter Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum og Mycobacterium microti. De første tre er patogene for mennesker mens den siste er patogen for dyr. Disse organismene produserer sakte utviklende granulomas på huden eller de kan trenge inn i indre organer. Tuberkulose i lungene kan spre seg til andre kroppsdeler ved hjelp av sirkulasjonssystemet, lymfesystemet eller tarmen. Til tross for bedringer i folkehelsen og anvendelse av effektiv kjemoterapi, fortsetter Mykobakterielle sykdommer, særlig tuberkulose, å representere et vesentlig verdensomspennende helse-problem .

Den klassiske metode for påvisning av bakterier i en test-prøve, omfatter dyrking av prøven for å øke antall bakterieceller som er tilstede til observerbar vekst av kolonier som kan identifiseres og opptelles.

Om ønsket, kan kulturen også underkastes ytterligere undersøkelser for å bestemme anti-mikrobiell følsomhet. For tiden, er de mest brukte prosedyrer for påvisning, isolasjon og identifikasjon av mycobakterie-arter, utstryk av syrefast bacilli (AFB) for mikroskopisk påvisning (ved anvendelse av enten Ziehl Nielsen eller fluorkrom-teknikker), dyrkingsmetoder ved anvendelse av Lowenstein-Jensen medium og Middlebrook medium, og biokjemiske

tester. AFB avhenger av den høye lipidinnhold i mycobacterium for å beholde farge etter behandling med syre-alkohol. mens AFB utstryknings-testen er relativt hurtog og enkel å gjennomføre påviser den ikke alltid Mycobacteria og vil ikke differensiere mellom mycobacterium avium og ikke-tuberkolose-arter, mellom Mycobacterium intracellulare og ikke-tuberkolose-arter eller mellom Mycobacterium tuberculosis- kompleks-bacilli og ikke-tuberkulose-arter. For nøyaktig identifisering av de infeksiøse mycobacterie-artene, må klinikeren stole på dyrkings-resultater som kan kreve alt fra 3 til 8 ukers dyrking etterfulgt av omfattende biokjemisk testing. Andre tester er utviklet og basert på påvisningen av metaboliske produkter fra mycobacterium ved anvendelse av karbon-14 merkede substrater.

Særlig, Bactec (Tm) instrumentet kan påvise tilstedeværelsen av Mycobacterium i løpet av 6 til 10 døgn under inokkulasjonstiden. Gil, V.J., supra. Testen sjeldner imidlertid ikke bakterium-artene. Det er ofte viktig å gjøre denne bestemmelse slik at spesielle legemidler som denne orgnaisme er følsom overfor kan foreskrives. For vanlige dyrkningsmetoder, krever dette ytterligere to til tre uker og for Bactec-metoden, ytterligere seks til 10 døgn.

I tillegg, er spesifikke utførelsesformer for Mycoplasma-pneumonia, Mycobacterium, Legionella, Salmonella, Chlamydia trachomatis, Campylobacter, Proteus mirabilis, Enterococcus, Enterocacter cloacae. E. coli, Pseudomonas gruppe I, bakterier, sopp, og Neisseria gonorrhoeae frem-satt i de følgende eksempler.

Som indikert ved eksemplene under, har den foreliggende oppfinnelse betydelige fordeler over hver av disse tidligere kjente metodene, ikke bare i økt nøyaktighet, spesifisitet og enkelhet på testen, men også ved at tiden for å komme frem til en diagnose reduseres betraktelig. Oppfinnelsen gjør det mulig å gi diagnoser og initiere en effektiv behandling samme dag som testingen.

Eksempel 1

I- det følgende er det beskrevet fremstillingen av et enkelkjedet deoksyoligonukleotid med unik sekvens og definert lengde, som er merket og anvendes som en probe i et hybridiseringsforsøk i løsning, for å påvise tilstedeværelsen av rRNA fra Mycobacterium avium. Denne unike sekvens er spesifikk for rRNA i Mycobacterium avium og kryss-reagerer ikke av betydning under hybridiserings-betingelsene i dette eksempel, med nukleinsyre fra en rekke andre bakteriearter eller respiratorisk infeksiøst middel, omfattende de nær beslektede Mycobacterium intracellulare. Denne proben er i stand til å sjeldne de to artene, til tross for en omtrentlig homologi på 98% rRNA mellom de to artene. I dette eksempel, såvel som i eksempel 2 og 3, ble sekvenser for M.avium, M. tuberculosis compleks, M. intracellulare og beslektede organismer oppnådd ved anvendelse av en spesifikk primer til et sterkt bevart område i 16S rRNA. Sekvensen av denne primer, avledet fra E. coli rRNA, var 5'-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT-3'. 5 nanogram primer ble blandet med 1 mikrogram av hver rRNA som skulle sekvenseres i nærvær av 0,1M KC1 og 20mM tris-HCl pH 8,3 i et sluttvolum på 10 mikroliter. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 10 min. ved 45°C og deretter plassert på is. 2,5 mikroliter 3 5SdATP og 0,5 mikroliter revers transkriptase ble tilsatt. Prøven ble fordelt i 4 rør, idet hvert rør inneholder enten dideoksy A, G, T eller C. Konsentrasjonene av disse nukleotider er gitt i Lane et al. supra. Prøvene ble onkubert ved 40°C i 30 min. og ble deretter precipitert i etanol, sentrifugert og pelletene ble lyfolisert tørre. Pelletene ble resuspendert i 10 mikroliter formamid farger (100% formamid, 0,1% bromfenol-blått og 0,1% xylen-cyanol), og påsatt på 80 cm 8% polyakrylamid-geler. Gelene ble kjørt ved 2000 volt i 2-4 timer.

Således, ble nukleotid-sekvensene for 16S rRNA av Mycobacterium avium og det som ble betraktet å være dens nærmeste fylogenetiske naboer, Mycobacterium intracellulare og Mycobacterium tuberculosis, bestemt ved hjelp av metoden etter Lane, D.J. et al., Pore. Nat.

Acad. Sei USA 82:6955 (1985). I tillegg til å bestemme rRNA-sekvensene for organismene som er gitt over, ble et spektrum av klinisk signifikant Mycobacterium også sekvensert. Disse omfattet M. fortuitum, M. scrofulaceum og M. chelonae. Utvalgte medlemmer av en rekke slekter som er nær beslektet med Mycobacterium ble også sekvensert, omfattende Rhodococcus bronchialis, Corynebacterium xerosis og Nocardia asteroides.

Partielle rRNA-sekvenser fra de ovennevnte organismene

ble rettet inn for maksimal nukleotid homologi, ved anvendelse av vanlig tilgjengelig software from Intelligenetics, Inc., 1075 El Camino Real West,

Mountain View, California 94040-2216 (IFIND Program).

Fra denne innrettingen, ble sekvensområder som var unike for Mycobacterium avium bestemt. Proben ble utvalgt slik at den var fullstendig komplementær til en target-nukleinsyre-sekvens og slik at den hadde en 10% eller større uoverensstemmelse med det innrettede rRNA fra dens nærmest kjente fylogenetiske nabo. En sekvens med lengde på 38 baser ble valgt. Antall uoverensstemmende baser i forhold til Mycobacterium avium-sekvensen var som følger: Mycobacterium tuberculosis (8); Mycobacterium

Spesifisitet av proben for M. avium ble undersøkt ved

32

at den P merkede probe ble blandet med rRNA frigjort fra celler av 29 andre mykobakterie-arter ved hjelp av sonisk nedbrytningsteknikker som er beskrevet i Murphy

g

et al., US patentansøkning serie nr. 841.860. 1x10 celler ble oppløst i 0,1 ml 5% SDS og ultralydbehandlet i 10 min. ved 50-60°C. 1,0 ml hybridiseringsbuffer (45% natrium-diisobutyl-sulfosuccinat, 40 mM fosfat-buffer pH 6,8 og 1 mm EDTA) ble tilsatt og blandingen ble inkubert i 60 min. ved 72°C. Etter inkubering, ble 4,0 ml hydroksyapatittløsning (0,14M natrium-fosfat-buffer, pH 6,8, 0,02% SDS og 1,0 g hydroksyapatitt pr.

50 ml løsning) tilsatt og inkubert i 5 min. ved 72°C. Prøven ble sentrifugert og supernatanten fjernet. 4,OM vaskeløsning (0,14M natrium-fosfat pH 6,8) ble tilsatt og prøven ble omrørt, sentrifugert og supernatanten fjernet. Radiaoaktiviteten som var bundet til hydroksyapatitt ble bestemt ved scintillasjonstelling. Resultatene er vist i tabell 2 og indikerer at proben er spesifikk for Mycobacterium avium og reagerer ikke med andre mykobakterie-arter, omfattende Mycobacterium intracellulare.

Som vist i tabell 3, reagerte heller ikke proben med rRNA fra noen av de respiratoriske patogener som også ble testet ved metoden som er beskrevet over. Heller ikke reagerte proben med noen andre nær beslektede eller fylogenetisk mer forskjellige bakteriearter som også ble testet ved hjelp av metoden (tabell 4).

Eksempel 2

Etter utrettingen som beskrevet i eksempel 1, ble følgende sekvenskarakterisert vedovennevnte kriterier når det gjelder lengde, Tm og sekvens-analyser og ble bestemt å være spesifikk for Mycobacterium intracellulare:

Sekvensen er komplementær til et unikt segment funnet i 16S rRNA fra Mycobacterium intracellulare. Størrelsen på proben var 38 baser. Proben hadde en Tm på 75°C og sekvensanalyser bekreftet at proben var riktig syntetisert. Proben hybridiserte til rRNA fra M. intracellulare i området som tilsvarer basene 185-225 i E. coli 16S rRNA.

For å demonstrere reaktiviteten av denne sekvens for Mycobacterium intracellulare, ble proben testet i hybridiserings-reaksjoner under følgende betingelser.

32

P-ende-merket oligonukleotid-prober ble blandet med

1 mikrogram (7x10 -13 mol) renset rRNA fra Mycobacterium intracellulare og omsatt i 0,12M PB (ekvimolare mengder Na2HP04og NaH2P04), ImM EDTA og 0,2% SDS (natrium-dodecyl-sulfat) ved 65°C i 60 min. i et sluttvolum på 50 mikroliter. I separate rør ble proben blandet med hybridiseringsbuffer med å uten targetMycobacterium intracellulare rRNA tilstede. Etter separering på hydroksyapatitt som beskrevet tidligere, ble hybridene kvantisert ved scintallasjons-telling. Disse resultatene er vist i tabell 5.

Disse dataene viser at proben i stor utstrekning reagerer med dens homologe target og har en svært liten ikke-spesifikk binding til hydroksyapatitt.

Spesifisiteten for Mycobacterium intracellulare-proben

32

ble testet ved at den P-merkede proben ble blandet med rRNA frigitt fra celler fra 29 andre mykobakterie-arter ved hjelp av soniske nedbrytningsteknikker som beskrevet i Murphy et al., US patentansøkning nr. 841.860. Alle hybridiserings-forsøkene ble gjennomført som beskrevet i eksempel 1. Tabell 6 indikerer at proben er spesifikk for Mycobacterium intracellulare og reagerer ikke med andre mykobakterie-arter, omfattende Mycobacterium avium.

Disse resultater er imponerende sett på bakgrunn av 98% rRNA homogoli til M. avium; 98% homologi til M. Kansasii; 98% homologi til M. asiaticum og 97% homologi til M. tuberculosis.

Som vist i tabell 7, reagerte ikke proben med rRNA fra noen av de respiratoriske patogener som ble testet i hybridiserings-forsøket. Heller ikke reagerte proben med noen andre nær beslektede eller fylogenetisk mer forskjellige bakterie-arter som ble testet (tabell 8).

Eksempel 3

Etter innrettingen som beskrevet i eksempel 1, ble følgende sekvenskarakterisert vedovennevnte tre kriterier som gjelder størrelse, sekvens og Tm, og ble bestemt å være spesifikke overfor Mtb-komplekset av organismene Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis og Mycobacterium microti:

1. TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTG.

Sekvensen er komplementær til et unikt segment funnet i 16S rRNA av Mtb-kompleks-bakterien. Størrelsen på proben er 35 baser. Proben har en Tm på 72°C og sekvens-analyse bekreftet at proben var riktig syntetisert. Den kan hybridisere i områder som tilsvarer basene 185-225 i E. coli 16S rRNA.

For å demonstrere reaktiviteten av denne sekvens for Mtb-komplekset, ble proben testet i hybridiserings-reaksjoner

32

under følgende betingelser. P-ende-merket oligo-nukleotid-probe ble blandet med 1 mikrogram (7x10 -13 mol) renset rRNA fra Mycobacterium tuberculosis og omsatt i 0,12M PB hybridiserings-buffer (ekvimolare mengder av Na2HP04og NaH2P04), ImM EDTA og 0,2 SDS (natriumdodecyl-sulfat) ved 65°C i 60 min. i et sluttvolum på 50 mikroliter. I separate rør ble proben blandet med hybridiserings-bufferen med og uten target-rRNA fra Mycobacterium tuberculosis tilstede. Etter separering på hydroksyapatitt som beskrevet over, ble hybridene kvantisert ved scintallasjons-telling. Resultatene er vist i tabell 9.

Disse dataene viser at proben i stor utstrekning reagerer med homolog target og har svært liten ikke-spesifikk binding til hydroksyapatitt.

Spesifisitet av proben for Mtb-komplekset ble undersøkt ved å blande<32>P-merket probe med rRNA frigjort fra celler av 4 Mtb-komplekset bacilli og fra 25 andre mykobakterie-arter ved hjelp av sonisk nedbrytnings-teknikker som er beskrevet i Murphy et al., US patent-ansøkning nr. 841.860. Alle hybridiserings-forsøkene ble gjennomført som beskrevet i eksempel 1. Tabell 10 indikerer at proben er spesifikk for organismer innen Mtb-komplekset og reagerer ikke med andre mykobakterie-arter .

Som vist i tabell 11, reagerte ikke prøven med rRNA fra noen av de respiratoriske patogener som er testet i hybridiserings-forsøket. Heller ikke reagerte proben med noen andre nær beslektede eller fylogenetisk mer forskjellige bakterie-arter som ble testet (tabell 12).

To derivater av proben i eksempel 3 (gitt som 2-3 under) ble fremstilt og undersøkt:

2. CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCG

3. ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATC.

Alle tre probene hadde lignende Tm (henhv. 72°C, 73,5°C og 72,3°C) og lignende hybridiserings-egenskaper.

Hybridisering til Mycobacterium tuberculosis kompleks-organismer var 68-75% og ikke-spesifikk hybridisering til hydroksyapatitt var mindre enn 2%.

Resultater for hybridiserings-forsøkstester for disse derivater følger.

Eksempel 4

Proben som er spesifikk for 23S rRNA fra M. tuberculosis-komplekset ble oppnådd ved anvendelse av en primer som var komplementær til et godt bevart område i 23S rRNA. Sekvensen av denne primer, avledet fra E. coli rRNA, var 5<1->AGG AAC CCT TGG GCT TTC GG-3'. Fem nanogram av denne primer ble blandet med 1 mikrogram rRNA fra M. tuberculosis og andre nær beslektede mykobakterier og prosedyren som beskrevet i eksemplene 1, 2 og 3 ble fulgt. Etter innretting som beskrevet i eksempel 1, ble følgende sekvens bestemt å være spesifikk til Mtb-komplekset fra organismene Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis og Mycobacterium microti:

Sekvensen er komplementær til et unikt segment funnet i

23S rRNA i Mtb-kompleks-bakterien. Oligonukleotid-proben blekarakterisertsom beskrevet tidligere ved kriteriene som vedrører lengde, Tm og sekvensanalyser. Størrelsen på proben er 31 baser. Proben har en Tm på 72,5°C og sekvensanalyseer bekreftet at proben var riktig syntetisert. Den er i stand til å hybridisere i området som tilsvarer basene 1155-1190 fra E. coli 23S rRNA.

For å demonstrere reaktiviteten av denne sekvens for Mtb-komplekset ble proben testet i hybridiserings-reaksjoner

32

under følgende betingelser. P-ende-merkede oligonukleotidprober ble blandet med 1 mikrogram (7 x 10 -13 mol) renset rRNA fra Mycobacterium tuberculosis og omsatt i 0,12M PB hybridiserings-buffer (ekvimolare mengder Na2HP04og NaH2P04), ImM EDTA og 0,2 SDS (natrium-dodecyl-sulfat) ved 65°C i 60 min. i et slutt-volum på 50 mikroliter. I separate rør ble proben blandet med hybridiserings-bufferen med og uten target rRNA fra Mycobacterium tuberculosis tilstede. Etter separering

på hydroksyapatitt som beskrevet tidligere, ble hybridene kvantisert ved hjelp av scintillasjons-telling. Resultatene er vist i tabell 14.

Disse data viser at proben reagerte i høy grad med homolog target og hadde svært liten ikke-spesifikk binding til hydroksyapatitt.

Spesifisitet av proben for Mtb-komplekset ble testet

ved å blande den<32>P-merkede proben med rRNA frigitt fra celler fra de fire Mtb-kompleks bacilli og fra 25 andre mykobakterie-arter ved sonisk nedbrytningsteknikker som er beskrevet i Murphy et al., US patentansøkning nr. 841.860. Alle hybridiseringsforsøk ble gjennomført som beskrevet i eksempel 1. Tabell 14 indikerer at proben er spesifikk for organismer innen Mtb-komplekset og reagerer ikke med andre bakterie-arter.

Eksempel 5

Tre ytterligere Mycobacterium tuberculosis kompleks-prober, eksemplene 5-7 heri, ble identifisert ved anvendelse av to unike primere komplementær til 23S rRNA. Den første sekvens er:

Sekvensen i dette eksempel"5 ble oppnådd ved anvendelse

av en 23S primer med sekvensen 5'-GGC CAT TAG ATC ACT CC-3'. Den blekarakterisertog vist å være spesifikk for Mycobacterium tuberculosis komplekset av organismer omfattende Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum og Mycobacterium bovis. Denne sekvens, fra 23S rRNA, har en lengde på 31 baser og har en Tm på 72°C. Proben er i stand til å hybridisere til rRNA fra de ovennevnte organismer i området tilsvarende basene 540-575 i E. coli 23S rRNA.

For å vise reaktiviteten og spesifisiteten av denne

probe for Mycobacterium tuberculosis komplekset, ble den testet som en probe i hybridiserings-reaksjoner under

32

følgende betingelser. P-ende-merket oligonukleotid-probe ble blandet med rRNA frigjort fra celler fra 30 mykobakterie-arter ved hjelp av soniske nedbrytnings-teknikker som er beskrevet i Murphy et al., US patent-ansøkning ser. nr. 841.860. 3 x 10 7 celler ble suspendert i 0,1 ml 5% SDS og ultralyd-behandlet i 15 min. ved 50-60°C. 1 ml hybridiserings-buffer (45% diisobutyl-sulfosuccinat, 40 mM fosfatbuffer pH 6,8, ImM EDTA,

1 mM EGTA) ble tilsatt og blandingen inkubert ved 72°C

i 2 timer. Etter inkubering, ble 4 ml 2% (w/v) hydroksyapatitt, 0,12M natrium-fosfat-buffer pH 6,8, 0,02% SDS, 0,02% natrium-azid tilsatt og inkubert ved 72°C i 5 min. Prøven ble sentrifugert og supernatanten fjernet. 4 ml vaskeløsning (0,12M natrium-fosfatbuffer pH 6,8, 0,02%

SDS, 0,02% natrium-azid) ble tilsatt og prøven ble blandet, sentrifugert og supernatanten fjernet. Radioaktiviteten som var bundet til hydroksyapatitt ble bestemt ved scintallasjonstelling. Resultatene er vist i tabell 16

og indikerer at proben er spesifikk for Mycobacterium tuberculosis komplekset av organismer.

Tabell 16 viser at proben ikke kryss-reagerte med RNA fra av de nær beslektede organismer testet ved hjelp av metoden som er beskrevet over.

Eksempel 6

Den andre Mycobacterium tuberculosis kompleksproben ble oppnådd ved anvendelse av en 23S primer med seskvensen

CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG AAC CTT TGG G-3 ' .

Sekvensen er:

Denne sekvens, fra 23S rRNA, har en lengde på 38 baser og har en Tm på 75°C. Den hybridiserer i området som tilsvarer basene 2195-2235 fra E. coli 23S rRNA.

Lik kompleks-proben i eksempel 5, ble denne sekvenskarakterisertog vist å være spesifikk for Mycobacterium tuberculosis komplekset av organismer omfattende Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum og Mycobacterium bovis.

For å demonstrere reaktiviteten og spesifisiteten av proben fra dette eksempel 6 til Mycobacterium tuberculosis kompleks, ble den testet som en probe i hybridiserings-reaksjoner under følgende betingelser som er beskrevet for proben i eksempel 5. Resultatene er vist i tabell 18 og indikerer at proben er spesifikk for Mycobacterium tuberculosis komplekset av organismer med unntagelse av Mycobacterium thermoresistibile, et sjeldent isolat som ikke er en human patogen.

Tabell 19 viser at proben ikke kryss-reagerte med RNA fra noen av de fylogenetisk nær beslektede organismer som ble testet ved hjelp av metoden som nettopp er beskrevet.

Eksempel 7

Følgende ytterligere Mycobacterium tuberculosis kompleks-probe er også identifisert, ved- anvendelse av en 23S primer med samme sekvens som den i eksempel 6, nemlig

Denne sekvens, fra 23S rRNA har en lengde på 31 baser

og har en Tm på 71°C. Den hybridiserer i området tilsvarer basene 2195 - 2235 fra E. coli 23S rRNA. Som tilfellet var med Mycobacterium tuberculosis kompleks-probene fra eksempel 5 og 6 heri, ble denne sekvens også

karakterisertog vist å være spesifikk for Mycobacterium tuberculosis komplekset av organismer, omfatter Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum og Mycobacterium bovis.

For demonstrere reaktiviteten og spesifisiteten av denne probe for Mycobacterium tuberculosis kompleks, ble det testet som en probe i hybridiserings-reaksjoner under betingelsene som beskrevet for proben i eksempel 5. Tabell 20 viser at proben er spesifikk for Mycobacterium tuberculosis komplekset av organismer.

Tabell 21 viser at proben•ikke kryss-reagerer med RNA fra noen av de nær beslektede organismer som ble testet ved hjelp av metoden som nettopp er beskrevet.

Spesielt, overlappende prober har identisk spesifisitet. Sammenlign, f.eks., probene fra eksemplene 6 og 7:

Der kan være flere sekvenser fra et spesielt område som vil gi prober med ønskede hybridiserings-egenskaper. I andre tilfeller, kan en probe-sekvens være betydelig bedre enn en annen probe, idet forskjellen mellom dem bare er en eneste base. Generelt, jo større sekvens-forskjellen (% uoverensstemmelse) mellom en target og en ikke-target organisme er, dessto mer sannsynlig vil man være i stand til å endre proben uten å innvirke på dens anvendelighet for en spesifikk anvendelse. Dette fenomen ble også vist ved de avledede prober i eksempel 3.

I eksempel 7, ble fem baser tilsatt til 5<1->enden av proben i eksempel 6, og 12 baser ble fjernet fra 3'-enden. De to prober har ialt vesentlig identiske hybridiserings-egenskaper.

Eksempel 8

Mycobacterium-slekten er særlig vanskelig å sjeldne fra Nocardia, corynebacterium og Rhodococcus. Disse slekter har felles antigener, precipitiner og G & C tellinger. Til tross for det faktum at disse organismer også utviser 92 - 94% rRNA homologi til de ovennevnte Mycobacterium organismer, har man utformet prober som påviser alle medlemmer av slekten Mycobacterium uten kryss-reagering til de nær beslektede slekter.

I tillegg til Mycobacterium-art-probene som allerede

er gitt, ble fire prober spesifikke for medlemmer av Mycobacterium-slekten identifisert ved anvendelse av en primer som er komplementær til 16S rRNA og en primer komplementær til 23S rRNA. Sekvens 1 ble oppnådd ved anvendelse av en 16S primer med sekvensen

5' -TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA-3'.

Sekvenser 2, 3 og 4 ble oppnådd ved å anvende en 16S primer med sekvensen 5' - GTG TCG GTT TTG GGT ACG-3' . Sekvens 1 er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Mycobacterium i området som tilsvarer basene 1025-1060 fra E. coli 16S rRNA. Sekvensene 2-4 hybridiserer i områder tilsvarende til følgende baser fraE. coli 23S rRNA i nummer-systemet i overensstemmelse med oppfinnelsen (se fig. 2); 1440-1475; 1515-1555; 1570-1610 i nummer-systemet i overensstemmelse med oppfinnelsen.

Følgende sekvenser blekarakterisertog vist å være spesifikke for slekten Mycobacterium:

1. CCA TGC ACC ACC TGC ACA CAG GCC ACA AGG

2. GGC TTG CCC CAG TAT TAC CAC TGA CTG GTA CGG

3. CAC CGA ATT CGC CTC AAC CGG CTA TGC GTC ACC TC

4. GGG GTA CGG CCC GTG TGT GTG CTC GCT AGA GGC

Sekvens 1 fra 16S rRNA, har en lengde på 30 baser og har en Tm på 73°C. Sekvens 2, fra 23S rRNA, har en lengde på 33 baser og en Tm på 75°C. Sekvens 3, fra 23S rRNA, har en lengde på 35 baser og en Tm på 76°C. Sekvens 4, fra 23S er rRNA, har en lengde på 33 baser og en Tm på 73°C.

For å demonstrere reaktiviteten og spesifisiteten av probe 1 for medlemmer av slekten Mycobacterium, ble den testet som en probe i hybridiserings-reaksjoner under

125

følgende betingelser. I-merket oligonukleotid-probe ble blandet med rRNA frigjort fra celler av 30 arter av mykobakterier ved hjelp av soniske nedbrytningsteknikker som er beskrevet i Murphy et al., US patentansøkning, serie nr. 841.860. 3 x 10^ celler ble suspendert i 0,1 ml 5% SDS og ultralydbehandlet i 15 min. ved 50 til 60°C. 1 ml hybridiserings-buffer (45% diisobutyl-sulfosuccinat, 40 mM natrium-fosfat pH 6,8, ImM EDTA,

1 mM EGTA) ble tilsatt og blandingen inkubert ved 72°C

i 2 timer. Etter inkuberingen, ble 2 ml separerings-løsning (inneholdende 2,5 g/l kationiske magnetiske mikrokuler, 0,17M natrium-fosfat-buffer pH 6,8, 7,5% triton X-100 (TM), 0,02% natrium-azid) tilsatt og

inkubert ved 72°C i 5 min. RNA:probe-hybridene bundet til de magnetiske partiklene, ble samlet og supernatanten fjernet. 1 ml vaskeløsning (0,2M natrium-fosfat-buffer pH 6,8, 14% isobutyl-sulfosuccinat, 5% triton X-100, 0,02% natrium-azid) ble tilsatt, partiklene ble samlet og supernatanten fjernet. Dette trinn ble gjentatt to ganger. Radioaktiviteten bundet til de magnetiske partiklene ble bestemt i en gamma-teller. Resultatene er vist i tabell 22 og indikerer at probene hybridiserer til organismer i slekten Mycobacterium og at en kombinasjon av prober vil påvise alle medlemmer av slekten. Tabell 23 viser at probene ikke reagerer med andre nær beslektede bakterier.

Eksempel 9

Mykoplasmaer er små. aerobe bakterier som mangler celle-vegger. Mycoplasma pneumoniae er estimert å forårsake 8-15 millioner infeksjoner pr. år. Infek-sjonene kan være asymptomatiske eller ordnet når det gjelder graden av alvorlighet fra mild til alvorlig bronkitt og penumoni. Organismene antas å forårsake omtrent 10% av pneumoni i den generelle befolkning og 10-50% av pneumoni blant medlemmer av grupper som er i nær kontakt over lengre perioder, slik som collage-studenter og militært personell.

Diganoser har inntil nå krevd isolering av organismen

i kultur eller demonstrasjon av en økning i antistoff-titer. Dyrking av organismen omfatter inokkulering av prøver fra luftveien på agar eller tofase-medium-inneholdende bakterievekst-inhibitorer. Undersøkelse vedrørende vekst ved 3-4 og 7-10 døgn anvendes for å bevise tilstedeværelse eller fravær av mykoplasma. Mycoplasma pneumoniae må deretter identifiseres ved hemadsorbsjon (evnen for M. pneumoniae til å klebe fast erythrocytter fra sau eller marsvin), hemolyse (evnen

hos M. pneumoniae til å produsere beta-hemolyser av erythrocytter fra sau eller marsvin i blodagar), vekst-inhibering ved spesifikke antistoff, eller immunofluorescens med spesifikke antistoff. Den foreliggende oppfinnelse har betydelige fordeler sammenlignet med hver av disse tidligere kjente metoder, både på grunn av enkelheten av testen og på grunn av den meget reduserte tid nødvendig for å oppnå en diagnose.

En probe-spesifikk for 5S rRNA av M. pneumoniae ble oppnådd ved hjelp av en sammenligning av kjente rRNA-sekvenser. De spesielle innrettede sekvenser var fra M. penumoniae, M. gallisepticum og Ureaplasma urealyticum (Rogers, M.J. et al. 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82 (1160-1164), M. capricolum (Hori, H. et al., 1981, Nucl. Acid. Res. 9, 5407-5410) og Spiroplasma sp.

(Walker, R.T. et al. 1982 Nucl. Acids Res. 10, 6363-6367). Utrettingene ble gjennomført som beskrevet over og skissert på side 6. 5S rRNA kan isoleres og sekvenseres som skissert i Rogers et al., eller en primer kan fremstilles som er komplementær til et bevart område i 5S rRNA, og sekvenseringen gjennomføres som skissert i eksemplene 1-4. Det bevarte området av 5S rRNA er dokumentert i Fox, G.E. og Woese, CR. 1975, Nature 256: 505-507. Følgende sekvens ble bestemt å være spesifikk for Mycoplasma pneumoniae:

Sekvensen er komplementær til et unikt segment funnet i 5S rRNA fra Mycoplasma pneumoniae i området som tilsvarer basene 65-108 i E. coli 5S rRNA, og ble utvalgt ved sammenligning med 5S rRNA-sekvenser fra Mycoplasma gallisepticum, Spiroplasma mirum og Ureaplasma urealyticum. Oligonukleotid-proben blekarakterisertsom beskrevet over. Størrelsen på proben var 42 baser. Proben hadde en Tm på 71,5°C.

For å demonstrere reaktiviteten av denne sekvens for Mycoplasma pneumoniae, ble proben testet i hybridiserings-reaksjoner under følgende betingelser.

32

P-ende-merket oligonukleotid-probe ble blandet med

1 mikrogram (7 x 10 -13 mol) renset rRNA fra Mycoplasma pneumoniae og omsatt i 0,12M PB (ekvimolare mengder Na2HP04og NAH2P04), 1 mM EDTA og 0,2% SDS (natrium-dodecyl-sulfat) ved 65°C i 16 min. i et endelig volum på 50 mikroliter. I separate rør ble proben blandet med hybridiserings-bufferen med og uten target Mycoplasma pneumoniae rRNA tilstede. Etter separering på hydroksyapatitt som gitt tidligere, ble hybridene kvantisert ved scitillasjons-telling. Disse resultatene er vist i tabell 24.

Disse data viser at proben har en høy reaksjonsgrad med dens homologe target og har svært liten ikke-spesifikk binding til hydroksyapatitt.

Spesifisitet av M. pneumoniae 5S proben ble testet

ved å blande<32>P-merket probe med rRNA frigjort fra celler fra andre Mycoplasma-arter. Alle hybridiserings-forsøk ble gjennomført som beskrevet i eksempel 1.

Tabell 25 indikerer at proben er spesifikk for Mycoplasma pneumoniae og reagerer ikke med andre Mycoplasma-arter.

Som vist i tabell 26, reagerte ikke proben med andre nær beslektede eller fylogenetisk forskjellige bakterie-arter.

Fire ytterligere probe-sekvenser (nummerert 2-5 under) spesifikk for Mycoplasma pneumoniae ble oppnådd ved anvendelse av fire unike primere komplementær til bevarte områder på 16S rRNA. Områdene tilsvarer henhv. basene 190-230; 450-490; 820-860 og 1255-1290 i E. coli 16S rRNA. Probe-sekvens # 1 ble oppnådd ved anvendelse av en primer med sekvensen

Probe-sekvensen 44- 2 ble oppnådd med en primer med sekvensen 5'- GTATTACCGCGGCTGCTGGC-3'.

Probe-sekvensen 44 3 ble oppnådd med en primer med sekvensen 5'- CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC-3'. Probe-sekvensen 44 4 ble oppnådd ved anvendelse av en primer med sekvensen 5'- CGATTACTAGCGATTCC-3' . Sekvenserings-reaksjoner ble gjennomført som gitt i de tidligere eksempler. M. pneumoniae-sekvensene ble sammenlignet med sekvensene fra Mycoplasma genitalium, Mycoplasma capricolum, Mycoplasma gallisepticum,

og Spiroplasma mirum.

Følgende probe-sekvenser blekarakterisert vedkriterier som er beskrevet i eksempel 1 i stam-ansøkningen og ble vist å være spesifikk for

Mycoplasma pneumoniae;

2. 'aataac<g>aaccctt<g>ca<gg>tcctttcaacttt<g>at

3. ca<g>tcaaactcta<g>ccattacct<g>ctaaa<g>tcatt

4. tacc<g>a<gggg>atc<g>cccc<g>aca<g>cta<g>tat

5. ctttaca<g>attt<g>crrcacttttacaa<g>cr<gg>c<g>ac.

Probe #2 'har en lengde på 3 5 baser og en Tm på 67 C*

1Probe#3har en len9de Pa 35 baser og en Tm på 66* C.Probe#4har en len<3de Pa 30 baser og en Tm på 69'C. Probe f^har en lengde på 3 5 baser og en Tm på 65°C.

Når de fire prober ble blandet og anvendt i hybridiserings-forsøk ved 60°C på samme måte som i de tidligere eksempler, ble de funnet å være spesifikke for M. pneumoniae. Probene kryss-reagerte ikke med andre respiratoriske patogener eller med andre organismer som representerer det bakterielle fylogenetiske tre (tabell 28).

Eksempel 10

Slekten Legionella inneholder 22 arter som alle er potensielle patogener for mennesker. Disse organismer forårsaker Legionnaires sykdom, en akutt pneumoni, eller Pontiac feber, en akutt, ikke-pneumoni, febril sykdom som ikke er dødelig. Legionella-arter har også blit vist å være ansvarlige for nosocomial pneumoni som hovedsakelig finner sted blant immunokompromiterte

pasienter.

Legionellosis, som omfatter legionnaires sykdom og Pontiac feber, diagnostiseres på grunnlag av kliniske symptomer, enten direkte eller indirekte fluorescens antistoff-tester, eller ved dyrking ved anvendelse av bufret kull-gjærekstrakt (BCYE) agar inneholdende selektive antimikrobielle midler. Der er ingen eneste bestemt slekttest kjent i teknikkens stand. (Se Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, side 283, (ed. 1984)). Fluorescens-antistoff-testene kan ikke identifisere alle arter av Legionella, men bare de få hvor det eksisterer antistoff. Dyrkingsmetoden er ikke endelig diagnostisk for Legionella-arter.

Oligonukleotid-sekvensene som er beskrevet over, når de anvendes som prober i et nukleinsyre-hybridiserings-forsøk, identifiserer nøyaktig alle arter av Legionella. Dette forsøk er mer følsomt enn dyrkingstester eller antistoff-tester og forkorter tiden for identifikasjon betydelig og således diagnostisering. Forsøket representerer derfor en betydelig forbedring over tidligere kjente diagnostiske metoder.

Tre probe-sekvenser som er spesifikke for slekten Legionella ble oppnådd ved anvendelse av tre unike primere komplementære til bevarte områder på både 16S og 23S rRNA. Sekvens 1 ble oppnådd ved anvendelse av 16S primer med sekvensen 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C-3'. Probe-sekvens 2 ble oppnådd med en 23S primer med sekvens 5'-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT-3'. Probe-sekvens 3 ble oppnådd med en 16S primer med sekvens 5'-GCTCGT TGC GGGACT TAA CCC ACC AT-3'. Sekvensering av disse primere ble gjennomført som beskrevet i tidligere eksempler.

Følgende tre sekvenser blekarakterisert vedkriteriene som er beskrevet i eksempel 1 og ble vist å være spesifikke for slekten Legionella. De fylogenetisk nærmeste naboene Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus og Acinetobacter calcoaceticus ble anvendt som sammenligninger med sekvenser fra Legionella-arter.

1. TACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACCAGTATTATCTGACC

2. GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC

3. CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCAAGGGTAGGTAAGG.

Sekvens 1, fra 16S rRNA har en lengde på 40 baser og en Tm på 72°C. Sekvens 2, fra 23S rRNA, har en lengde på 42 baser og en Tm på 73°C. Sekvens 3, fra 16S rRNA, har en lengde på 40 baser og en Tm på 68°C. Disse sekvensene kan hybridisere til RNA fra slekten Legionella i områder som tilsvarer henhv. 630-675

fra E. coli 16S rRNA; 350-395 fra E. coli 23S rRNA;

og 975-1020 fra E. coli 16S rRNA. Når probene er blandet sammen hadde de en kombinert gjennomsnittlig Tm på 73°C. Analyse på polyakrylamid-geler viste at hver probe hadde riktig lengde og sekvensanalyser viste at hver hadde riktig basesekvens.

Når de tre probene ble blandet og anvendt i et hybridiseringsforsøk, ble de funnet å være spesifikke for slekten Legionella (tabellene 29 og 30) og kryss-reagerte ikke med andre respiratoriske patogener eller med andre utvalgte organismer fra det fylogenetiske tre (tabell 31 og 32). Anvendelse av mer enn 1 probe, dvs. en blanding av prober, kan resultere i økt forsøks-sensitivitet og/eller i en økning i antall ikke-virale organismer til påvisning.

Tre ytterligere probe-sekvenser (nummeret 4-6)

spesifikke for slekten Legionella ble oppnådd ved å anvende to primere komplementære til bevarte områder på 23S rRNA. Sekvens 4 ble fremstilt fra en 23S

primer med sekvensen 5' -CCTTCT CCC GAA GTT ACG G-3'. Probe-sekvensene 5 og 6 ble fremstilt fra en 23S primer med sekvens 5'- AAG CCG GTT ATC CCC GGG GTA ACT TTT-3". Sekvensering med disse primere ble gjennomført som beskrevet i de tidligere eksempler.

Følgende tre sekvenser blekarakterisert vedkriteriene som er beskrevet tidligere og ble vist å være spesifikke for slekten Legionella. De fylogenetisk nærmeste naboer Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus og Actinetobacter calcoaceticus ble anvendt for sammenligning med sekvensene fra Legionella-arter.

4. GCG GTA CGG TTC TCT ATA AGT TAT GGC TAG C

5. GTA CCG AGG GTA CCT TTG TGC T

6. CAC TCT TGG TAC GAT GTC CGA C

Probe 4, komplementær til 3S rRNA i området tilsvarende basene 1585-1620 fra E. coli 23S rRNA, har en lengde på 31 baser og et Tm på 67°C. Probe 5, komplementær til 23S rRNA i området tilsvarende basene 2280-2330

fra E. coli 23S rRNA, har en lengde på 22 baser og Tm på 66°C. Probe 6, komplementær til 23S rRNA i det samme område som probe 5, har en lengde på 22 baser og en Tm på 63°C.

Når de tre probene ble blandet med probe 3 over og anvendt i et hybridiserings-forsøk som beskrevet for probene 1-3, ble de funnet å være spesifikke for slekten Legionella (tabell 33) og kryss-reagerte ikke med andre respiratoriske patogener eller med andre utvalgte organismer fra det fylogenetiske tre (tabellene 34 og 35). Anvendelse av mer enn en probe, dvs. en blanding av prober, kan forbedre forsøks-sensitiviteten og/eller øke antall påviste ikke-virale organismer.

Eksempel 11

Chlamydia er gram-negative, ikke-bevegelige, obligate intracellulære bakterier. Artene C. trachomatis er assosiert med endemisk trachoma (den mest vanlige form for blindhet som kan forebygges). Inklusjons-konjunktivitt og lymfogranuloma venerium (LGV). Den er viktig årsak til ikke-gonokokk uretritt hos menn og kan forårsake cervititt og akutt salpingitt hos kvinner. Øyesykdom eller chlamydiell pneumoni kan utvikles hos nyfødte som passerer gjennom den infiserte fødselskanal.

Man har en rekke metoder som er kjent innen teknikkens stand for identifisering av C. trachomatis i urinveien, f.eks. ved direkte immunofluorescens-farging eller enzym-immunoassay av kliniske prøver. Ved metoden som velges må man imidlertid dyrke organismen i cykloheksimid-behandlede McCoy-celler. Celle-dyrking etterfølges av morfologisk eller fluorescerende antistoff-farging for å bekrefte organismens identitet.

Oligonukleotid-sekvensen i henhold til oppfinnelsen

som er beskrevet under, når de anvendes som prober i nukleinsyre-hybridiseringsforsøk, identifiserer Chlamydia trachomatis isolater nøyaktig. Denne testen er lik dyrkings- eller antistoff-tester når det gjelder sensitivitet og, når det gjelder dyrking, nedsette tiden til identifisering betraktelig og således diagnostiseringen.

Anvendelse av prober for å identifisere og sjeldne mellom medlemmer av artene, er ny og oppfinnerfrisk. Kingsbury, D.T. og E. Weiss, 1968 J. Bacteriol. 96: 1421-23 (1968); Moulder, J.W., ASM News, vol. 50, No. 8

(1984) rapporterer virkelig en 10% DNA homologi mellom C. thrachomatis og C. psittaci. Dessuten, viser

disse rapporter at forskjellige C. trachomatis-

stammer har forskjellig DNA-homologi. Weissberg,

W.G. et al., J. Bacteriol. 167:570-574 (1986)

publiserer 16S rRNA-sekvensen fra C. psittaci og bemerker at C. trachomatis og C. psittaci deler mer enn 95% rRNA-homologi. Fra disse rapporter, kan det sluttes at det vil være vanskelig å oppfinne (1) prober som er i stand til å hybridisere til alle stammer av C. trachomatis; og (2) prober som er i stand til å sjeldne mellom C. trachomatis og C. psittaci.

De følgende prober oppnår begge deler.

Ti probe-sekvenser som er spesifikke for Chlamydia trachomatis ble fremstilt ved anvendelse av syv unike primere komplementære til bevarte områder av både 16S

og 23S rRNA. Probe-sekvens 1 ble oppnådd fra en 16S

primer med sekvens 5'-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C-3'. Probe-sekvens 2 ble oppnådd med en 16S primer med

sekvens 51 - CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3'.

Sekvens 3 og 4 ble oppnådd ved anvendelse av en 16S

primer med sekvensen 5'-GGC CGT TACCCC ACC TAC TAGCTA AT-3 ' Probe-sekvensr 5 og 6 ble oppnådd med en 23S primer

med sekvens 5'-CTTTCC CTC ACG GTA-3'.

Probe-sekvensene 7 og 8 ble oppnådd med 23S primer med

en sekvens 5'- CCT TCT CCC GAA GTT ACGG-3'. Probe-sekvens 9 ble oppnådd med 23S primer med sekvens

5'-TCG GAA CTT ACC CGA CAA GGA ATT TC-3'.

Probesekvens 10 ble oppnådd med en primer med sekvens

5'- CTA CTT TCC TGC GTCA-3'.-

De følgende 10 sekvenser blekarakterisert vedanvendelse av kriteriene som er beskrevet i eksempel 1 og ble vist å være spesifikke for rRNA fra Chlamydia trachomatis.

Den fylogenetiske nærmeste nabo Chlamydia psittaci

ble anvendt til sammenligning med Chlamydia trachomatis-sekvensen.

1. CCG ACT CGG GGT TGA GCC CAT CTT TGA CAA 2. TTA CGT CCG ACA CGG ATG GGG TTG AGA CCA TC 3. CCG CCA CTA AAC AAT CGT CGA AAC AAT TGC TCC i GTT CGA

4. CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA TCG CCA CAT TCG

5. CAT CCA TCT TTC CAG ATG TGT TCA ACT AGG AGT CCT GAT CC

6. GAG GTC GGT CTT TCT CTC CTT TCG TCT ACG

7. CCG TTC TCA TCG CTC TAC GGA CTC TTC CAA TCG

8. CGA AGA TTC CCC TTG ATC GCG ACC TGA TCT

9. CCG GGG CTC CTA TCG TTC CAT AGT CAC CCT AAA AG

10. TAC CGC GTG TCT TAT CGA CAC ACC CGC G

Sekvens 1, fra 16S rRNA, har en lengde på 30 baser og Tm 66°C. Sekvens 2, fra 16S rRNA, har en lengde på 32 baser og Tm på 67°C. Sekvens 3, fra 16S rRNA,

har en lengde på 39 baser og Tm på 70°C. Sekvens 4, fra 16S rRNA, har en lengde på 33 baser og Tm på 69°C. Sekvens 5, fra 23S rRNA, har en lengde på 41 baser og Tm på 71°C. Sekvens 6, fra 23S rRNA, har en lengde på 30 baser og en Tm på 72°C. Sekvens 7, fra 23S rRNA,

har en lengde på 33 baser og en Tm på 72°C. Sekvens 8, fra 23S rRNA, har en lengde på 30 baser og en Tm på 71°C. Sekvens 9, fra 23S rRNA, har en lengde på 35 baser og en Tm på 74°C. Sekvens 10, har en lengde på 28 baser og en Tm på 72°C.

Reaktiviteten og spesifisiteten for probene ble testet

32

ved hybridiseringsforsøk. P-ende-merkede oligo-nukleotid-prober 1 og 2 ble blandet med renset RNA

7

eller RNA frigjort fra minst 10 organismer i 0,55 ml 41% diisobutyl-sulfosuccinat, 3% natrium-dodecylsulfat, 0,03M natrium-fosfat pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA ved 60°C (probe 1) eller 64°C (probe 2) i 1 time.

Hybrider ble bundet til hydroksyapatitt som beskrevet i tidligere eksempel og mengde radioaktivitet bundet ble bestemt ved scintillasjons-telling. Tabell 36 viser at probene 1 og 2 hybridiserer bra til alle serotyper av C. trachomatis som ble testet. Probe 1 reagerer ikke med noen stammer av C. psittaci som ble testet og probe 2 reagerer ikke med to av stammene. Probe 2 reagerer med den ovine polyarthritis-stammen av C. psittaci, en organisme som ikke er kjent for å infisere mennesker. Tabell 37 viser reaktiviteten og spesifisiteten av probene 3-9 når de er<125>I-merket og anvendt som en blanding. I dette tilfellet, var hybridene bundet til kationiske magnetiske partikler som beskrevet i Arnold et al., US patentansøkning, serie nr. 020.866, innsent 2. mars 1987. Disse prober hybridiserer bra til alle stammer av C. trachomatis som ble testet og hybridiserer ikke til noen stammer av C. psittaci. Probene 3-9 ble ytterligere testet overfor et utvalg av organismer som vanligvis finnes i urinveien (tabell 38) og en fylogenetisk kryssdel av organismer (tabell 39). I alle tilfellene, viste probene seg å være spesifikke. Probe 10 er 25% ikke-homolog til C. psittaci og skulle også være spesifikk for C. trachomatis.

Eksempel 12

Campylobacter er bevegelige, mikroaerofile, gram-negative krummede staver. Slekten er svært uensartet og forskjellig fra andre slekter. Skjønt slekten er vel definert, forekommer det noe revidering på arts-nivået (Romaniuk, P.J. et al., J. Bacteriol. 169:2137-2141 (1987)). Tre campylobact-arter, Campylobacter jejuni, C. coli og C. laridis, forårsaker enterit hos mennesker. Denne sykdommen omfatter diaré, feber, kvalme, magesmerter og i noen tilfeller oppkast. Disse organismene forårsaker omtrent 2 "millioner pr. år i USA (estimering basert på antall Salmonella og Shigella induserte tilfeller av diaré-sykdommer ). Andre medlemmer av slekten forårsaker sepciss hos mennesker og abort og sterilitet hos sauer og kveg.

Diagnostisering av Campylobacter enteritt er til nå avhengig av vekst og isolering av organismen i kultur, etterfulgt av en rekke biokjemiske tester. Optimal vekst av campylobacter krever spesielle betingelser slik som lav oksygen-spenning og høy temperatur (42°C). Ingen enkel gruppe av betingelser anbefales for isolering av alle Campylobact-arter.

Oligonukleotid-sekvensene som er gitt over, anvendt i

et hybridiseringsforsøk, hybridiserer til 16S rRNA fra Campylobact-arter av interesse. Foreliggende oppfinnelse har betydelige fordeler over tidligere kjente metoder når det gjelder påvisning av Campylobacter fordi en probe kan påvise alle Campylobacter av interesse; de to andre prober påviser de enteriske Campylobacter og en kan påvise humane isolater av Campylobacter. I tillegg, har probene fordeler over tidligere kjent teknikk når det gjelder enkelheten av forsøket og redusert tid for identifikasjon og derfor diagnostisering.

De fire probene som hybridiserer til 16S rRNA fra Campylobact-arter av interesse" ble oppbygd ved anvendelse av tre unike primere som er komplementære til 16S rRNA. Sekvensene 1 og 2 ble fremstilt ved anvendelse av en 16S primer med sekvensene 5'-

GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3' .

Sekvens 3 ble fremstilt ved anvendelse av en 16S primer med sekvensen 5<1->CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3'. Sekvens 4 ble fremstilt med en 16S primer med sekvensen

5 • - GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT-3 ' .

Følgende sekvenser blekarakterisertog viste seg å hybridisere til Campylobacter jejuni, C. coli og C. laridis. De fylogenisk nærmeste naboer Vibrio parahaemolyticus og Wollinella succinogenes ble anvendt til sammenligning med Campylobacter-sekvensene.

1. CGC TCC GAA AAG TGT CAT CCT CC

2. CCT TAG GTA CCG TCA GAA TTC TTC CC

3. GCC TTC GCA ATG GGT ATT CTT GGT G

4. GGT TCT TAG GAT ATC AAG CCC AGG

Sekvens 1, fra 16S rRNA, har en lengde på 23 baser og Tm på 65°C. Sekvens 2, fra 16S rRNA, har en lengde på 26 baser og en Tm på 64°C. Sekvens 3, fra 16S rRNA, har en lengde på 25 baser og en Tm på 66°C. Sekvens 4, fra 16S rRNA, har en lengde på 24 baser og en Tm på 61°C. Sekvens 1 kan hybridisere i området tilsvarende basene 405-428 i E. coli 16S rRNA; sekvens 2 kan hybridisere i området tilsvarende basene 440-475 i E. coli 16S rRNA; sekvens 3 kan hybridisere i området tilsvarende basene 705-735 i E. coli 16S rRNA; sekvens 4 kan hybridisere i området tilsvarende basene 780-1010 i E. coli 16S rRNA.

Reaktiviteten og spesifisiteten av probene for

32 Campylobacter ble testet i hybridiserings-forsøk. P-ende-merkede oligonukleotid-prober ble blandet med renset RNA eller RNA frigjort fra celler i 0,1% natrium-dodecyl-sulfat. 0,5 ml hybridiseringsløsning (41% diisobutyl-sulfosuccinat, 30 mM natrium-fosfat pH 6,8, 0,7% natrium-dodecyl-sulfat, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) ble tilsatt og blandingen ble inkubert ved 60°C

i 1-lH time. Etter inkubering, ble 2-2,5 ml separasjonsløsning (2% hybroksyapatitt, 0,12M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat) tilsatt og blandingen inkubert ved 60°C i 5 min. Prøven ble

sentrifugert og supernatanten fjernet. 2,5 ml vaske-løsning (0,12M natriumfosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecylsulfat) ble tilsatt og prøven blandet, sentrifugert og supernatanten fjernet. Radioaktiviteten bundet til hydroksyapatitt ble bestemt ved scintailla-sjons-teIling.

Tabell 40 indikerer at probene hybridiserte vel til Campylocater-arter av interesse, C. jejuni, C. coli

og C. laridis. Probe 1 påviser alle Campylobacter-arter som ble testet, probene 2 og 4 påviser bare de enteriske Campylobacter og probe 3 påviser alle Campylobacter-artene unntatt C. sputorum, en organisme som er isolert fra kveg. Således er alle probene nyttige for identifisering av Campylobacter i diaré-prøver. Valget av hvilken probe som skal brukes i andre anvendelser, vil avhenge av nivået av spesifisitet som er nødvendig (dvs. enteriske Campylobacter eller alle Campylobacter-arter).

Tabell 41 viser at probene ikke hybridiserer til nær beslektede organismer eller organismer funnet i mage-og tarm-kanalen.

Probene som er spesifikke for de enterisk Campylobacter, probene 2 og 4, ble ytterligere testet og vist ikke å reagere med rRNA fra andre organismer funneti mage-tarmkanalen.

Eksempel 13

Streptokokker er gram-positive, oksidase-negative kokkoide bakterier. Slekten er oppdelt i 18 grupper A-R, på basis av gruppe-spesifikke karbohydrater. Gruppe D streptokokker er videre delt i enterokokker

(S. faecium, S. faecalis, S. avium og S. gallinarum)

og ikke-enterokokkene S. bovis og S. equinus. S. faecium, S. faecalis og S. avium betraktes å være medisinsk viktige enterokokker. Noen streptokokk-arter er patogene for mennesker; andre er normal flora i munn og tarm, men kan forårsake sykdommer når de

innføres andre steder. To eksempler er S. faecium og S. faecalis som normalt finnes i tarmen, men kan spres og forårsake bacteremi, sårinfeksjoner, og som mye som 10% av urinveisinfeksjonene i USA.

Nåværende påvisnings-metoder av enterokokker krever dyrking av prøven i 18-72 timer etterfulgt av en rekke biokjemiske tester. Oligonukleotid-sekvensen som er vist under, anvendt i et hybridiseringsforsøk, påviser nøyaktig streptococcus faecalis, S. avium og S. faecium. Den oppfinneriske probe kryssreagerer ikke med andre streptokokker eller stafylokokker som er svært nær beslektet i DNA-homologi. (Kiepper-Baez,

1981, 1982, Schliefer 1984). Den foreliggende oppfinnelse reduserer også antallet tester som må utføres på en prøve og reduserer i stor grad tiden for identifisering og således diagnostisering. Dette representerer en betydelig forbedring i forhold til tidligere kjente metoder.

Probe-sekvensen ble identifisert ved anvendelse av en primer komplementær til 16S rRNA med sekvensen 5'-CCG CTT

GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-3' .

Følgende sekvens blekarakterisertog vist å være spesifikk for tre enterokokker, S. faecium, S. faecalis og S. avium. De fylogenetisk nærmeste naboer S. agalactiae, S. bocis, S. pneumoniae og S. pyogenes ble anvendt for sammenligning med sekvenser av interesse.

1. TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA

Sekvensen har en lengde på 35 baser og har Tm på 72°C. Den kan hybridisere i området tilsvarende basene 825-860 i E. coli 16S rRNA. For å vise reaktiviteten og spesifisiteten av proben, ble den anvendt i et hybridiseringsforsøk med renset RNA eller RNA frigjort

7

fra cellene. En suspensjon inneholdende minst 10

celler i 2% natrium-dodecyl-sulfat ble blandet i nærvær av glassperler. 0,1 ml suspensjon ble blandet med 0,1 ml hybridiserings-buffer (0,96M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,002M EDTA, 0,002M EGTA) og inkubert ved 65°C i 2 timer. Etter inkubering, ble 5 ml 2% hydroksyapatitt, 0,12M natrium-fosfat pH 6,8, 0,02% natrium-dodecylsulfat tilsatt og blandingen ble inkubert ved 65°C i 10 min. Prøven ble sentrifugert og supernatanten fjernet. 5 ml vaskeløsning (0,12M fosfatbuffer, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecylsulfat)

ble tilsatt og prøvene ble blandet, sentrifugert og supernatanten fjernet. Mengden radioaktivitet bundet til hydroksyapatitt ble bestemt ved scintillasjons-telling. Tabell 43 viser at proben reagerer bra med S. faecium, S. faecalis og S. avium, og reagerer ikke med andre nær beslektede organismer.

Eksempel 14

Pseudomonas er gram-negative ikke-sprodannende, ikke- fermenterende bacilli. Pseudomonas finnes vanligvis i jord og vann og infiserer sjelden friske individer. Når organismene treffer allerede kompromiterte pasienter, kan de forårsake en rekke kliniske syndromer omfattende sårinfeksjoner, post-operative infeksjoner, septicemi, diaré hos barn og infeksjoner i luftveier og urinveier. Medlemmer av slekten Pseudomonas er særlig viktig for å identifisere en klinisk prøve på grunn av organismenes resistens overfor antibiotika. Nukleinsyre-homologi-studier har oppdelt slekten i fem homologe klasser kjent som RNA-gruppe I-V. Åttitre % av alle kliniske isolater av Pseudomonas er fra RNA-gruppe I og Pseudomonas aeruginosa er langt fra den mest vanlige isolerte arten.

Nåværende påvisnings-metoder av Pseudomonas krever dyrking av en pasientprøve i 24 til 32 timer, etterfulgt av en rekke biokjemiske tester. Oligonukleotid-sekvensen under, anvendt i et hybridiseringsforsøk, påviser den klinisk viktige gruppe I Pseudomonas. Den foreliggende oppfinnelse reduserer antall tester som må gjennomføres på en prøve, og reduserer påvisningstiden. Dette representerer en betydelig forbedring over tidligere kjente metoder.

Sekvensen ble oppnådd med en primer komplementær til

et bevart område på 23S rRNA med sekvens 5'- CCT TCC ACG GTA-3'. Følgende sekvens ble vist å påvise

gruppe I Pseudomonas:

1 • CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT

Proben har en lengde på 35 baser og en Tm på 70°C.

Den kan hybridisere til RNA fra gruppe I Pseudomonas

i området tilsvarende baser 365-405 fra E. coli 23S rRNA. For å viser reaktiviteten og spesifisiteten for proben, ble den anvendt i et hybridiseringsforsøk.

32

P-ende-merket oligonukleotid ble blandet med rRNA frigjort fra minst 10 7organismer ved standard metoder 1 0,48M natrium-fosfat pH 6,8, 1% natrium-dodecyl-sulf at, ImM EDTA, 1 mM EGTA og inkubert ved 65°C i

2 timer. Etter inkubering, ble RNA:DNA hybridene bundet til hydroksyapatitt som beskrevet i tidligere eksempel og bundet radioaktivitet ble bestemt ved hjelp av scintallasjons-telling. Tabell 44 viser at proben reagerte vel med alle 8 arter fra gruppe I Pseudomonas som ble testet. Proben reagerte ikke med RNA fra gruppe II eller gruppe V organismer. En lav reaksjon ble sett med Pseudomonas acidovorans, en gruppe III organisme som representerer mindre enn 1% av alle isolater av ikke-fermenterbare bacilli fra kliniske prøver. Tabell 45 viser at proben ikke reagerer med andre nær beslektede organismer som ble testet.

Eksempel 15

Eksempler 15-18 omfatter prober for Enterobacteriaceae, hvori alle er nær beslektet på DNA-nivået. Det eksisterer til og med færre forskjeller på rRNA-nivået. Protus vulgaris 16S rRNA er f.eks. 93%

homolog til E. coli. Disse faktorer viser vanskelighet-ene i forbindelse med fremstilling av rRNA prober som er spesifikke for denne gruppen av organismer. Likevel har man nå oppfunnet prober for Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Salmonella og E. coli.

Medlemmer av slekten Enterobacter er bevegelige, gram-negative, ikke-sporedannende bacilli som tilhører familien Enterobacteriaceae. Slekten er en stor og heterogen gruppe. Åtte arter er definert, men kun fem er klinisk signifikante. Enterobacter cloacae og E. aerogenes er de mest vanlige isolater og er assosiert med infeksjoner i urinveien, lunger, blod,

sentralnervesystemet og det myke vev hos mennesker.

Den gjeldne metode for identifisering av Enterobacter cloacae fra pasient-prøver omfatter dyrking av prøven på agar-plater i 18-24 timer, etterfulgt av en rekke biokjemiske tester. Oligonukleotid-sekvensen som er beskrevet under, når den anvendes som en probe i et nukleinsyre-hybridiseringsforsøk, identifiserer nøyaktig Enterobacter cloacae. Den foreliggende oppfinnelse reduserer antall tester som må gjennomføres på en prøve, tiden til identifisering og derfor diagnoser, og representerer således en betydelig forbedring i forhold til de tidligere kjente metoder.

Proben som er spesifikk for Enterobacter cloacae ble oppnådd med en primer som er komplementær til et bevart område av 23S rRNA med sekvensen 5' -CAG TCA GGAGTA

TTT AGC CTT-'3.

Følgende sekvens blekarakterisertog vist å være spesifikk for E. cloacae. De fylogenetisk nærmeste naboer Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Proteus vulgaris, Salmonella enteritidis og

Citrobacter freundii ble anvendt som sammenligninger med sekvensen fra E. cloacae.

1. GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC

Proben har en lengde på 29 baser og en Tm på 68°C.

Den kan hybridisere til RNA fra E. cloacae i området tilsvarende basene 305-340 i E. coli 23S rRNA. For å vise reaktiviteten og spesifisiteten av proben for E. cloacae, ble den anvendt i et hybridiseringsforsøk.<32>P-ende-merket oligonukleotid-probe ble blandet med

7

RNA frigjort fra minst 10 organismer i 1% natrium-dodecyl-sulf at , 0,48M natrium-fosfat, pH 6,8 (0,2 ml sluttvolum) og inkubert ved 60°C i 2 timer. Etter inkubering, ble 5 ml 2% hydroksyapatitt, 0,12M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat tilsatt og blandingen inkubert ved 60°C i 10 min. Prøven ble sentrifugert og supernatanten fjernet. 5 ml vaske-løsning (0,12M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulf at ) ble tilsatt, prøven ble blandet og sentrifugert og supernatanten fjernet. Mengden radioaktivitet bundet til hydroksyapatitt ble bestemt ved scintillasjons-telling. Resultatene er vist i tabell 46 og viser at proben reagerer bra med E. cloacae og reagerer ikke med RNA fra nær beslektede organismer.

Tabell 47 viser at proben ikke reagerer med RNA fra organismer funnet i urin.

Eksempel 16

Medlemmer av slekten Proteus er bevegelige, gram-negative, ikke-sporedannende bacilli som tilhører familien Enterobac-teriaceae. Fire arter av Proteus er beskrevet og tre av dem, Proteus mirabilis,

P. vulgaris og P. penneri forårsaker sykdommer hos mennesker.

Den mest vanlige typen proteus-infeksjon innbefatter urinveien, men sepsiss, pneumoni og sårinfeksjoner forekommer også. Proteus mirabilis er den arten som oftest isoleres og som svarer for opp til 10% av alle akutte, ukompliserte urinveisinfeksjoner. Art, heller enn identifikasjon på slekt-nivå av de forårsakede organismer er ønskelig på grunn av forskjellig anti-biotisk følsomhet blant artene.

Den nåværende metode for identifisering av Proteus mirabilis fra pasientprøver, omfatter dyrking av prøven på agar-plater i 18-24 timer, etterfulgt av en rekke biokjemiske tester. Oligonukleotid-sekvensen som er beskrevet under, når den anvendes som en probe i et nukleinsyre-hybridiseringsforsøk, identifiserer nøyaktig Proteus mirabilis. Den foreliggende oppfinnelse reduserer antall tester som må utføres på en prøve, tiden til identifisering og derfor diagnose og behandling. Dette representerer en betydelig forbedring i forhold til tidligere kjent teknikk.

Proben som er spesifikk for Proteus mirabilis ble oppnådd med en primer komplementær til et bevart område av 23SrRNAmed sekvensen 5'-CAG TCA GGA GTA

TTT AGC CTT-3 ' .

Følgende sekvens blekarakterisertog vist å være spesifikk for P. mirabilis. De fylogenetisk nærmeste naboer Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Proteus vulgaris og Salmonella enteritidis ble anvendt som sammenligninger med sekvensen fra Proteus mirabilis.

1. CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC

Denne probe kan hybridiseres til RNA fra P. mirabilis

i området tilsvarende til basene 270-305 i E. coli 23S rRNA. Proben har en lengde på 33 baser og en Tm på 66°C. For å viser reaktiviteten og spesifisiteten av proben for P. mirabilis, ble den anvendt i et

32

hybridiserings-forsøk. P-ende-merket oligonukleotid-probe ble blandet med RNA frigjort fra minst 10<7>organismer i 1% natrium-dodecyl-sulfat, 0,48M natrium-fosfat, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (0,2 ml sluttvolum) og inkubert ved 64°C i 2 timer. Etter inkubering, ble

5 ml 2% hydroksyapatitt, 0,12M natriumfosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat tilsatt og blandingen inkubert ved 64°C i 10 min. Prøven ble sentrifugert

og supernatanten fjernet. 5 ml vaskeløsning (0,12 M

natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat) ble tilsatt, prøven ble blandet, sentrifugert og supernatanten fjernet. Mengden radioaktivitet bundet til hydroksyapatitt ble bestemt ved scintillasjons-telling. Resultatene er vist i tabell 48 og viser at proben reagerer godt med P. mirabilis og reagerer ikke med 27 andre nær beslektede bakterier. Tabell 49 viser at proben ikke reagerer med 24 andre fylogenetisk forskjellige bakterier og 2 gjærtyper som er undersøkt på samme måte som organismene i tabell 48.

Eksempel 17

Medlemmer av slekten Salmonella er bevegelige, gram-negative, ikke-sporedannende bacilli som tilhører familien Enterobacteriaceae. Alle salmonella-slekter er nær beslektet og noen mikrobiologer betrakter dem for å være en art. Fem undergrupper er identifisert ved anvendelse av nukleinsyre-homologistudier og over 1400 forskjellige serotyper er beskrevet. Alle serotyper har vært infisert i humane enteriske sykdommer som strekker seg fra celle-begrensende gastroenteritt med milde symptomer til alvorlig gastroenteritt med bacteremi, til tyfoid-feber, en potensiell livs-

truende sykdom. S. cholerasuis, S. paratyphi A

og S. typhi er serotypene som oftest er assosiert med alvorlige sykdommer og bacteremi. Diagnose av Salmonella-indusert enteritt er avhengig av påvisning

av organismen i avføringsprøver. Fordi infeksjonen først og fremst forekommer ved inntak av kontaminert melk, mat og vann, er metoder for identifisering av Salmonella i disse produktene før frigjøring til konsument kritisk.

Nåværende metode for påvisning av medlemmer av slekten Salmonella omfatter dyrking av prøven 1-3 døgn på selektivt medium etterfulgt av en rekke biokjemiske tester. Svært ofte er det nødvendig med et opp-konsentreringstrinn for å isolere Salmonella fra kliniske prøver eller matvareprodukter. Oligonukleotid-sekvenser som er vist under, når den anvendes i et hybridiseringsforsøk, identifiserer nøyaktig medlemmer av slekten Salmonella. De foreliggende oppfinneriske prober er spesifikke for alle medlemmer av slekten og reagerer ikke med andre nær beslektede Enterobacteriaceae-slekter. Disse oppfinneriske prober reduserer antall tester som må gjennomføres på en prøve og reduserer betraktelig tiden nødvendig for identifisering. Dette representerer en betydelig forbedring over tidligere kjente metoder.

Probene som er spesifikke for slekten Salmonella

ble oppnådd med to primere komplementære til 16S og 23S rRNA. Sekvens 1 ble oppnådd ved anvendelse av en 16S primer med sekvensen 5<1->TTA CTA GCG ATT CCG ACT

TCA 3<1>. Sekvens 2 ble oppnådd ved anvendelse av en

23S primer med sekvensen 5'- CAG TCA GGA GTA TTT ACG

CTT 3<1>. Følgende sekvenser blekarakterisertog vist å være spesifikke for slekten Salmonella:

1. CTC CTT TGA GTT CCC GAC CTA ATC GCT GGC

2. CTC ATC GAG CTC ACA GCA CAT GCG CTT TTG TGT A Sekvens 1, fra 16S rRNA, har en lengde på 30 baser og en Tm på 73°C. Sekvens 2, fra 23S rRNA, har en lengde på 34 baser og en Tm på 71°C. Disse prober kan hybridisere i områdene tilsvarende til henhv. basene 1125-1155 i E. coli 16S rRNA og 335-375 i E. coli 23S rRNA. For å vise reaktiviteten og spesifisiteten av probe 1 for medlemmer av slekten Salmonella, ble 32 2 P-ende-merket oligonukleotid testet som en probe i en hybridiserings-reaksjon. Renset RNA, eller RNA frigjort fra minst 10 7 organismer ved hjelp av standard metoder, ble blandet med 1 ml hybridiseringsbuffer (slutt-konsentrasjon 43% diisobutyl-sulfosuccinat, 60 mM natrium-f osf at, pH 6', 8 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) og inkubert ved 72°C i 2 til 12 timer. Etter innkubering ble 5 ml separerings-løsnings (2% hydroksyapatitt, 0,12M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% natriumdodecyl-sulfat) tilsatt og prøven ble blandet, inkubert ved 72°C i 5 min., sentrifugert og supernatanten ble fjernet. 4 ml vaskeløsning (0,12M natriumfosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-suflat) ble tilsatt og prøvene ble blandet, sentrifugert og supernatanten ble fjernet. Mengden radioaktivitet bundet til hydroksyapatitt ble bestemt ved scintallasjons-telling. Resultatene som er vist i tabell 50 indikerer at en kombinasjon av de to prober hybridiserte til fem under-grupper av Salmonella og til alle 31 serotypene som ble testet.

Spesifisiteten av probene for medlemmer av slekten Salmonella ble vist med hybridiserings-reaksjoner inneholdende RNA fra organismer som er nær beslektet til Salmonella. Resultatene er vist i tabell 51.

Tabell 52 viser at Salmonella-prober 1 og 2 ikke hybridiserer til fylogenetisk forskjellige organismer.

Eksempel 18

Escherichia coli er en gram-negativ, ikke-sporedannende bacillus som tilhører familien Enterobacteriaceae. Fem arter av Escherichia er beskrevet: E. coli, som svarer for >99% av de kliniske isolater, E. hermanii, E. blattae, E. vulneris og E. fergusonii. E. coli er en av de viktigste årsaker til urinveisinfeksjoner, bacteremi og neonatal meningitt, og kan være årsak til en type gastroenteritt som er kjent som reisendes diaré.

Den nåværende metode for identifisering av E. coli fra pasientprøver omfatter dyrking av prøven på agar-plater i 18 til 72 timer, etterfulgt av en rekke biokjemiske tester på isolerte kolonier. Oliog-nukleotid-sekvensen som er beskrevet under, når den anvendes som en probe i et nukleinsyre-hybridiserings-forsøk, påviser nøyaktige E. coli celler i nærvær av andre organismer. Den foreliggende oppfinnelse reduserer antallet tester som må gjennomføres på en prøve og reduserer tiden til identifisering og derfor diagnose og behandling. Dette representerer en betydelig forbedring over tidligere kjente metoder.

Proben som er spesifikk for E. coli ble avledet fra den publiserte E. coli-sekvens (Brosius, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:4801-4805 (1978)), ved anvendelse Proteus vulgaris (Carbon et al., Nuc. Acids Res. 9:2325-2333 (1981)), Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, Enterobacter gergoviae og Citrobacter freundii til sammenligning. Probe-sekvensene er vist under.

1. GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGG

Den hybridiserer til RNA fra E. coli i området 995-1030 i 16S rRNA. Proben har en lengde på 30 baser og en Tm på 66°C. For å vise reaktiviteten og spesifisiteten av proben for E. coli, ble den anvendt

32

i et hybridiseringsforsøk. P-ende-merket oligo-nukleotid-probe ble blandet med to umerkede oligo nukleotider med sekvens 5'- TGG ATG TCA AGA CCA GGT AAG

GTT CTT CGC GTT GCA TCG.-3' og 5' -CTG ACG ACA GCC ATG

<*->SAG CAC CTG TCT CAC GGT TCC CGA AGG CA-3'

og med renset RNA, eller RNA frigitt fra celler med detergent og varme, i 1% natrium-dodecyl-sulfat (SDS), 0,48M natrium-fosfat, pH 6,8, ImM EDTA, ImM

EGTA (0,2 ml slutt-volum) og inkubert ved 60°C i

2 timer. Etter inkubering, ble 5 ml 2% hydroksyapatitt, 0,12M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat tilsatt og blandingen ble inkubert ved 60°C i 10 min. Prøven ble sentrifugert og supernatanten fjernet. 5 ml vaskeløsning (0,12 M natriumfosfat,

pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat) ble tilsatt, prøven ble blandet, sentrifugert og supernatanten ble fjernet. Mengden radioaktivitet bundet til hydroksyapatitt ble bestemt ved hjelp av scintillasjonstelling.

Et eksempel på en anvendelse av denne probe vil være

å påvise E. coli i urinprøver. Tabell 53 viser at proben påviser 7 av 8 stammer av E. coli som ble testet. Proben reagerer også med E. fergusonii, en organisme som bare sjeldent vil bli funnet i urin.

Tabell 54 viser at proben ikke reagerer med noen

andre slekter som er undersøkt med unntak av Shigella, som er en annen organisme som sjeldent isoleres fra urin. Disse resultater viser at proben vil være nyttig i påvisning av E. coli fra urinprøver.

Eksempel 19

Bakteriene omfatter en morfologisk og fysiologisk forskjellige gruppe av unicellulære organismer som er tilstede i de fleste naturlige omgivelser. Skjønt mange bakterier er harmløse eller fordelaktige for deres omgivelser eller vert, er noen skadelige og forårsaker sykdom. Tilstedeværelsen av enhver bakterie i noen områder er uønsket eller indikerer sykdom (f. eks. dyrkingsmedia, farmasøytiske produkter, kroppsvæsker slik som blod, urin eller cerebrospinal-væsker, og vevsbiopsier). Små mengder bakterier betraktes som aksepterbare i andre produkter slik som drikkevann og matvarer. Følgelig, har man et behov for et middel for påvisning og kvantifisering av bakterier i en prøve.

Den nåværende metode for påvisning og kvantifisering

av totalt antall bakterier i en prøve krever dyrking på flere typer medier under forskjellige betingelser når det gjelder temperatur og atmosfære. Til dags dato, eksisterer ingen eneste test for å påvise eller kvantifisere alle bakteriene. Oligonukleotid-sekvensen som er vist under, når den anvendes i et hybridiserings-forsøk, påviser et bredt polygenetisk tverrsnitt av bakterier. Den foreliggende oppfinnelse reduserer antall tester som må utføres og reduserer også tiden som kreves for forsøket. Sammenligning av hybridiserings-resultatene fra en ukjent prøve med et sett standarder vil tillate endel kvantifisering av antall tilstede-værende bakterier. Dette representerer en betydelig forbedring i forhold til tidligere kjente metoder.

De bakterielle prober ble utformet etter undersøkelse

av publiserte sekvenser av rRNA og sekvenser bestemt ved Gen-probe. Sekvensene som anvendes for sammen-ligningen omfatter Agrobacterium tumefaciens (Yang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:4443, (1985)), Anacystis nidulans (Tomioka og Sugiura. Mol. Gen.

Genet. 191:46, (1983), Douglas og Doolittle Nuc. Acids

Res. 12:3373, (1984)), Bacrillus subtilis (Green et al., Gene 37:261 (1985)), Bacillus stearothermophilus

(Kop et al., DNA 3:347, (1984)), Bacteroides fragilis (Weisburg et al., J. Bacteriol. 164:230, (1985)), Chlamydia psittaci (Weisburg et al., J. Bacteriol. 167:570 (1986)), Desulfovibrio desulfuricans (Oyaizu og Woese, System Appl. Microbiol. 6:257, (1985)); Escherichia coli, (Brosius et al., Proe. Nati. Acad.

Sei USA 77:201, (1980)); Flavobacterium heparinum (Weisburg et al., J. Bacteriol. 164:230 (1985)); Heliobacterium chlorum (Woese et al., Science 229:762,

(1985); Mycoplasma PG50 (Frydenberg og Christiansen, DNA 4:127, (1985)); Proteus vulgaris (Carbon et al., Nuc. Acids Res. 9:2325 (1981)); Pseudomonas testosteroni (Yang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:4443,

(1985)); Rochalimaea qunitana (Weisburg et al., Science 230:556, (1985)); Saccharomyces cervisiae (Rubstov et al., Nuc. Acids Res. 8:5779 (1980)); Georgiev et al., Nuc. Acids Res. 9:6953 (1981)); og human (Torczynski et al., DNA 4:283 (9185)); Gonzales et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:7666, (1985)).

Følgende sekvenser ble vist å hybridisere til et bredt fylogenetisk tverrsnitt av bakterier og ikke til gjær eller human rRNA:

1. CCA CTG CTG CCT CCC GTA GGA GTC TGG GCC

2. CCA GAT CTC TAC GCA TTT CAC CGC TAC ACG TGG

3. GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT

4. GGG GTT CTT TTC GCC TTT CCC TCA CGG

5. GGC TGC TTC TAA GCC AAC ATC CTG

6. GGA CCG TTA TAG TTA CGG CCG CC

7. GGT CGG AAC TTA CCC GAC AAG GAA TTT CGC TAC C

Probe 1 har en lengde på 30 baser og en Tm på 70°C. Probe 2 har en lengde på 33 baser og en Tm på 69°C. Probe 3 har en lengde på 26 baser og en Tm på 67 C. Probe 4 har en lengde på 27 baser og en Tm på 69°c.

Probe 5 har en lengde på 24 baserog en Tm på 66 C.

Probe 6 har en lengde på 23 baser og en Tm på 62°C.

Probe 7 har en lengde på 34 baser og en Tm på 66°C. Probene 1-3 hybridiserer til 16S rRNA i henhv. følgende områder (tilsvarende til E. coli baser) 330-365;

675-715; og 1080-1110. Probene 4-7 hybridiserer til 23S rRNA i henhv. følgende områder (tilsvarende til E. coli baser) 460-490; 1050-1080; og 1900-1960 (probene 6 og 7). Oligonukleotidene reagerer gjensidig med områder på rRNA som er meget godt bevart blant eubacteria. Dette betyr at de kan anvendes som bakterielle prober i et hybridiseringsforsøk. En annen anvendelse er som et mål for å oppnå rRNA-sekvens. F.eks. kan en oligo-nukleotid hybridiseres til rRNA-interesse og forlenges med revers transkriptase. Sekvensen av oppnådd DNA kan bestemmes og anvendes for å utlede den komplementære rRNA-sekvens som beskrevet i den detaljerte beskrivelse av den foreliggende oppfinnelse.

En anvendelse av den foreliggende oppfinnelse er å påvise bakterier i urin (bacteriuria). For å demonstrere reaktiviteten og spesifisiteten av probene for bakterier funnet i urinen, ble de anvendt i hybridiser-32 12 5

ings-forsøk. P-ende-merkede eller I-merkede oligonukleotid-prober ble blandet med RNA frigitt fra celler ved hjelp av standard metode (f.eks. soniske nedbrytnings-teknikker beskrevet i Murphy et al., US patentansøkning, serie nr. 841.860, detergent med glassperler eller enzymatisk lysering). Probe ble blandet med RNA i 0,48M natrium-fosfat, pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM

EGTA, 1% natrium-dodecyl-sulfat (0,2 ml sluttvolum) og hybridisert ved 60°C i 2 timer. 5 ml 2% hydroksyapatitt, 0,12M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat ble tilsatt og blandingen inkubert ved 60°C i 10 min. Blandingenn ble sentrifugert og supernatanten fjernet.

5 ml vaskeløsning (0,12M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat) ble tilsatt og prøven ble blandet, sentrifugert og supernatanten fjernet. Mengden radioaktivitet bundet til hydroksyapatitt ble bestemt ved hjelp av sc^llasjonstelling. Tabellene 55-68

viser spesifisiteten av disse prober og viser at en kombinasjon av prober vil kunne anvendes for å påvise alle bakterier som er blitt testet.

Tabell 55 viser at probe 1 hybridiserer til RNA fra bakterier som vanlig isoleres fra urin og påviser ikke gjær RNA. Tabell 56 viser at probe 1 påviser fylogenetisk forskjellige bakterier og hybridiserer ikke til human RNA. Tabell 57 viser at probe 2 hybridiserer til RNA fra bakterier som vanligvis blir funnet i urin med unntak av Ureaplasma urealyicum og hybridiserer ikke til gjær RNA.

Tabell 58 viser at probe 2 påviser fylogenetisk forskjellige bakterier og hybridiserer ikke til human rRNA.

Tabell 59 viser at probe 3 hybridiserer til RNA fra bakterier som vanligvis blir funnet i urin og påviser ikke gjær rRNA. Tabell 60 viser at probe 3 påviser fylogenetisk forskjellige bakterier og hybridiserer ikke til human rRNA

Tabell 61 viser at probe 4 hybridiserer til RNA fra bakterier som vanligvis blir funnet i urin og påviser ikke gjær rRNA.

Tabell 62 viser av probe 4 påviser fylogenetisk forskjellige bakterier og hybridiserer ikke til human rRNA.

Tabell 63 vise at probe 5 hybridiserer til RNA fra bakterier som vanligvis blir funnet i urin og påviser ikke gjær rRNA.

Tabell 64 viser at probe 5" påviser fylogenetisk forskjellige bakterier og hybridiserer ikke til human

RNA.

Tabell 65 viser at probe 6 hybridiserer til RNA fra bakterier som vanligvis blir funnet i urin og påviser ikke gjær rRNA.

Tabell 66 viser at probe 6 påviser noen fylogenetisk forskjellige bakterier og hybridiserer ikke til human rRNA.

Tabell 67 viser at probe 7 hybridiserer til RNA fra bakterier som vanligvis blir funnet i urin og påviser ikke gjær rRNA.

Tabell 68 viser at probe 7 påviser fylogenetisk forskjellige bakterier og hybridiserer ikke til human rRNA.

Eksempel 20

Sopp omfatter en morfologisk og"fysiologisk forskjellig gruppe av enkle eukaryotiske organismer. Man anslår, ved anvendelse av publiserte sekvenser fra tre sopp, Neurospora crassa, Podospora og Saccharomyces, at rRNA fra sopp er 58-60% homologe til E. coli 84-90% homologe til hverandre. Noen sopp vokser som enkle celler (gjær) andre som multi-nukleære filamenter (mugg) og enda andre kan vokse enten som enkle celler eller multi-cellulære filamenter (dimorfe sopp). Skjønt mange mange sopp er harmløse beboere i deres omgivelser, er andre skadelige og forårsaker sykdom. Tilstedeværelsen av enhver sopp enkelte steder er uønskelig eller indikerer sykdom (f.eks. kulturmedia, farmasøytiske produkter, kroppsvæsker slik som blod, urin eller cerebrosponalvæske og vevsbiopsier). Små konsentrasjoner sopp betraktes aksepterbare i andre produkter slik som drikkevann og matvareprodukter. Dette har skapt behovet for et middel for påvisning og kvantifisering av sopp i en proøve.

Nåværende metode for påvisning og kvantifisering av sopp omfatter mikroskopisk undersøkelse av prøvene og dyrking på forskjellige media. Skjønt de fleste gjær kan dyrkes fra kliniske prøver i løpet av noen døgn, har noen filamentformige sopp en dyrkningstid på 4 uker, hvoretter spesielle fargeprosedyrer, biokjemiske analyser og antigen-tester gjennomføres. Oligonukleotid-sekvensene under, når de anvendes i et hybridiseringsforsøk, påviser de fem vanligste gjærtyper isolert i klinisk omgivelse, Candida albicans, Torulopsis glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis og Candida krusei.

Fem andre sopp som representerer Trichosporon, Blastomyces, Cryptococcus og Saccharomyces slektene er også påvist. Den foreliggende oppfinnelse tillater påvisning av disse organismer i et trinn og, sammenlignet med dyrking, reduserer tiden som er nødvendig for identifisering eller eliminering av disse sopp som årsak til en infeksjon. Dette representerer en betydelig forbedring i forhold til tidligere kjente metoder.

De fire prober som hybridiserer til organismene av interesse ble identifisert ved anvendelse av 3 primere som var komplementære til bevarte områder på 18S eller 28S rRNA. Sekvens 1 ble oppnådd ved anvendelse av en 18S primer med sekvensen 5'-AGA ATT TCA CCT CTG-3'. Sekvens 2 ble oppnådd ved anvendelse av 28S primer med

sekvens 5'-cCT TCTrm

A iLX CCCGAA GTT ACG G-3'.

Sekvensene 3 og 4 ble oppnådd med en 28S primer med sekvensen

Følgende sekvenser blekarakterisertog vist å hybridisere til sopp rRNA. Sekvensene fra Saccharomyces cervisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Escherichia coli og human rRNA ble anvendt til sammenligning med sekvensene av interesse.

1. CCC GAC CGT CCC TAT TAA TCA TTA CGA TGG

2. CGA CTT GGC ATG AAA ACT ATT CCT TCC TGT GG

3. GCT CTT CAT TCA ATT GTC CAC GTT CAA TTA AGC AAC

AAG G

4. GCT CTG CAT TCA AAC GTC CGC GTT CAA TAA AGA AAC

AGG G

Sekvens 1, fra 18S rRNA, har en lengde på 30 baser og en Rm på 68°C. Sekvens 2, fra 23S rRNA, har en lengde på 32 baser og en Tm på 67°C. Sekvens 3, fra 23S rRNA, har en lengde på 40 baser og en Tm på 66°C. Sekvens 4, fra 23S rRNA, har en lengde på 40 baser og en Tm på 68°C. Sekvens 1 hybridiserer i området som tilsvarer stillingen 845-880 fra Saccharomyces cerevisiae 18S rRNA. Sekvens 2 hybridiserer i området tilsvarende til stilling 1960-2000 i Saccharomyces cerevisiae 28S rRNA og sekvens 3 og 4 hybridiserer i området 1225-1270 i 28S rRNA.

For å vise reaktiviteten og spesifisiteten av disse prober for sopp rRNA, ble de anvendt i hybridiserings-32 12 5

forsøk. P- eller I-merkede oligonukletid-prober ble anvendt med renset RNA eller RNA frigjort fra celler ved hjelp av standard lyserings-teknikker i 0,2 ml 0,48M natrium-fosfat, pH 6,8, 1% natrium-dodecyl-sulf at, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og inkubert ved 60°c i 2 t.

Etter inkubering, ble 5 ml 2% hydroksyapatitt, 0,12 M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat tilsatt og prøvene ble inkubert i 10 min. ved 60°C. Prøvene ble sentrifugert og supernatanten fjernet. 5 ml 0,12 M natriumfosfat, pH 6,8, 0,02% natrium-dodecyl-sulfat ble tilsatt, prøvene ble blandet, sentrifugert og supernatanten fjernet. Resultatene er vist i tabell 69. Probe 1 påviser alle 10 sopp som ble testet, probe 2 påviser alle 6 gjær som ble testet, probe 3 påviser 5

av 6 gjær og probe 4 påviser bare C. krusei. Således vil probe 4 kunne anvendes for å påvise og identifisere C. krusei i prøver, probe 1, 2 eller en kombinasjon av

3 og 4 vil kunne anvendes for å påvise gjær, og probe 1 vil kunne anvendes for å påvise enhver av de 10 organismer som er gitt i tabell 69. En potensiell anvendelse for disse prober er å identifisere gjær i urinprøver eller andre normalt sterile kroppsvæsker. Probene ble hybridisert til et panel av bakterier som vanligvis isoleres fra urin og ble vist ikke å reagere (tabell 70). Tabell 71 viser at probene ikke hybridiserer til fylogenetisk forskjellige bakterier eller til human RNA.

To derivater av probe 1 ble også fremstilt:

Det første derivat fungerer bra ved 65°C, det andre ved 60°C.

Eksempel 21

Gonorré er en av de mest vanlige rapporterte bakterie-infeksjoner i USA, med over 2 mill. tilfeller rapportert årlig. Denne seksuelle overførbare sykdom resulterer vanligvis i foranliggende urethritt hos menn og involverer halsen hos kvinner. Mens alvorlige komplikasjoner og til og sterilitet kan forekomme hos ubehandlede individer, er asymptomatiske infeksjoner vanlige som resulterer i bærere som uten å vite det sprer sykdommen.

Det forårsakende middel, Neisseria gonorrhoeae, er

en gram-negativ, oksidase positiv diplococcus med strenge vekstkrav. Metoden som anvendes for diagnostisering avhenger av infeksjonsstedet og symptomene hos pasienten. Gonokk urethritt hos menn diagnostiseres med god

følsomhet og spesifisitet ved anvendelse av gram-farging. Dyrking, som krever 24-72 timer, må vanligvis gjennomføres for å bekrefte diagnosen på gonorré fra alle kvinner og menn uten symptomer. Etter påvisning av organismen som er dyrket i kultur, må Neisseria gonorrhoeae identifiseres ved ytterligere tester slik som karbohydrat-nedbrytning, koagglutinering, fluorescerende antistoff-screen eller kromogeniske enzym-substrat-forsøk.

Neisseria gonorrhoeae er særlig vanskelig å påvise og skjelne ved anvendelse av en nukleinsyre-probe, fordi den er svært nær beslektet med en meningitidis. Data publisert i Kingsbury, D.T. J. Bacteriol. 94:870-874

(1967) viser en DNA:DNA homologi for de to arter på omtrent 80-94%. Under retningslinjer etablert av Ad Hoc Committee on Reconciliation og Approaches to Bacterial Systematics, Int'1 J. System. Bacteriol. 37:463-464 (1987), betyr den fylogenetiske definisjon av en art generelt 70% eller større DNA:DNA homologi. Til tross for det faktum at disse orgnismer vil kunne betraktes å være de samme arter under etablerte prinsipper, er man må i stand til å fremstille prober som kan skjelne dem.

Som forventet, er rRNA homologien mellom N. gonorrhoeae og N. meningitidis til og med større på grunn av kjente bevarte områder. Man har merket seg en 1,0% forskjell mellom 16S og en 1,1% forskjell mellom 23S rRNA-sekvenser fra N. gonorrhoeae og N. meningitidis ved anvendelse av de foreliggende sekvenseringsdata.

Fremstilling av en probe for N. gonorrhoeae ble komplisert ved det faktum at på noen steder hvori N. meningitidis og N. gonorrhoeae var forskjellige, var andre Neisseria-arter like med N. gonorrhoeae. De få uoverensstemmelser som eksisterer mellom disse to arter er i de mest variable områder, dvs. områder som ikke bare varierer mellom arter men også fra stamme til stamme. Til tross for det faktum at noen trodde at artene ikke ville kunne skjelnes med nukleinsyre-prober i det hele tatt, og andre trodde at rRNA var altfor bevart til å være anvendbar i probe-diagnostikk, har man vært i stand til å fermstille prober som kan differensiere N. gonorrhoeae og N. meningitidis.

Den foreliggende oppfinnelse har betydelige fordeler i forhold til hver av de tidligere kjente metoder; probene er mer spesifikke og mye hurtigere enn dyrkingsmetoder. Man antar også at probene er mer sensitive (dvs. i stand til å påvise et mindre antall organismer i en klinisk prøve) enn tidligere kjente metoder.

Primerne som ble anvendt for å identifisere disse probe-sekvenser hadde følgende sekvenser:

1. GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT

2. GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC

3. GCTCGTTGCGGGACTTAACCCACCAT

Hver av rRNA-stedene er valgt til target hadde minst

to uoverensstemmelser til E. coli, N. meningitidis,

N. cinerea, N. lactamica, N. mucosa og Kingella kingae.

Oligonukleotider komplementære til sekvenser som grenset opp til probeområdene ble syntetisert og anvendt i hybridiserings-blandingen i overensstemmelse med Hogan

et al., US patentansøkning serie nr. (ikke tildelt ennå), innsendt 24. november, 1987, med tittelen "Means and Method for Enhancing Nucleic Acid Hybridization (the "helper" patentansøkning).

Følgende sekvenser blekarakterisertog vist å være spesifikke for Neisseria gonorrhoeae. De fylogenetisk nærmeste naboer Neisseria meningitidis, N. lactamica, N. cinerea, N. mucosa, og Kingella kingae ble anvendt for sammenligning med N. gonorrhoeae-sekvensen.

1. CCG CCG CTA CCC GGT AC

2. TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC

3. GAG CAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TA

Sekvens 1, komplementær til 16S rRNA i området 125-150, har en lengde på 17 baser og en Tm på 56°C Sekvens 2, komplementær til 16S rRNA i området 455-485, har en lengde på 21 baser og en Tm på 63°C. Sekvens 3, komplementær til 16S rRNA i området 980-1015, har en lengde på 29 baser og en Tm på 57°C.

Reaktiviteten og spesifisiteten av probene for Neisseria gonorrhoeae ble vist med et hybridiserings-forsøk. De tre oligonukleotid-prober ble merket med jod og blandet med umerkede oligonukleotider med sekvens og med renset RNA i 0,48M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,5% natrium-dodecyl-sulfat (SDS) og inkubert ved 60°C i 1 time. Etter inkubering, ble 4 ml 2% hydroksyapatitt, 0,12M natrium-fosfat, pH 6,8, 0,02% SDS tilsatt og blandingen ble inkubert ved 60°C i 5 min. Prøvene ble sentrifugert og supernatantene fjernet. 5 ml vaske-løsning (0,12M natrium-fosfat, pH 6,8, 2% SDS) ble tilsatt og prøvene ble blandet, sentrifugert og supernatantene fjernet. Mengden radioaktivitet bundet til hydroksyapatitt ble bestemt i en gammateller.

Tabell 72 viser at probene hybridiserte godt til N. gonorrhoeae RNA og hybridiserte ikke til de andre artene som ble undersøkt.

Følgende derivater av Neisseria-prober er også fremstilt og anvendt:

Skjønt de ovennevnte utførelses-eksempler ble bestemt

ved anvendelse av det standard forsøksformat som er beskrevet tidligere, kan probene anvendes under en rekke eksperimentelle forhold. F.eks. kan tilsetningsmidler tilsettes til reaksjonsløsningene for å tilveiebringe optimale reaksjonsbetingelser for aksellerert hybridisering. Slike tilsetningsmidler kan omfatte buffere, chelaterende midler, organiske forbindelser og nukleinsyre-precipiterende midler slik som detergenter, dihydroksy-benzen, natrium-dodecyl-sulfat, natrium-diisobutyl-sulfosuccinat, natrium-tetradecyl-sulfat, sarkosyl og alkali-metall-saltene og ammonium-saltene av SO-2.,

11

PO-34, Cl- og HCOO- . Slike tilsetningsmidler kan anvendes av den fagkyndige på området for å tilveiebringe optimale betingelser for den hybridiseringsreaksjonen som finner sted. Disse betingelser for aksellerert hybridisering av enkelkjedete nukleinsyre-molekyler til dobbelt-kjedete molekyler er formålet for den ovennevnte US patentansøkning, serie nr. 627.795 innsendt 5. juli 1984, continuation innsendt 4. juni, 1987,(serie nr.

ennå ikke tildelt) og serie nr. 816.711, innsendt 7. januar 1986, som begge har tittelen "ACCELERATED NUCLEIC

ACID REASSOCIATION METHOD".

Den foreliggende oppfinnelse kan gjennomføres på ikke-virale organismer fra rensede prøver eller urensede kliniske prøver slik som spytt, feces, vev, blod,

spinal- eller synovial-væsker, serum, urin eller andre kroppsvæsker, eller andre prøver slik som prøver fra

omgivelsene eller matvarer". Før cellenedbryting og hybridisering, kan cellene suspenderes eller plasseres i løsning. Når det gjelder urensede prøver som er omtalt over, kan cellene forbli intakt og ubehandlet i deres eget biologiske miljø før forsøket.

Probene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan anvendes i et forsøk enten alene eller i kombinasjon med forskjellige prober. En rekke individuelle prober kan også festes sammen under nukleinsyre-synteser. Dette resulterer i et probe-molekyl som inneholder multiple probesekvenser, og derfor multiple spesifisiteter. F.eks. kan et enkelt nukleinsyre-molekyl syntetiseres som inneholder både Mycobacterium avium og Mycobacterium intracellulare sekvenser beskrevet i eksemplene 1 og 2. Når man hybridiserer med enten M. avium eller M. intracellulare rRNA vil denne proben hybridisere fullstendig. Dersom de to probesekvensene ble kombinert separat i et forsøk vil bare halvdelen av de blandede individuelle prober hybridisere med enten M. avium eller M. intracellulare rRNA. Andre utførelsesformer kan også gjennomføres innenfor området for kravene. F.eks. kan probene merkes ved anvendelse av en rekke midler for merking, som beskrevet tidligere, og kan innlemmes i diganostiske kit.

Claims (329)

1. En fremgangsmåte for fremstilling av en probe for anvendelse i et kvalitativt eller kvantitativt hybridiserings-forsøk karakterisert ved oppbygning av et oligonukleotid som er tilstrekkelig komplementært til å hybridisere til et område av rRNA utvalgt til å være unikt til en ikke-viral organisme eller gruppe av ikke- virale organismer som man forsøker å påvise, idet nevnte område av rRNA velges ved å sammenligne en eller flere variable område rRNA-sekvenser av nevnte ikke-virale organismer eller grupper av ikke-virale organismer med en eller flere variable område rRNA-sekvenser fra en eller flere ikke-virale organismer som man forsøker å skjelne derfra.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte variable område rRNA-sekvenser fra ikke-virale organismer som man ønsker å skjelne er fra den kjente, nærmest beslektede organisme til nevnte ikke-virale organisme eller gruppe av ikke-virale organismer som man forsøker å påvise.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte område av rRNA velges å ha minst omtrent en forskjell på en base-sekvens fra en tilsvarende rRNA-sekvens fra den kjente, nærmest beslektede organisme til nevnte ikke-virale organisme eller gruppe av ikke-virale organismer som man søker å påvise.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte område av rRNA velges til å ha minst omtrent en 10% eller større base-sekvens-forskjell fra den tilsvarende rRNA-sekvens fra den kjente, nærmest beslektede organisme til nevnte ikke-virale organisme eller gruppe av ikke-virale organismer som man søker å påvise.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte område av rRNA velges fra gruppen bestående av 5S, 16S og 23S rRNA.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte område av rRNA velges fra gruppen bestående av 5,OS, 5,8S, 18S og 28S rRNA.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst 10 nukleotider.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte oligonukleotid har en lengde på minst omtrent 15 nukleotider.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte oligonukleotid har en lengde på minst omtrent 20 nukleotider.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst omtrent 30 nukleotider.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde fra omternt 20 nukleotider til omtrent 50 nukleotider.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på omtrent 30 nukleotider til omtrent 50 nukleotider.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst omtrent 10 nukleotider.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst omtrent 15 nukleotider.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst omtrent 20 nukleotider.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst omtrent 30 nukleotider.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på omtrent 20 nukleotider til omtrent 50 nukleotider.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på omtrent 30 nukleotider til omtrent 50 nukleotider.

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst omtrent 10 nukleotider.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst omtrent 15 nukleotider.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst omtrent 20 nukleotider.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på minst omtrent 30 nukleotider.

23. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på omtrent 20 nukleotider til omtrent 50 nukleotider.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på omtrent 30 nukleotider til omtrent 50 nukleotider.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte probe er minst omtrent 75% komplementær til nevnte område av rRNA.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte oligonukleotid er minst omtrent 35% komplementær til nevnte område av rRNA.

27. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte oligonukleotid er minst omtrent 75% komplementær til nevnte område av rRNA.

28. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte probe er fullkommen komplementær til nevnte område av rRNA.

29. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at nevnte probe er fullkommen komplementær til nevnte område av rRNA.

30. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte probe er fullkommen komplementær til nevnte område av rRNA.

31. En hybridiseringsforsøk-probe for en ikke-viral organisme eller organismer karakterisert ved at den omfatter et oligonukleotid med en lengde på minst omtrent 10 nukleotider hvori minst omtrent 10 tilstøtende nukleotider er ialt vesentlig komplementære til minst et variabelt område av nukleinsyre valgt til å være unikt til nevnte ikke-virale organisme eller organismer.

32. En hybridiseringsforsøk-probe for en ikke-viral organisme eller organismer karakterisert ved at den omfatter et oligonukleotid med en lengde på minst omtrent 10 nukleotider som er minst omtrent 75% komplementær til minst et variabelt område av nukleinsyre valgt til å være unikt til nevnte ikke-virale organisme eller organismer.

33. Probe som angitt i krav 31 eller 32, karakterisert ved at nevnte nukleinsyre er 5S, 16S eller 23S rRNA.

34. Probe som angitt i krav 31 eller 32, karakterisert ved at nevnte nukleinsyre er 5,OS, 5,8S, 18S eller 28S rRNA.

35. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organisme er Mycobacterium avium.

36. Probe som angitt i krav 35, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

37. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren kan hybridisere til proben i krav 36 eller til komplementer derav.

38. Nukleinsyrehybrid karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en oligonukleotid omfattende sekvensen

og en nukleinsyre-sekvens som ialt vesentlig er komplementær dertil.

39. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren har strukturen AC CGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG og komplementet dertil.

40. Nukleltidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Mycobacterium avium i området som tilsvarer til basene 185-225 i E. coli 16S rRNA.

41. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotid-polymer som angitt i krav 40 og en nukleinsyre-sekvens som ialt vesentlig er komplementær dertil.

42. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organisme er Mycobacterium intracellulare.

43. Probe som angitt i krav 42, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

44. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til proben som angitt i krav 43 eller til komplimentet derav.

45. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en oligonukleotid omfattende sekvensen

og en nuklemsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

46. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren har strukturen

og komplementet derav.

47. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Mycobacterium intracellulare i området tilsvarende til basene 185-225 i E. coli 16S rRNA.

48. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at det er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 47 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

49. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organismer er Mycobacterium tubereulosis-kompleks-bakterier.

50. Probe som angitt i krav 49, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

51. Probe som angitt i krav 49, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

52. Probe som angitt i krav 49, karakterisert ved at nevnte oligo- nukleotid omfatter sekvensen

53. Probe som angitt i krav 49, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

54. Probe som angitt i krav 49, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

55. Probe som angitt i krav 49, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

56. Probe som angitt i krav 49, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

57. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til proben som er angitt i kravene 50 eller 51 eller 52 eller 53 eller 54 eller 55 eller 56 eller til komplementene derav.

58. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende et medlem av gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensene

og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

59. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren omfatter et medlem av gruppen bestående av nukleotidpolymerene av strukturene

og komplementene derav.

60. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til rRNA fra artene inkludert i Mycobacterium tuberculosis komplekset i området tilsvarende til basene 185-225 i E. coli 16S rRNA.

61. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 60 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

62. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra artene inkludert i Mycobacterium tuberculosis-komplekset i området tilsvarende til basene 540-575 i E. coli 23S rRNA.

63. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 62 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

64. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra artene inkludert i Mycobacterium tuberculosis-komplekset i området tilsvarende til basene 1155-1190 fra E. coli 23S rRNA.

65. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 64 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

66. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra artene inkludert i Mycobacterium tuberculosis-komplekset i området tilsvarende til basene 2195-2235 i E. coli 23S rRNA.

67. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom nukleotidpolymer som angitt i krav 66 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

68. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organismer er slekten Mycobacterium.

69. Probe som angitt i krav 68, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen CCA TGC ACC ACC TGC ACA CAG GCC ACA AGG.

70. Probe som angitt i krav 68, karakterisert ved at nevnte oligonukleotid omfatter sekvensenG GCT TG CCC CAG TAT TAC CAC TGA CTG GTA CGG.

71. Probe som angitt i krav 68, karakterisert ved at nevnte oligonukleotid omfatter sekvensen CAC CGA ATT CGC CTC AAC CGG CTA TGC GTC ACC TC.

72. Probe som angitt i krav 68, karakterisert ved at nevnte oligonukleotid omfatter sekvensen <qqq> GTk q^ q <qqq> GTG TGT GTG CTC GCT AGA GGC.

73. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til probene som angitt i kravene 69 eller 70 eller 71 eller 72 eller til komplementene derav.

74. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende et medlem av gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensen

og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

75. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren omfatter et medlem fra gruppen bestående av nukleotidpolymerer med strukturene

og komplementene dertil.

76. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Mycobacterium i området tilsvarende til basene 1025-1060 i E. coli 16S rRNA.

77. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 76 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

78. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Mycobacterium i området tilsvarende til basene 1440-1475 i E. coli 23S rRNA.

79. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 78, og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

80. Nukleotidpolymer, - karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Mycobacterium i området tilsvarende til basene 1515-1555 i E. coli 23S rRNA.

81. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 80 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

82. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Mycobacterium i området tilsvarende til basene 1570-1610 i E. coli 23S rRNA.

83. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 82 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

84. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organisme er Mycoplasma pneumoniae.

85. Probe som angitt i krav 84, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

86. Probe som angitt i krav 84, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

87. Probe som angitt i-krav 84, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

88. Probe som angitt i krav 84, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

89. Probe som angitt i krav 84, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

90. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til probene som angitt i kravene 85 eller 86 eller 87 eller 88 eller 89 eller til komplementene derav.

91. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende et medlem fra gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensen

og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

92. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren omfatter et medlem fra gruppen bestående av nukleotidpolymerer med strukturene

og komplementene dertil.

93. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Mycoplasma pneumoniae i området tilsvarende til basene 190-230 i E. coli 16S rRNA.

94. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 93 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

95. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Mycoplasma pneumoniae i området tilsvarende til basene 450-490 i E. coli 16S rRNA.

96. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 95 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

97. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Mycoplasma pneumoniae i området tilsvarende til basen 820-860 i E. coli 16S rRNA.

98. En nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 97 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

99. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Mycoplasma pneumoniae i området tilsvarende til basene 1255-1290 i E. coli 16S rRNA.

100. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 99 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

101. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Mycoplasma pneumonia i området tilsvarende til basene 65-120 i E. coli 5S rRNA.

102. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 101 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

103. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organismer er slekten Legionella.

104. Probe som angitt i krav 103, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

105. Probe som angitt i krav 103, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

106. Probe som angitt i krav 103, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

107. Probe som angitt i krav 103, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

106. Probe som angitt i krav 103, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

109. Probe som angitt i krav 103, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

110. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til probene som angitt i krav 104 eller 105 eller 106 eller 107 eller 108 eller 109 eller til komplementene derav.

111. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende et medlem fra gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensene

og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

112. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren omfatter et medlem av gruppen bestående av nukleltidpolymerer med strukturene

og komplementene dertil.

113. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA. fra slekten Legionella i området tilsvarende til basene 630-675 i E. coli 16S rRNA.

114. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et nukleotidpolymer som ..angitt-i krav J.13 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

115. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Legionella i området tilsvarende til basene 975-1020 i E. coli 16S rRNA.

116. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 115 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

117. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Legionella i området tilsvarende til basene 350-395 i E. coli 23S rRNA.

118. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 117 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

119. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Legionella i området tilsvarende til basene 1585-1620 i E. coli 23S rRNA.

120. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 119 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

21. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Legnionella i området tilsvarende til basene 2280-2330 i E. coli 23S rRNA.

122. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 121 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

123. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organisme er Chlamydia trachomatis.

124. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

125. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nenvte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

126. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nenvte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

127. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

128. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

129. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

130. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

131. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

132. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

133. Probe som angitt i krav 123, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

134. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til probene som angitt i kravene 124 eller 125 eller 126 eller 127 eller 128 eller 129 eller 130 eller 131 eller 132 eller 133 eller til komplementene derav.

135. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en oligonukleotid omfattende et medlem fra gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensen og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

136. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren omfatter et medlem fra gruppen bestående av nukleotidpolymerer med strukturene

og komplementene dertil.

137. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachomatis i området tilsvarende til basene 6-105 i E. coli 16S rRNA.

138. Nukleinsyrehybrid,- karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 137 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

139. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachomatis i området tilsvarende til basene 175-210 i E. coli 16S rRNA.

140. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 139 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

141. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachomatis i området tilsvarende til basene 600-635 i E. coli 16S rRNA.

142. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 141 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

143. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachomatis i området tilsvarende til basene 830-870 i E. coli 16S rRNA.

144. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 143 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplimentær dertil.

145. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachomatis i området tilsvarende til basene 275-320 i E. coli 23S rRNA.

146. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 145 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

147. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachomatis i området tilsvarende til basene 330-365 i E. coli 23S rRNA.

148. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 147 og en nukleinsyre som ialt vesentlig er komplementær dertil.

149. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachomatis i området tilsvarende til basene 1160-1190 i E. coli 23S rRNA.

150. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 149 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

151. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachomatis i området tilsvarende til basene 1450-1490 i E. coli 23S rRNA.

152. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 151, og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

153. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachomatis i området tilsvarende til basene 1510-1545 i E. coli 23S rRNA.

154. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 153, og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

155. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Chlamydia trachoamtis i området tilsvarende til basene 1710-1750 i E. coli 23S rRNA.

156. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 155, og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

157. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organisme er Campylobacter.

158. Probe som angitt i.krav 157, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

159. Probe som angitt i krav 157, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

160. Probe som angitt i krav 157, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

161. Probe som angitt i krav 157, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

162. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til probene som angitt i kravene 158 eller 159 eller 160 eller 161 eller til komplementene derav.

163. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende et medlem fra gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensen

og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

164. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren omfatter et medlem fra gruppen bestående av nukleotidpolymerer med strukturene

og komplemente dertil.

165. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Campylobacter i området tilsvarende til basene 405-428 i E. coli 16S rRNA.

166. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 165 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

167. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Campylobacter i området tilsvarende til basene 440-475 i E. coli 16S rRNA.

168. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 167 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

169. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Campylobacter i området tilsvarende til basene 705-735 i E. coli 16S rRNA.

170. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 169 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

171. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Campylobacter i området tilsvarende til basene 980-1010 i E. coli 16S rRNA.

172. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 171 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

173. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organismer er den sub-generiske gruppe av Streptococci kjent som enterococci.

174. Probe som angitt i krav 173, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA.

175. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til proben som angitt i krav 74 eller til komplementet derav.

176. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende sekvensen og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

177. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er strukturen TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA og komplementet dertil.

178. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til hybridisere til RNA fra den sub-generiske gruppe Streptococci kjent som enterococci i området tilsvarende til basene 825-860 i E. coli 16S rRNA.

179. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer angitt i krav 178 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

180. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organismer er den sub-generiske gruppe kjent som gruppe I Pseudomonas.

181. Probe som angitt i krav 180, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

182. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til proben som angitt i krav 181 eller til komplementet derav.

183. Nukleinsyrehybrid ; karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende sekvensen CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

184. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren har strukturenCAGACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT og komplementet dertil.

185. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra den sub-generiske gruppe kjent som gruppe I Psuedomonas i området tilsvarende til basene 365-405 i E. coli 23S rRNA.

186. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som er angitt i krav 185 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

187. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organisme er Enterobacter cloacae.

188. Probe som angitt i krav.187, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

189. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til proben som angitt i krav 189 eller til komplementet derav.

190. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende et medlem fra gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensen

og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

191. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er strukturen GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC og komplementet dertil.

192. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Enterobacter cloacae i området tilsvarende til basene 305-340 i E. coli 23S rRNA.

193. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 192 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

194. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organisme er Proteus mirabilis.

195. Probe som angitt i krav 194, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

196. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til hybridisere til proben som angitt i krav 195 eller til komplementet derav.

197. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende sekvensen CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

198. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren har strukturenCCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC og komplementet dertil.

199. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Proteus mirabilis i området tilsvarende til basene 270-305 i E. coli 23S rRNA.

200. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 199 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

201. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organismer er slekten Salmonella.

202. Probe som angitt i krav 201, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen cT c CTT TGA GTT CCC GAC CTA ATC GCT GGC.

203. Probe som angitt i krav 201, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen CTC ATC GAG CTC ACA GCA CAT GCG CTT TTG TGT A.

204. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til proben som angitt i krav 202 eller 203 eller til komplementet derav.

205. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en oligonukleotid omfattende et medlem fra gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensen

og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

206. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren omfatter et medlem fra gruppen bestående av nukleotidpolymerer med strukturene

og komplementene dertil.

207. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Salmonella i området tilsvarende til basene 1125-1155 i E. coli 16S rRNA.

208. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 207 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

209. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra slekten Salmonella i området tilsvarende til basene 335-375 i E. coli 23S rRNA.

210. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som er angitt i krav 209 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

211. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organisme er Eschrichia coli.

212. Probe som angitt i krav 211, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

213. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til proben som angitt i krav 212 eller til komplementet derav.

214. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en oligonukleotid omfattende sekvensen

og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

215. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren har strukturen

og komplementet dertil.

216. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Escherichia coli i området tilsvarende til basene 995-1030 i E. coli 16S rRNA.

217. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 216 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

218. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organismer er bakteriene fra den fylogenetiske gruppe.

219. probe som angitt i krav 218, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen CCA CTG CTGCCT CCC GTA GGA GTC TGG GCC.

220. Probe som angitt i krav 218, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen CCA GAT CTC TAC . GCA TTT CAC CGC TAC ACG TGG.

221. Probe som angitt i krav 218, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT.

222. Probe som angitt i krav 218, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensenGGGGTT CTT TTC GCC TTT CCC TCA CGG.

223. Probe som angitt i krav 218, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen GGC TGC TTC TAA GCC AAC ATC CTG.

224. Probe som angitt i krav 218, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensenGGA CCG TTA TAG TTA CGG CCG CC.

225. Probe som angitt i krav 218, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen <qq> ^ CGG AAC TTA CCC GAC AAG GAA TTT CGC TAC C.

226. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til probene som angitt i krav 219 eller 220 eller 221 eller 222 eller 223 eller 224 eller 225 eller til komplementene derav.

227. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende et medlem fra gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensene og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er lik dertil.

228. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren omfatter et medlem fra gruppen bestående av nukleotidpolymerer med strukturene

og komplementene dertil.

229. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra bakterier av den fylogenetiske gruppe i området tilsvarende til basene 330-365 i E. coli 16S rRNA.

230. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 229 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

231. En nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra bakteriene i den fylogenetiske gruppe i området tilsvarende til basene 675-715 i E. coli 16S rRNA.

232. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotipolymer som angitt i krav 231 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

233. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra bakteriene i den fylogenetiske gruppe i området tilsvarende til basene 1080-1110 i E. coli 16S rRNA.

234. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 233 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

235. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra bakteriene i den fylogenetiske gruppe i området tilsvarende til basene 460-490 i E. coli 23S rRNA.

236. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som, angitt i krav 235 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

237. En nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra bakteriene i den fylogentiske gruppe i området tilsvarende basene 1050-1080 i E. coli 23S rRNA.

238. Nukleinsyrehybrid," karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 237 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

239. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra bakteriene i den fylogenetiske gruppe i området tilsvarende basene 1900-1960 i E. coli 23S rRNA.

240. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 239 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

241. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organismer er sopp.

242. Probe som angitt i krav 241, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

243. Probe som angitt i krav 241, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

244. Probe som angitt i krav 241, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

245. Probe som angitt i krav 241, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

246. Probe som angitt i krav 241, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

247. Probe som angitt i krav 241, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

248. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til probene som angitt i kravene 242 eller 243 eller 244 eller 245 eller 246 eller 247 eller til kompi .mentene derav.

249. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende et medlem fra gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensen og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

250. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at et medlem av gruppen bestående av nukleotidpolymerer med strukturene

og komplementene dertil.

251. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra sopp av den fylogenetiske gruppe i området tilsvarende til stillingen 845-880 i Saccharomyces cervisiae 18S rRNA.

252. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som "angitt i krav 251 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

253. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra sopp av den fylogenetiske gruppe i området tilsvarende til stillingen 960-2000 i Saccharomyces cervisiae 28S rRNA.

254. Nukleinsyrehybrid karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 253 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

255. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra sopp av den fylogenetiske gruppe i området tilsvarende til stillingen 1225-1270 i Saccharomyces cervisiae 28S rRNA.

256. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 255 og en nukleinsyre som i alt vesentlig er komplementær dertil.

257. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte ikke-viral organisme er Neisseria gonorrhoeae.

258. Probe som angitt i krav 257, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen CCG CCG CTA CCC GGT AC.

259. Probe som angitt i krav 257, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

260. Probe som angitt i krav 257, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

261. Probe som angitt i. krav 257, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

262. Probe som angitt i krav 257, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen

263. Probe som angitt i krav 257, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen CCC GCT ACC CGG TAC GTTC.

264. Probe som angitt i krav 257, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid omfatter sekvensen CCG CTA CCC GGTAC GTTC.

265. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til probene som angitt i krav 258 eller 259 eller 260 eller 261 eller 262 eller 263 eller 264 eller til komplementene derav.

266. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom et oligonukleotid omfattende et medlem av gruppen bestående av oligonukleotider med sekvensene og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

267. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren omfatter et medlem fra gruppen bestående av nukleotidpolymerer med strukturene

og komplementene dertil.

268. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Neisseria gonorrhoeae i området tilsvarende til:basene -125-150 E. coli 16S rRNA.■

269. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 268 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

270. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra artenN eisseria gonorrhoeae i området tilsvarende til basene 455-485 i E. coli 16S rRNA.

271. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 270 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

272. Nukleotidpolymer, karakterisert ved at polymeren er i stand til å hybridisere til RNA fra arten Neisseria gonorrhoeae i området tilsvarende til basene 980-1050 i E. coli 16S rRNA.

273. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 272 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

274. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid er fullkommen komplementær til nevnte område av rRNA.

275. Probe som angitt i krav 41, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid har en lengde på omtrent 20 nukleotider til omtrent 50 nukleotider.

276. Probe som angitt i krav 31, karakterisert ved at nevnte oligo-nukleotid er minst omtrent 95% komplementær til et område av rRNA.

277. Hybridiserings-forsøk, karakterisert ved at man (1) reagerer sammen enhver rRNA fra en prøve som skal måles for en ikke-viral organisme eller organismer og en oligo-nukleotid-probe med en lengde på minst 10 nukleotider som er minst omtrent 75% komplementær til et variabelt område i rRNA valgt til å være unikt til nevnte ikke-virale organisme eller organismer, (2) under betingelser slik at hybridisering mellom oligonukleotidproben og enhver tilstrekkelig komplementær prøve rRNA kan forekomme, og (3) observerer og/eller måler nevnte hybridisering.

278. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at nevnte hybridisering mellom oligonukleotidproben og enhver target-prøve rRNA er fra minst omtrent 10% til omtrent 100%.

279. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at nevnte oligonukleotidprobe er cDNA.

280. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at nevnte betingelser omfatter en temperatur fra omtrent 25°C under Tm til omtrent 1°C over Tm.

281. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at forsøket ytterligere omfatter det parallelle forsøk av en positiv homolog kontroll, eller en positiv heterolog kontroll, eller begge.

282. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at forsøket ytterligere omfatter det parallelle forsøk med en negativ kontroll.

283. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at nevnte betingelser omfatter midler for en økt grad av hybridisering.

284. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at nevnte betingelser er slik at de fremmer maksimum hybridisering mellom oligonukleotidproben og enhver komplementær prøve rRNA og minimal kryss-reaktivitet mellom oligonukleotidproben og enhver ikke-komplementær prøve rRNA.

285. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at nevnte oligonukleotidprobe er merket.

286. Forsøket som angitt i krav 285, karakterisert ved at nevnte oligonukleotidprobe er merket med en isotopisk, ikke-isotopisk eller kjemiluminescent merking.

287. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at forsøket ytterligere omfatter frigjøring av rRNA fra cellene av nevnte ikke-virale organisme eller organismer før trinnet med sarnmenreagering.

288. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at nevnte ikke-virale organisme eller organismer er Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis-kompleks-bakterier, Mycobacterium slekt, Mycoplasma pneumoniae, Legionella, Salmonella, Chlamydia trachomatis, Campylobacter cloacae, Proteus mirabilis, Enterococcus, Enterobacter cloacae, E. coli, Pseudomonas gruppe I, bakterier eller sopp.

289. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at nevnte merkede oligonukleotidprobe har en lengde på omtrent 20 nukleotider til omtrent 50 nukleotider.

290. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at nevnte merkede oligonukleotidprobe er minst omtrent 95% komplementær til nevnte variable område av rRNA.

291. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at forsøket ytterligere omfatter anvendelse av en eller flere ytterligere oligonukleotidprober med en lengde på minst omtrent 10 nukleotider og som er minst omtrent 75% komplementær til en eller flere ytterligere variable områder av rRNA valgt til å være unike til nevnte ikke-virale organismer.

292. Forsøket som angitt i krav 277, karakterisert ved at forsøket ytterligere omfatter anvendelse av en eller flere ytterligere prober som identifiserer en eller flere ytterligere ikke-virale organismer, og derved utvide gruppe av ikke-virale organismer som skal testes.

293. Fremgangsmåte for fremstilling av en probe eller en kombinasjon av prober for anvendelse i et kvalitativt eller kvantitativt hybridiseringsforsøk, karakterisert ved at den omfatter oppbygning av en nukleotidpolymer som er tilstrekkelig komplementær til å hybridisere et område av DNA eller rRNA valgt for å skjelne en target ikke-viral organisme eller gruppe av ikke-virale organismer som søkes å påvises fra minst en ikke-target organisme eller gruppe av ikke-target organismer som kan være tilstede i en prøve, idet nevnte område av DNA eller rRNA er valgt ved: sammenligning av en eller flere DNA eller rRNA-sekvenser av nevnte ikke-virale organisme eller gruppe av ikke-virale organismer som søkes å påvises med en eller flere DNA eller rRNA-sekvenser av nevnte ikke-target organismer eller grupper av ikke-target organismer; innretting av nevnte DNA eller rRNA-sekvenser fra nevnte ikke-virale organismer eller gruppe av ikke-virale organismer til homologien med nevnte DNA eller rRNA- sekvenser fra nevnte ikke-target organismer eller gruppe av organismer for å identifisere områder med homologi; utvelging av nevnte nukleotidpolymer ved i alt vesentlig maksimalisering av homologien av nevnte probe-oligonukleotid til områdene av nevnte DNA eller rRNA fra nevnte ikke-virale organismer eller ikke-virale gruppe av organismer som søkes å påvises, mens i alt vesentlig minimalisering av homologien av nevnte nukleotidpolymer til DNA eller rRNA-sekvenser fra nevnte ikke-target organismer eller gruppe av organismer som søkes å skjelnes derfra.

294. Fremgangsmåte som angitt i krav 293, karakterisert ved at nevnte ikke-target organismer eller gruppe av organismer er nære fylogenetiske slektninger av nevnte target-organismer eller gruppe av organismer.

295. Fremgangsmåte som angitt i krav 292, karakterisert ved at nevnte nukleotid-polymer er minst omtrent 90% homolog til områdene i nevnte DNA eller rRNA fra nevnte ikke-virale organisme eller ikke-virale gruppe av organismer som søkes å påvises.

296. Fremgangsmåte som angitt i krav 292, karakterisert ved at nevnte probe-oligonukleotid er mindre enn omtrent 90% homolog til DNA eller rRNA-sekvenser fra nevnte nærmeste fylogenetiske slektninger som søkes å skjelnes derfra.

297. Fremgangsmåte som angitt i krav 293 eller 294 eller 295 eller 296, karakterisert ved at den ytterligere omfatter trinnet med verifisering av nevnte probe ikke-kryssreaktivitet ved hybridisering av nevnte probe-oligonukleotid til ikke-virale organismer eller gruppe av ikke-virale organismer som man søker å skjelne ved hjelp av nevnte probe.

298. Fremgangsmåte for fremstilling av en probe for anvendelse i et kvalitativt eller kvantitativt hybridiseringsforsøk, karakterisert ved oppbygning av et oligonukleotid som er tilstrekkelig komplementært til å hybridisere et område av DNA eller rRNA valgt til å være unikt til en ikke-viral organisme eller gruppe av ikke-virale organismer som søkes påvist, idet nevnte område av DNA eller rRNA velges ved: sammenligning av en eller flere DNA eller rRNA-sekvenser av nevnte ikke-virale organisme eller gruppe av ikke-virale organismer som søkes påvist med en eller flere DNA eller rRNA-sekvenser fra dens nærmeste fylogenetiske slektninger; innretting av nevnte DNA eller rRNA-sekvenser fra nevnte ikke-virale organisme eller gruppe av ikke-virale organismer til homologier med nevnte DNA eller rRNA-sekvenser fra nevnte nærmeste fylogenetiske slektninger, for å åpenbare de interspecies hypervariable DNA eller rRNA-områder; utvelging av nevnte probe-oligonukleotid i nevnte interspecies hypervariable område ved vesentlig maksimalisering av homologien av nevnte probe-oligonukleotid til områdene av nevnte DNA eller rRNA fra nevnte ikke-virale organismer eller ikke-virale gruppe av organismer som søkes påvist, mens vesentlig minimalisering av homologien av nevnte probe-oligo-nukleotid til DNA eller rRNA-sekvenser fra nevnte nærmeste fylogentiske slektninger som man søker å skjelne derfra.

299. Fremgangsmåte som "angitt i krav 298, karakterisert ved at nevnte probe-oligonukleotid er minst omtrent 90% homolog til områdene i nevnte DNA eller rRNA fra nevnte ikke-virale organisme eller ikke-virale gruppe av organismer som søkes påvist.

300. Fremgangsmåte som angitt i krav 298, karakterisert ved at nevnte probe-oligonukleotid er mindre enn omtrent 90% homolog til DNA eller rRNA-sekvenser fra nevnte nærmeste fylogenetiske slektninger som man søker på skjelne derfra.

301. Fremgangsmåte som angitt i krav 298 eller 299 eller 300, karakterisert ved at den omfatter det ytterligere trinn med verifisering av nevnte probe ikke-kryssreaktivitet ved hybridisering av nevnte probe-oligonukleotid til ikke-virale organismer eller gruppe av ikke-virale organismer som man søker å skjelne ved nevnte probe.

302. Probe omfattende en nukleotidpolymer, karakterisert ved at den er i stand til å hybridisere til 16S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 60-100 i E. coli 16S rRNA.

303. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at det er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 302 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

304. Probe, karakterisert ved at den består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 16S-lignende rRNA frå en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 120-150 i E. coli 16S rRNA.

305. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 304 og en nukleinsyresekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

306. Probe, karakterisert ved at den består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 16S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 170-230 i E. coli 16S rRNA.

307. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 306 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

308. Probe, karakterisert ved at den består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 16S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 405-480 i E. coli 16S rRNA.

309. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 308 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

310. Probe, karakterisert ved at den består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 16S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 600-670 i E. coli 16S rRNA.

311. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 3,10 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

312. Probe, karakterisert ved at proben består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 16S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 820-860 i E. coli 16S rRNA.

313. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 312 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

314. Probe, karakterisert ved at den består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 16S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 980-1050 i E. coli 16S rRNA.

315. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 314 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

316. Probe, karakterisert ved at proben består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 16S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 1250-1290 i E. coli 16S rRNA.

317. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 316 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

318. Probe, karakterisert ved at proben består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 23S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 270-390 i E. coli 23S rRNA.

319. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 318 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

320. Probe, karakterisert ved at proben består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 23S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 535-560 i E. coli 23S rRNA.

321. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 320 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

322. Probe, karakterisert ved at proben består av en nukleotidpolymer som er i stand til å hybridisere til 23S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 1150-1200 i E. coli 23S rRNA.

323. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 322 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

3 24. Probe, karakterisert ved at proben består av en nukleotid-polymer som er i stand til å hybridisere til 23S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 1440-1600 i E. coli 23S rRNA.

325. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 324 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

326. Probe, karakterisert ved at proben består av en nukleotid-polymer som er i stand til å hybridisere til 23S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 1710-1750 i E. coli 23S rRNA.

327. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 326 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.

328. Probe, karakterisert ved at proben består av en nukleotidpolymer som er i stand til hybridisere til 23S-lignende rRNA fra en ikke-viral organisme eller gruppe av organismer i området tilsvarende til basene 2190-2330 i E. coli 23S rRNA.

329. Nukleinsyrehybrid, karakterisert ved at hybridet er dannet mellom en nukleotidpolymer som angitt i krav 328 og en nukleinsyre-sekvens som i alt vesentlig er komplementær dertil.