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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien der
Gattung Legionella mittels der Sandwich- Hybridisierungs- Methode.
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Legionella
spp. sind gram- negative, stäbchenförmige und
fakultative intrazelluläre
Pathogene. Es werden mehr als 42 Spezies mit 64 Sero- Gruppen unterschieden.
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Sie
werden als intrazelluläre
Parasiten von Amöben
und Ciliaten normalerweise in wässriger
Umgebung sowie in nassen Boden gefunden. Sie werden auch in oder
an künstlich
hergestellten Plätzen
oder Produkten wie Kühltürmen, klinischen
Beatmungsgeräten,
Whirlpools oder Duschen gefunden.
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Der
Mensch infiziert sich mit Legionellen nach dem Einatmen kontaminierter
Aerosol- Aerosol- Tropfen aus den oben erwähnten Habitaten. In der Lunge
fallen die Legionella- Bakterien Makrohagen und können eine Form
der Lungenentzündung
verursachen, bekannt als Legionärs-
Krankheit. Die Symptome beginnen mit schwachen Husten, Unwohlsein,
Muskelschmerzen, leichten Fieber, sowie gastrointestinalen Störungen und steigern
sich zu hohen Fieber, Alveolitis und Bronchitis. Legionella pneumophila
ist der wichtigste Erreger für die
Legionellose, aber auch andern Spezies der Gattung L. Kommen als
Krankheitserreger beim Menschen in Frage.
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Zum
Nachweis der Legionella- Spezies in Wasserproben sind aus der Literatur
die Kultivierungs- Methode, auf Polymerase- Kettenreaktionen beruhende
Methode sowie die Verwendung monoklonaler Antikörper bekannt. Angewendet wird
die Hybridisierurng mit fluoreszensmarkiertern Sonden.
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Aus
der
DE 195 15 891
A1 ist auch ein Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäuren der
Gattung Legionella bekannt. Dieses Verfahren verwendet nicht die
Sandwich- Hybridisierungs- Methode.
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Weiter
wurde aus der
US 5.569.586
A die Anwendung der Sandwich- Hybridisierung- Me thode bekannt.
Diese Methode basiert auf der Nutzung von zwei Obligonukleotid-
Sonden einer Fänger-
Sonde und einer Nachweis- Sonde. Die Fänger- Sonde ist Kovalent an
einen Festen Untergrund gebunden. Zunächst hybridisiert die zu untersuchende
Ziel- Nukleinsäure
bei spezifischen Temperaturen mit den beiden Sonden. Danach bindet
die Ziel- Nukleinsäure
und der Sondenkomplex an den festen Untergrund der Fänger- Sonde.
Der Nachweis kann mit Fluoreszenz oder Chemilumineszenz, Farbreaktionen
oder radioaktiven Markierungen erfolgen. Aus der Veröffentlichung
Rautio et.al: Sandwich hybridisation assay for quantitative detection
of geast RNA s in crade cell lysates. Microb. Cell Fact. (28.04.2003
2 (1)4, S. 1–19),
ist weiter ein Sandwich- Hybridisierungs- Assay für Hefen
bekannt.
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Wichtig
für den
Erfolg dieser Methoden sind die Eigenschaften der Sonden für die jeweilige
spezifische Hybridisierung. Das wird durch den bisherigen Stand
der Technik nur teilweise gewährleistet.
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Die
Aufgabe der Erfindung besteht deshalb darin, neue gattungs- und
artspezifische Oligonukleotide zum Nachweis von Bakterien der Gattung
Legionella herzustellen und zu verwenden.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe dadurch gelöst,
daß
- a) zum Nachweis der gesamten Gattung Legionella
als Fängersonde
ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CCTCCTCCCCACTGAAAGT-3' und als Nachweissonde
ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CACTGTATGTCAAGGGTAGG;
- b) zum Nachweis von Legionella pneumophila als Fänger-Sonde
ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-ATCTGACCGTCCCAGGTT-3' und als Nachweissonde
ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-TTCGCCGCCCTCTGTATCG-3';
- c) zum Nachweis von Legionella feeleii als Fänger-Sonde ein Oligonukleotid
der Sequenz 5'-GCGCCACTAACCTCATTCAT-3' und als Nachweissonde
ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-TATACAACCACCTACGCACC-3' und
- d) zum Nachweis von Legionella jordanis als Fänger-Sonde
ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CCACTCCTCCCCACTGAAAG-3' und als Nachweis-Sonde
ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-CTTACGGTCCCCAGCTTTTT-3' verwendet werden
und die Hybridisierung bei Temperaturen von fünfzig bis fünfundfünfzig Grad Celsius erfolgt.
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Die
wichtigsten Daten der neuen Oligonukleotid-Sonden sind in nachfolgender
Tabelle 1 dargestellt.
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Bei
artspezifischen Nachweisen von Legionella-Spezies sind gemäß Patentanspruch
2 die Oligonukleotide für
Fänger-Sonden
und Nachweis-Sonden gegeneinander austauschbar.
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Weiterhin
werden die Nachweise von Bakterien der Gattung Legionella gemäß Patentanspruch
3 mit Kombinationen von Oligonukleotiden für gattungsspezifische Sonden
und Oligonukleotiden für
artspezifische Sonden vorgenommen.
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Von
Vorteil ist weiter, daß die
neuen gattungs- und artspezifischen Oligonukleotid-Sonden alle für eine Hybridisierung
bei Temperaturen von 50–55°C entwickelt
wurden. Damit sind Kombinationen von mehr als 2 Sonden möglich, welche
die Voraussetzung für
den Nachweis von mehr als 1 Legionella -Spezies in einem Test sind.
Hierzu werden magnetische Beads mit verschiedenen zum Nachweis von
einzelnen Legionella-Spezies Fänger-Sonden
gemischt (Multiplex-Analyse) beispielsweise Fänger-Sonden zum Nachweis von
L. p. mit Fänger-Sonden
zum Nachweis von L. f. oder anderen in Kombination mit einer gattungsspezifischen
Nachweis-Sonde.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird im folgenden unter Hinweis auf die beigefügte Zeichnung näher erläutert.
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1 zeigt
eine schematische Darstellung der Sandwich-Hybridisierungs- Methode.
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Dabei
ist die Fänger-Sonde 1 mit
Biotin 4 markiert; bindet an mit Streptavidin 5 ummantelte
magnetische Kugeln (magnetic beads) 7. Nach erfolgter Hybridisierung
der Ziel-Nukleinsäure
mit den beiden Sonden 1 und 2 geschieht der Nachweis
mit Alkalischer Phosphatase 6 die an die Digoxigenin markierte
Nachweissonde 2 über
Anti DIG Fab Fragment bindet. der Nachweis des amplizierten Fluoreszenz-
Signals kann durch ein Fluoreszenz- Lesegerät quantifiziert werden. Eine
weiter Nachweismöglichkeit
ist die Erfassung der Aktivität der
Alkalischen Phosphatase durch elektrochemische Sensoren.
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Zur
Probenaufbereitung werden Gesamt- DNA -Proben verschiedener Legionella-
Spezies verwendet. Die 16S ribosomale DNA (rDNA) wurde aus der gesamt
DNA verschiedener Legionella- Spezies unter Verwendung der fD1 und
rP2- Universal- Primer für
die 16SrDNA mittels PCR amplifiziert. Der Promoter- Bereich der T7
Polymerase war im fD1 enthalten. In vitro transkribierte 16SrRNA
wurde von den entsprechenden PCR Produkten aus Legionella (16SrDNA)
unter Verwendung des DIG RNA Labeling- Kit (SP6/T7) (Roche) oder
des MAXIscript- Kits/Ambion) hergestellt.
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Die
Wirksamkeit der Oligonukleotide- Sonden wurde durch die Slot- Blot-
Methode getestet. In vitro transkribierte 16SrRNA (Ribosomale RNA
der kleinen Untereinheit der Bakterien-Ribosomen) wurde das Ziel- Molekül verwendet.
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Die
Slot- Blot- Hybridisierungen wurden entsprechend des Protokolls
des DIG System User's
guide for Filter Hybridiziation, Boehringer Mannheim (1995) durchgeführt. 1000
fmol in vitro Transkribierter 165rRNA verschiedener Legionella-
Spezies wurden in RNA- Lösungs-
Puffer (DEPC- HO, 20 × SSC),
Formaldehyd (5:3:2) präpariert
und für
10 Minuten bei 65°C
denaturiert. Anschließend
werden die Proben mittels eines Vakuum- Slot- Blotter-(Bio- Rad)
auf eine posetive geladene Nylon- Membran (Hybond- N) aufgebracht.
Diese Membran war vor und nach dem Blotten mit 20 × SSC (3M
NaCl und 300 mM Natriumcitrat pH 7,0) gewaschen worden. Anschließend wurden
die Nukleinsäuren
mit UV- Licht (für
2 Minuten) an die Membranen gebunden. Die Abkürzungen „M" und „mM" stehen für die Einheiten mol/1 bzw.
mmol/1.
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Die
Prä- Hybridisierung
wurde in Hoch- SDS- Puffer (7% SDS, 50% Formaldehyd, 5 × SSC, 2%
Blocking Reagent (Roche), 50 mM Natriumphosphat pH und 0,1 % Laurylsarcosin)
für 2 Stunden
bei Hybridisierungs- Temperaturen durchgeführt. Danach erfolgte die Hybridisierung über Nacht
in Hoch- SDS- Puffer mit 100 pmol DIG- markierter Oligonukleotid-
Sonde bei 50–55°C abhängig von
der Schmelztemperatur der Sonde. Die Proben wurden am 3'-Ende mit dem DIG Oligonukleotide 3'End
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Labeling
Kit (Roche Diagnostics GmbH) entsprechend des Protokolls des Herstellers
mit Digoxigenin markiert.
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Nach
der Hybridisierung wurde die Membran zwei Mal mit 2 × SSC; 0,1
% SDS für
5 Minuten gewaschen, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 0,1 × SSC; 0,1
% SDS, 0,2 × SSC;
0,1 % SDS oder 0,5 × SSC; 0,1
% SDS für
20 Minuten bei Hybridisierungstemperatur, um die ungebundene Sonde
zu entfernen. Anschließend
wurde die Membran in Maleinsäure-Puffer
( 0,1 M Maleinsäure
und 0,15 M NaCl, pH 7,5 ) mit 0,3 % Tween 20TM für 5 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert, um unspezifische Bindung der Alkalischen
Phosphatase zu vermeiden. Die Membran wurde für 30 Minuten in Maleinsäure-Puffer
mit 0,1% Blocking Lösung
(Roche) inkubiert. Anschließend
wurde die Anti-Digoxigenin-Alkalische-Phosphatase
(AP) 1 : 20 000 in Maleinsäure-Puffer
mit 1% Blocking Lösung
verdünnt
und die Membran in der Antikörper-Lösung 30
Minuten inkubiert. Die Membran wurde 2 mal mit Maleinsäure-Puffer
mit 0,3% Tween 20 für
15 Minuten gewaschen und für
5 Minuten in Nachweis-Puffer
(100 mM Tris-HCl, pH 9,5 und 100 mM NaCl) äquilibriert. Das als Substrat
für die Alkalische
Phosphatase benutzte CDP-StarTM Substrat
(Roche) wurde 1:100 in Nachweis-Puffer verdünnt, auf die Oberfläche der
Membran aufgetragen und in Plastik-Folie eingeschweißt für 10 Minuten
inkubiert. Die Membran wurde exponiert ( Hyperfilm ECL, Amersham
Pharmacia Biotech). Zeitraum war zuerst 1 Stunde und später 10 oder
5 Minuten um die Färbung
des Hintergrundes zu reduzieren.
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Die
Ergebnisse der Slot-Blot-Test's
zeigen folgendes.
- 1. Sonden zum Nachweis der
Gattung Legionella
Die Sonde Legall 11 hybridisierte mit der
in vitro transkribierten 16SrRNA aller untersuchten
Legionella
Spezies (15 Arten – siehe
Tabelle 2, S.8). Die Bindung war spezifisch für alle Legionella- Spezies.
Die
Sonde Legall 22 hybridisierte ebenfalls spezifisch mit der in vitro
transkribierten 16SrRNA aller untersuchten Legionella- Spezies.
Beide
Sonden sind für
einen Nachweis der Gattung Legionella im Sandwich-Hybridisierungsnachweis
mit Legall 11 als Fängersonde
und Legall 22 als Nachweissonde geeignet. Die Hybridisierungstemperatur
war 50°C.
- 2. Sonden zum Nachweis von Legionella pneumophila Die Sonde
Legpneu 1 hybridisierte mit der in vitro transkribierten 16S rRNA
der Legionella pneumo phila Serogruppe 1 ATCC33152, Legionella pneumophila Serogruppe
6, Legionella pneumophila Philadelphia I JR32 WT und mit Legionella
micdadei.
Die Sonde Legpneu 2 hybridisiert mit in vitro transkribierter
16S rRNA von Legionella pneumophila Serogruppe 1 ATCC33152, Legionella
pneumophila Serogruppe 6 und Legionella pneumophila Philadelphia
I JR32 WT. Diese Sonde ist hochspezifisch und kann als Fänger-Sonde
mit der Legpneu1-Sonde in Sandwich-Hybridisierungs-Nachweisen verwendet
werden. Die Hybridisierungs-pe-Temperatur
war 50°C.
- 3. Sonden zum Nachweis von Legionella feeleii
Die Sonde
Legfeel 1 hybridisierte nur mit der in vitro transkribierten 16S
rRNA von Legionella feeleii und ist spezifisch. Sie kann als Fänger-Sonde
zusammen mit Leggfeel 2 zum Nachweis von Legionella feelei benutzt
werden.
Die Sonde Legfeel 2 hybridisierte nur mit der in vitro
transkribierten 16S rRNA von Legionella feelei und ist spezifisch.
Sie kann als Nachweis-Sonde verwendet werden, weil sie eine nierige
Bindungseffizienz besitzt als die Sonde Legfeel 1.
Diese beiden
Legfeel-Sonden können
zum Nachweis von Legionella feeleii in Sandwich-Hybridisierungs-Ansätzen verwendet
werden. Die spezifische Hybridisierungs-Temperatur beider Sonden
war 55°C.
- 4. Sonden zum Nachweis von Legionella jordanis
Die Sonde
Legjor 2 hybridisierte mit der in vitro transkribierten 16S rRNA
von Legionella jordanis und Legionella feelei. Die Bindung mit der
Legionella jordanis-Probe war spezifisch und die Bindung mit der
Legionella feelei-Probe war unspezifisch. Diese Sonde kann als Nachweis-Sonde
zusammen mit der Legjor1-Sonde verwendet werden.
Die Sonde
Legjor 1 hybridisierte nur mit der in vitro transkribierten 16S
rRNA von Legionella jordanis. Die Bindung dieser Sande zum Zielmolekül war spezifisch.
Die Sonde kann als Fänger-Sonde zusammen mit der
Sonde Legjor 2 verwendet werden. Die Hybridisierungs-Temperatur
für beide
Sonden war ebenfalls 55 °C.
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Die
Vorteile der Erfindung bestehen darin, daß die neuen Oligonukleotide
gattungs-und artspezifisch für
die Sandwich-Hybridisierungs-Methode besonders geeignet sind. Vorteilhaft
wirkt sich weiter der Einsatz von Kombinationen der neuen Oligonukleotide
aus. Möglich
sind auch Kombinationen mit anderen Oligonukleotid-Sonden z.B. für den Einsatz
als Primer für
PCR, fluoreszenzmarkiert für
mikroskopische Nachweise, zur Fluoreszenzsandwichhybridisierung
und zur Sandwich-Hybridisierung mit elektrischer Signalauslesung.
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Tabelle
2 : Untersuchte Legionella Spezies
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