JPH07121240B2 - 細菌の薬剤感受性試験法 - Google Patents
細菌の薬剤感受性試験法Info
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- JPH07121240B2 JPH07121240B2 JP3288604A JP28860491A JPH07121240B2 JP H07121240 B2 JPH07121240 B2 JP H07121240B2 JP 3288604 A JP3288604 A JP 3288604A JP 28860491 A JP28860491 A JP 28860491A JP H07121240 B2 JPH07121240 B2 JP H07121240B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、病院等の施設で利用さ
れる細菌の薬剤感受性試験方法に関する。
れる細菌の薬剤感受性試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗生物質等の化学療法剤の発見は、医学
の世界に革命的な発展をもたらした。しかしペニシリン
の発見から半世紀を経た現在、臨床材料から分離される
細菌、家畜、養殖魚から分離される細菌の多くが多剤耐
性化し、菌の薬剤感受性を測定することなしに、化学療
法剤を使用することはほとんど不可能な状態になってい
る。
の世界に革命的な発展をもたらした。しかしペニシリン
の発見から半世紀を経た現在、臨床材料から分離される
細菌、家畜、養殖魚から分離される細菌の多くが多剤耐
性化し、菌の薬剤感受性を測定することなしに、化学療
法剤を使用することはほとんど不可能な状態になってい
る。
【０００３】ところで、薬剤感受性の測定には次の２つ
の大きな目的がある。 (1) 臨床細菌、家畜、水産関係で分離された細菌がある
薬剤に感受性であるか否かを決定し、その薬剤を、その
細菌が原因となっている疾病の治療、予防に使用できる
か否かを判断する。 (2) 病院、施設において分離された細菌の薬剤感受性、
耐性が測定されたデータを集積することにより、耐性菌
の疫学的な状況を明らかにする。広い範囲で集積された
データを用いて、種々の対策を立てることが可能にな
る。
の大きな目的がある。 (1) 臨床細菌、家畜、水産関係で分離された細菌がある
薬剤に感受性であるか否かを決定し、その薬剤を、その
細菌が原因となっている疾病の治療、予防に使用できる
か否かを判断する。 (2) 病院、施設において分離された細菌の薬剤感受性、
耐性が測定されたデータを集積することにより、耐性菌
の疫学的な状況を明らかにする。広い範囲で集積された
データを用いて、種々の対策を立てることが可能にな
る。
【０００４】薬剤感受性試験には現在大別して３つの方
法が用いられている。 (1) 寒天平板希釈法 ある決まった寒天培地に、薬剤の倍々希釈系列を加え、
この培地に被検細菌を接種し、その菌の発育を阻止する
薬剤の最小濃度（ＭＩＣ）を測定する。 (2) 液体培養法 ある決まった液体培地に、薬剤の倍々希釈系列を加え、
この培地に被検細菌を接種し、その菌の発育阻止のＭＩ
Ｃを測定する。 (3) ディスク法 被検細菌を寒天平板上に塗抹し、一定の濃度の薬剤を含
ませたディスクを置き、拡散した薬剤によって菌の発育
が阻止される円の直径を測定する。
法が用いられている。 (1) 寒天平板希釈法 ある決まった寒天培地に、薬剤の倍々希釈系列を加え、
この培地に被検細菌を接種し、その菌の発育を阻止する
薬剤の最小濃度（ＭＩＣ）を測定する。 (2) 液体培養法 ある決まった液体培地に、薬剤の倍々希釈系列を加え、
この培地に被検細菌を接種し、その菌の発育阻止のＭＩ
Ｃを測定する。 (3) ディスク法 被検細菌を寒天平板上に塗抹し、一定の濃度の薬剤を含
ませたディスクを置き、拡散した薬剤によって菌の発育
が阻止される円の直径を測定する。
【０００５】寒天平板希釈法は、薬剤のＭＩＣ値を正し
く測定するために最も多く使用されている方法で、現
在、新薬の評価等に国際的に用いられている。ディスク
法は簡便であるため、臨床検査で広く使用されている。
液体培養法は、現在あまり使用されていないが、検査業
務を自動化する手段として将来性のある方法である。病
院等での臨床微生物検査の主要な工程は以下の通りであ
る。 サンプル（患者標本等）（一部保存）→塗抹検査（菌の
有無を確認）→（増菌培養）→分離培養→確認培養→生
化学的性状検査・血清学的検査→→菌の同定 ↓ 薬剤感受性試験→投与薬剤の決定 これらの工程の中で、菌の同定に関しては最近 DNAプロ
ーブ法により検査時間の大幅な短縮が可能となってき
た。しかしながら、薬剤感受性試験については培養法に
基づいた方法によらねばならず、菌の分離工程が必須と
なっている。薬剤感受性試験のための DNAプローブの開
発も試みられているが、薬剤耐性遺伝子をターゲットと
したもので実用域には達していない。
く測定するために最も多く使用されている方法で、現
在、新薬の評価等に国際的に用いられている。ディスク
法は簡便であるため、臨床検査で広く使用されている。
液体培養法は、現在あまり使用されていないが、検査業
務を自動化する手段として将来性のある方法である。病
院等での臨床微生物検査の主要な工程は以下の通りであ
る。 サンプル（患者標本等）（一部保存）→塗抹検査（菌の
有無を確認）→（増菌培養）→分離培養→確認培養→生
化学的性状検査・血清学的検査→→菌の同定 ↓ 薬剤感受性試験→投与薬剤の決定 これらの工程の中で、菌の同定に関しては最近 DNAプロ
ーブ法により検査時間の大幅な短縮が可能となってき
た。しかしながら、薬剤感受性試験については培養法に
基づいた方法によらねばならず、菌の分離工程が必須と
なっている。薬剤感受性試験のための DNAプローブの開
発も試みられているが、薬剤耐性遺伝子をターゲットと
したもので実用域には達していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特定
の薬剤に対する特定の細菌の感受性試験を短期間で行う
方法を提供することである。本発明の他の目的は、特定
の薬剤に対する特定の細菌の感受性試験を、該特定の細
菌以外の細菌が混在している状況下においても細菌の分
離をすることなく行うことができる方法を提供すること
である。
の薬剤に対する特定の細菌の感受性試験を短期間で行う
方法を提供することである。本発明の他の目的は、特定
の薬剤に対する特定の細菌の感受性試験を、該特定の細
菌以外の細菌が混在している状況下においても細菌の分
離をすることなく行うことができる方法を提供すること
である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、特定の
薬剤を含有する培地に、被検細菌又は該被検細菌と他の
細菌の混合物を接種し、培養後、該被検細菌のrRNA の
特異的配列に相補するDNAをプローブとして用いてrRNA-
DNAハイブリダイゼーションを行い、該被検細菌の増殖
菌量を測定することにより達成される。
薬剤を含有する培地に、被検細菌又は該被検細菌と他の
細菌の混合物を接種し、培養後、該被検細菌のrRNA の
特異的配列に相補するDNAをプローブとして用いてrRNA-
DNAハイブリダイゼーションを行い、該被検細菌の増殖
菌量を測定することにより達成される。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。リボゾー
ムＲＮＡ（rRNA）は生物が生存する上で必須の細胞構成
成分であり、細菌におけるrRNAは、５Ｓ、１６Ｓ及び２
３Ｓの３種類から構成されている。その構造（塩基配
列）は生物の進化の過程において比較的よく保存されて
いる。たとえば大腸菌と枯草菌のrRNAを比較した場合、
７０〜８０％の相同性がある。rRNAの中でも 16S rRNA
については、比較的よく研究がなされており、多くの生
物種においてその塩基配列が同定されている。更に、２
３Ｓについても最近研究が進み、配列が同定された種も
増えてきている。５Ｓも同様であるが、菌種間の差（可
変領域）を特定するのはやや困難である。このようにrR
NA には種々の生物で共通に保存されている領域以外に
生物種によって構造が異なる可変領域の存在が知られて
おり、この領域に対応する DNAプローブを用いてハイブ
リダイゼーション法により細菌の検出・同定を行う方法
が近年開発されてきた。rRNAは細胞当たり１０4 個以上
存在し、ハイブリダイゼーション法のターゲットとして
は感度の面からも有効である。この rRNA-DNA ハイブリ
ダイゼーション法は言い換えれば特定細菌のrRNA数を高
感度で検出する方法である。
ムＲＮＡ（rRNA）は生物が生存する上で必須の細胞構成
成分であり、細菌におけるrRNAは、５Ｓ、１６Ｓ及び２
３Ｓの３種類から構成されている。その構造（塩基配
列）は生物の進化の過程において比較的よく保存されて
いる。たとえば大腸菌と枯草菌のrRNAを比較した場合、
７０〜８０％の相同性がある。rRNAの中でも 16S rRNA
については、比較的よく研究がなされており、多くの生
物種においてその塩基配列が同定されている。更に、２
３Ｓについても最近研究が進み、配列が同定された種も
増えてきている。５Ｓも同様であるが、菌種間の差（可
変領域）を特定するのはやや困難である。このようにrR
NA には種々の生物で共通に保存されている領域以外に
生物種によって構造が異なる可変領域の存在が知られて
おり、この領域に対応する DNAプローブを用いてハイブ
リダイゼーション法により細菌の検出・同定を行う方法
が近年開発されてきた。rRNAは細胞当たり１０4 個以上
存在し、ハイブリダイゼーション法のターゲットとして
は感度の面からも有効である。この rRNA-DNA ハイブリ
ダイゼーション法は言い換えれば特定細菌のrRNA数を高
感度で検出する方法である。
【０００９】rRNAは生命を維持する上で重要な役割を担
っている。従って、その数は生存状態を敏感に反映す
る。本発明は、このようなrRNAの性質を応用したもので
ある。即ち、薬剤に感受性がある菌は、薬剤の存在によ
り生存あるいは増殖できなくなるため、その菌のrRNA数
は減少するかあるいは変化しない。一方、薬剤に対し耐
性を有する菌は、薬剤の有無に関わらず増殖するため、
rRNA数は増加する。これらの状態を、 rRNA-DNA ハイブ
リダイゼーション法により、簡便、迅速、且つ特異的に
検出することにより、菌の分離・同定を行うことなく、
被検細菌の薬剤感受性を簡便、迅速に試験することがで
きる。
っている。従って、その数は生存状態を敏感に反映す
る。本発明は、このようなrRNAの性質を応用したもので
ある。即ち、薬剤に感受性がある菌は、薬剤の存在によ
り生存あるいは増殖できなくなるため、その菌のrRNA数
は減少するかあるいは変化しない。一方、薬剤に対し耐
性を有する菌は、薬剤の有無に関わらず増殖するため、
rRNA数は増加する。これらの状態を、 rRNA-DNA ハイブ
リダイゼーション法により、簡便、迅速、且つ特異的に
検出することにより、菌の分離・同定を行うことなく、
被検細菌の薬剤感受性を簡便、迅速に試験することがで
きる。
【００１０】次に、本発明のrRNA-DNAハイブリダイゼー
ションを利用した薬剤感受性試験を適用することができ
る菌種の例及び、その試験に使用されるプローブ、すな
わちその菌のrRNAの特異的配列に相補するＤＮＡの塩基
配列の例を示すが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。１６ＳrRNAに相補するDNA の例 マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyop
neumoniae) 豚流行性肺炎原因菌 CTTGGTGAAG CTTGAAGGCT CCTTTGAATA（配列番号１） マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumonia
e) ヒトマイコプラズマ性肺炎原因菌（特願昭61-151849
号、J.Gen.Microbiol.,133, 1968 −1974(1987),Gobel,
U.B. et al.） CTCTAGCCAT TACCTGCTAA （配列番号２） プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris) 土壌細菌、腐敗物から大量に検出される細菌（FEMS Mic
robiol. Let., 43, 187-193(1987),Gobel,U.B. et al.) CCCCTGCTTT GGTCCGTAGA CGTC（配列番号３） アエロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida) 人の胃腸炎に関与していると考えられている細菌 (BIO/
TECHNOLOGY, 8, 233-236(1990)，Gannon,F. et al.) CCGTATCTCT ACAGGATTCC （配列番号４） ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchisep
tica) 豚萎縮性鼻炎原因菌 AGGCCGAAGC CCGTGCTGCC G （配列番号５） CTCCCTCTGA CACACTCTAG CCCGGTAGTT AAAA （配列番号
６） GCACTCCCAA ATCTCTTCGG GATT （配列番号７） 大腸菌 TCGTCAGCAA AGAAGCAAGC TTCTTCCTG （配列番号８）２３ＳrRNAに相補するDNA の例 大腸菌（２３Ｓ rRNA遺伝子 ＃132-148 に相補する配
列） AGTGTGTCGA AACACAC（配列番号９） 緑膿菌（２３Ｓ rRNA遺伝子 ＃132-148 に相補する配
列） ACCTAGGTTA TCCTAGG（配列番号１０） 本発明の薬剤感受性試験は、例えば次の２ステップの手
順で行うことができる。 １）薬剤含有培地を用いた被検細菌の培養 試料を、特定の薬剤をＭＩＣ上限あるいは治療上効果が
期待できる濃度で含有する液体培地に加え検体とする。
薬剤を含まない培地にも同様に試料を加え対照とする。
これより約0.５mlをサンプリングし、直ちに等容の２０
％Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを加え−２０℃で保存
する。次いで、適当な温度で培養を行う。培養時間は、
測定する菌種により異なるが、通常の細菌では４〜５時
間程度、マイコプラズマ等のように増殖が遅いものでも
１８時間程度でよい。また、使用する培地は個々の菌に
適した選択培地あるいは通常の薬剤感受性試験用の液体
培地を用いる。 ２）rRNA-DNAハイブリダイゼーション法による被検細菌
量の測定 培養開始前及び培養終了時の検体と対照について、それ
ぞれ約0.５mlをとり、直ちに等容の２０％Ｎ−アセチル
−Ｌ−システインを加え固定菌液とする。菌量に応じて
適宜１０％Ｎ−アセチル−Ｌ−システインで希釈し、ド
ットブロット作製装置にてナイロン膜上に各固定菌液を
スポットする。ここですべてのサンプルは同じ希釈率で
あることが望ましい。ナイロン膜を８０℃、１時間乾燥
させた後、プレハイブリダイゼーション、32Ｐ標識をし
たプローブを用いたハイブリダイゼーション、洗浄を行
う。次いで、ナイロン膜上のスポットを切り取り、液体
シンチレーションカウンターで放射能カウントを測定す
る。これにより増殖菌量を知ることができる。培養によ
る菌の増殖が、対照に比較して検体が少ない場合には、
当該薬剤に感受性ありと判定することができ、一方、両
方の値が近似の場合には、当該薬剤に対して耐性あるい
は当該薬剤による治療上の効果は期待できないと判定す
ることができる。ハイブリダイゼーションのすべての操
作は、約４時間で終了する。
ションを利用した薬剤感受性試験を適用することができ
る菌種の例及び、その試験に使用されるプローブ、すな
わちその菌のrRNAの特異的配列に相補するＤＮＡの塩基
配列の例を示すが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。１６ＳrRNAに相補するDNA の例 マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyop
neumoniae) 豚流行性肺炎原因菌 CTTGGTGAAG CTTGAAGGCT CCTTTGAATA（配列番号１） マイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumonia
e) ヒトマイコプラズマ性肺炎原因菌（特願昭61-151849
号、J.Gen.Microbiol.,133, 1968 −1974(1987),Gobel,
U.B. et al.） CTCTAGCCAT TACCTGCTAA （配列番号２） プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris) 土壌細菌、腐敗物から大量に検出される細菌（FEMS Mic
robiol. Let., 43, 187-193(1987),Gobel,U.B. et al.) CCCCTGCTTT GGTCCGTAGA CGTC（配列番号３） アエロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida) 人の胃腸炎に関与していると考えられている細菌 (BIO/
TECHNOLOGY, 8, 233-236(1990)，Gannon,F. et al.) CCGTATCTCT ACAGGATTCC （配列番号４） ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchisep
tica) 豚萎縮性鼻炎原因菌 AGGCCGAAGC CCGTGCTGCC G （配列番号５） CTCCCTCTGA CACACTCTAG CCCGGTAGTT AAAA （配列番号
６） GCACTCCCAA ATCTCTTCGG GATT （配列番号７） 大腸菌 TCGTCAGCAA AGAAGCAAGC TTCTTCCTG （配列番号８）２３ＳrRNAに相補するDNA の例 大腸菌（２３Ｓ rRNA遺伝子 ＃132-148 に相補する配
列） AGTGTGTCGA AACACAC（配列番号９） 緑膿菌（２３Ｓ rRNA遺伝子 ＃132-148 に相補する配
列） ACCTAGGTTA TCCTAGG（配列番号１０） 本発明の薬剤感受性試験は、例えば次の２ステップの手
順で行うことができる。 １）薬剤含有培地を用いた被検細菌の培養 試料を、特定の薬剤をＭＩＣ上限あるいは治療上効果が
期待できる濃度で含有する液体培地に加え検体とする。
薬剤を含まない培地にも同様に試料を加え対照とする。
これより約0.５mlをサンプリングし、直ちに等容の２０
％Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを加え−２０℃で保存
する。次いで、適当な温度で培養を行う。培養時間は、
測定する菌種により異なるが、通常の細菌では４〜５時
間程度、マイコプラズマ等のように増殖が遅いものでも
１８時間程度でよい。また、使用する培地は個々の菌に
適した選択培地あるいは通常の薬剤感受性試験用の液体
培地を用いる。 ２）rRNA-DNAハイブリダイゼーション法による被検細菌
量の測定 培養開始前及び培養終了時の検体と対照について、それ
ぞれ約0.５mlをとり、直ちに等容の２０％Ｎ−アセチル
−Ｌ−システインを加え固定菌液とする。菌量に応じて
適宜１０％Ｎ−アセチル−Ｌ−システインで希釈し、ド
ットブロット作製装置にてナイロン膜上に各固定菌液を
スポットする。ここですべてのサンプルは同じ希釈率で
あることが望ましい。ナイロン膜を８０℃、１時間乾燥
させた後、プレハイブリダイゼーション、32Ｐ標識をし
たプローブを用いたハイブリダイゼーション、洗浄を行
う。次いで、ナイロン膜上のスポットを切り取り、液体
シンチレーションカウンターで放射能カウントを測定す
る。これにより増殖菌量を知ることができる。培養によ
る菌の増殖が、対照に比較して検体が少ない場合には、
当該薬剤に感受性ありと判定することができ、一方、両
方の値が近似の場合には、当該薬剤に対して耐性あるい
は当該薬剤による治療上の効果は期待できないと判定す
ることができる。ハイブリダイゼーションのすべての操
作は、約４時間で終了する。
【００１１】豚流行性肺炎原因菌マイコプラズマ・ハイ
オニューモニエは、細菌の中でも最も生育速度の遅いも
ののひとつで、分離・同定には１カ月程度を要する。そ
れゆえ、現状では薬剤感受性試験は行われていない。本
発明によれば、このような菌の薬剤感受性試験も２４時
間以内に行うことが可能である。 実施例１ １６Ｓ rRNA/DNA ハイブリダイゼーションを
用いたマイコプラズマ・ハイオニューモニエの薬剤感受
性試験 １）他の細菌混在下における薬剤含有培地でのマイコプ
ラズマ・ハイオニューモニエの培養 マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（ATCC 25934）及
び他の細菌として緑膿菌 (ATCC 9721)を BHL培地にそれ
ぞれ約１０7 菌体／mlになるように混合し、その５０μ
l を各種薬剤を1.75μg ／ml含有する同培地５mlに接種
した。その約0.５mlを採取し、0.５mlの２０％Ｎ−アセ
チル−Ｌ−システイン溶液を加え−２０℃で保存した。
対照としては、薬剤を含有しない BHL培地に同量の菌液
を接種したものを用いた。
オニューモニエは、細菌の中でも最も生育速度の遅いも
ののひとつで、分離・同定には１カ月程度を要する。そ
れゆえ、現状では薬剤感受性試験は行われていない。本
発明によれば、このような菌の薬剤感受性試験も２４時
間以内に行うことが可能である。 実施例１ １６Ｓ rRNA/DNA ハイブリダイゼーションを
用いたマイコプラズマ・ハイオニューモニエの薬剤感受
性試験 １）他の細菌混在下における薬剤含有培地でのマイコプ
ラズマ・ハイオニューモニエの培養 マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（ATCC 25934）及
び他の細菌として緑膿菌 (ATCC 9721)を BHL培地にそれ
ぞれ約１０7 菌体／mlになるように混合し、その５０μ
l を各種薬剤を1.75μg ／ml含有する同培地５mlに接種
した。その約0.５mlを採取し、0.５mlの２０％Ｎ−アセ
チル−Ｌ−システイン溶液を加え−２０℃で保存した。
対照としては、薬剤を含有しない BHL培地に同量の菌液
を接種したものを用いた。
【００１２】薬剤としては、キタサマイシン、チアムリ
ン、酒石酸タイロシンを使用した。本試験に使用したマ
イコプラズマ・ハイオニューモニエはこれらの薬剤につ
いては感受性を示し、緑膿菌はいずれの薬剤に対しても
耐性を有していることを、通常の薬剤感受性試験法で確
認しておいた。３７℃で培養を行い、１８時間、３６時
間後に0.５mlづつ培養液を採取し、0.５mlの２０％Ｎ−
アセチル−Ｌ−システイン溶液を加え、rRNA-DNAハイブ
リダイゼーション法による検出試験に供した。 ２）rRNA-DNAハイブリダイゼーション法によるマイコプ
ラズマ・ハイオニューモニエ菌量の測定 プローブとしては、下記の塩基配列を有する DNAを DNA
合成機（アプライド・バイオシステムズ社、モデル391E
P)にて合成し、５′末端をＴ４ポリヌクレオチド・キナ
ーゼで32Ｐ標識し使用した。
ン、酒石酸タイロシンを使用した。本試験に使用したマ
イコプラズマ・ハイオニューモニエはこれらの薬剤につ
いては感受性を示し、緑膿菌はいずれの薬剤に対しても
耐性を有していることを、通常の薬剤感受性試験法で確
認しておいた。３７℃で培養を行い、１８時間、３６時
間後に0.５mlづつ培養液を採取し、0.５mlの２０％Ｎ−
アセチル−Ｌ−システイン溶液を加え、rRNA-DNAハイブ
リダイゼーション法による検出試験に供した。 ２）rRNA-DNAハイブリダイゼーション法によるマイコプ
ラズマ・ハイオニューモニエ菌量の測定 プローブとしては、下記の塩基配列を有する DNAを DNA
合成機（アプライド・バイオシステムズ社、モデル391E
P)にて合成し、５′末端をＴ４ポリヌクレオチド・キナ
ーゼで32Ｐ標識し使用した。
【００１３】CTTGG TGAAG CTTGA AGGCT CCTTTGAATA
（配列番号１） 被検培養液及び対照培養液を１０％Ｎ−アセチル−Ｌ−
システイン溶液で１０倍に希釈し、そのおのおの５０μ
ｌをドットブロット作製装置（アドバンテック東洋社、
DP48) に供し、ナイロン膜（Ｓ＆Ｓ社、ナイトラン13N)
上にスポットした。このナイロン膜を８０℃、１時間乾
燥後、６０℃のプレハイブリダイゼーション溶液（ 5xS
SC−5xDenhaldt's solution-0.2 ％ SDS-100μg/ml Yea
st tRNA)に３０分間浸漬した。続いて６０℃のハイブリ
ダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液
に2x106 c.p.m.／mlの32Ｐ標識プローブを加えたもの）
に１時間浸漬した。６０℃の 5xSSC−0.２％ SDSで２分
間ずつ３回洗浄し、風乾後、ナイロン膜上のスポットを
切り取り、液体シンチレーション・カウンターを用いて
放射能カウントを測定した。結果を図１に示す。
（配列番号１） 被検培養液及び対照培養液を１０％Ｎ−アセチル−Ｌ−
システイン溶液で１０倍に希釈し、そのおのおの５０μ
ｌをドットブロット作製装置（アドバンテック東洋社、
DP48) に供し、ナイロン膜（Ｓ＆Ｓ社、ナイトラン13N)
上にスポットした。このナイロン膜を８０℃、１時間乾
燥後、６０℃のプレハイブリダイゼーション溶液（ 5xS
SC−5xDenhaldt's solution-0.2 ％ SDS-100μg/ml Yea
st tRNA)に３０分間浸漬した。続いて６０℃のハイブリ
ダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液
に2x106 c.p.m.／mlの32Ｐ標識プローブを加えたもの）
に１時間浸漬した。６０℃の 5xSSC−0.２％ SDSで２分
間ずつ３回洗浄し、風乾後、ナイロン膜上のスポットを
切り取り、液体シンチレーション・カウンターを用いて
放射能カウントを測定した。結果を図１に示す。
【００１４】図１から、培養１８時間後において、抗生
物質含有培地におけるマイコプラズマ・ハイオニューモ
ニエの増殖が顕著に抑制されていること、すなわちマイ
コプラズマ・ハイオニューモニエがこれらの抗生物質に
対して感受性であることがわかる。緑膿菌の増殖速度は
速く、１８時間以内に定常期まで達するが、マイコプラ
ズマ・ハイオニューモニエでは最適の培養条件でも定常
期に達するまでに３日以上かかる。本発明方法によれ
ば、この両者が混合された極端な条件下でも、対照との
比較により２４時間以内に薬剤感受性試験が可能である
ことがわかる。実施例２ １６Ｓ rRNA/DNA ハイブリダ
イゼーションを用いた大腸菌の薬剤感受 性試験 １）他の細菌混在下における薬剤含有培地での大腸菌の
培養 大腸菌NIHJ株、ZF2191株、ボルデテラ・ブロンキセプチ
カMAKABE3-1 株をオキシテトラサイクリン50μg / mlを
含むBacto Antibiotic mediun No. ３(Difco社製）５ml
にそれぞれ１０5 菌体／mlになるように下記の組合せで
接種した。
物質含有培地におけるマイコプラズマ・ハイオニューモ
ニエの増殖が顕著に抑制されていること、すなわちマイ
コプラズマ・ハイオニューモニエがこれらの抗生物質に
対して感受性であることがわかる。緑膿菌の増殖速度は
速く、１８時間以内に定常期まで達するが、マイコプラ
ズマ・ハイオニューモニエでは最適の培養条件でも定常
期に達するまでに３日以上かかる。本発明方法によれ
ば、この両者が混合された極端な条件下でも、対照との
比較により２４時間以内に薬剤感受性試験が可能である
ことがわかる。実施例２ １６Ｓ rRNA/DNA ハイブリダ
イゼーションを用いた大腸菌の薬剤感受 性試験 １）他の細菌混在下における薬剤含有培地での大腸菌の
培養 大腸菌NIHJ株、ZF2191株、ボルデテラ・ブロンキセプチ
カMAKABE3-1 株をオキシテトラサイクリン50μg / mlを
含むBacto Antibiotic mediun No. ３(Difco社製）５ml
にそれぞれ１０5 菌体／mlになるように下記の組合せで
接種した。
【００１５】(A) 大腸菌NIHJ株のみ (B) 大腸菌ZF2191株のみ (C) 大腸菌NIHJ株＋大腸菌ZF2191株 (D) 大腸菌NIHJ株＋ボルデテラ・ブロンキセプチカMAKA
BE3-1 株 対照としては、薬剤を含有しない同培地に大腸菌NIHJ株
を同量接種したものを用いた。
BE3-1 株 対照としては、薬剤を含有しない同培地に大腸菌NIHJ株
を同量接種したものを用いた。
【００１６】大腸菌NIHJ株は、オキシテトラサイクリン
に感受性を示し、大腸菌ZF2191株及びボルデテラ・ブロ
ンキセプチカMAKABE3-1 株は耐性を有している。それぞ
れの培養液から、接種直後、４時間後、８時間後にその
0.５mlを採取し、0.５mlの２０％Ｎ−アセチル−Ｌ−シ
ステイン溶液を加えて−２０℃で保存した。保存試料
を、１６Ｓ検出用プローブを用いたrRNA-DNAハイブリダ
イゼーション法による検出試験に供した。 ２）rRNA-DNAハイブリダイゼーション法による菌量の測
定 １６Ｓ検出用プローブとしては、下記の塩基配列を有す
る DNAを DNA合成機（アプライド・バイオシステムズ
社、モデル391EP)にて合成し、５′末端をＴ４ポリヌク
レオチド・キナーゼで32Ｐ標識し使用した。
に感受性を示し、大腸菌ZF2191株及びボルデテラ・ブロ
ンキセプチカMAKABE3-1 株は耐性を有している。それぞ
れの培養液から、接種直後、４時間後、８時間後にその
0.５mlを採取し、0.５mlの２０％Ｎ−アセチル−Ｌ−シ
ステイン溶液を加えて−２０℃で保存した。保存試料
を、１６Ｓ検出用プローブを用いたrRNA-DNAハイブリダ
イゼーション法による検出試験に供した。 ２）rRNA-DNAハイブリダイゼーション法による菌量の測
定 １６Ｓ検出用プローブとしては、下記の塩基配列を有す
る DNAを DNA合成機（アプライド・バイオシステムズ
社、モデル391EP)にて合成し、５′末端をＴ４ポリヌク
レオチド・キナーゼで32Ｐ標識し使用した。
【００１７】TCGTCAGCAA AGAAGCAAGC TTCTTCCTG （配列
番号８） 被検培養液及び対照培養液を１０％Ｎ−アセチル−Ｌ−
システイン溶液で５倍に希釈し、そのおのおの１００μ
ｌをドットブロット作製装置（アドバンテック東洋社、
DP48) に供し、ナイロン膜（Ｓ＆Ｓ社、ナイトラン13N)
上にスポットした。このナイロン膜を８０℃、１時間乾
燥後、６０℃のプレハイブリダイゼーション溶液（ 5xS
SC−5xDenhaldt's solution-0.2 ％ SDS-100μg/ml Yea
st tRNA)に３０分間浸漬した。続いて６０℃のハイブリ
ダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液
に2x106 c.p.m.／mlの32Ｐ標識プローブを加えたもの）
に１時間浸漬した。６０℃の 5xSSC−0.２％ SDSで２分
間ずつ３回洗浄し、風乾後、ナイロン膜上のスポットを
切り取り、液体シンチレーション・カウンターを用いて
放射能カウントを測定した。結果を図２に示す。
番号８） 被検培養液及び対照培養液を１０％Ｎ−アセチル−Ｌ−
システイン溶液で５倍に希釈し、そのおのおの１００μ
ｌをドットブロット作製装置（アドバンテック東洋社、
DP48) に供し、ナイロン膜（Ｓ＆Ｓ社、ナイトラン13N)
上にスポットした。このナイロン膜を８０℃、１時間乾
燥後、６０℃のプレハイブリダイゼーション溶液（ 5xS
SC−5xDenhaldt's solution-0.2 ％ SDS-100μg/ml Yea
st tRNA)に３０分間浸漬した。続いて６０℃のハイブリ
ダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液
に2x106 c.p.m.／mlの32Ｐ標識プローブを加えたもの）
に１時間浸漬した。６０℃の 5xSSC−0.２％ SDSで２分
間ずつ３回洗浄し、風乾後、ナイロン膜上のスポットを
切り取り、液体シンチレーション・カウンターを用いて
放射能カウントを測定した。結果を図２に示す。
【００１８】オキシテトラサイクリンに耐性のある大腸
菌ZF2191株を含む培養液からのみ放射能カウントが検出
された。培養開始後、４時間で有意な差が認められた。
また、ボルデテラ・ブロンキセプチカMAKABE3-1 株はオ
キシテトラサイクリン耐性を有しているが、大腸菌では
ないため検出されなかった。これらの結果から、本発明
の方法によれば、薬剤耐性試験と菌の同定ステップを同
時に行うことが可能であることがわかる。 実施例３ ２３ＳrRNA/DNAハイブリダイゼーションを用
いた薬剤感受性試験 使用菌株：Pseudomonas aeruginosa ATCC9721 本菌に対する薬剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は以下
の通り。
菌ZF2191株を含む培養液からのみ放射能カウントが検出
された。培養開始後、４時間で有意な差が認められた。
また、ボルデテラ・ブロンキセプチカMAKABE3-1 株はオ
キシテトラサイクリン耐性を有しているが、大腸菌では
ないため検出されなかった。これらの結果から、本発明
の方法によれば、薬剤耐性試験と菌の同定ステップを同
時に行うことが可能であることがわかる。 実施例３ ２３ＳrRNA/DNAハイブリダイゼーションを用
いた薬剤感受性試験 使用菌株：Pseudomonas aeruginosa ATCC9721 本菌に対する薬剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は以下
の通り。
【００１９】 アンピシリン（ＡＰ） ＞100 μｇ／ml オキシテトラサイクリン（ＯＴＣ） 25 μｇ／ml ゲンタマンシン（ＧＭ） 6.3 μｇ／ml コリスチン（ＣＬ） 3.2 μｇ／ml 使用プローブ：P. aeruginosa 23S rRNA遺伝子 ＃132-
148 に相補する合成ＤＮＡ ACCTA GGTTA TCCTA GG （配列番号１０） P. aeruginosa ATCC9721株 103細胞を上記４種の抗生物
質を含む薬剤感受性測定用ブイヨン２mlに接種し、３２
℃で培養した。０、２、１８時間後に培養液の２００μ
ｌを採取し、等容の２０％Ｎ−アセチル−Ｌ−システイ
ンを加え、−20℃で保存した。
148 に相補する合成ＤＮＡ ACCTA GGTTA TCCTA GG （配列番号１０） P. aeruginosa ATCC9721株 103細胞を上記４種の抗生物
質を含む薬剤感受性測定用ブイヨン２mlに接種し、３２
℃で培養した。０、２、１８時間後に培養液の２００μ
ｌを採取し、等容の２０％Ｎ−アセチル−Ｌ−システイ
ンを加え、−20℃で保存した。
【００２０】この検体について、上記プローブを用いた
ハイブリダイゼーションによる検出試験を行った。ハイ
ブリダイゼーションは５０℃で他の実施例と同様の方法
により行った。結果を表１に示す。 表１ ────────────────────────────────── 放射能カウント（cpm) ０時間 ２時間 18時間 ────────────────────────────────── 対照（薬剤なし） 12 50 2843 AP 100 μg/ml 9 69 2268 AP 50 μg/ml 3 41 2619 AP 5 μg/ml 10 28 2674 OTC 100 μg/ml 2 7 46 OTC 50 μg/ml 3 5 39 OTC 5 μg/ml 11 25 365 GM 100 μg/ml 13 2 1 GM 50 μg/ml 4 7 26 GM 5 μg/ml 4 5 26 CL 100 μg/ml 8 5 0 CL 50 μg/ml 12 0 0 CL 5 μg/ml 10 4 13 ────────────────────────────────── 表１は、培養１８時間で採取したサンプルからはもちろ
んのこと、培養２時間で採取したサンプルからも、本菌
がアンピシリン耐性を有していることを確認できること
を示している。また、本菌に対するGM、CLの増殖抑制効
果が高いこともわかる。 実施例４ ２３Ｓ rRNA/DNA ハイブリダイゼーションを
用いた大腸菌及び緑膿菌の薬剤感受性試験 １）他の細菌存在下における薬剤含有培地での大腸菌及
び緑膿菌の培養 大腸菌 JM109株（プラスミドpUC118を含む。アンピシリ
ン耐性）、NIHJ株（アンピシリン感受性）、及び緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa ATCC9721株、アンピシリン
耐性）を、アンピシリン １００μｇ／mlを含むBacto
Antibiotic medium No.3（Difco 社製）５mlにそれぞれ
１０3 菌体／mlになるように下記の組合せで接種した。
ハイブリダイゼーションによる検出試験を行った。ハイ
ブリダイゼーションは５０℃で他の実施例と同様の方法
により行った。結果を表１に示す。 表１ ────────────────────────────────── 放射能カウント（cpm) ０時間 ２時間 18時間 ────────────────────────────────── 対照（薬剤なし） 12 50 2843 AP 100 μg/ml 9 69 2268 AP 50 μg/ml 3 41 2619 AP 5 μg/ml 10 28 2674 OTC 100 μg/ml 2 7 46 OTC 50 μg/ml 3 5 39 OTC 5 μg/ml 11 25 365 GM 100 μg/ml 13 2 1 GM 50 μg/ml 4 7 26 GM 5 μg/ml 4 5 26 CL 100 μg/ml 8 5 0 CL 50 μg/ml 12 0 0 CL 5 μg/ml 10 4 13 ────────────────────────────────── 表１は、培養１８時間で採取したサンプルからはもちろ
んのこと、培養２時間で採取したサンプルからも、本菌
がアンピシリン耐性を有していることを確認できること
を示している。また、本菌に対するGM、CLの増殖抑制効
果が高いこともわかる。 実施例４ ２３Ｓ rRNA/DNA ハイブリダイゼーションを
用いた大腸菌及び緑膿菌の薬剤感受性試験 １）他の細菌存在下における薬剤含有培地での大腸菌及
び緑膿菌の培養 大腸菌 JM109株（プラスミドpUC118を含む。アンピシリ
ン耐性）、NIHJ株（アンピシリン感受性）、及び緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa ATCC9721株、アンピシリン
耐性）を、アンピシリン １００μｇ／mlを含むBacto
Antibiotic medium No.3（Difco 社製）５mlにそれぞれ
１０3 菌体／mlになるように下記の組合せで接種した。
【００２１】(A)大腸菌NIHJ株のみ (B)大腸菌JM109 株のみ (C)緑膿菌ATCC9721株のみ (D)大腸菌NIHJ株＋緑膿菌ATCC9721株 (E)大腸菌JM109 株＋緑膿菌ATCC9721株 対照としては、薬剤を含有しない同培地に大腸菌NIHJ
株、及び緑膿菌ATCC9721株を同量接種したものを用い
た。
株、及び緑膿菌ATCC9721株を同量接種したものを用い
た。
【００２２】それぞれの培養液から、接種直後、２時間
後、１８時間後にその0.5 mlを採取し、0.5 mlの２０％
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン溶液を加えて−２０℃で
保存した。保存試料を、２３Ｓ検出用プローブを用いた
rRNA-DNAハイブリダイゼーション法による検出試験に供
した。 ２）rRNA-DNAハイブリダイゼーション法による菌の検出 大腸菌、緑膿菌それぞれの２３Ｓ検出用プローブとして
は、下記の塩基配列を有するDNA を、DNA 合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ社、モデル391EP ）にて合成
し、５′末端をＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼで32Ｐ
標識したものを使用した。 大腸菌検出用：AGTGTGTCGA AACACAC（大腸菌２３ＳrRNA
遺伝子 ＃132-148 に相補する配列）（配列番号９） 緑膿菌検出用：ACCTAGGTTA TCCTAGG（緑膿菌２３ＳrRNA
遺伝子 ＃132-148 に相補する配列)（配列番号１０） Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン溶液を加えた被検培養液
及び対照培養液１００μｌをドットブロット作製装置
（アドバンテック東洋社、ＤＰ４８）に供し、ナイロン
膜（Ｓ＆Ｓ社、ナイトラン１３Ｎ）上にスポットした。
後、１８時間後にその0.5 mlを採取し、0.5 mlの２０％
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン溶液を加えて−２０℃で
保存した。保存試料を、２３Ｓ検出用プローブを用いた
rRNA-DNAハイブリダイゼーション法による検出試験に供
した。 ２）rRNA-DNAハイブリダイゼーション法による菌の検出 大腸菌、緑膿菌それぞれの２３Ｓ検出用プローブとして
は、下記の塩基配列を有するDNA を、DNA 合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ社、モデル391EP ）にて合成
し、５′末端をＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼで32Ｐ
標識したものを使用した。 大腸菌検出用：AGTGTGTCGA AACACAC（大腸菌２３ＳrRNA
遺伝子 ＃132-148 に相補する配列）（配列番号９） 緑膿菌検出用：ACCTAGGTTA TCCTAGG（緑膿菌２３ＳrRNA
遺伝子 ＃132-148 に相補する配列)（配列番号１０） Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン溶液を加えた被検培養液
及び対照培養液１００μｌをドットブロット作製装置
（アドバンテック東洋社、ＤＰ４８）に供し、ナイロン
膜（Ｓ＆Ｓ社、ナイトラン１３Ｎ）上にスポットした。
【００２３】このナイロン膜を８０℃、１時間乾燥後、
５０℃のプレハイブリダイゼーション溶液（5xSSC-5xDe
nhaldt's solution-0.2 ％SDS-100 μｇ／ml Yeast tRN
A)に３０分浸漬した。続いて５０℃のハイブリダイゼー
ション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液に2x106
c.p.m./ml の32Ｐ標識プローブを加えたもの）に１時間
浸漬した。５０℃の5xSSC-0.2 ％SDS 溶液で２分間ずつ
３回洗浄し、風乾後、ナイロン膜のスポットを切り取
り、液体シンチレーション・カウンターを用いて放射能
カウントを測定した。結果を表２及び表３に示す。
５０℃のプレハイブリダイゼーション溶液（5xSSC-5xDe
nhaldt's solution-0.2 ％SDS-100 μｇ／ml Yeast tRN
A)に３０分浸漬した。続いて５０℃のハイブリダイゼー
ション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液に2x106
c.p.m./ml の32Ｐ標識プローブを加えたもの）に１時間
浸漬した。５０℃の5xSSC-0.2 ％SDS 溶液で２分間ずつ
３回洗浄し、風乾後、ナイロン膜のスポットを切り取
り、液体シンチレーション・カウンターを用いて放射能
カウントを測定した。結果を表２及び表３に示す。
【００２４】 表２ 大腸菌検出用プローブ ────────────────────────────────── 放射能カウント（cpm) ０時間 ２時間 18時間 ────────────────────────────────── 対照（薬剤なし） 10 55 3321 大腸菌NIHJ株 6 11 13 大腸菌JM109 株 9 52 2721 緑膿菌ATCC9721株 4 2 6 大腸菌NIHJ株＋緑膿菌ATCC9721株 11 7 38 大腸菌JM109 株＋緑膿菌ATCC9721株 13 49 2551 ────────────────────────────────── 表２は、培養１８時間で採取したサンプルからはもちろ
んのこと、培養２時間で採取したサンプルからも、大腸
菌JM109 株がアンピシリン耐性を有していることを確認
できることを示している。
んのこと、培養２時間で採取したサンプルからも、大腸
菌JM109 株がアンピシリン耐性を有していることを確認
できることを示している。
【００２５】 表３ 緑膿菌検出用プローブ ────────────────────────────────── 放射能カウント（cpm) ０時間 ２時間 18時間 ────────────────────────────────── 対照（薬剤なし） 12 50 2843 大腸菌NIHJ株 2 3 3 大腸菌JM109 株 4 10 7 緑膿菌ATCC9721株 9 69 2268 大腸菌NIHJ株＋緑膿菌ATCC9721株 3 41 2219 大腸菌JM109 株＋緑膿菌ATCC9721株 10 38 2174 ────────────────────────────────── 表３は、培養１８時間で採取したサンプルからはもちろ
んのこと、培養２時間で採取したサンプルからも、緑膿
菌ATCC9721株がアンピシリン耐性を有していることを確
認できることを示している。
んのこと、培養２時間で採取したサンプルからも、緑膿
菌ATCC9721株がアンピシリン耐性を有していることを確
認できることを示している。
【００２６】
【発明の効果】本発明の薬剤感受性試験法によれば、試
験に要する時間を大幅に短縮することができる。マイコ
プラズマ・ハイオニューモニエのように培養に時間がか
かる細菌においても、従来の方法では通常１週間以上要
する試験時間を、２４時間以内に短縮できる。また、他
の細菌が混在している場合にも、分離培養を行う必要が
ない。これらのことから、感染症に対する使用薬剤の決
定等の対応を簡便且つ迅速に行うことが可能となる。
験に要する時間を大幅に短縮することができる。マイコ
プラズマ・ハイオニューモニエのように培養に時間がか
かる細菌においても、従来の方法では通常１週間以上要
する試験時間を、２４時間以内に短縮できる。また、他
の細菌が混在している場合にも、分離培養を行う必要が
ない。これらのことから、感染症に対する使用薬剤の決
定等の対応を簡便且つ迅速に行うことが可能となる。
【００２７】さらに本発明の方法によれば、薬剤耐性試
験と菌の同定ステップを同時に行うことが可能である。
験と菌の同定ステップを同時に行うことが可能である。
【００２８】
【００２９】配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 CTTGGTGAAG CTTGAAGGCT CCTTTGAATA ３０
【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 CTCTAGCCAT TACCTGCTAA ２０
【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 CCCCTGCTTT GGTCCGTAGA CGTC ２４
【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 CCGTATCTCT ACAGGATTCC ２０
【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 AGGCCGAAGC CCGTGCTGCC G ２１
【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 CTCCCTCTGA CACACTCTAG CCCGGTAGTT AAAA ３４
【００３５】配列番号：７ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 GCACTCCCAA ATCTCTTCGG GATT ２４
【００３６】配列番号：８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 TCGTCAGCAA AGAAGCAAGC TTCTTCCTG ２９
【００３７】配列番号：９ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 AGTGTGTCGA AACACAC １７
【００３８】配列番号：１０ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to rRNA 配列 ACCTAGGTTA TCCTAGG １７
【図１】マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する
薬剤感受性試験の結果を示す図面である。
薬剤感受性試験の結果を示す図面である。
【図２】大腸菌NIHJ株、ZF2191株及びボルデテラ・ブロ
ンキセプチカMAKABE3-1 株に対するオキシテトラサイク
リン耐性試験の結果を示す図面である。
ンキセプチカMAKABE3-1 株に対するオキシテトラサイク
リン耐性試験の結果を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｃ１２Ｒ 1:37） (72)発明者 種田 貴至 千葉県佐倉市王子台２−５−２ ベルタウ ン203号 (72)発明者 阪野 哲也 千葉県佐倉市宮前２−19−６ (56)参考文献 特表 平１−503356（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】 特定の薬剤を含有する培地に、被検細菌
又は該被検細菌と他の細菌との混合物を接種し、培養
後、該被検細菌のｒＲＮＡの特異的配列に相補するＤＮ
Ａをプローブとして用いてｒＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダ
イゼーションを行い、該被検細菌の増殖菌量を測定する
ことにより、該被検細菌の該特定の薬剤に対する感受性
を試験する方法であって、 該被検細菌が、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、
マイコプラズマ・ニューモニエ、プロテウス・ブルガリ
ス、アエロモナス・サルモニシダ、ボルデテラ・ブロン
キセプチカ、大腸菌及び緑膿菌からなる群から選ばれ、 該被検細菌が、マイコプラズマ・ハイオニューモニエで
ある場合には、配列番号１で表される塩基配列を有する
ＤＮＡをプローブとして使用し、 該被検細菌が、マイコプラズマ・ニューモニエである場
合には、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
をプローブとして使用し、 該被検細菌が、プロテウス・ブルガリスである場合に
は、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡをプ
ローブとして使用し、 該被検細菌が、アエロモナス・サルモニシダである場合
には、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡを
プローブとして使用し、 該被検細菌が、ボルデテラ・ブロンキセプチカである場
合には、配列番号５、６又は７で表される塩基配列を有
するＤＮＡをプローブとして使用し、 該被検細菌が、大腸菌である場合には、配列番号８又は
９で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして
使用し、 該被検細菌が、緑膿菌である場合には、配列番号１０で
表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用
することを特徴とする細菌の薬剤感受性試験法。 - 【請求項２】 被検細菌が、緑膿菌である請求項１記載
の細菌の薬剤感受性試験法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3288604A JPH07121240B2 (ja) | 1990-11-09 | 1991-11-05 | 細菌の薬剤感受性試験法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-304756 | 1990-11-09 | ||
| JP30475690 | 1990-11-09 | ||
| JP3288604A JPH07121240B2 (ja) | 1990-11-09 | 1991-11-05 | 細菌の薬剤感受性試験法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05100A JPH05100A (ja) | 1993-01-08 |
| JPH07121240B2 true JPH07121240B2 (ja) | 1995-12-25 |
Family
ID=26557245
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3288604A Expired - Lifetime JPH07121240B2 (ja) | 1990-11-09 | 1991-11-05 | 細菌の薬剤感受性試験法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07121240B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7640494A (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-22 | Cellpro, Incorporated | Methods for quantifying the number of cells containing a selected nucleic acid sequence in a heterogenous population of cells |
| US5951368A (en) * | 1996-05-29 | 1999-09-14 | Ebara Corporation | Polishing apparatus |
| WO1999022023A2 (de) * | 1997-10-29 | 1999-05-06 | Mira Diagnostica Gmbh | Verfahren zum nachweis von mikroorganismen |
| JP2008118904A (ja) * | 2006-11-10 | 2008-05-29 | Canon Inc | プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3752172T3 (de) * | 1986-11-24 | 2008-04-10 | Gen-Probe Inc., San Diego | Nukleinsäuresonden zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von nicht-viralen Organismen |
-
1991
- 1991-11-05 JP JP3288604A patent/JPH07121240B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05100A (ja) | 1993-01-08 |
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