JPH1042880A - 非ウイルス生物の検出及び／又は定量用核酸プローブ - Google Patents

非ウイルス生物の検出及び／又は定量用核酸プローブ

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JPH1042880A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 標的非ウイルス生物又は生物と非標的非ウイ
スル生物又は生物群から区別するためのハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブを及びアッセイ手段を提供す
る。 【解決手段】 プローブとして、標的非ウイルス生物又
は生物群のヌクレオチド配列の可変領域の少なくとも約
１０連続ヌクレオチドとハイブリッドし、該可変領域が
E. coliの5SrRNA、16SRNA若しくは23SRNA又はS. cerevi
siaeの18SRNAもしくは23SRNAのある領域に対応するもの
である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 発明の分野 本発明は、RNA のごとき遺伝子材料の使用に基づくプロ
ーブ及びアッセイに係る。より詳細には本発明は、被検
標本、例えば痰、尿、血液、組織切片、食品、土壌及び
水中の標的非ウイルス生物を検出及び／又は定量するア
ッセイで使用するための核酸プローブの設計及び構築、
並びに該プローブと標的非ウイルス生物の遺伝子材料と
のハイブリダイゼーションに係る。
【０００２】概 論 ヌクレオチドから成る核酸の２本の単鎖は、結合（「ハ
イブリダイズ」）して二重螺旋構造を形成し得る。該構
造中では対向方向を指向する２つのポリヌクレオチド鎖
が、中央に位置する「塩基」として公知の整合した化合
物対の間で水素結合（弱い形態の化学結合）によって互
いに結合されている。一般に核酸の二重螺旋構造におい
ては、例えばアデニン塩基(A) はチミン塩基(T) 又はウ
ラシル塩基(U) と水素結合し、またグアニン塩基(G) は
シトシン塩基(C) と水素結合する。従って鎖に沿ったい
かなる点においても、塩基対AT又はAU、TA又はUA、GC又
はCGが検出される。また従来の（「基準形 (canonica
l)」）塩基対以外の塩基対AG及びGUも検出され得る。核
酸の第１単鎖が第２単鎖に十分に相補的であり、２本の
鎖が両者のハイブリダイゼーションを促進する条件下に
おかれたと想定すると、二重鎖核酸が得られるであろ
う。適当な条件下で DNA/DNA、 RNA/DNA又はRNA/RNA ハ
イブリッドが形成され得る。
【０００３】基本的な核酸ハイブリダイゼーション手順
は概して２種類に大別される。その１つは「溶液」ハイ
ブリダイゼーション」として知られており、「プロー
ブ」核酸配列と被検標本由来の核酸分子との双方が溶液
中に遊離している。いま１つの方法では、標本核酸が通
常は固体支持体に固定されプローブ配列が溶液中に遊離
している。
【０００４】プローブは、検出すべき核酸配列（「標的
配列」）に対して特定されたある程度まで相補的な単鎖
核酸配列でもよい。また、プローブが標識されていても
よい。特定核酸配列を検出するための手順として核酸ハ
イブリダイゼーションが使用される従来技術に関して
は、1983年１月10日付けの米国特許出願第456729号、
「Method for Detection, Identi-fication and Quanti
tation of Non-Viral Organisms 」(Kohne I) 、及び、
1984年９月４日付けの米国特許出願第655365号、「Meth
od for Detecting, Identifying and Quantitating Org
anisms and Viruses」(Kohne II)に記載されている。こ
れらの特許出願の記載は本明細書で言及する他の総ての
出願と同様に本明細書に含まれる。
【０００５】前記出願はまた、RNA 含有生物を含むと予
想される標本中で該RNA 含有生物の存在を検出する方法
を記載している。該方法は、サンプル由来の核酸と、元
のrRNAサブユニット配列よりも短いが１種類以上の非ウ
イルス性生物又は非ウイルス性生物群のrRNAとハイブリ
ダイズすべく十分に相補的な核酸分子を含むプローブと
を混合し、特定のハイブリダイゼーション条件下に混合
物をインキュベートし、得られた混合物中でプローブと
被検標本rRNAとのハイブリダイゼーションを検定するス
テップを含む。該特許出願においては、特定生物又は生
物群中に存在するrRNAサブユニットサブ配列と同じか又
は十分に類似のrRNAサブユニットサブ配列だけを検出す
るプローブが使用され、多くの非近縁生物の存在下でも
標本中の１つ以上の特定生物又は生物群の有無を検出で
きると記載している。
【０００６】本発明は、任意の非ウイルス性生物群を検
出及び／又は定量するアッセイにおいて非反復（特有)r
RNA 配列の検出に使用するためのDNA プローブを設計し
構築する新規な方法及び手段を提供する。本発明のプロ
ーブのいくつかは、非ウイルス性生物の単一種または菌
株を検出及び／または定量するために使用され得、残り
のプローブは、属全体または所望の系統分類学的群の生
物を検出及び／または定量するために使用され得る。
【０００７】発明の概要 プローブの調製及び使用方法において、特定の標的非ウ
イルス性生物由来のrRNA の存在又は量を測定し系統分
類（発生）学的に最も近縁の既知の生物から識別するハ
イブリダイゼーションアッセイにおいては、所定長さを
もつ特定配列の単鎖デオキシオリゴヌクレオチドが使用
される。本発明によれば、Mycoba cterium avium 、Myco
bacterium intracellulare及びMycobacterium tubercul
osis -複合細菌の夫々の16S rRNA可変サブ配列に夫々特
異的で適当なストリンジェンシー下に互いの核酸又は別
の細菌種もしくは呼吸器感染物質と交差反応しないプロ
ーブ配列が提供される。また、Mycobacterium tubercul
osis- 複合細菌に由来の23S rRNA可変領域の３つのサブ
配列に特異的なプローブがrRNA可変領域プローブとして
提供される。これらのプローブは、Mycobacterium 属
（16S 及び23S rRNA特異的）、Myco-plasma p neumoniae
（5S及び16S rRNA特異的）、Chlamydia trachomatis
（16S及び23S rRNA特異的）、Enterobacter clo-acae
（23S rRNA特異的）、Escherichia coli(16S rRNA 特異
的）、Legionella（16S 及び23S rRNA特異的）、Salmon
el la（16S 及び23S rRNA特異的）、Enterococci （16S
rRNA特異的）、Neisseria go norrhoeae （16S rRNA特異
的）、Campylobacter （16S rRNA特異的）、Prot eus
mirabilis （23S rRNA特異的）、Pseudomonas （23S rR
NA特異的）、菌類（18S 及び28S rRNA特異的）及び細菌
（16S 及び23S rRNA特異的）のハイブリダイゼーション
アッセイにおいて有効なrRNA可変領域プローブである。
【０００８】アッセイ方法の１つの具体例においては、
被検標本をまず、該標本中に存在する非ウイルス性生物
からrRNAが遊離する条件下に維持する。rRNAは単鎖であ
り、従って遊離したrRNAは、十分に相補的な遺伝子材料
とのハイブリダイゼーションを生じ得る。標識可能なプ
ローブと標的rRNAとを、溶液中で２つの鎖間のハイブリ
ダイゼーションが促進される条件下に接触させる。次
に、反応混合物においてハイブリダイズしたプローブの
存在を検定する。従来技術に比較した本発明の非ウイル
ス性生物検出方法の多くの利点、例えばその正確性、簡
便性、経済性及び迅速性等は以下の詳細な記載より更に
十分に理解されるであろう。
【０００９】詳細な説明 定 義 本文中及び請求の範囲中で使用した用語を以下のごとく
定義する。
【００１０】ヌクレオチド ホスフェート基、５′炭素糖及び窒素含有塩基から成る
核酸のサブユニット。RNA 中で５′炭素糖はリボースで
ある。DNA 中では2-デオキシリボースである。この用語
はまたかかるサブユニットの類似体を含む。
【００１１】ヌクレオチドポリマー ホスホジエステル結合によって結合した少なくとも２つ
のヌクレオチド。
【００１２】オリゴヌクレオチド 一般には約10〜約100 ヌクレオチドを含む長さのヌクレ
オチドポリマーであるが、長さ100 ヌクレオチド以上で
もよい。
【００１３】核酸プローブ 相補的な単鎖標的核酸配列と結合して二重鎖分子（ハイ
ブリッド）を形成し得る単鎖核酸配列。核酸プローブは
オリゴヌクレオチドでもよくまたはヌクレオチドポリマ
ーでもよい。
【００１４】ハイブリッド 相補的塩基の間のワトソン−クリック塩基対合または非
基準形塩基対合によって２つの単鎖核酸配列間に形成さ
れる複合体。
【００１５】ハイブリダイゼーション ２つの相補的な核酸鎖を結合させて二重鎖分子（ハイブ
リッド）を形成するプロセス。
【００１６】相補性 夫々の鎖ワトソン−クリック塩基対間の水素結合を介し
てハイブリッドまたは二重鎖 DNA:DNA、RNA:RNA または
DNA:RNAを形成するように単鎖DNA またはRNAの塩基配
列が与える特性。アデニン(A) は通常はチミジン(T) ま
たはウラシル(U) と相補性（的）で、グアニン(G) は通
常はシトシン(C) と相補性（的）である。
【００１７】ストリンジェンシー（stringency） ハイブリダイゼーション及びその後の処理段階で使用さ
れる温度及び溶媒組成を規定する用語。高ストリンジェ
ンシー条件下では高度に相同の核酸ハイブリッドだけが
形成される。十分な相補度をもたないハイブリッドは形
成されない。従って、アッセイ条件のストリンジェンシ
ーはハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間の必要な相
補的核酸量を決定する。ストリンジェンシーは、標的核
酸で形成されたハイブリッドと非標的核酸で形成された
ハイブリッドとの間の安定性の差を最大にするように選
択される。
【００１８】プローブ特異性 標的配列と非標的配列とを識別するプローブの能力を規
定する特性値。配列及びアッセイ条件に左右される。プ
ローブ特異性は絶対的（即ち、標的生物といかなる非標
的生物とをも識別し得るプローブ）でもよく、または機
能的（即ち、標的生物と特定標本中に通常存在する別の
生物とを識別し得るプローブ）でもよい。使用条件次第
で多くのプローブ配列を広い特異性または狭い特異性に
使用し得る。
【００１９】可変領域 標本中に含まれる標的生物と非標的生物との間で少なく
とも１つの塩基が異なるヌクレオチドポリマー。
【００２０】保存領域 可変でない領域。
【００２１】配列の分岐（divergence） 進化中にヌクレオチドポリマーの類似性が減少するよう
なプロセス。
【００２２】配列の収斂（convergence ） 進化中にヌクレオチドポリマーの類似性が増加するよう
なプロセス。
【００２３】細 菌 ３つの主要界の１つと考えられる系統分類学的真正細菌
群の構成単位。
【００２４】Ｔｍ 50％のプローブがハイブリダイズ形態から非ハイブリダ
イズ形態に変換される温度。
【００２５】熱安定性 プローブ：標的ハイブリッドの50％が単鎖形態に変換さ
れる温度。熱安定性に影響を与える要因はプローブ特異
性に影響を与えるのでコントロールされる必要がある。
プローブ配列が特定タイプの生物を１種類だけ検出する
ために有効であるか否かは、プローブ：標的ハイブリッ
ド（「P:T 」）の熱安定性とプローブ：非標的ハイブリ
ッド（「P:NT」）の熱安定性との差に依存する。プロー
ブを設計するときには、P:T のTm値からP:NTのTm値を減
算した差ができるだけ大きくなるようにする。
【００２６】発明者等は、プローブ配列の新規な選択方
法に加えて、単一タイプの標的生物から得られた特定rR
NA配列に相補的なDNA プローブを作製し、該プローブを
該単一生物検出のための非交差反応アッセイにおいて有
効に使用し得ること、系統分類学的または系統発生学的
に最も近縁の既知の生物の存在下においてもかかる検出
が可能であることを知見した。ウイルスを除くすべての
原核細胞生物は、5S rRNA 及び 16S rRNA を含むrRNA分
子及び23S rRNAとして知られるより大きいrRNA分子を含
有している。真核細胞が5.0S、5.8S、18S 及び28S rRNA
分子または類似構造をもつことは知られている。（18S
及び17S rRNAを含む小さいリボソームサブユニット中で
検出されるrRNAはときには「16S 様」なる用語で指称さ
れる。同様に大きいリボソームサブユニットで検出され
るrRNAはときには「23S 様」なる用語で指称される。5.
8S rRNA は23S 様rRNAの５′末端に等価である）。これ
まで検査されたすべての生物においてこれらのrRNA分子
は高度に保存されたヌクレオチド配列をもつ。これらの
rRNA配列の有意部分を決定し得る方法は公知である。例
えば、長さ約20〜30塩基の相補的オリゴヌクレオチドプ
ライマーを5S、16S又は23S サブユニットに特異的な精
製rRNAの共通保存領域にハイブリダイズさせ、逆転写酵
素で延長し得る。その後に化学分解反応又はジデオキシ
ヌクレオチド末端化配列決定反応を用いて延長産物のヌ
クレオチド配列を決定し得る。Lane、D. J. 等、Pr oc.
Nat′l Ac ad. Sci. USA 82、6955-6959 (1985)。
【００２７】本発明によれば、標的生物に由来の１つ以
上の配列決定されたrRNA可変領域を近縁の細菌種に由来
の１つ以上のrRNA可変領域配列と比較し、これを利用し
て標的生物のrRNAに特有の配列を選択する。細胞中での
相対的存在量及び安定性の見地及び系統分類学的保存パ
ターンの見地からプローブ標的としては rRNA がDNAよ
りも好ましい。
【００２８】rRNAが高度に保存性であるにもかかわら
ず、rRNA分子中の多くの配列可変領域は近縁種間でも異
なっており、従って、これらの生物種間の識別に利用で
きることが判明した。rRNA分子中の差異は分子全体にラ
ンダムには分布せず特定領域に集中している。保存の程
度にも差があり、リボソームRNA サブユニットには特有
の保存パターンが形成される。変異の程度及びその分布
を分析して診断用プローブの標的部位を検出することも
可能である。このプローブ選択方法を使用して標的生物
のrRNAに特有の２つ以上の配列を選択することも可能で
ある。
【００２９】文献に発表された rRNA 配列及び当業界で
公知の手順で我々自身が決定した rRNA 配列の比較分析
によって可変領域を同定した。比較分析のためにSun Mi
crosystems(TM)コンピュータを使用した。コンパイラは
多くのデータ配列を同時に処理し得る。このタイプのコ
ンピュータ及び本明細書に記載の目的で使用または適用
できるコンピュータプログラムは市販されている。
【００３０】一般に、系統分類学的に保存された属の近
縁の種間を識別するために有効な領域は少なく、例えば
16S rRNA分子の５′末端に由来の 400〜500 塩基の領域
がある。近縁の生物の分析によって（第６，７及び８
図）、近縁の生物間での差異が存在する特定位置（可変
領域）が判明する。rRNA分子のこれらの可変領域はプロ
ーブ設計の有望な候補である。
【００３１】第５図、第６図及び第７図は、異なる２つ
の細菌間の16S 及び23S rRNA中で両者間の類似量が減少
する変異を示す。これらの図のより詳細な分析によって
これらの近縁生物間である種の潜在的パターンが判明す
る。検討したすべてのケースで、同一標本中で検出され
た標的生物と系統分類学的に最も近縁の生物との間には
有効なプローブを設計できるに十分な変異が存在するこ
とを知見した。更に、今日まで検討されたすべてのケー
スにおいて、同一標本中で検出された（１種類または複
数種の）標的生物と系統分類学的に最も近縁の生物との
間の類似率は90％〜99％であった。注目すべきは、Neis
seria gonorrhoeae とNeisseria meningitidisとが、DN
A:DNA 相同の研究ではこれらの２つの種が実際には同一
の種であると示唆されたにもかかわらず、両者のrRNAの
間にはプローブが設計できるに十分な変異が存在したこ
とである（実施例21参照）。
【００３２】これらの図はまた、差異が16S 及び23S rR
NAの全体に分布していることを示す。しかしながら差異
の多くは少数の領域に集中している。rRNA中のこれらの
場所は我々の常用のアッセイ条件でプローブ設計の有望
な候補である。我々はまた、変異の密度が大きい場所が
通常は16S 及び23S rRNAの同じ領域に同等の値の類似率
で存在することに注目した。このようにして、16S 及び
23S rRNAのいくつかの領域は、同一標本中で検出される
標的生物と系統分類学的に最も近縁の生物との間の有意
な変異が最も存在し易い領域であることを観察した。本
発明は、同一標本中で検出される標的生物と系統分類学
的に最も近縁の生物との間の有意な変異を示すこれらの
領域にハイブリダイズする種特異的プローブを提供す
る。
【００３３】第９図、第10図及び第11図は本発明で提供
されるプローブの場所を示す概略説明図である。原則と
して16S 及び23S のRNA は約６ヌクレオチドの長さをも
つ配列より長い複製配列を含まないので、これらの方法
によって設計されたプローブは標的核酸の１つまたは少
数の位置に特異的である。（例えば最小10ヌクレオチド
の長さをもつ）各可変領域での配列進化の大部分は分岐
性であり収斂性ではない。従って、標的生物と系統分類
学的に最も近縁の生物との間で異なる少数のrRNA配列に
基づいて確実なプローブを設計し得る。相同な一次構
造、二次構造及び三次構造を進化中に維持するrRNA分子
に対する生物学的及び構造的制約とプローブ診断に対す
るかかる制約の影響とはこれからの研究課題である。生
物間の進化間隔が大きいほど生物間の識別に使用できる
可変領域の数が増加する。
【００３４】可変領域の同定後、配列を整列(align) さ
せて最大相同の領域即ち「整合」領域を検出する。ここ
で、潜在プローブ領域を同定できるように配列を解析す
る。プローブ設計に関する２つの重要な条件は、（１つ
以上の）標的配列に対する相同を最大にし（90％を上回
る相同が好ましい）、（１つ以上の）非標的配列に対す
る相同を最小にする（非標的に対する相同は90％未満が
好ましい）ことである。所望の特性値をもつプローブを
設計するために以下の方針が有効であることが確認され
た。
【００３５】第一には、プローブはプローブ：非標的核
酸ハイブリッドの安定性を最小にするように位置決めさ
れる必要がある。このためには、非標的生物に対する完
全相補性の長さを最小にし、非標的配列に相同のＧ及び
Ｃに富む領域を回避し、できるだけ多くの不安定不適合
を測定できるようにプローブを配置する（例えば、dG:r
U 塩基対はいくつかの別の塩基対よりも不安定であ
る）。
【００３６】第二には、プローブ：標的核酸ハイブリッ
ドの安定性を最大にする必要がある。このためには、Ａ
及びＴに富む長い配列を回避し、ハイブリッドをＧ：Ｃ
塩基対で終結させ、適当なTm値をもつプローブを設計す
る。プローブの始点及び終点は、最終アッセイでの使用
温度よりも約２〜10℃高いTm値を与える長さ及びＧの％
及びＣの％が得られるように選択する。種々のアッセイ
条件の重要性及び効果は本文中で後述する。第三に、強
力なハイブリダイゼーション阻害構造を形成することが
わかっているrRNAの領域は好ましくない。最後に、広汎
な自己相補性をもつプローブは避ける必要がある。
【００３７】いくつかのケースでは、所望のハイブリダ
イゼーション特性をもつプローブを生じる特定領域から
複数の配列が得られるかもしれない。また別のケースで
は、１つの配列は塩基１つの差異をもつ別の配列よりも
はるかに優れているかもしれない。
【００３８】以下のチャートは本発明の１つの具体例と
して、近縁核酸配列の存在下に核酸配列を検出するため
に有効な非反復rRNA配列の選択方法を示す。この具体例
では、生物Ａ〜Ｅに関するrRNA配列を決定し、番号を付
けて整列させた。配列１は生物Ａ〜Ｅの全部に共通であ
る。配列２〜６は生物Ａ、Ｂ及びＣにだけ存在し、配列
８，９または10は生物Ａに特有である。従って、配列
８，９及び10に相補的なプローブは、生物Ａと特異的に
ハイブリダイズするであろう。
【００３９】
【表１】
【００４０】高分子、例えばrRNAの変異パターンが既知
の場合、プローブ設計の有望な候補を特定領域に絞るこ
とができる。しかしながら、プローブ配列を得るために
必ずしも核酸配列全体を決定する必要はない。任意の単
一オリゴヌクレオチドプライマーからの延長によって 3
00〜400 塩基の配列が得られる。標的生物と標的に近縁
の生物とのrRNAを部分的に配列決定するために単一プラ
イマーを使用すると、上記のごとき整列(alignment) を
作成できる。要するに、有効なプライマー配列が知見さ
れれば、別のプライマーを使用してrRNAの配列決定を継
続する必要はない。逆に、最初のプライマーによる配列
決定から有効なプローブ配列が得られないときまたはよ
り高い感度のプローブを所望するときは、別のプライマ
ーを使用して別の配列を探すとよい。分子の変異パター
ンが十分にわかっていないときは、プローブ設計の前に
より多くの配列データが必要である。
【００４１】従って、後述の実施例１〜３においては、
２つの16S 由来のプライマーを使用した。第１プライマ
ーは本発明で定義した判定基準に合格するプローブ配列
を産生しなかった。第２プライマーは、前記のごとき特
性決定及び特異性試験の結果有効であると判定されたプ
ライマーを産生した。実施例４では、記載のプローブ配
列を検出するまでに６つの23S プライマーを使用した。
【００４２】推定された非反復配列の同定後に、相補的
DNA オリゴヌクレオチド配列を合成する。この単鎖オリ
ゴヌクレオチドは、DNA/rRNAアッセイハイブリダイゼー
ション反応のプローブとして機能するであろう。いくつ
かの公知方法いずれかを用いて特定オリゴヌクレオチド
を合成し得る。例えばシアノエチルホスホラミジット前
駆体を使用する自動固相化学合成がある。 Barone.A.D.
等、Nucleic Acid Res earch 12、4051-4060 (1984)。こ
の方法では、固体ポリマー支持体上でデオキシオリゴヌ
クレオチドを合成する。水酸化アンモニウムで60℃で16
時間処理することによって支持体からオリゴヌクレオチ
ドを遊離させる。溶液を乾燥し、粗産生物を水に溶解
し、ポリアクリルアミドゲルで分離する。ポリアクリル
アミドゲルの濃度はフラグメントの長さ次第で一般に10
〜20％の範囲で調整する。紫外逆光で可視化される主バ
ンドをカミソリ刃でゲルから切り出し、室温の0.1M酢酸
アンモニウム pH7.0で８〜12時間抽出する。遠心後、
0.4μフィルターで上清を濾過し、P-10カラム(Pharmaci
a) で脱塩する。合成オリゴヌクレオチドを構築するた
めの別の公知方法の使用も勿論可能である。
【００４３】常用のDNA シンセサイザーは多量の合成DN
A を産生し得る。合成後、新しく作製されたDNA のサイ
ズをゲル濾過によって検査すると、一般に種々のサイズ
の分子が検出される。これらの分子のあるものは、合成
プロセス中に生じた不稔合成事象を示す。通常は合成後
の精製処理の一部として合成DNA をサイズ分画し、適当
な長さの分子だけを保存する。このようにして、均一サ
イズの合成DNA 分子の集団を得ることが可能である。
【００４４】しかしながら一般には、合成DNA は本来、
すべてが同じサイズで同じ塩基配列をもつ分子の均一集
団から構成され、調製物中の各分子のハイブリダイゼー
ション特性は等しいと想定されてきた。現実には、合成
DNA 分子の調製物は不均一（heterogeneous ）であり、
同じサイズであるが互いにある程度の差異をもち従って
異なるハイブリダイゼーション特性をもつ数種類の分子
から構成されている。同じ配列をもつ調製物であって
も、調製物毎に異なるハイブリダイゼーション特性をも
つことがときどきある。
【００４５】従って、同じ合成プローブ配列をもつ複数
の調製物は互いに異なるハイブリダイゼーション特性を
有し得る。このため、異なる調製物に由来するプローブ
分子の特異性が同じでないこともある。所望のプローブ
特異性を得るために使用すべきハイブリダイゼーション
条件を決定するために、各調製物のハイブリダイゼーシ
ョン特性を検査する必要がある。例えば後述の実施例４
に記載の合成プローブは、表14に示す特異性プロフィル
をもつ。このデータは記載のハイブリダイゼーション及
びアッセイ条件を用いて得られた。異なるハイブリダイ
ゼーション特性をもつこのプローブの別の調製物は、実
施例４の条件下にアッセイを行なっても正確に同じ特異
性プロフィルを示すとは限らない。このような複数のプ
ローブ調製物を作製した。所望の特異性を得るために、
塩濃度及び／または温度等の条件を種々に変更してこれ
らのプローブのハイブリダイゼーション及びアッセイを
行なうことができる。DNA 合成の技術は多少不完全でも
あるので、プローブの各バッチ毎に実際のプローブ使用
条件を決定、即ち現存要件に適合させる必要がある。
【００４６】特定オリゴヌクレオチド配列の合成及び精
製後にいくつかの手順を利用して最終産物の適否を決定
する。まずポリアクリルアミドゲル電気泳動によってサ
イズを決定する。例えば32P-ATP 及び T4ポリヌクレオ
チドキナーゼによってオリゴヌクレオチドを標識する。
標識プローブをエタノール沈殿させ、遠心し、乾燥ペレ
ットを充填バッファ（80％ホルムアミド、20mM NaOH 、
1mM EDTA、 0.1％ブロモフェノールブルー及び 0.1％キ
シレンシアノール）に再懸濁させる。標本を90℃で５分
間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに充填する。TB
E バッファ（0.1MトリスHCl pH8.3 、0.08M ホウ酸、
0.002M EDTA）中で 1.000Ｖで１〜２時間電気泳動にか
ける。オリゴヌクレオチドの電気泳動後、ゲルをＸ線フ
ィルムに露光する。次に同様に処理したオリゴヌクレオ
チド標準の泳動からオリゴヌクレオチドのサイズを計算
する。
【００４７】合成オリゴヌクレオチドの配列を確認する
ために、該ヌクレオチドの５′末端を32P-ATP 及びT4ポ
リヌクレオチドキナーゼで標識し、Maxam 、 A.M. 及び
Gilbert 、W.、Proc. Nat′l Ac ad. Sci. USA 74 、560
-564(1980）の標準化学分解法で処理し、産生物をポリ
アクリルアミドゲルで分析してもよい。プローブのヌク
レオチド配列が、予め同定した非反復rRNA配列に完全に
相補的であることが好ましいがこれは必須条件ではな
い。
【００４８】また、オリゴヌクレオチド／rRNAハイブリ
ッドの融解温度（Tm値）を含めて溶解プロフィルを決定
する必要もある。Tm値を決定するための１つの方法で
は、50℃の0.1Mリン酸バッファpH6.8 中で32P 標識オリ
ゴヌクレオチドをその相補的核酸にハイブリダイズす
る。ハイブリダイゼーション混合物を希釈し、50℃で2c
mのヒドロキシアパタイトカラムに通す。カラムを0.1M
リン酸バッファ、0.02％ SDSで洗浄し、ハイブリダイズ
しなかった単鎖プローブを完全に溶出させる。次にカラ
ム温度を15℃に下げ、全部のプローブが単鎖になるまで
５℃ずつ温度を上げる。各温度毎に非ハイブリダイズプ
ローブが溶出し、各画分の毎分のカウント数(cpm) を測
定する。ヒドロキシアパタイトに結合したcpm の値をカ
ラムに添加した総cpm で除算した商が、標的核酸に対す
るプローブのハイブリダイゼーション％である。
【００４９】また、ハイブリッドの熱安定性を決定する
ために以下の方法を使用してもよい。ハイブリッド核酸
の部分試料を１mlの0.12M リン酸バッファ、 0.2％ SD
S、１mM EDTA 、１mM EGTA に希釈するかまたは適当な
ハイブリダイゼーションバッファに希釈する。この１ml
溶液を45℃で 5分間加熱し、室温水浴にいれて５分間放
冷する。この１mlのハイブリッド含有溶液をヒドロキシ
アパタイトカラムで検定し、ハイブリッドを捕集し、非
結合プローブを洗浄除去する。0.12M リン酸バッファ以
外のハイブリダイゼーション溶液を使用するときは、ハ
イブリダイゼーション溶液を0.12M リン酸バッファに希
釈して結合させる必要があろう。ハイブリッドの部分試
料を採集し、１mlのハイブリダイゼーション溶液または
前記の標準0.12M リン酸バッファに希釈し、５℃ずつ温
度を上げて加熱を続ける。全部のハイブリッドが溶解す
るまでこの処理を続ける。ハイブリッドの1/2 が溶解形
態に変換された温度をTm値とする。所与のハイブリッド
のTm値は、使用されるハイブリダイゼーション溶液次第
で大きく異なる。その理由は、熱安定性が種々の塩、界
面活性剤、及び熱変性中の相対ハイブリッド安定性に影
響を与えるその他の溶質の濃度に左右されるからであ
る。
【００５０】本明細書に記載のごときハイブリダイゼー
ション反応の程度及び特異性は多数の要因に左右され、
これらの要因の１つまたはそれ以上を操作すると特定プ
ローブの正確な感受性及び特異性を決定し、また標的に
完全に相補的であるか否かを決定し得る。例えば、プロ
ーブの塩基組成が重要であろう。GC塩基対は付加的水素
結合をもつのでAT塩基対に比較してより高い熱安定性を
示す。
【００５１】このためGC含量の高い相補的核酸配列が関
与するハイブリダイゼーションはより高温安定性であ
る。
【００５２】標的核酸配列の長さ、従ってプローブ配列
の長さも重要であることが判明した。完全に相補的では
ない核酸もハイブリダイズ可能であるが、通常は完全に
相同の塩基配列の最長部分がハイブリッドの安定性を主
として決定するであろう。種々の長さ及び塩基組成のオ
リゴヌクレオチドプローブを使用し得るが、本発明の好
ましいオリゴヌクレオチドプローブは長さ約15〜約50塩
基で標的核酸に少なくとも約75％〜 100％相同である。
ほとんどの用途では、標的核酸に95％〜 100％の相同が
好ましい。
【００５３】プローブ構築のときにはまた、イオン強度
及びインキュベーション温度を考慮に入れる必要があ
る。ハイブリダイゼーションの速度（rate）が反応混合
物のイオン強度の増加に伴って増加し、ハイブリッドの
熱安定性がイオン強度の増加に伴って増加することは公
知である。一般に、長さ約15〜50塩基の合成オリゴヌヌ
クレオチドプローブの最適ハイブリダイゼーションは所
与の二重鎖（duplex）では融点を約５℃下回る温度で生
じる。最適温度より低温でのインキュベーションは整合
しない塩基対をハイブリダイズさせ、従って、特異性の
低下を生じる。
【００５４】核酸濃度に関しては、ハイブリダイゼーシ
ョン速度が、相互作用する２つの核酸種の濃度に比例す
ることが知られている。従って、デキストラン及び硫酸
デキストランのごとき化合物の存在は、核酸種の局部濃
度を増加させこれによりハイブリダイゼーション速度を
増加させると考えられる。ハイブリダイゼーション速度
を増加させる別の物質は、1984年７月５日付けの米国特
許出願第627795号「AcceleratedNucleic Acid Reassoci
ation Method」、そのCIP 出願たる1987年６月４日付け
の米国特許出願（未権利化）、及び、1986年１月７日付
けの米国特許出願第816711号「Accelerated Nucleic Ac
id Reassociation Method 」に記載されている。これら
の出願は本明細書に含まれるものとする。他方で、ホル
ムアミド、尿素、DMSO及びアルコールのごとき水素結合
を破壊する化学物質はハイブリダイゼーションのストリ
ンジェンシーを増加させるであろう。
【００５５】選択されたオリゴヌクレオチドプローブを
いくつかの公知方法のいずれかを用いて標識し得る。常
用のラベルは放射性同位体及び非放射性指示基である。
同位体ラベルとしては3H 、35S 、32P 、125I 、コバル
ト及び14C がある。多くの同位体標識方法が酵素を使用
し、公知方法としてニックトランスレーション、末端標
識、第２鎖合成及び逆転写がある。放射性標識プローブ
を使用する場合、ハイブリダイゼーションはオートラジ
オグラフィー、シンチレーションカウンティング又はガ
ンマカウンティングによって検出できる。選択される検
出方法は、ハイブリダイゼーション条件及び標識に使用
された特定放射性ラベルに依存する。
【００５６】また、非同位体材料を標識に使用すること
も可能であり、これらは、酵素を使用した変性ヌクレオ
チドの組み込み、又は例えば非ヌクレオチドリンカー基
を使用したプローブの化学的変性によって導入され得
る。非同位体ラベルは、蛍光分子、化学発光分子、酵
素、補因子、酵素基質、ハプテン又はその他のリガンド
を含む。通常はアクリジニウムエステルの使用が好まし
い。
【００５７】本発明のDNA/rRNAハイブリダイゼーション
アッセイの１つの具体例においては、標識プローブと細
菌性標的核酸とを溶液中で反応させる。rRNAは、1986年
３月20日付けのK. A. Murphy等の米国特許出願第841860
号「Method for Releasing RNA and DNA From Cells 」
に記載の超音波破壊方法によって細菌細胞から遊離され
得る。該特許出願は本明細書に含まれるものとする。細
胞破壊のための別の公知方法としては、酵素の使用、浸
透衝撃、化学処理、及びガラスビーズと一緒の渦流攪拌
の使用がある。rRNAの遊離後または遊離と同時に、標識
プローブを促進物質の存在下に添加し、最適ハイブリダ
イゼーション温度で有意な反応を達成するに必要な時間
インキュベートする。このインキュベーション期間後
に、反応混合物にヒドロキシアパタイトを添加して非ハ
イブリダイズプローブ分子からプローブ／rRNAハイブリ
ッドを分離し得る。ヒドロキシアパタイトペレットを洗
浄し、再遠心し、使用ラベルに適した手段でハイブリッ
ドを検出する。
【００５８】本発明の21の代表具体例を以下に示す。こ
れら具体例では標的生物又は標的生物群に由来の非反復
rRNA配列に相補的な１つまたは複数の合成プローブを決
定し、構築し、ハイブリダイゼーションアッセイで使用
する。
【００５９】特定具体例 Mycobacterium は酸耐性、アルコール耐性、好気性、非
易動性桿菌である。これらは脂質含量が高く増殖が遅
い。Mycobacterium avium とMycobacteriu m intracellu
lareとは識別し難いので総合してM. avium-intracellu l
are と指称されている。最近になって、M. intracellul
are を含むM. avium複合体が二番目に多く分離される臨
床的に重要なMycobacterium であることが判明した。Go
od、R. C.等、J. Infect. Dis.146、829-833(1982) 。
より最近には、これらの生物がエイズ（後天性免疫不全
症候群）患者に対する日和見感染の共通原因であること
が証明された。Gill、V. J. 等、J. Clin. Microbio. 2
2、543-546(1985) 。これらの生物は殆どの抗結核剤に
耐性をもつのでエイズ患者におけるこのような感染の治
療は極めて難しい。５種類の薬剤を併用する療法がしば
しば使用される。これらの感染症は重態になり易く従っ
て速やかな診断が必要であるが、本発明以前にはそのよ
うな診断方法は存在しなかった。
【００６０】Mycobacteri um tuberculosis複合体(Mtb)
には、Mycobacterium tuberc ulosis、Mycobacterium bo
vis 、Mycobacteriu m africanum 及びMycobacterium mi
croti がある。最初の３つはヒト病原性であり最後の１
つは動物病原体である。これらの生物は皮膚で緩徐に増
殖する肉芽腫を生じるか又は内部器官を侵す。肺の結核
菌は循環系、リンパ系又は消化管によって体内の別の部
分に伝播される。公衆衛生が進歩し有効な化学療法が発
達したにも拘わらずMycobacterium 疾患特に結核は依然
として全世界的に重要な健康問題である。
【００６１】被検標本の細菌を検出する従来の方法にお
いては、観察可能コロニー増殖物中に存在する同定及び
計数可能な細菌細胞の数を増加するために標本を培養す
る。所望の場合、抗菌剤感受性を決定するために培養物
を更に試験する。現状で、Mycobacterium 種を検出、分
離及び同定するための最も普及した手順は、(Ziehl-Nee
lsen又はフロオロクロム（fluorochrome）法を用いる）
酸耐性桿菌(AFB) スミア、 Lo-wenstein-Jensen 培地及
びMiddlebrook 培地を用いる培養方法及び生化学試験で
ある。AFB は、酸−アルコールに暴露した後に色素を保
持するMycobacterium の高含量の脂質を利用する。AFB
スミア試験は比較的速やかで処理も簡単であるが、Myco
bacterium を必ず検出するとは限らない。また、Mycoba
cteriu mavium と非結核種との識別及びMycobacterium i
ntracellulareと非結核種との識別又はMycobacte rium t
uberculosis -桿菌複合体と非結核種との識別ができな
い。感染性Mycobacterium 種を正確に同定するために
は、臨床医は、常に３〜８週間の増殖期間を必要とし、
その後に広汎な生化学試験を行なって培養結果を得る。
14C 標識基質を用いたMycobacterium の代謝産物の検出
に基づく別の試験方法も開発された。特に、 Bactec(T
M) 器具は、接種後６〜10日以内にMycobacterium の存
在を検出し得る。Gill、V.J.等、上掲。しかしながら、
この検査ではMycobacterium の種を識別できない。生物
が感受性をもつ特定薬剤を処方するためにはこのように
種を識別することがしばしば極めて重要である。このた
めに、従来の培養方法ではさらに２〜３週間を必要と
し、Bactec法ではさらに６〜10日を要する。
【００６２】更に、Mycoplasma pneumoniae 、Mycobact
erium 、Legionella、S almonella、Chlamydia trachoma
tis 、Campylo bacter 、Proteus mirabilis 、Enteroco
ccus、Enterobacter cloacae、E.coli、Pseudomonas Ｉ
群、細菌、菌類及びNeisseri a gonorrhoeae に関する特
定具体例も以下の実施例に記載する。
【００６３】以下の実施例に示すように、本発明は、試
験の正確さ、特異性及び簡便さ等においても前記のごと
き従来技術の方法のいずれよりもはるかに有利であり、
同時に、診断所要時間を大幅に短縮する。本発明によれ
ば検査の当日に最終診断を与え有効な治療を開始するこ
とが可能である。
【００６４】実施例１ 非反復配列をもつ所定の長さの単鎖デオキシオリゴヌク
レオチドを以下のごとく調製し、標識し、Mycobacteriu
m avium に由来のrRNAの存在を検出するための溶液ハイ
ブリダイゼーションアッセイのプローブとして使用す
る。この非反復配列は、Mycobacteri um avium のrRNAに
特異的であり、この実施例のハイブリダイゼーション条
件下では近縁のMycobacterium int racellulareを含めて
いかなる別の細菌種又は呼吸器感染物質に由来の核酸と
も有意に交差反応しない。このプローブは２つの種の間
に約98％のrRNA相同が存在するときにも両者を識別し得
る。この実施例では実施例２及び３と同様に、 16S rRN
A の高保存領域に対する特異的プライマーを使用するこ
とによって、M. avium、M. tuberculosis 複合体、M.in
tracellulare 及び近縁生物に対する配列を得た。大腸
菌E. coli rRNA に由来のこのプライマー配列は、 ５′-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT-３′ であった。0.1M KClと 20mM トリス-HCl pH8.3との存在
下に５ngのプライマーと配列決定すべき１μg の各rRNA
とを混合し最終容量10μl にした。反応混合物を45℃で
10分間加熱し、氷に載せ、 2.5μl の35S dATPと 0.5μ
l の逆転写酵素とを添加した。標本を４つの部分試料に
分けて夫々試験管に入れた。各試験管は夫々、ジデオキ
シＡ、Ｇ、Ｔ又はＣを収容していた。これらのヌクレオ
チドの濃度はLane等、上掲、に記載されている。標本を
40℃で30分間インキュベートし、次に、エタノール沈殿
させ、遠心し、ペレットを凍結乾燥した。ペレットを10
μlのホルムアミド色素(100％ホルムアミド、 0.1％ブ
ロモフェノールブルー、 0.1％キシレンシアノール）に
再懸濁させ、80cmの 8％ポリアクリルアミドゲルに充填
した。ゲルに 2000Vを２〜４時間通電した。
【００６５】Mycobacteri um avium の16S rRNAのヌクレ
オチド配列と系統分類学的に最も近縁の細菌、即ちMyco
bacterium intracellulare及びMycobacterium t ubercul
osisの16S rRNAのヌクレオチド配列とをLane、D.J.等、
Proc. Nat. Acad. Sci. USA82：6955（1985）の方法で
決定した。上記生物のrRNA配列の決定に加えて、臨床的
に有意な一連のMycobacterium の配列決定を行なった。
これらは、 M. fortuitum 、M. scrofulaceum 及びM.ch
elonaeである。Mycobacterium に近縁の幾つかの属のい
くつかの生物を選択しこれらについても配列決定を行な
った。これらは、Rhodococcus bronchialis 、Coryneba
cter ium xerosis 及びNorcardia asteroidesである。
【００６６】Intelligenetics 、Inc.、1975 E1 Camino
Real West、Mountain View 、California 94040-2216
(IFIND Program)から市販されているソフトウェアを使
用し、前記生物に由来の部分rRNA配列を最大ヌクレオチ
ド相同になるように整列させた。この整列からMycoba ct
erium avium に特有の配列の領域を決定した。プローブ
が標的核酸配列に完全に相補的であり且つプローブが系
統分類学的に最も近縁の既知の生物由来のrRNAと整列し
たときに10％以上の不整合をもつようにプローブを選択
した。長さ38塩基の配列を選択した。Mycobacterium av
ium 配列に対する不整合塩基の数は以下の通りであっ
た。Mycobacterium tuberculo sis(8)；Mycobacterium i
ntracellulare(5)；Mycob acterium scro-fulaceum(6)；
Mycobacterium ch elonae(12)及びMycobacte-rium for tu
itum(10)。
【００６７】７〜８頁で記載した長さ、Tm及び配列解析
等の判定基準によってcDNA配列 ACCGCAAAAGCTTTCCACCAGAAGACATGCGTCTTGAG の特性を決定し、Mycobacterium avium のrRNAに特異的
であることを知見した。この配列はMycobacterium aviu
m の 16S rRNA で検出された非反復セグメントに相補的
である。プローブのサイズは38塩基である。プローブの
Tm値は74℃であり、Maxam 及びGilbert 法（1980）、上
掲、を用いた配列解析によってプローブが正しく合成さ
れたことを確認した。プローブは、E.coli 16SrRNAの塩
基 185〜225 に対応する領域でM.avium のrRNAにハイブ
リダイズし得る。
【００６８】Mycobacteri um avium に対するこの配列の
反応性を証明するために、この配列を以下の条件下のハ
イブリダイゼーション反応のプローブとして試験した。
32P末端標識オリゴヌクレオチドプローブをMy cobacteri
um avium 由来の1 μg (7×10-13モル）の精製rRNAと混
合し、0.12M PBハイブリダイゼーションバッファ（等モ
ル量のNa2HPO4及びNaH2PO4）、1mM EDTA及び0.02％ SDS
（ドデシル硫酸ナトリウム）中で65℃で60分間反応させ
最終容量50μl にした。別々の試験管で、標的を含むハ
イブリダイゼーションバッファ及び標的を含まないハイ
ブリダイゼーションバッファの夫々とプローブとを混合
した。２頁に引用した特許出願に記載のごとくヒドロキ
シアパタイトで分離し、ハイブリッドをシンチレーショ
ンカウンティングで定量した。これらの結果を表１に示
す。この結果は、相同性標的に対するプローブの反応度
が高いこと及びヒドロキシアパタイトに対する非特異的
結合がきわめて少ないことを示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】プローブのM. avium特異性を試験するため
に、 Murphy 等の米国特許出願第841860号に記載の超音
波破壊法で別の29のMycobacterium 種の細胞から遊離さ
れたrRNAと32P 標識プローブとを混合した。１×108細
胞を 0.1mlの５％ SDSに懸濁させ、50〜60℃で10分間超
音波処理した。1.0 mlのハイブリダイゼーション バッ
ファ（45％ジイソブチルスルホコハク酸ナトリウム、40
mMリン酸バッファpH6.8 及び1mM EDTA）を添加し、混合
物を72℃で60分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、4.0ml のヒドロキシアパタイト溶液（溶液50ml
当たり0.14M リン酸ナトリウムバッファ pH6.8、0.02％
SDS及び 1.0ｇヒドロキシアパタイト）を添加し、72℃
で５分間インキュベートした。サンプルを遠心し、上清
を除去した。4.0 mlの洗浄液（0.14M リン酸ナトリウム
pH6.8）を添加し、サンプルを渦流で攪拌し、遠心し、
上清を除去した。ヒドロキシアパタイトに結合した放射
能をシンチレーションカウンティングで測定した。結果
を表２に示す。この結果は、プローブがMycobacterium
avium に特異的であること及びMycobacterium i ntracel
lulareを含むその他のMycobacterium 種とは反応しない
ことを示す。
【００７１】
【表３】
【００７２】また表３は、同じく前記方法で試験すると
プローブがいかなる呼吸器病原体に由来のrRNAとも反応
しなかったことを示す。また同じ方法で試験すると、プ
ローブはその他のいかなる近縁の細菌種及び系統分類学
的により多様な細菌種とも反応しないことが判明した
（表４）。
【００７３】
【表４】
【００７４】
【表５】
【００７５】実施例２ 実施例１に記載のごとく整列後に、前記判定基準、即ち
長さ、Tm及び配列解析によって配列、 ACCGCAAAAGCTTTCCACCTAAAGACATGCGCCTAAAG の特性を決定し、Mycobacterium intracellulareに特異
的であることを知見した。 この配列はMycobacterium
intracellulareの16S rRNAに検出される非反復セグメン
トに相補的である。プローブのサイズは38塩基であっ
た。プローブのTm値は75℃であり、配列解析によってプ
ローブが正しく合成されたことを確認した。プローブは
E.coli 16S rRNA の塩基 185〜225 に対応する領域でM.
intracellulareのRNA にハイブリダイズする。
【００７６】Mycobacteri um intracellulareに対するこ
の配列の反応性を証明するために、プローブを以下の条
件下のハイブリダイゼーション反応で試験した。32P 末
端標識オリゴヌクレオチドプローブを１μg （７×10
-13モル）のMycobacterium i ntracellulareに由来の精
製rRNAと混合し、0.12M PB（等モル量のNa2HPO4及びNaH
2PO4）、1mM EDTA及び0.02％ SDS（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）中で65℃で60分間反応させ最終容量50μl にし
た。別々の試験管で標的Mycobacterium intr acellulare
rRNA を含むハイブリダイゼーションバッファ及びこの
標的を含まないハイブリダイゼーションバッファの夫々
とこのプローブとを混合した。前記のごとくヒドロキシ
アパタイトで分離し、ハイブリッドをシンチレーション
カウンティングで定量した。これらの結果を表５に示
す。
【００７７】
【表６】
【００７８】これらのデータは、相同性標的に対するプ
ローブの反応度が高いこと及びヒドロキシアパタイトに
対する非特異的結合がきわめて少ないことを示す。
【００７９】プローブのMycobacterium intracellulare
特異性を試験するために、Murphy等の米国特許出願第84
1860号に記載の超音波破壊法で別の29のMycobacterium
種の細胞から遊離されたrRNAと32P 標識プローブとを混
合した。実施例１と全く同様にハイブリダイゼーション
アッセイを行なった。結果を表６に示す。表６は、プロ
ーブがMycobac terium intracellulareに特異的であるこ
と及びMycobacteriuma vium を含むその他のMycobacteri
um 種とは反応しないことを示す。これらの結果は、Myc
obacter ium intracellulareの rRNA がM.avium に98
％、M.kansa siiに98％、M.asiaticum に98％及びM.tube
rculosisに97％の相同をもつことを考えると極めて衝撃
的である。
【００８０】
【表７】
【００８１】また表７は、ハイブリダイゼーションアッ
セイで試験するとプローブがいかなる呼吸器病原体に由
来のrRNAとも反応しなかったことを示す。また同じ方法
で試験すると、プローブはその他のいかなる近縁の細菌
種及び系統分類学的により多様な細菌種とも反応しない
ことが判明した（表８）。
【００８２】
【表８】
【００８３】
【表９】
【００８４】実施例３ 実施例１に記載のごとく整列後に、前記の３つの判定基
準、即ちサイズ、配列及びTm値によって配列 １．TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTG の特性を決定し、 Mtb−生物複合体、Mycoba cterium tu
ber-culosis 、Mycobacterium afr icanum 、Mycobacter
ium bovis 及びMycobacterium microtisに特異的である
ことを決定した。
【００８５】この配列はMtb-細菌複合体の16S rRNAで検
出される非反復セグメントに相補的である。プローブの
サイズは35塩基である。プローブのTm値は72℃であり、
配列解析によってプローブが正しく合成されたことを確
認した。このプローブはE.coli 16S rRNA の塩基 185〜
225 に対応する領域にハイブリダイズし得る。
【００８６】Mtb 複合体に対するこの配列の反応性を証
明するために、プローブを以下の条件下のハイブリダイ
ゼーション反応で試験した。32P 末端標識オリゴヌクレ
オチドプローブを１μｇ（７×10-13モル）のMycobacte
rium t uberculosisの精製rRNAと混合し、 0.12M PB ハ
イブリダイゼーションバッファ（等モル量のNa2HPO4及
びNaH2PO4) 、 1mM EDTA 及び0.02％ SDS（ドデシル硫
酸ナトリウム）中で65℃で60分間反応させ最終容量50μ
ｌにした。別々の試験管でプローブを標的Mycobacteriu
m tuberculosis rRNA を含むハイブリダイゼーションバ
ッファ及びこの標的を含まないハイブリダイゼーション
バッファと夫々混合した。前記のごとくヒドロキシアパ
タイトで分離し、ハイブリッドをシンチレーションカウ
ンティングで定量した。これらの結果を表９に示す。
【００８７】
【表１０】
【００８８】これらのデータは、相同性標的に対するプ
ローブの反応度が高いこと及びヒドロキシアパタイトに
対する非特異的結合がきわめて少ないことを示す。
【００８９】プローブのMtb 複合体特異性を試験するた
めに、 Murphy 等の米国特許出願第841860号に記載の超
音波破壊法で４種類の Mtb- 桿菌複合体及び別の２５の
Mycobacterium 種の細胞から遊離されたrRNAと32P 標識
プローブとを混合した。実施例１と全く同様にハイブリ
ダイゼーションアッセイを行なった。表１０は、プロー
ブがMtb 複合体中の生物に特異的であること及び他のMy
cobacterium 種とは反応しないことを示す。
【００９０】
【表１１】
【００９１】また表１１は、ハイブリダイゼーションア
ッセイでプローブがいかなる呼吸器病原体由来のrRNAと
も反応しなかったことを示す。また同じ方法で試験する
と、プローブはその他のいかなる近縁の細菌種または系
統分類学により多様な細菌種とも反応しないことが判明
した（表１１）。
【００９２】
【表１２】
【００９３】
【表１３】
【００９４】実施例３のプローブの２つの誘導体（以下
のプローブ２及び３）を作製し試験した。
【００９５】 ２．CCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCG ３．ACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATC ３つのプローブはすべて同様のTm値（夫々72℃、73.5℃
及び72.3℃）及び同様のハイブリダイゼーション特性を
有していた。
【００９６】Mycobacteri um tuberculosis生物複合体に
対するハイブリダイゼーションは68〜75％でありヒドロ
キシアパタイトに対する非特異的ハイブリダイゼーショ
ンは2％未満であった。
【００９７】これらの誘導体のハイブリダイゼーション
アッセイ試験の結果を以下に示す。
【００９８】
【表１４】
【００９９】実施例４ 23S rRNAの高保存領域に相補的なプライマーを使用しM.
tuberculosis 複合体の23S rRNAに特異的なプローブを
作製した。E.coli rRNA に由来のこのプライマーの配列
は ５′-AGG AAC CCT TGG GCT TTC CG-３′ であった。5ng のこのプライマーを１μｇのM. tu bercu
losis 由来のrRNA及び別の近縁Mycobacterium 由来のrR
NAと混合し、実施例１、２及び３に記載の手順で処理し
た。実施例１に記載のごとく整列後に、配列 TGCCCTACCCACACCCACCACAAGGTGATGT がMtb 生物複合体、Mycobacterium tubercul osis、Myco
-bacterium africanum、Mycobacter ium bovis 及びMy co
bac-terium microtiに特異的であることを決定した。
【０１００】この配列はMtb-細菌複合体の23S rRNAで検
出される非反復セグメントに相補的である。長さ、Tm値
及び配列解析に関する判定基準によって前記のごとくオ
リゴヌクレオチドプローブの特性を決定した。プローブ
のサイズは31塩基である。プローブのTm値は72.5℃であ
り、配列解析によってプローブが正しく合成されたこと
が確認された。このプローブはE.co li 23S rRNA の塩基
1155〜1190に対応する領域にハイブリダイズし得る。
【０１０１】Mtb 複合体に対するこの配列の反応性を証
明するために、プローブを以下の条件下のハイブリダイ
ゼーション反応で試験した。32P 末端標識オリゴヌクレ
オチドプローブを１μｇ（７×10-13モル）のMycobacte
rium t uberculosisの精製rRNAと混合し、0.12M PB（等
モル量のNa2HPO4及びNaH2PO4）、1mM EDTA及び0.02％SD
S（ドデシル硫酸ナトリウム）中で65℃で60分間反応さ
せ最終容量５０μl にした。別の試験管でプローブを、
標的Mycobac terium tuberculosis rRNA を含むハイブリ
ダイゼーションバッファ及びこの標的を含まないハイブ
リダイゼーションバッファと夫々混合した。前記のごと
くヒドロキシアパタイトで分離し、ハイブリッドをシン
チレーションカウンティングで定量した。これらの結果
を表１４に示す。
【０１０２】
【表１５】
【０１０３】これらのデータは、相同性標的に対するプ
ローブの反応度が高いこと及びヒドロキシアパタイトに
対する非特異的結合がきわめて少ないことを示す。
【０１０４】プローブのMtb 複合体特異性を試験するた
めに、 Murphy 等の米国特許出願第841860号に記載の超
音波破壊法で４種類の Mtb- 桿菌複合体及び別の25のMy
cobacterium 種の細胞から遊離されたrRNAと32P 標識プ
ローブとを混合した。実施例１と全く同様にハイブリダ
イゼーションアッセイを行なった。表15は、プローブが
Mtb 複合体に特異的であること及び他のMycobacterium
種とは反応しないことを示す。
【０１０５】
【表１６】
【０１０６】実施例５ 23S rRNA に相補的な２つの非反復プライマーを使用し
更に３つのM ycobacterium tuberculosis複合体プローブ
を同定した（実施例５〜７）。第1 配列は CCATCACCACCCTCCTCCGGAGAGGAAAAGG である。この実施例５の配列は、配列 ５′-GGC CAT TAG ATC ACT CC-３′ をもつ23S プライマーを使用して得られた。この配列を
特性決定し、Mycobacterium tuberculosis、M ycobacter
ium africanum 及びMycobacterium bovis 等を含むMyco
bac terium tuberculosisの生物複合体に特異的であるこ
とを知見した。23S rRNA由来のこの配列は長さ31塩基で
Tm値72℃である。このプローブはE.coli 23S rRNA の塩
基540 〜575 に対応する領域で前記生物のRNA にハイブ
リダイズし得る。
【０１０７】Mycobacteri um tuberculosis複合体に対す
るこのプローブの反応性及び特異性を証明するために、
このプローブを以下の条件下のハイブリダイゼーション
反応で試験した。Murphy等、米国特許出願第841860号に
記載の超音波破壊法で30のMycobacterium 種の細胞から
遊離されたrRNAと32P 末端標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブとを混合した。３×107の細胞を0.1ml の５％SDS
に懸濁させ50〜60℃で15分間超音波処理した。１mlのハ
イブリダイゼーションバッファ（45％スルホコハク酸ジ
イソブチル、40mMリン酸バッファpH6.8 、1mM EDTA、1m
M EGTA）を添加し、混合物を72℃で２時間インキュベー
トした。インキュベーション後、４mlの２％(w/v) ヒド
ロキシアパタイト、0.12M リン酸ナトリウムバッファpH
6.8 、0.02％ SDS、0.02％ナトリウムアジドを添加し、
72℃で５分間インキュベートした。標本を遠心し、上清
を除去した。４mlの洗浄液(0.12Mリン酸ナトリウムバッ
ファ pH6.8、0.02％ SDS、0.02％ナトリウムアジド）を
添加し、標本を攪拌し、遠心し、上清を除去した。ヒド
ロキシアパタイトに結合した放射能をシンチレーション
カウンティングによって測定した。結果を表１６に示
す。この結果は、プローブがMycobacterium tuberculos
i s生物複合体に特異的であることを示す。
【０１０８】
【表１７】
【０１０９】表１７は、前記方法で試験するとプローブ
が近縁の生物のいずれに由来するRNA とも交差反応しな
かったことを示す。
【０１１０】
【表１８】
【０１１１】実施例６ 配列５′-CCT GAT TGC CGT CCA GGT TGA GGG AAC CTT T
GG G- ３′をもつ23S プライマーを使用して第２のMyco
bacterium tuberculosis複合体プローブを作製した。こ
のプローブの配列は CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC であった。
【０１１２】23S rRNA由来のこの配列は長さ38塩基でTm
75℃である。これはE.coli 23SrRNAの塩基2195〜2235に
対応する領域にハイブリダイズする。
【０１１３】実施例５の複合体プローブと同様に、この
配列を特性決定しMy cobacterium tuberculosis、Mycoba
cterium a frica-num及びMyc obacterium bovis 等のMyco
bacterium tubercu-losis 生物複合体に特異的であるこ
とを知見した。
【０１１４】Mycobacteri um tuberculosis複合体に対す
るこの実施例６のプローブの反応性及び特異性を証明す
るために、実施例５のプローブに関して記載した条件下
のハイブリダイゼーション反応のプローブとして試験し
た。結果を表18に示す。この結果は、プローブは、稀な
分離株がヒト病原体にはならないMycobacterium thermo
res isti-bileを除くMycobacterium tu berculosis結核菌
群に特異的であることを示す。
【０１１５】
【表１９】
【０１１６】また表１９は、前記方法で試験すると、プ
ローブが系統分類学的に近縁のいかなる生物に由来する
RNA とも交差反応しなかったことを示す。
【０１１７】
【表２０】
【０１１８】実施例７ 実施例６と同じ配列、即ち配列５′-CCT GAT TGC CGT C
CA GGT TGA GGG AAC CTT TGG G- ３′をもつ23S プライ
マーを使用して、別の配列 AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC をもつMycobacteriu m tuberculosis結核菌群プローブを
同定した。
【０１１９】23S rRNA由来のこの配列は長さ31塩基でそ
のTm値は71℃であった。これはE.coli 23S rRNA の塩基
2195〜2235に対応する領域にハイブリダイズする。実施
例５及び６のMycobacterium tuberculosis複合体プロー
ブと同様にこの配列を特性決定し、M ycobacterium tube
rculosis、Mycobacterium africa-num及びMy cobacteriu
m bovis 等のMycobacterium tubercu-losis 生物複合体
に特異的であることを知見した。
【０１２０】Mycobacteri um tuberculosis複合体に対す
るこのプローブの反応性及び特異性を証明するために、
このプローブを実施例５のプローブに関して記載した条
件下のハイブリダイゼーション反応のプローブとして試
験した。表20は、このプローブがMycobacterium tube rc
ulosis生物複合体に特異的であることを示す。
【０１２１】
【表２１】
【０１２２】また表２１は、前記方法で試験するとプロ
ーブが近縁の生物のいずれに由来するRNA とも交差反応
しなかったことを示す。
【０１２３】
【表２２】
【０１２４】特に、オーバーラップするプローブは同じ
特異性をもつ。例えば実施例６及び実施例７のプローブ
を比較するとよい。
【０１２５】 Ex. ６ CTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTCGAGGTTAGATGC Ex. ７ AGGCACTGTCCCTAAACCCGATTCAGGGTTC 所望のハイブリダイゼーション特性をもつプローブを生
じる特定領域から複数の配列が得られる。別の場合に
は、１つのプローブ配列が、１つの塩基だけしか違わな
い別のプローブよりもかなりすぐれている。一般に、標
的生物と非標的生物との間の配列差異（不整合％）が大
きいほど、特定用途に対するプローブの有効性を損なう
ことなくプローブを変性し易い。この現象は実施例３の
プローブ誘導体によっても証明される。
【０１２６】実施例７のプローブは、実施例６のプロー
ブの５′末端に５つの塩基が付加され３′末端から12の
塩基が除去されたものである。２つのプローブは本質的
に同じハイブリダイゼーション特性を示す。
【０１２７】実施例８ Mycobacterium 属はNocardi a、Corynebacterium 及びRh
o-dococcusとの識別が特に難しい。これらの属は共通の
抗原、沈降素及びＧ＆Ｃカウント数をもつ。これらの生
物はまた前記に網羅したMycobacterium 生物に対して92
〜94％の rRNA相同を示す。しかしながら出願人等は近
縁属と交差反応することなくMycobacterium 属のすべて
の菌を検出するプローブを設計した。
【０１２８】16S rRNAに相補的な１つのプライマーと23
S rRNAに相補的な１つのプライマーとを使用し、既に開
示したMycobac-terium種のプローブ以外にMycobacteriu
m 属の菌に特異的な４つのプローブを同定した。配列１
は、配列 ５′-TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA- ３′ をもつ16S プライマーを用いて得られた。配列２、３お
よび４は、配列 ５′-GTG TCG GTT TTG GGT ACG- ３′ をもつ23S プライマーを用いて得られた。配列１はE.co
li 16S rRNA の塩基1025〜1060に対応する領域でMycoba
cteri-um属のRNA にハイブリダイズし得る。配列２〜４
は夫々、我々の数え方で（第２図参照） E.coli 23S r
RNA の塩基1440〜1475、1515〜1555及び1570〜1610に夫
々対応する領域にハイブリダイズする。
【０１２９】配 列 １．CCA TGC ACC ACC TGC ACA CAG GCC ACA AGG ２．GGC TTG CCC CAG TAT TAC CAC TGA CTG GTA CGG ３．CAC CGA ATT CGC CTC AAC CGG CTA TGC GTC ACC TC ４．GGG GTA CGG CCC GTG TGT GTG CTC GCT AGA GGC を特性決定し、Mycobacterium 属に特異性であることを
証明した。
【０１３０】16S rRNAに由来の配列１は長さ30塩基でTm
値は73℃である。23S rRNAに由来の配列２は長さ33塩基
でTm値は75℃である。
【０１３１】23S rRNAに由来の配列３は長さ35塩基でTm
値は76℃である。
【０１３２】23S rRNAに由来の配列４は長さ33塩基でTm
値は73℃である。
【０１３３】Mycobacteri um 属の菌に対するプローブ１
の反応性及び特異性を試験するために、以下の条件下の
ハイブリダイゼーション反応のプローブとして使用し
た。Murphy等の米国特許出願第841860号に記載の超音波
破壊法で30のMycobacterium 種から遊離したrRNAと125
Ｉ標識プローブとを混合した。３×107細胞を0.1ml の
５％ SDSに懸濁させ、50〜60℃で15分間超音波処理し
た。１mlのハイブリダイゼーションバッファ（45％スル
ホコハク酸ジイソブチル、40mMリン酸ナトリウムpH6.8
、1mM EDTA、1mM EGTA）を添加し、混合物を72℃で２
時間インキュベートした。インキュベーション後、２ml
の分離溶液（ 2.5g/l のカチオン性磁性マイクロスフィ
ア、0.17M リン酸ナトリウムバッファ pH6.8、 7.5％ト
リトン X-100(TM)、0.02％ナトリウムアジド）を添加
し、72℃で 5分間インキュベートした。磁性粒子に結合
したRNA:プローブハイブリッドを収集し、上清を除去し
た。１mlの洗浄液（0.12M リン酸ナトリウムバッファ p
H6.8、14％スルホコハク酸ジイソブチル、５％トリトン
X-100 、0.02％ナトリウムアジド）を添加し、粒子を収
集し上清を除去した。この段階を２回繰り返した。磁性
粒子に結合した放射能をガンマカウンタで測定した。こ
の結果を表22に示す。表22は、プローブがMycobacteriu
m 属の生物にハイブリダイズすること及びプローブの組
み合わせによって属の全部の生物を検出できることを示
す。表23はプローブが別の近縁の細菌と反応しないこと
を示す。
【０１３４】
【表２３】
【０１３５】
【表２４】
【０１３６】実施例９ Mycoplasmaは細胞壁をもたない好気性小細菌である。
【０１３７】Mycoplasma pneumoniae は毎年 800万〜15
00万の感染を生じると推定される。感染は無症状のとき
もありまた軽症から重症までの種々の容態の気管支炎及
び肺炎を引き起こすこともある。生物は総人口の約10％
の割合、また学生及び軍人のごとく長期間緊密に接触し
ている集団では10〜50％の割合で肺炎を発病させると考
えられている。
【０１３８】これまでの診断方法では、培養物中で生物
を単離するか又は抗体価の上昇を証明することが必要で
あった。生物を培養するためには、気管から採取した標
本を、細菌増殖インヒビターを含む寒天培地又は二相培
地に接種する。３〜４日間及び７〜10日間の増殖を検査
し、 Mycoplasma の有無を確認する。My coplasma pneum
oniae は、血球吸着テスト（ヒツジ又はモルモットの赤
血球に対する M. pneumo niaeの付着能）、溶血テスト
（血液寒天中でヒツジ又はモルモットの赤血球のβ溶血
を生起する M. pneumoniaeの能力）、特異的抗体による
増殖阻害又は特異的抗体との免疫蛍光によって同定され
る必要がある。本発明はこれらの従来方法のいずれに比
較しても、試験が簡単で且つ診断所要時間が大幅に短縮
されるという利点をもつ。
【０１３９】M. pneumoni ae の5S rRNA に特異的なプロ
ーブは、既知のrRNA配列の比較によって得られた。M. p
neum oniae 、M. galisepticum 及びUreaplasma urealyt
icum（Rogers、M.J.等、1985、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA、82 (1160-1164)、M. capricolum （Hori、 H.
等、1981、Nucl. Acids Res. 9、5407-5410 ）及びSpir
oplasma sp. （Walker、R.T.等、1982 Nucl. Acids Re
s．10、6363-6367)に由来の特定配列を整列させた。整
列は６頁に記載したように行なった。5S rRNA を単離
し、Rogers等に記載の方法で配列決定するか、又は5S r
RNA 中の保存領域に相補的なプライマーを作製し実施例
１〜４に記載のごとく配列決定を行なった。5SrRNA の
保存領域はFox 、G.E.及びWoese 、C.R.、1975、Nature
256:505-507に記載されている。配列 ＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＧ
ＡＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣ がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ に特
異的であることが決定された。
【０１４０】この配列は、E.coli 5S rRNAの塩基65〜10
8 に対応する領域でMycoplasma pneumoni ae の5S rRNA
中の非反復セグメントに相補的であり、Mycoplasma gal
lisepticum、Spiroplasma mir um 及びUreaplasm a ureal
yticumに由来の5S rRNA 配列との比較によって選択され
た。オリゴヌクレオチドプローブを前記のごとく特性決
定した。プローブのサイズは42塩基で Tm 71.5℃であっ
た。
【０１４１】Mycoplasma pneumoniae に対するこの配列
の反応性を証明するために、プローブを以下の条件下の
ハイブリダイゼーション反応で試験した。32P 末端標識
オリゴヌクレオチドプローブを１μg (7×10-13モル)
のMycoplasma pneumonia e 由来の精製rRNAと混合し、0.
12M PB（等モル量のNa2HPO4及びNaH2PO4）、1mM EDTA及
び0.02％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）中で65℃で60
分間反応させ最終容量50μl にした。別々の試験管でプ
ローブと標的M ycoplasma pneumoniae を含むハイブリダ
イゼーションバッファ及び標的を含まないハイブリダイ
ゼーションバッファとを夫々混合した。前記のごとくヒ
ドロキシアパタイトで分離し、ハイブリッドをシンチレ
ーションカウンティングで定量した。これらの結果を表
２４に示す。
【０１４２】
【表２５】
【０１４３】このデータは、相同性標的に対するプロー
ブの反応度が高いこと及びヒドロキシアパタイトに対す
る非特異的結合がきわめて少ないことを示す。
【０１４４】M.pneumonia e 5S プローブの特異性を試験
するために、32P 標識プローブを別のMycoplasma種の細
胞から遊離されたrRNAと混合した。ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイは実施例１と全く同様に行なった。表25
は、プローブがMycopl asma pneumoniae に特異的である
こと及び他のいかなるMycoplasma種とも反応しないこと
を示す。
【０１４５】
【表２６】
【０１４６】また表２６に示すように、プローブはいか
なる別の近縁細菌種又は系統分類学的に多様な細菌種と
も反応しなかった。
【０１４７】
【表２７】
【０１４８】16S rRNAの保存領域に相補的な４つの非反
復プライマーを使用してMycoplasmapneumoniae に特異
的な４つのプローブ配列（配列２〜５）が更に得られ
た。これらの配列は夫々、E.coli16S rRNAの塩基 190〜
230 、 450〜490 、 820〜860及び1255〜1290に対応す
る。プローブ配列１は配列 ５′-GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT-３′ をもつプライマーを使用して得られた。プローブ配列２
は配列 ５′-GTATTACCGCGGCTGCTGGC-３′ をもつプライマーを使用して得られた。プローブ配列３
は配列 ５′-CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC-３′ をもつプライマーを使用して得られた。プローブ配列４
は配列 ５′-CGATTACTAGCGATTCC- ３′ をもつプライマーを使用して得られた。前出の実施例と
同様にして配列決定反応を行なった。M.pneumoniae配列
をMycoplasma g enitalium 、Mycoplasma capricolum 、
Mycopl asma gallisepticum及びSpiroplasma mirum に由
来の配列と比較した。
【０１４９】親出願の実施例に記載した判定基準に基づ
いてプローブ配列 ２．AATAACGAACCCTTGCAGGTCCTTTCAACTTTGAT ３．CAGTCAAACTCTAGCCATTACCTGCTAAAGTCATT ４．TACCGAGGGGATCGCCCCGACAGCTAGTAT ５．CTTTACAGATTTGCTCACTTTTACAAGCTGGCGAC を特性決定し、Mycoplasma pneumoniae に特異的である
ことを知見した。
【０１５０】プローブ２は長さ35塩基でTm値は67℃であ
る。プローブ３は長さ35塩基でTm値は66℃である。プロ
ーブ４は長さ30塩基でTm値は69℃である。プローブ５は
長さ35塩基でTm値は66℃である。
【０１５１】４つのプローブを混合し、先行実施例と同
様に60℃でハイブリダイゼーションアッセイを行なうと
M.pneumoniaeに特異的であることが判明した。プローブ
は別の呼吸器病原体または細菌の系統樹に示されるいか
なる生物とも交差反応しない（表２８）。
【０１５２】
【表２８】
【０１５３】
【表２９】
【０１５４】実施例１０ Legionella 属は22の種を含みこれらはすべてヒト病原性
であり得る。これらの生物は、Legionnaire 疾患、急性
肺炎、またはPontiac 熱、致死性でない急性非肺性熱病
の原因である。Legionella種はまた衰弱した病人に主と
して発症する病院肺炎の原因であることも判明した。
【０１５５】Legionnaire 疾患及びPontiac 熱を含むLe
gionellosis は、臨床症状に基づいて、直接または間接
の蛍光抗体試験、及び、選択的抗菌剤を含む緩衝チャコ
ールイースト抽出物（BCYE）寒天を用いた培養によって
診断され得る。従来技術では１つの試験で種を確定でき
る方法はない（Bergey′s Manual of Systematic Bacte
riology、283 ページ（1984年刊）参照）。蛍光抗体試
験はL egionellaの全部の種を同定することはできず抗体
が存在する少数の種だけしか同定できない。培養方法は
Legionella種の確定的な診断方法ではない。
【０１５６】後述するオリゴヌクレオチド配列は核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイのプローブとして使用さ
れると、Legio-nella の全部の種を正確に同定する。こ
のアッセイは培養試験または抗体試験よりも感度が高く
また同定時間をかなり短縮し従って診断時間をかなり短
縮する。従ってこのアッセイは従来の診断方法をかなり
改良すると考えることができる。
【０１５７】16S 及び23S rRNAの保存領域に相補的な３
つの非反復プライマーを使用することによってLegionel
la種に特異的な３つのプローブ配列が得られた。
【０１５８】配列１は配列 ５′-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C- ３′ をもつ16S プライマーの使用によって得られた。プロー
ブ配列２は配列 ５′-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT- ３′ をもつ23S プライマーの使用によって得られた。プロー
ブ配列３は配列 ５′-GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC ACC AT-３′ をもつ16S プライマーの使用によって得られた。これら
のプライマーの配列決定はこれまでの実施例と同様にし
て行なった。
【０１５９】実施例１に記載の判定基準によって以下の
３つの配列の特性を決定し、Legionella属に特異的であ
ることを証明した。Legionella種に由来の配列と比較す
るために系統分類学的に最も近縁のEscherichia coli、
P seudomonas aeruginosa、Vibrio parahaemoly ticus 及
びAcinet obacter calcoaceticus を使用した。
【０１６０】 １．TACCCTCTCCCATACTCGAGTCAACCAGTATTATCTGACC ２．GGATTTCACGTGTCCCGGCCTACTTGTTCGGGTGCGTAGTTC ３．CATCTCTGCAAAATTCACTGTATGTCAAGGGTAGGTAAGG 16S rRNA由来の配列１は長さ40塩基でTm値は72℃であ
る。23S rRNAに由来の配列２は長さ42塩基でTm値は73℃
である。16S rRNAに由来の配列３は長さ40塩基でTm値は
68℃である。これらの配列は夫々E.coli 16S rRNA の 6
30〜675 、E.coli23S rRNA の 350〜395 及びE.col i 23
S rRNA の 975〜1020に対応する領域でL egionella属のR
NA にハイブリダイズし得る。これらのプローブを一緒
に混合すると平均Tm値73℃が得られる。ポリアクリルア
ミドゲルで分析すると各プローブが正しい長さをもつこ
とが判明し、配列解析によって各々が正確な塩基配列を
もつことが証明された。
【０１６１】３つのプローブを混合しハイブリダイゼー
ションアッセイで使用すると、これらのプローブがLegi
onella属に特異的であることが知見され（表29及び3
0）、別の呼吸器病原体または系統樹から選択されたい
かなる生物とも交差反応しないことが知見された（表31
及び32）。２つ以上のプローブ即ちプローブ混合物を使
用するとアッセイ感度が向上し及び／または検出すべき
非ウイルス生物の数が増加する。
【０１６２】
【表３０】
【０１６３】
【表３１】
【０１６４】23S rRNAの保存領域に相補的な２つのプラ
イマーを利用することによって更に３つのLegionella属
特異的配列（４〜６）が得られた。配列４は配列 ５′-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G- ３′ をもつ23S プライマーから得られた。プローブ配列５及
び６は配列 ５′-AAG CCG GTT ATC CCC GGG GTA ACT TTT- ３′ をもつ23S プライマーから得られた。これらのプライマ
ーを用いた配列決定を先行実施例と同様に行なった。
【０１６５】前記の判定基準に基づいて以下の３つの配
列を特性決定し、Le gionella属に特異的であることを証
明した。Legionella種に由来の配列と比較するために系
統分類学的に最も近縁のEscherichia coli、Pseudomona
s aeru ginosa、Vibrio parahaemolyticus及びAcinetoba
cter calcoace ticus を使用した。
【０１６６】 ４．GCG GTA CGG TTC TCT ATA AGT TAT GGC TAG C ５．GTA CCG AGG GTA CCT TTG TGC T ６．CAC TCT TGG TAC GAT GTC CGA CE.coli 23S rRNA の塩基1585〜1620に対応する領域で 2
3S rRNA に相補的なプローブ４は長さ31塩基でTm値は67
℃である。E.coli 23S rRNA の塩基2280〜2330に対応す
る領域で23S rRNAに相補的なプローブ５は長さ22塩基で
Tm値は66℃である。プローブ５と同じ領域で23S rRNAに
相補的なプローブ６は長さ22塩基でTm値は63℃である。
【０１６７】３つのプローブを前記のプローブ３と混合
しプローブ１〜３で記載したようなハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを行なうと、これらのプローブはLegionel
la属に特異的であり（表３３）、その他の呼吸器病原体
または系統樹に由来のいかなる選択生物とも交差反応し
なかった（表３４及び３５）。２つ以上のプローブ、即
ちプローブ混合物を使用するとアッセイ感度が向上し及
び／または非ウイルス性生物の検出数が増加する。
【０１６８】
【表３２】
【０１６９】
【表３３】
【０１７０】実施例１１ クラミジアChlamydia はグラム陰性の非易動性、偏性細
胞内細菌である。 C.trachomatis 種は、地方病性トラ
コーマ（最も普通の形態の予防可能な視覚障害）、封入
体組織炎及び淋病性リンパ肉芽腫(LGV) に関連する。こ
の細菌は、男性の非淋菌性尿道炎の主因でありまた女性
の子宮頸炎及び急性卵管炎の原因にもなる。感染産道を
通った新生児では眼病またはクラミジア肺炎が起きる。
【０１７１】尿生殖管のC.trachomatis を同定するため
には、例えば臨床標本の間接免疫蛍光染色またはエンザ
イムイムノアッセイのごときいくつかの方法が公知であ
る。しかしながら、選択されている方法は、シクロヘキ
シミド処理したMcCoy 細胞中での生物の培養である。次
に細胞培養物を形態的または蛍光抗体染色によって確認
し生物を同定する。
【０１７２】以下に記載の本発明のオリゴヌクレオチド
配列は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイのプロー
ブとして使用されるとChlamydia trachomatis 分離株を
正確に同定する。このアッセイ試験は培養試験または抗
体試験と等しい感度をもち、培養試験に比較して同定所
要時間従って診断所要時間をかなり短縮する。
【０１７３】種に所属する各菌を同定し識別するための
プローブを使用することに本発明の新規性及び進歩性が
存在する。実際、Kingsbury 、D.T.及びE.Weiss 、1968
J.Bacter iol . 96: 1421〜23 (1968); Moulder、J.
W.、ASM News、vol.50、No.8、(1984)はC.trachomat is
とC.psittacis との間に10％のDNA 相同を報告してい
る。更に、これらの報告は、異なるC.trachoma tis 菌株
においてはDNA 相同が異なっていることを示す。Weisbe
rg、W.G.等はJ.Bactriol.167:570〜574(1986) におい
て、C.psittaciの16S rRNA配列を発表し、C.trachomati
s とC.psittaciとが95％以上のrRNA相同を共有すること
を指摘した。これらの報告より、(1) C.trachoma tis の
すべての菌株にハイブリダイズし得るプローブ、及び
(2) C.trachomatis とC.psittaciとを識別し得るプロー
ブを作製することは難しいと予測された。以下のプロー
ブは両方の目的を果たし得る。
【０１７４】16S 及び23S rRNAの保存領域に相補的な７
つの非反復プライマーを使用してChlamydia trachomati
s に特異的なプローブ配列を作製した。プローブ配列１
は配列 ５′-TCT ACG CAT TTC ACC GCT ACA C- ３′ をもつ16S プライマーから得られた。プローブ配列２は
配列 ５′-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-３′ をもつ16S プライマーから得られた。配列３及び４は配
列 ５′-GGC CGT TAC CCC ACC TAC TAG CTA AT-３′ をもつ16S プライマーから得られた。プローブ配列５及
び６は配列 ５′-CTT TCC CTC ACG GTA- ３′ をもつ23S プライマーから得られた。プローブ配列７及
び８は配列 ５′-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G- ３′ をもつ23S プライマーから得られた。プローブ配列９は
配列 ５′-TCG GAA CTT ACC CGA CAA GGA ATT TC-３′ をもつ23S プライマーから得られた。プローブ配列10は
配列 ５′-CTA CTT TCC TGC GTC A- ３′ をもつ配列のプライマーによって得られた。
【０１７５】以下の10個の配列を実施例１の判定基準を
使用して特性決定しChlamydia trachomatis のrRNAに特
異的であることを証明した。Chlamydia tr achomatis と
比較するために系統分類学的に近縁のChlamydia psitta
ciを使用した。
【０１７６】 １．CCG ACT CGG GGT TGA GCC CAT CTT TGA CAA ２．TTA CGT CCG ACA CGG ATG GGG TTG AGA CCA TC ３．CCG CCA CTA AAC AAT CGT CGA AAC AAT TGC TCC GTT CGA ４．CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA TCG CCA CAT TCG ５．CAT CCA TCT TTC CAG ATG TGT TCA ACT AGG AGT CCT GAT CC ６．GAC GTC GGT CTT TCT CTC CTT TCG TCT ACG ７．CCG TTC TCA TCG CTC TAC GGA CTC TTC CAA TCG 8.CGA AGA TTC CCC TTG ATC GCG ACC TGA TCT ９．CCG GGG CTC CTA TCG TTC CAT AGT CAC CCT AAA AG 10. TAC CGC GTG TCT TAT CGA CAC ACC CGC G 16S rRNAに由来の配列１は長さ30塩基及びTm値は66℃で
ある。
【０１７７】16S rRNA由来の配列２は長さ32塩基及びTm
値は67℃である。
【０１７８】16S rRNA由来の配列３は長さ39塩基及びTm
値は70℃である。
【０１７９】16S rRNA由来の配列４は長さ33塩基及びTm
値は69℃である。
【０１８０】23S rRNA由来の配列５は長さ41塩基及びTm
値は71℃である。
【０１８１】23Sr RNA由来の配列６は長さ30塩基及びTm
値は72℃である。
【０１８２】23S rRNA由来の配列７は長さ33塩基及びTm
値は72℃である。
【０１８３】23S rRNA由来の配列８は長さ30塩基及びTm
値は71℃である。
【０１８４】23S rRNA由来の配列９は長さ35塩基及びTm
値は74℃である。配列10は長さ28塩基及びTm値は72℃で
ある。
【０１８５】プローブの反応性及び特異性をハイブリダ
イゼーションアッセイで試験した。32P 末端標識オリゴ
ヌクレオチドプローブ１及び２を精製RNA または少なく
とも107個の生物から遊離したRNA と、0.55mlの41％ス
ルホコハク酸ジイソブチル、３％のドデシル硫酸ナトリ
ウム、0.03M のリン酸ナトリウム pH6.8、1mM EDTA、1m
M EGTA中で60℃（プローブ１）または64℃（プローブ
２）で1 時間混合した。先行実施例と同様にハイブリッ
ドをヒドロキシアパタイトに結合させ、結合した放射能
の量をシンチレーションカウンティングで測定した。表
36は、プローブ１及び２が被検C.trachomat is のすべて
の血清型に十分にハイブリダイズすることを示す。プロ
ーブ１は被検C.psittaciのいかなる菌株とも全く反応せ
ず、プローブ２は２つの菌株と反応しない。プローブ２
はヒト感染性がわかっている生物であるC.psittaciのヒ
ツジ多発性関節炎菌株と反応する。表３７は混合使用し
たときの125I 標識したプローブ３〜９の反応性及び特
異性を示す。この場合、ハイブリッドを1987年３月２日
出願のArnold等の米国特許第020866号に記載のごとくカ
チオン性磁性粒子に結合させた。これらのプローブは被
検C.trachomatis のすべての菌株に十分にハイブリダイ
ズしC.psitt aciのいかなる菌株ともハイブリダイズしな
い。更にプローブ３〜９を尿生殖管で普通に検出される
一連の生物（表３８）及び生物の系統分類学的クロスセ
クション（表３９）に対して試験した。いずれの場合に
も、プローブが特異的であることが判明した。プローブ
10はC.psittaciに25％非相同でまたC.trachomatis に特
異的である。
【０１８６】
【表３４】
【０１８７】
【表３５】
【０１８８】
【表３６】
【０１８９】
【表３７】
【０１９０】実施例１２ Campylobacter は易動性、微好気性、グラム陰性の曲が
った桿菌である。この属は極めて多様であり別の属とは
顕著に異なる。この属は十分に定義されているが種のレ
ベルではある程度修正された（Romaniuk、P.J.等、J.Ba
ctriol. 169: 2137-2141(1987) ）。３つのCampylobact
er 種、Campylobacter jejuni、C.coli及びC.laridis
はヒトの腸炎の原因になる。この疾患は下痢、発熱、吐
き気、腹痛及びある場合にはおう吐等の症状を伴う。こ
れらの３種類の生物は米国で毎年200万の感染を生じる
と推定される（推定値は下痢疾患を誘発したSalmonella
及びShigellaの数に基づく）。この属の別の菌はヒトの
敗血症並びにヒツジ及びウシの流産及び不妊の原因とな
る。
【０１９１】Campylobact er 腸炎を診断するための現行
の方法は、生物を培養によって増殖させて単離し多数の
生化学試験を行なう手順を含む。Campylobacter の最適
増殖には低酸素圧及び高温（42℃）のごとき特殊条件を
要する。１つの条件の組み合わせがすべてのCampylobac
ter 種の増殖に好ましいわけではない。
【０１９２】以下のオリゴヌクレオチド配列は、ハイブ
リダイゼーションアッセイで使用されると該当Campylob
act er 種の16S rRNAにハイブリダイズする。本発明は、
従来のCampylobacter 検出方法に比較して顕著な利点を
もつ。何故なら１つのプローブが該当Campylobacter 全
部を検出でき残りの２つのプローブが腸内Campyl obacte
r を検出でき１つがCa mpylobacter のヒト分離株を検出
できるからである。更に、本発明プローブは従来方法に
比較してアッセイが容易であり同定時間従って診断時間
を大幅に短縮するという利点をもつ。
【０１９３】16S rRNAに相補的な３つの非反復プライマ
ーを使用し該当Campylobacter 種の16S rRNAにハイブリ
ダイズする４つのプローブを作製した。配列１及び２は
配列 ５′-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C- ３′ をもつ16S rRNAプライマーを使用して作製された。配列
３は配列 ５′-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-３′ をもつ16S プライマーを使用して作製された。配列４は
配列 ５′-GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT-３′ をもつ16S rRNAプライマーを使用して作製された。
【０１９４】以下の配列を特性決定しCampylobacter je
juni、C.coli及びC.laridis にハイブリダイズすること
を証明した。系統分類学的に最も近縁のVibrio parahae
molyticus及びWollinella succinogenesをCampylocact
er 配列との比較に使用した。
【０１９５】１．CGC TCC GAA AAG TGT CAT CCT CC ２．CCT TAG GTA CCG TCA GAA TTC TTC CC ３．GCC TTC GCA ATG GGT ATT CTT GGT G ４．GGT TCT TAG GAT ATC AAG CCC AGG 16S rRNAに由来の配列１は長さ23塩基及びTm値は65℃で
ある。16S rRNAに由来の配列２は長さ26塩基及びTm値は
64℃である。16S rRNA由来の配列３は長さ25塩基及びTm
値は66℃である。16S rRNAに由来の配列４は長さ24塩基
及びTm値は61℃である。配列１はE.coli 16S rRNA の塩
基 405〜428 に対応する領域にハイブリダイズし得る。
配列２はE.coli 16S rRNA の塩基 440〜475 に対応する
領域にハイブリダイズし得る。配列３はE. coli 16S rRN
A の塩基 705〜735 に対応する領域にハイブリダイズし
得る。配列４はE.coli 16S rRNA の塩基 980〜1010に対
応する領域にハイブリダイズし得る。
【０１９６】Campylobacter プローブの反応性及び特異
性をハイブリダイゼーションアッセイで試験した。32P
末端標識オリゴヌクレオチドプローブと精製RNA または
細胞から遊離したRNA とを 0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ム中で混合した。0.5ml のハイブリダイゼーション溶液
（41％のスルホコハク酸ジイソブチル、30mMリン酸ナト
リウム pH6.8、 0.7％ドデシル硫酸ナトリウム、1mM ED
TA、1mM EGTA）を添加し、混合物を60℃で１〜1.5 時間
インキュベートした。インキュベーション後、２〜2.5m
l の分離溶液（２％ヒドロキシアパタイト、0.12M リン
酸ナトリウムpH6.8 、0.02％ドデシル硫酸ナトリウム）
を添加し、混合物を60℃で５分間インキュベートした。
標本を遠心し、上清を除去した。2.5 mlの洗浄液（0.12
M リン酸ナトリウム pH6.8、0.02％ドデシル硫酸ナトリ
ウム）を添加し、標本を攪拌し、遠心し、上清を除去し
た。ヒドロキシアパタイトに結合した放射能をシンチレ
ーションカウンティングで測定した。
【０１９７】表４０はプローブが該当Campylobacter
種、C.jejuni、E.coli及びC.laridisに十分にハイブリ
ダイズすることを示す。プローブ１は被検Campylobacte
r 種をすべて検出し、プローブ２及び４は腸内Campylob
acter だけを検出し、プローブ３は、ウシから単離され
た生物たるC.sputorum以外のCampylobacter 種をすべて
検出する。従ってすべてのプローブが便標本中のCampyl
obacter の同定に有効である。その他の用途に使用する
ためにどのプローブを選択するかは所望の特異性レベル
次第である（即ち、腸内Campylobacter またはすべての
Camp ylobacter 種）。
【０１９８】
【表３８】
【０１９９】表４１はプローブが近縁の生物または消化
管で検出された生物とハイブリダイズしないことを示
す。
【０２００】
【表３９】
【０２０１】腸内Campylobacter に特異的なプローブ即
ちプローブ２及び４を更に試験すると、消化管で検出さ
れるその他の生物のrRNAと反応しないことが判明した。
【０２０２】
【表４０】
【０２０３】実施例１３ Streptococcus （連鎖球菌）はグラム陽性、オキシダー
ゼ陰性の球菌である。この属は群特異性炭水化物に基づ
いて A〜R の18の群に分類される。D 群のStreptococcu
s は更にenterococcus（腸球菌）（S.faecium 、S.faec
alis、S.avium及びS.gallinarum）と非enterococcus
（S.bovis 及びS.equinus ）に細分される。S.faecium
、S.faecalis及びS.avium は医学的に重要なenterococ
cusであると考えられる。いくつかのStreptococcus 種
がヒト病原体である。他に、口腔及び腸にノーマルフロ
ーラを生じるが別の部位に導入されると病気の原因にな
るものもある。２つの例は、S .faecium 及びF.f aecalis
であり、これらは腸内で普通に検出されるが菌血症、傷
感染を生じることもあり、米国では尿路感染が10％もあ
る。
【０２０４】enterococcusの現行の検出方法では、標本
を18〜72時間培養し一連の生化学試験を行なう必要があ
る。以下のオリゴヌクレオチド配列はハイブリダイゼー
ションアッセイで使用されると、Strep tococcus faecal
is、S.avium 及びS.faeciumを正確に検出する。本発明
のプローブは、DNA 相同において極めて近縁の別のStre
ptococcus またはStaphylococcusと交差反応しない（Ki
epper-Baez、1981、1982、Sch-liefer 1984 ）。本発明
はまた、標本に対して必要な試験の数を減らし、従って
同定即ち診断に要する時間を大幅に短縮する。これは従
来方法に比較して顕著な利点である。
【０２０５】配列 ５′-CCG CTT GTG CGG GCC CCC GTC AAT TC-３′ をもつ16S rRNAに相補的なプライマーを使用してプロー
ブ配列を同定した。以下の配列を特性決定すると３つの
enterococcus即ちS.faecium 、S.faecalis及びS.avium
に特異的であることが判明した。該当配列と比較するた
めに、系統分類学的に最も近縁のS.agalactiae、S.bovi
s 、S.pneumoniae及びS.pyogenesを使用した。
【０２０６】 １．TGC AGC ACT GAA GGG CGG AAA CCC TCC AAC ACT TA 配列は長さ35塩基でTm値は72℃である。この配列はE.co
li 16S rRNAの塩基 825〜860 に対応する領域にハイブ
リダイズし得る。プローブの反応性及び特異性を証明す
るために、精製RNＡまたは細胞から遊離したRNA とのハ
イブリダイゼーションアッセイに使用した。少なくとも
107個の細胞を２％ドデシル硫酸ナトリウム中に含むガ
ラスピーズの存在下に攪拌した。 0.1mlの懸濁液を0.1m
l のハイブリダイゼーションバッファ（0.96M リン酸ナ
トリウム pH6.8、 0.002M EDTA、0.002M EGTA ）と混合
し、65℃で２時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、５mlのヒドロキシアパタイト、0.12M リン酸ナ
トリウムpH 6.8、0.02％ドデシル硫酸ナトリウムを添加
し、混合物を65℃で10分間インキュベートした。標本を
遠心し、上清を除去した。５mlの洗浄液（0.12M リン酸
バッファ pH6.8、0.02％ドデシル硫酸ナトリウム）を添
加し、標本を攪拌し、遠心し、上清を除去した。ヒドロ
キシアパタイトに結合した放射能の量をシンチレーショ
ンカウンティングで測定した。表４３はプローブがS.fa
ecium 、S.faecalis及びS.avium と十分に反応しその他
の近縁生物とは反応しないことを示す。
【０２０７】
【表４１】
【０２０８】実施例１４ Pseudomonas はグラム陰性、胞子非形成性、非発酵性桿
菌である。Pseudomonas は土中及び水中に棲息し健康な
人間にはまれにしか感染しない。既に衰弱した病人に対
してはこの生物は種々の臨床的症状、例えば傷口感染、
手術後感染、敗血症、小児下痢及び呼吸器及び尿路感染
を生じ得る。この生物は抗生物質に耐性であるためPseu
domonas 属の各菌を臨床標本中で同定することが特に重
要である。核酸相同の研究によって属はRNA 群Ｉ〜Ｖと
して知られる５つの相同群に分類されている。Ps eudomo
nas の臨床単離物全部のうちの83％がRNA 群Ｉに由来
し、これまではPseu domonas aeruginosaが最も多く単
離されている。
【０２０９】Pseudomonas の現行の検出方法では患者の
標本を24〜72時間培養しその後に一連の生化学試験を行
なう必要がある。下記のオリゴヌクレオチド配列はハイ
ブリダイゼーションアッセイで使用されると臨床的に重
要なＩ群のPseudomonas を検出する。本発明は標本に対
して行なう試験の数を減らし検出までの所要時間を短縮
する。これは従来方法に比較して顕著な進歩である。
【０２１０】配列 ５′-CTT TCC CTC ACG GTA- ３′ をもつ23S rRNAの保存領域に相補的なプライマーを使用
して配列を作製した。以下の配列はＩ群Pseudomonas を
検出することが判明した。
【０２１１】 １．CAG ACA AAG TTT CTC GTG CTC CGT CCT ACT CGA TT プローブは長さ35塩基でTm値は70℃である。プローブは
E.coli 23S rRNA の塩基 365〜405 に対応する領域でＩ
群Pseudomonas のRNA にハイブリダイズし得る。プロー
ブの反応性及び特異性を証明するために、ハイブリダイ
ゼーションアッセイに使用した。32P 末端標識オリゴヌ
クレオチドと少なくとも107個の細胞から遊離したRNA
とを、0.48M リン酸ナトリウム pH6.8、１％ドデシル硫
酸ナトリウム、１mM EDTA 、１mM EGTA ）中で標準方法
で混合し、65℃で２時間インキュベートした。インキュ
ベーション後、RNA:DNA ハイブリッドを先行実施例の記
載と同様にヒドロキシアパタイトに結合させ、結合放射
能をシンチレーションカウンティングで測定した。表４
４は試験したＩ群Pseudomonas の８つの種のすべてに対
してプローブが十分に反応したことを示す。プローブは
II群またはＶ群の生物に由来のRNA とは反応しなかっ
た。臨床標本に由来の非発酵性Bacillusの分離株全体の
１％未満に相当するIII 群の生物Pseudomonas acidovor
ans との反応は少なかった。表４５は試験したその他の
近縁生物に対してプローブが反応しないことを示す。
【０２１２】
【表４２】
【０２１３】実施例１５ 実施例１５〜１８はEnterobact eriaceae用プローブにつ
いて説明する。これらの生物はすべてDNA レベルで極め
て近縁である。 rRNA レベルでの差異は更に少ない。例
えば、Proteus vulgaris 16S rRNA はE.coliに95％相同
である。これらの要因は、このグループの生物に特異的
な rRNA プローブの作製に困難が伴うことを示唆する。
しかしながら、我々は、Enterobact er cloacae、Proteu
s mirabilis 、Salmonella及びE.coliのプローブを作
製した。
【０２１４】Enterobacte r属の生物は、Enterobacteria
ceae族に所属する易動性、グラム陰性、胞子非形成性桿
菌である。この属は大きい不均一なグループである。８
つの種が定義されているが臨床的に重要なものは５種で
ある。Enterobacter cloaca e 及びE.aerogene s は最も
多い分離株であり、ヒトの尿生殖器、肺、血液、中枢神
経系及び軟組織の感染に関連する。
【０２１５】患者の標本からEnterobacter cloacaeを同
定する現行の方法は、寒天プレート上で標本を18〜24時
間培養し一連の生化学試験を行なう手順を含む。以下の
オリゴヌクレオチド配列は核酸ハイブリダイゼーション
アッセイのプローブとして使用されると、Enterobacter
cloacaeを正確に同定する。本発明は標本に対して行な
う試験の数を減らし同定に要する時間従って診断所要時
間を短縮する。これは従来方法に比較して顕著な改良で
ある。
【０２１６】配列 ５′-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT- ３′ をもつ 23S rRNA の保存領域に相補的なプライマーを使
用してEnterobacter cloacae特異的プローブが得られ
た。
【０２１７】配列 １．GTG TGT TTT CGT GTA CGG GAC TTT CAC CC を特性決定しE.cloacae に特異的であることを証明し
た。E. cloacaeの配列と比較するために、系統分類学的
に最も近縁の生物Escherichia coli、Klebsiella pneum
oniae 、Pr oteus vulgaris、Salmonella enteritidis及
びCitrobacter fre undiiを使用した。
【０２１８】プローブは長さ29塩基で Tm 68℃である。
プローブはE.coli 23S rRNA の塩基305〜340 に対応す
る領域でE.cloacae のＲＮＡにハイブリダイズし得る。
E.cloacae に対するプローブの反応性及び特異性を証明
するためにこれをハイブリダイゼーションアッセイで使
用した。32P 末端標識オリゴヌクレオチドプローブと少
なくとも107個の生物から遊離したRNA とを１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム、0.48M リン酸ナトリウム pH6.8中で
混合し（最終容量0.2ml ）、60℃で２時間インキュベー
トした。インキュベーション後、５mlの 2％ヒドロキシ
アパタイト、0.12M リン酸ナトリウム pH6.8、0.02％ド
デシル硫酸ナトリウムを添加し、混合物を60℃で10分間
インキュベートした。標本を遠心し、上清を除去した。
５mlの洗浄液(0.12Mリン酸ナトリウム pH6.8、0.02％ド
デシル硫酸ナトリウム）を添加し、標本を攪拌し、遠心
し、上清を除去した。ヒドロキシアパタイトに結合した
放射能の量をシンチレーションカウンティングで測定し
た。結果を表４６に示す。表４６は、プローブがE.cloa
cae と十分に反応し近縁生物のRNA とは反応しないこと
を示す。
【０２１９】
【表４３】
【０２２０】表４７はプローブが尿中で検出される生物
のRNA と反応しないことを示す。
【０２２１】
【表４４】
【０２２２】実施例１６ Proteus 属の生物はEnteroba cteriaceae族に所属する易
動性、グラム陰性、胞子非形成性の桿菌である。４つの
Proteus 種が知られており、そのうちの３種、即ちProt
eusmirabilis、P.vulgaris及びP. penneri がヒト疾患の
原因になる。
【０２２３】最も多いタイプのproteus 感染は尿道で生
じるが、敗血症、肺炎、及び傷感染も生じる。Proteus
m irabilis は最も多く分離される種であり急性の単純尿
道感染の10％を占める。種間で抗生物質感受性が異なる
ので病因生物を属のレベルでなく種のレベルで同定する
のが望ましい。
【０２２４】患者の標本からProteus mirabilis を同定
する現行の方法は、寒天プレート上で標本を18〜24時間
培養しその後に一連の生化学試験を行なう手順を含む。
下記のオリゴヌクレオチド配列は核酸ハイブリダイゼー
ションアッセイのプローブとして使用されると、Proteu
s mirabilis を正確に同定する。本発明は標本に対して
行なう試験の数を減らし同定に要する時間従って診断所
要時間を短縮する。これは従来方法に比較して顕著な改
良である。
【０２２５】配列 ５′-CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT- ３′ をもつ 23S rRNA の保存領域に相補的なプライマーを使
用してProteus mirabilis 特異的プローブが得られた。
【０２２６】配列 １．CCG TTC TCC TGA CAC TGC TAT TGA TTA AGA CTC を特性決定しP.mirabilis に特異的であることを証明し
た。
【０２２７】Proteus mir abilis の配列と比較するため
に、系統分類学的に最も近縁の生物Escherichia coli、
Klebsiella pneumonia e 、Proteus vulgaris、Salmonel
la enteritid is及びCitrobacte r freundiiを使用した。
【０２２８】このプローブはE.coli 23S rRNA の塩基 2
70〜305 に対応する領域で P. mirabilis のRNA にハイ
ブリダイズし得る。プローブは長さ33塩基でTm値は66℃
である。P.mirabilis に対するプローブの反応性及び特
異性を証明するために、これをハイブリダイゼーション
アッセイで使用した。32P 末端標識オリゴヌクレオチド
プローブと少なくとも107個の生物から遊離したRNA と
を 1％ドデシル硫酸ナトリウム、0.48M リン酸ナトリウ
ムpH 6.8、1mM EDTA、1mM EGTA中で混合し（最終容量0.
2 ml）、64℃で2 時間インキュベートした。インキュベ
ーション後、５mlの 2％ヒドロキシアパタイト、0.12M
リン酸ナトリウム pH 6.8 、0.02％ドデシル硫酸ナトリ
ウムを添加し、混合物を64℃で10分間インキュベートし
た。標本を遠心し、上清を除去した。5 mlの洗浄液（0.
12M リン酸ナトリウム pH6.8、0.02％ドデシル硫酸ナト
リウム）を添加し、標本を攪拌し、遠心し、上清を除去
した。ヒドロキシアパタイトに結合した放射能の量をシ
ンチレーションカウンティングで測定した。結果を表４
８に示す。表４６は、プローブがP.mirabilis と十分に
反応し他の27の近縁の生物とは反応しないことを示す。
表４９は表４８と同様に試験してプローブが他の24の系
統分類学的に多様な生物及び２つの酵母とは反応しない
ことを示す。
【０２２９】
【表４５】
【０２３０】
【表４６】
【０２３１】実施例１７ Salmonella 属の生物は、Enterobacteriaceae族に所属す
る易動性、グラム陰性、胞子非形成性の桿菌である。す
べてのSalmonellae が極めて近縁であり、学者によって
はこれらの生物を１つの種と考えることもある。核酸相
同の研究によって５つのサブグループが同定され異なる
1400の血清型が知られるようになった。すべての血清型
が、軽症の自己限定性胃腸炎から菌血症を伴う重態胃腸
炎、生命を脅かす恐れのあるチフス熱にわたるヒトの腸
疾患に関与する。S.cholerasuis、S.parat yphi A 及び
S.typ hi は重病及び菌血症にもっとも関係の深い血清型
である。Salmonella誘発腸炎の診断は、便標本中の生物
の検出に依存する。感染が主として汚染ミルク、食物及
び水の摂取によって生じるのでこれらの製品が消費者の
手にわたる前にこれらの物質中のSalmonellaを同定する
方法が必須である。
【０２３２】Salmonella属の生物を検出する現行の方法
は、選択培地で標本を１〜３日培養し一連の生化学試験
を行なう手順を含む。臨床標本または食品中のSalmonel
laを分離するために濃縮段階がしばしば必要である。下
記のオリゴヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼー
ションアッセイのプローブとして使用されると、Salmon
ella属の各菌を正確に同定する。本発明のプローブは属
のすべての菌に特異的であり他の近縁のEnterobacteria
ceae属とは反応しない。本発明プローブは標本に対して
行なう試験の数を減らし同定に要する時間従って診断所
要時間を短縮する。これは従来方法に比較して顕著な改
良である。
【０２３３】16S 及び 23S rRNA に相補的な２つのプラ
イマーを使用してSalmonella属特異的プローブが得られ
た。配列１は配列 ５′ TTA CTA GCG ATT CCG ACT TCA ３′ をもつ16S プライマーを用いて得られた。配列２は配列 ５′ CAG TCA GGA GTA TTT AGC CTT ３′ をもつ23S プライマーを用いて得られた。
【０２３４】配列 １．CTC CTT TGA GTT CCC GAC CTA ATC GCT GGC ２．ＣＴＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＣＡ ＧＣＡ
ＣＡＴ ＧＣＧ ＣＴＴ ＴＴＧ ＴＧＴ Ａ を特性決定しＳａｌｍｏｎｅｌｌａに特異的であること
を証明した。
【０２３５】16S rRNAに由来の配列１は長さ30塩基でTm
値は73℃である。23S rRNAに由来の配列２は長さ34塩基
でTm値は71℃である。これらのプローブはE.coliの16S
rRNAの塩基1125〜1155及び23S rRNAの塩基 335〜375 に
対応する領域にハイブリダイズし得る。Sa lmonella属の
各菌に対するプローブ１の反応性及び特異性を証明する
ために、32P 末端標識オリゴヌクレオチドプローブをハ
イブリダイゼーション反応でプローブとして使用した。
精製RNA または少なくとも107個の生物から標準法で遊
離したRNA を1 mlのハイブリダイゼーションバッファ
（最終濃度43％スルホコハク酸ジイソブチル、60mMリン
酸ナトリウム pH6.8、1mM EDTA、1mM EGTA）と混合し、
72℃で２〜12時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、５mlの分離溶液（２％ヒドロキシアパタイト、
0.12M リン酸ナトリウムpH6.8 、0.02％ドデシル硫酸ナ
トリウム）を添加し、標本を混合し、混合物を72℃で５
分間インキュベートし、遠心し、上清を除去した。４ml
の洗浄液（0.12M リン酸ナトリウム pH6.8、0.02％ドデ
シル硫酸ナトリウム）を添加し標本を攪拌し、遠心し、
上清を除去した。ヒドロキシアパタイトに結合した放射
能の量をシンチレーションカウンティングで測定した。
表５０の結果は、併用した２つのプローブが５つのSalm
on ellaサブグループ及び試験した31の血清型全部とハイ
ブリダイズしたことを示す。
【０２３６】
【表４７】
【０２３７】
【表４８】
【０２３８】Salmonella属の生物に対するプローブの特
異性を、Salmonella近縁生物に由来のRNA を含むハイブ
リダイゼーション反応で証明した。結果を表５１に示
す。
【０２３９】
【表４９】
【０２４０】表５２はSalmonellaプローブ１及び２が系
統分類学的に多様な生物とハイブリダイズしないことを
示す。
【０２４１】
【表５０】
【０２４２】実施例１８ Escherichia c oli はEnterbacteriaceae 属に所属するグ
ラム陰性、胞子非形成性の桿菌である。５つのEscheric
hia 種、即ち、臨床分離株の99％以上を占めるE.coli及
びE.hermanii、E.blattae 、E.vulneris、E .fergusonii
が知られている。E.coliは尿道感染、菌血症及び新生児
髄膜炎の主因であり、また旅行者下痢として知られる１
種の胃腸炎の原因である。
【０２４３】患者の標本からE.coliを同定する現行の方
法では、寒天プレート上で標本を18〜72時間培養し単離
したコロニーに一連の生化学試験を行なう。下記のオリ
ゴヌクレオチド配列は核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイのプローブとして使用されると別の生物の存在下で
もE.coliを正確に検出する。本発明は標本に対して行な
う試験の数を減らし同定に要する時間従って診断所要時
間を短縮する。これは従来技術の方法に比較して顕著な
改良である。
【０２４４】E.coli特異的プローブは、公知のE.coli配
列（Brosius 等、Pr oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:
4801〜4805 (1978) ）に由来し、比較としてProteus vu
lgaris（Carbon等、Nuc.Acids Res. 9: 2325〜2333 (19
81) ）、Klebsiella pneumoniae、Sa lmonella enterit
idis、Enterobacter gergov iae及びCitrobact er freund
iiを使用した。プローブ配列を以下に示す。
【０２４５】 １．GCA CAT TCT CAT CTC TGA AAA CTT CCG TGG プローブは16S rRNAの995 〜1030の領域でE. coliのRNA
にハイブリダイズする。プローブは長さ30塩基及びTm値
は 66 ℃である。E.coliに対するプローブの反応性及び
特異性を試験するために、このプローブをハイブリダイ
ゼーションアッセイで使用した。32P末端標識オリゴヌ
クレオチドプローブと配列５′-TGG ATGTCA AGA CCA GG
T AAG GTT CTT CGC GTT GCA TCG- ３′及び配列 5′- C
TG ACG ACA GCC ATG CAG CAC CTG TCT CAC GGT TCC CGA
AGG CA- ３′をもつ２つの非標識オリゴヌクレオチド
と精製RNA または界面活性剤及び加熱によって細胞から
遊離したRNA とを、１％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)
、0.48M リン酸ナトリウムpH 6.8 、1mM EDTA、1mM EG
TA（最終容量0.2 ml）中で混合し、60℃で 2時間インキ
ュベートした。インキュベーション後、５mlの２％ヒド
ロキシアパタイト、0.12M リン酸ナトリウム pH6.8、0.
02％ドデシル硫酸ナトリウムを添加し、混合物を60℃で
10分間インキュベートした。標本を遠心し、上清を除去
した。５mlの洗浄液（0.12M リン酸ナトリウム pH6.8、
0.02％ドデシル硫酸ナトリウム）を添加し、標本を攪拌
し、遠心し、上清を除去した。ヒドロキシアパタイトに
結合した放射能の量をシンチレーションカウンティング
で測定した。
【０２４６】このプローブは例えば、尿標本中のE.coli
を検出するために使用される。表53は試験したE.coliの
８つの菌株の７つをプローブが検出したことを示す。プ
ローブはまた尿中でまれにしか検出されない生物E.ferg
usoniiと反応する。
【０２４７】表５４は、プローブが尿中でまれにしか分
離されない別の生物たるS higella以外の属とは反応しな
いことを示す。これらの結果はプローブが尿標本中のE.
coliを検出するために有効であることを示す。
【０２４８】
【表５１】
【０２４９】
【表５２】
【０２５０】実施例１９ バクテリアは、たいていの自然環境に存在する形態的及
び系統分類学的に多様な単細胞生物のグループを包含す
る。多くのバクテリアは環境または宿主に無害または有
益であるが、あるものは有害で病因になる。ある場所
（例えば培地、薬品、または血液、尿、脳脊髄液のごと
き体液及び組織生検）におけるバクテリアの存在は好ま
しくないかまたは病気の指標となる。飲料水、食品等の
ごとき別の物質中では低レベルのバクテリアの存在が許
容される。従って標本中のバクテリアを検出し定量する
手段が必要である。標本中の全てのバクテリアを検出及
び定量するための現行の方法では、種々の温度及び雰囲
気の条件下に多数タイプの培地で培養する必要がある。
全部のバクテリアを１つの試験で検出または定量できる
試験方法は今日まで知られていない。下記のオリゴヌク
レオチド配列はハイブリダイゼーションアッセイで使用
されると、広い系統分類学的クロスセクションのバクテ
リアを検出する。本発明は、行なう試験の数を減らしア
ッセイ所要時間を短縮する。未知の標本から得られたハ
イブリダイゼーションと１組の標準とを比較することに
よってバクテリアの存在数をある程度定量できる。これ
は従来技術に比較して顕著な改良である。
【０２５１】公知のrRNA配列及びGen-Probe で決定され
た配列を検討することによってバクテリアプローブを設
計した。比較に使用した配列は、A grobactrium tumefac
iens（Yang等、Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.、82:4443
(1985) 、Anacystis nidulans(Tomioka and Sugiura、M
ol.Gen.Genet. 191:46 (1983)、Douglas and Doolittle
、Nuc.Acids.Res. 12:3373(1984)、Ba cillus subtilis
（Green 等、Gene 37:261(1985) 、Bacillus s tearoth
ermophilus （Kop 等、DNA 3:347(1984)、Bacteroides
fragilis（Weisburg等、J.Bacteriol. 164:230(1985)、
Chlamydia psittaci（Weisburg等、J.Bacteriol. 167:5
70(1986)、Desulfovibrio desulfu ricans（Oyaizu andW
oese 、System. Appl. Microbiol. 6:257(1985)、Esche
richia coli（Brosius 等、Proc. Natl.Acad. Sci.U.S.
A. 77:201 (1980)、Flavobactri umheparinum （Weisbur
g等、J.Bacteri ol. 164:230(1985)、Heliobacterium ch
l orum（Woese 等、Scien ce 229:762(1985)、Mycop lasma
PG50(Frydenberg and Christiansen、DNA 4:127(198
5)、Proteus vul garis（Carton等、Nuc. Acids Res.9:23
25(1981) 、Pseudomonas testosteroni（Yang等、Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S．A. 82:4443(1985)、Rochalimaea q
uintana（Weisburg等、Science 230:556(1985)Saccharo
m yces cerevisiae（Rubstov 等、Nuc.Acids Res. 8:577
9(1980) 、Georgiev等、Nuc.Acids Res. 9:6953 (198
1)）及びヒト（Torczynski等、DNA 4:283(1985)、Gonza
lez等、Proc.Natl.A cad.Sci. U.S.A. 82:7666 (1985)。
【０２５２】以下の配列は広い系統分類学的クロスセク
ションのバクテリアにハイブリダイズし、酵母またはヒ
トrRNAにハイブリダイズしないことが判明した。
【０２５３】 １．CCA CTG CTG CCT CCC GTA GGA GTC TGG GCC ２．CCA GAT CTC TAC GCA TTT CAC CGC TAC ACG TGG ３．GCT CGT TGC GGG ACT TAA CCC AAC AT ４．GGG GTT CTT TTC GCC TTT CCC TCA CGG ５．GGC TGC TTC TAA GCC AAC ATC CTG ６．GGA CCG TTA TAG TTA CGG CCG CC ７．GGT CGG AAC TTA CCC GAC AAG GAA TTT CGC TAC C プローブ１は長さ30塩基及びTm値は70℃である。プロー
ブ２は長さ33塩基及びTm値は69℃である。プローブ３は
長さ26塩基及びTm値は67℃である。プローブ４は長さ27
塩基及びTm値は69℃である。プローブ５は長さ24塩基及
びTm値は66℃である。プローブ６は長さ23塩基及びTm値
は62℃である。プローブ７は長さ34塩基及びTm値は66℃
である。プローブ１〜３は（E.coli塩基に対応する）領
域 330〜365 、 675〜715 及び1080〜1110の16S rRNAに
ハイブリダイズする。プローブ４〜７は（E.coli塩基に
対応する）領域 460〜490 、1050〜1080及び1900〜1960
（プローブ６及び７）の23S rRNAにハイブリダイズす
る。オリゴヌクレオチドは、ユウバクテリア中で高度に
保存されたrRNA上の領域と相互作用する。これは、これ
らがハイブリダイゼーションアッセイでバクテリアプロ
ーブとして使用できることを意味する。第二にはrRNAを
得るツールとして使用することもできる。例えばオリゴ
ヌクレオチドを該当rRNAにハイブリダイズさせ逆転写酵
素で延長する。得られたDNA の配列を決定し、本明細書
中の詳細な説明の項で記載したように相補的rRNA配列を
推定するために使用され得る。
【０２５４】本発明の１つの用途は尿中のバクテリア
（細菌尿）を検出することである。尿中で検出されたバ
クテリアに対するプローブの反応性及び特異性を証明す
るために、32P 末端標識または 125Ｉ標識したオリゴヌ
クレオチドプローブと標準法（例えばMurphy等、米国特
許第841860号に記載の超音波破壊法、ガラスビーズを含
む界面活性剤または酵素溶菌）によって細胞から遊離し
たRNA とを混合した。プローブとRNA とを、0.48M リン
酸ナトリウム pH6.8、1mM EDTA、 1％ドデシル硫酸ナト
リウム（最終容量0.2 ml）中で混合し、60℃で2 時間ハ
イブリダイズした。５mlの 2％ヒドロキシアパタイト、
0.12M リン酸ナトリウム pH6.8、0.02％ドデシル硫酸ナ
トリウムを添加し、混合物を60℃で10分間インキュベー
トした。混合物を遠心し、上清を除去した。５mlの洗浄
液(0.12Mリン酸ナトリウム pH6.8、0.02％ドデシル硫酸
ナトリウム）を添加し、標本を攪拌し、遠心し、上清を
除去した。ヒドロキシアパタイトに結合した放射能の量
をシンチレーションカウンティングで測定した。表55〜
68はこれらのプローブの特異性を証明し、複数プローブ
の併用によって被検バクテリア全部を検出できることを
証明する。
【０２５５】表５５は、プローブ１が、尿から最も多く
分離されるバクテリアのRNA とハイブリダイズし、酵母
RNA とはハイブリダイズしないことを示す。表５６は、
プローブ１が、系統分類学的に多様なバクテリアを検出
し、ヒトRNA とはハイブリダイズしないことを示す。
【０２５６】
【表５３】
【０２５７】
【表５４】
【０２５８】表５７は、プローブ２がUreaplasma ureal
yicum 以外の尿中で通常検出されるバクテリアのRNA と
ハイブリダイズし、酵母rRNAとハイブリダイズしないこ
とを示す。
【０２５９】
【表５５】
【０２６０】表５８はプローブ２が系統分類学的に多様
なバクテリアを検出しヒトrRNAとはハイブリダイズしな
いことを示す。
【０２６１】
【表５６】
【０２６２】表５９はプローブ３が尿中で通常検出され
るバクテリアのＲＮＡとハイブリダイズし酵母rRNAを検
出しないことを示す。
【０２６３】
【表５７】
【０２６４】表６０はプローブ４が系統分類学的に多様
なバクテリアを検出しヒトRNA とハイブリダイズしない
ことを示す。
【０２６５】
【表５８】
【０２６６】表６１はプローブ４が尿中で通常検出され
るバクテリアのRNA とハイブリダイズし、酵母rRNAを検
出しないことを示す。
【０２６７】
【表５９】
【０２６８】表６２はプローブ４が系統分類学的に多様
なバクテリアを検出しヒトrRNAとはハイブリダイズしな
いことを示す。
【０２６９】
【表６０】
【０２７０】表６３はプローブ５が尿中で通常検出され
るバクテリアのRNA とハイブリダイズし酵母rRNAを検出
しないことを示す。
【０２７１】
【表６１】
【０２７２】表６４はプローブ５が系統分類学的に多様
なバクテリアを検出しヒトRNA とはハイブリダイズしな
いことを示す。
【０２７３】
【表６２】
【０２７４】表６５はプローブ６が尿中で通常検出され
るバクテリアのRNA とハイブリダイズし酵母rRNAを検出
しないことを示す。
【０２７５】
【表６３】
【０２７６】表６６はプローブ６が系統分類学的に多様
なバクテリアを検出しヒトRNA とはハイブリダイズしな
いことを示す。
【０２７７】
【表６４】
【０２７８】表６７はプローブ７が尿中で通常検出され
るバクテリアのRNA とハイブリダイズし酵母rRNAを検出
しないことを示す。
【０２７９】
【表６５】
【０２８０】表６８はプローブ７が系統分類学的に多様
なバクテリアを検出しヒトRNA とはハイブリダイズしな
いことを示す。
【０２８１】
【表６６】
【０２８２】実施例２０ 菌類は、単純な真核細胞生物の形態的及び系統分類学的
に多様なグループを包含する。３つの菌類、即ちNeuros
pora crassa、Podosp ora 及びSaccharo mycesの公知の
配列を使用して、菌類のrRNAがE.coliに58〜60％相同で
互いに84〜90％相同であると推定した。ある種の菌類は
単細胞（酵母）として増殖し、その他のものは多核糸状
体（かび）として増殖し、またいくつかは単細胞または
多核糸状体として増殖し得る（二形態菌類）。多くの菌
類が環境の棲息体に無害であるが、有害で病気を誘発す
るものもある。ある場所では菌類の存在が好ましくない
かまたは病気の指標となる（例えば、培地、薬品、血
液、尿または脳脊髄液のごとき体液及び組織生検）。飲
料水及び食品のごとき別の製品では低レベルの菌類は許
容される。このため標本中の菌類を検出し定量する手段
が必要になる。
【０２８３】菌類の検出及び定量のための現行の方法
は、標本の顕微鏡観察及び種々の培地での培養を含む。
多くの酵母は臨床標本から数日のオーダーで増殖する
が、ある種の糸状体菌類は４週間の培養期間を要し、そ
の後に特殊染色処理と生化学分析と抗原試験等を行なう
必要がある。以下のオリゴヌクレオチド配列は、ハイブ
リダイゼーションアッセイで使用されると、臨床標本群
から最も多く単離される５種類の酵母、即ち、Candida
albican s、Torulopsis glabrata 、Candida tropocali
s、Candida parapsilosis及びCandida kruseiを検出す
る。Trichosporon、 Blastomyces 、Cryptococcus及びSa
ccharomyces 属を示す他の５つの菌類も検出される。本
発明によればこれらの菌類を１段階で検出することが可
能であり、培養に関してはこれらの菌類を同定し感染原
因として除去するまでの時間を短縮し得る。これは従来
技術の方法に比較して顕著な改良である。
【０２８４】18S または28S rRNAの保存領域に相補的な
３つのプライマーを使用して該当生物とハイブリダイズ
する４つのプローブを同定した。配列１は配列 ５′-AGA ATT TCA CCT CTG- ３′ をもつ18S プライマーを使用して得られた。配列２は配
列 ５′-CCT TCT CCC GAA GTT ACG G- ３′ をもつ28S プライマーを使用して得られた。配列３及び
４は配列 ５′-TTC CGA CTT CCA TGG CCA CCG TCC- ３′ をもつ28S プライマーから得られた。下記の配列の特性
を決定し菌類 rRNA にハイブリダイズすることを証明し
た。該当配列との比較のためにSa ccharomyces cerevisi
ae、Sac charomyces carlsbergensis、Escherichia co li
及びヒトrRNAを使用した。１．CCC GAC CGT CCC TAT TA
A TCA TTA CGA TGG 18S rRNA由来の配列１は長さ30塩基及びTm値は68℃であ
る。23S rRNA由来の配列２は長さ32塩基及びTm値は67℃
である。23S rRNA由来の配列３は長さ40塩基及びTm値は
66℃である。23S rRNA由来の配列４は長さ40塩基及びTm
値は68℃である。配列１はSaccharomyces cerevisiae 1
8S rRNA の位置 845〜880 に対応する領域にハイブリダ
イズする。配列２はSaccharomyces cerevis iae 28S rRN
A の位置1960〜2000に対応する領域にハイブリダイズす
る。配列３及び４は28S rRNAの1225〜1270の領域にハイ
ブリダイズする。
【０２８５】菌類に対するこれらのプローブの反応性及
び特異性を証明するために、これらをハイブリダイゼー
ションアッセイで使用した。32P または125Ｉ標識プロ
ーブと精製RNA または標準溶菌法で細胞から遊離したRN
A とを、0.2 mlの0.48M リン酸ナトリウム pH6.8、 1％
ドデシル硫酸ナトリウム、1mM EDTA、1mM EGTA中で混合
し、60℃で2 時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、５mlの２％ヒドロキシアパタイト、0.12M リン
酸ナトリウム pH6.8、0.02％ドデシル硫酸ナトリウムを
添加し標本を60℃で10分間インキュベートした。標本を
遠心し上清を除去した。５mlの0.12M リン酸ナトリウム
pH6.8、0.02％ドデシル硫酸ナトリウムを添加し、標本
を攪拌し、遠心し、上清を除去した。結果を表69に示
す。プローブ１は試験した10種類の菌類全部を検出し、
プローブ２は試験した６つの酵母全部を検出し、プロー
ブ３は６つのうちの５つの酵母を検出し、プローブ４は
C.kruseiだけを検出する。従ってプローブ４は標本中の
C.kruseiの検出及び同定に使用でき、プローブ１と２ま
たはプローブ３と４との併用によって複数の酵母を検出
でき、プローブ１は表６９に示す10種類の生物のいずれ
かの検出に使用できる。
【０２８６】これらのプローブの有望な用途の１つは、
尿標本またはその他の通常は無菌の体液中で酵母を同定
することである。プローブは尿から最も普通に単離され
る一連の細菌にハイブリダイズした（表７０）。表７１
はプローブが系統分類学的に多様な生物またはヒトRNA
にハイブリダイズしないことを示す。
【０２８７】
【表６７】
【０２８８】
【表６８】
【０２８９】
【表６９】
【０２９０】またプローブ１の２つの誘導体を作製し
た。
【０２９１】 CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAAC CCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGG 第１誘導体は65℃で作用し第２誘導体は60℃で作用す
る。
【０２９２】実施例２１ 淋疾は米国で最も多く報告される細菌感染症であり、毎
年200 万を超える感染例が報告される。性的感染するこ
の生物は男性の前立腺尿道炎及び女性の子宮頸炎を発症
させる。治療しない患者では重篤な合併症及び不妊の可
能性もあるが、一般には無症状感染がおおく、従って無
意識に伝染を広げる保菌者が増える。
【０２９３】原因菌Neisseria gonorrhoeae はグラム陰
性、オキシダーゼ陽性の双球菌で厳密な増殖条件を要す
る。診断方法は感染部位及び患者の症状に左右される。
男性の淋病性尿道炎はグラム染色法によって高い感受性
及び特異性で診断できる。女性全体及び無症状男性の淋
病診断を確実に行なうためには一般には24〜72時間を要
する培養が必要である。培養増殖物から生物を検出後、
炭水化物分解、共同凝集、蛍光抗体スクリーニングまた
は発色酵素基質アッセイのごとき試験によってNeisseri
a gonorrhoeae を同定する必要がある。
【０２９４】Neisseria g onorrhoeae はN.meningitidis
に極めて近縁なので核酸プローブを使用した検出及び識
別が特に難しい。Kingsbury 、D.T.、J.Bactrio l. 94:8
70〜874(1967）の発表したデータでは両者のDNA:DNA 相
同が約80〜94％である。AdHoc Committee on Reconcili
ation of Approaches to Bacterial Systematics、In
t′l J. System. Bacteriol.37: 463〜464 (1987)によ
って制定された指針によれば、１つの種の系統分類学的
定義は一般に、70％以上のDNA:DNA 相同を意味する。制
定された原則ではこれらの生物が同じ種に属すると考え
られるにもかかわらずこれらを識別することが可能であ
る。
【０２９５】N.gonorrhoe ae とN.meningitidisとの間の
rRNA相同は既知の保存領域から予想されるように更に大
きい。我々の配列決定データによれば、N.gonorrhoeae
とN.meningitidisとの16S rRNA配列間の差異は 1.0％で
あり23S rRNA間の差異は １．１％である。
【０２９６】Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓとN.gonorr
hoeae との間のいくつかの変異部位において他のNe isse
ria がN.gonorrhoeae と等しいためN . gonorrhoeaeプロ
ーブの作製がより難しい。これらの２つの種の間に存在
する少数の不整合は、最も可変の領域、即ち、種間だけ
でなく菌株間でも変異する領域である。核酸プローブに
よって種を識別することは全くできないと考える者もあ
り、またプローブ診断に使用するにはrRNAが保存されす
ぎていると考える者もあるが、本発明では、N.gonorrho
eae とN .meningitidisとを識別できるプローブの作製に
成功した。
【０２９７】本発明は従来技術の方法に比較して顕著な
利点をもつ。プローブは培養方法よりも特異的で培養方
法よりも診断が速い。また、プローブは従来方法よりも
感度がよい（例えば、臨床標本中の少数の生物を検出し
得る）。
【０２９８】これらのプローブ配列を同定するために配
列 １．GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT ２．GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC ３．GCTCGTTGCGGGACTTAACCCACCAT をもつプライマーを使用した。
【０２９９】標的として選択されたrRNAの各々はE.col
i、N.meningitidis、N.cinerea 、N.lactamica 、N.muc
osa及びKingella kingae に対して少なくとも２つの不
整合を有していた。
【０３００】プローブ領域に隣接の配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチドを合成し、ハイブリダイゼーション混合
物としてHogan 等の米国特許出願（未権利化）、1987年
11月24日出願、「 Meansand Method for Enhancing Nu
cleic Acid Hybridization」（「helper」特許出願）に
従って使用した。
【０３０１】下記の配列を特性決定しNeisseria gonorr
hoeae に特異的であることを知見した。N.gonorrhoeae
との比較のために系統分類学的に最も近縁の生物Neisse
riameningitidis、N.cinerea 、N.la ctamica 、N.mucos
a及びKingella kingae を使用した。
【０３０２】１．CCG CCG CTA CCC GGT AC ２．TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC ３．GAG CAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TA 領域 125〜150で16S rRNA に相補的な配列１は長さ17塩
基でTm値は56℃である。領域 455〜485 で16S rRNAに相
補的な配列２は長さ21塩基でTm値は63℃である。領域 9
80〜1015で16S rRNAに相補的な配列３は長さ29塩基でTm
値は56℃である。ハイブリダイゼーションアッセイを使
用してNeisseria gono rrhoeaに対するプローブの反応性
及び特異性を証明した。３つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブをヨウ素化し配列 ５′-CCC CTG CTT TCC CTC TCT AGA CGT ATG CGG TAT T
AG CTG ATC TTT CG-３′、 ５′-GCC TTT TCT TCC CTG ACA AAA GTC CTT TAC AAC C
CG- ３′、 ５′-GGC ACG TAG TTA GCC GGT GCT TAT TCT TCA GGT A
C-３′及び ５′-GGT TCT TCG CGT TGC ATC GAA TTA ATC CACATC AT
C CAC CGC-３′ をもつ非標識オリゴヌクレオチド及び精製rRNAと共に、
0.48M リン酸ナトリウムpH6.8、 0.5％ドデシル硫酸ナ
トリウム(SDS）中で混合し、60℃で 1時間インキュベー
トした。インキュベーション後、4 mlの 2％ヒドロキシ
アパタイト、0.12M リン酸ナトリウム pH6.8、0.02％SD
S を添加し、混合物を60℃で 5分間インキュベートし
た。標本を遠心し、上清を除去した。5 mlの洗浄液（0.
12M リン酸ナトリウム pH6.8、 2％ SDS）を添加し、標
本を攪拌し、遠心し、上清を除去した。ヒドロキシアパ
タイトに結合した放射能をガンマカウンタで測定した。
【０３０３】表７２はプローブがN.gonorr hoeae に十分
にハイブリダイズし試験したその他の種にハイブリダイ
ズしないことを示す。
【０３０４】
【表７０】
【０３０５】更に、Neisseria プローブの以下の誘導体
を作製し使用した。
【０３０６】 以上の実施例では標準アッセイフォーマットを使用して
測定を行なったが、特異的プローブを種々の実験条件下
で使用することが可能である。例えば、ハイブリダイゼ
ーションの促進に最適の反応条件を与えるために反応溶
液に種々の添加剤を添加してもよい。かかる添加剤は、
バッファ、キレート剤、有機化合物、核酸沈降剤、並び
にドデシル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジイソブチ
ル、テトラデシル硫酸ナトリウム、サルコシル及びSO4
-2、PO4 -3、Cl-1及びHCOO-1のアルカリ金属塩及びアン
モニウム塩のごとき界面活性剤である。ハイブリダイゼ
ーション反応の最適条件を得るためにかかる添加剤を使
用することは当業者に容易である。単鎖核酸分子を二重
鎖核酸にするハイブリダイゼーションの促進条件は、上
記した1984年７月５日付けの米国特許出願第627795号及
び1987年６月４日付けのそのCIP 出願（未権利化）、及
び1986年1 月7 日付けの米国特許出願第816711号の主題
である。いずれも発明の名称は「ACCELERATED NUCLEIC
ACID REASSOCIATION METHOD 」である。
【０３０７】本発明は、精製標本、または痰、便、組
織、血液、脊髄液もしくは滑液、血清、尿またはその他
の体液のごとき未精製の臨床標本、あるいは環境または
食物標本のごときその他の標本から非ウイルス性生物を
検出するために使用され得る。細胞破壊及びハイブリダ
イゼーションの前に細胞を溶液に懸濁または溶解し得
る。前記のごとき未精製標本の場合、細胞はアッセイ以
前にそれ自体の生物環境に維持され無傷で非処理であ
る。
【０３０８】本発明のプローブはアッセイにおいて単独
で使用してもよくまたは種々のプローブと併用してもよ
い。核酸合成中に複数の単独プローブを結合させてもよ
い。この結果、多数プローブ配列を含み従って多数特異
性をもつ１つのプローブ分子が得られる。例えば、実施
例１及び２に記載の前記の Mycobac terium avium とMy
cobacterium intracellula reの双方の配列を含む単一核
酸分子を合成し得る。M.avium またはM.intra cellulare
rRNAのいずれかとのハイブリダイゼーションアッセイ
においてこのプローブは完全にハイブリダイズする。１
つのアッセイで別々の２つのプローブ配列が併用される
と混合プローブの半分だけがM.avium またはM.intracel
lurale rRNA とハイブリダイズする。本発明の範囲内で
別の方法を用いることも可能である。例えば、本文中に
記載のごとき種々のラベルによってプローブを標識して
もよくこれを診断用キットに組み込んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coliの
細菌16S rRNAの一次構造のチャート図の全体図である。
【図１Ａ】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coli
の細菌16S rRNAの一次構造のチャート図の部分図であ
る。
【図１Ｂ】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coli
の細菌16S rRNAの一次構造のチャート図の部分図であ
る。
【図２】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coliの
細菌23S rRNAの一次構造のチャート図の全体図である。
【図２Ａ】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coli
の細菌23S rRNAの一次構造のチャート図の部分図であ
る。
【図２Ｂ】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coli
の細菌23S rRNAの一次構造のチャート図の部分図であ
る。
【図２Ｃ】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coli
の細菌23S rRNAの一次構造のチャート図の部分図であ
る。
【図２Ｄ】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coli
の細菌23S rRNAの一次構造のチャート図の部分図であ
る。
【図３】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coliの
細菌5S rRNA の一次構造のチャート図の全体図である。
【図３Ａ】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coli
の細菌5S rRNA の一次構造のチャート図の部分図であ
る。
【図３Ｂ】塩基の標準参照番号を示すEscherichia coli
の細菌5S rRNA の一次構造のチャート図の部分図であ
る。
【図４】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces cere
visiaeの18S rRNAの一次構造のチャート図の全体図であ
る。
【図４Ａ】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces ce
revisiaeの18S rRNAの一次構造のチャート図の部分図で
ある。
【図４Ｂ】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces ce
revisiaeの18S rRNAの一次構造のチャート図の部分図で
ある。
【図４Ｃ】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces ce
revisiaeの18S rRNAの一次構造のチャート図の部分図で
ある。
【図５】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces cere
visiaeの28S rRNAの一次構造のチャート図の全体図であ
る。
【図５Ａ】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces ce
revisiaeの28S rRNAの一次構造のチャート図の部分図で
ある。
【図５Ｂ】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces ce
revisiaeの28S rRNAの一次構造のチャート図の部分図で
ある。
【図５Ｃ】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces ce
revisiaeの28S rRNAの一次構造のチャート図の部分図で
ある。
【図５Ｄ】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces ce
revisiaeの28S rRNAの一次構造のチャート図の部分図で
ある。
【図５Ｅ】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces ce
revisiaeの28S rRNAの一次構造のチャート図の部分図で
ある。
【図５Ｆ】塩基の標準参照番号を示すSaccharomyces ce
revisiaeの28S rRNAの一次構造のチャート図の部分図で
ある。
【図６】異なる12の近縁生物間の16S rRNAの異なる位置
を（E .coliの参照番号を使用して）示すダイヤグラムで
ある。例えば実施例１で99.7はClostridium botulinium
とClostridium subterminaleとの間の16S rRNAの差を示
す。
【図７】異なる12の近縁生物間の23S rRNAの最初の1500
の塩基の位置を（E.coliの参照番号を使用して）示すダ
イヤグラムである。
【図８】異なる12の近縁生物間の23S rRNAの末端塩基の
位置を（E.coli参照番号を使用して）示すダイヤグラム
である。
【図９】16S rRNAにハイブリダイズし得るプローブの位
置を示す概略図である。
【図１０】23S rRNAの最初の1500の塩基とハイブリダイ
ズし得るプローブの位置を示す概略図である。
【図１１】23S rRNAの末端塩基にハイブリダイズし得る
プローブの位置を示す概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:32 1:35 1:185 1:38） (72)発明者 ジヨ・アン・コツプ アメリカ合衆国、カリフオルニア・92069、 サン・マルコス、ハンプトン・ロード・ 1314 (72)発明者 シエロル・ホウフア・マクドナウ アメリカ合衆国、カリフオルニア・92122、 サン・デイエゴ、ロビンズ・ストリート・ 4697

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的非ウイルス生物又は非ウイルス生物
    群の標的ヌクレオチド配列を非標的非ウイルス生物又は
    非ウイルス生物群の非標的ヌクレオチド配列から区別す
    るためのハイブリダイゼーションアッセイプローブであ
    って、前記プローブはオリゴヌクレオチドを含み、前記
    オリゴヌクレオチドの少なくとも約１０連続ヌクレオチ
    ドはハイブリダイゼーション条件下で前記標的ヌクレオ
    チド配列の標的可変領域又はその相補配列と検出可能な
    ハイブリドを形成することができ、前記オリゴヌクレオ
    チドは前記非標的ヌクレオチド配列とは検出可能なハイ
    ブリドを形成することができなく、前記標的可変領域は
    前記標的非ウイルス生物又は非ウイルス生物群のｒＲＮ
    Ａ又は前記ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中に存在し、か
    つ前記標的可変領域はEscheric hia coliの５ＳｒＲＮ
    Ａ、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡ、Escherichia
    coliの２３ＳｒＲＮＡ、Saccharomyces cerevisiaeの１
    ８ＳｒＲＮＡ及びSacc haromyces cere visiaeの２８Ｓｒ
    ＲＮＡからなる群より選ばれるｒＲＮＡの領域に対応す
    るものである、プローブ。
  2. 【請求項２】 標的非ウイルス生物又は非ウイルス生物
    群の標的ヌクレオチド配列を非標的非ウイルス生物又は
    非ウイルス生物群の非標的ヌクレオチド配列から区別す
    るためのハイブリダイゼーションアッセイプローブ又は
    プローブの組み合わせの調製法であって、前記プローブ
    はオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチド
    の少なくとも約１０連続ヌクレオチドはハイブリダイゼ
    ーション条件下で前記標的ヌクレオチド配列の標的可変
    領域又はその相補配列と検出可能なハイブリドを形成す
    ることができ、前記オリゴヌクレオチドは前記非標的ヌ
    クレオチド配列とは検出可能なハイブリドを形成するこ
    とができなく、前記標的可変領域は前記標的非ウイルス
    生物又は非ウイルス生物群のｒＲＮＡ又は前記ｒＲＮＡ
    をコードするＤＮＡ中に存在し、かつ前記標的可変領域
    はEscherichia coliの５ＳｒＲＮＡ、Escherichia coli
    の１６ＳｒＲＮＡ、Esche richia coliの２３ＳｒＲＮ
    Ａ、Saccharomyces cerevisiaeの１８ＳｒＲＮＡ及びSa
    ccharomyce scerevisiaeの２８ＳｒＲＮＡからなる群よ
    り選ばれるｒＲＮＡの領域に対応するものである、調製
    法。
  3. 【請求項３】 前記標的可変領域が以下の群：Escher ic
    hia coliの５ＳｒＲＮＡの６５−１０８塩基、Escheric
    hia coliの５ＳｒＲＮＡの６５−１２０塩基、Escheric
    hia coliの１６ＳｒＲＮＡの６０−１００塩基、Escher
    ichia coliの１６ＳｒＲＮＡの６０−１０５塩基、Esch
    erichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１２０−１５０塩基、
    Esc herichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１２５−１５０塩
    基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１７０−２３
    ０塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１７５−
    ２１０塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１８
    ５−２２５塩基、Escheri chia coliの１６ＳｒＲＮＡの
    １９０−２３０塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮ
    Ａの３３０−３６５塩基、Escherichia coliの１６Ｓｒ
    ＲＮＡの４０５−４２８塩基、Escherichia coliの１６
    ＳｒＲＮＡの４０５−４８０塩基、Escherichia coliの
    １６ＳｒＲＮＡの４４０−４７５塩基、Es cherichia co
    liの１６ＳｒＲＮＡの４５０−４９０塩基、Escherichi
    a coliの１６ＳｒＲＮＡの４５５−４８５塩基、Escher
    ichia coliの１６ＳｒＲＮＡの６００−６３５塩基、Es
    cherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの６００−６７０塩
    基、Escher ichia coliの１６ＳｒＲＮＡの６３０−６７
    ５塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの６７５−
    ７１５塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの７０
    ５−７３５塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの
    ８２０−８６０塩基、Escherichi a coliの１６ＳｒＲＮ
    Ａの８２５−８６０塩基、E scherichia col iの１６Ｓｒ
    ＲＮＡの８３０−８７０塩基、Escherichia coliの１６
    ＳｒＲＮＡの９７５−１０２０塩基、Escherichia coli
    の１６ＳｒＲＮＡの９８０−１０１０塩基、Escherichi
    a co liの１６ＳｒＲＮＡの９８０−１０１５塩基、Esch
    erichia coliの１６ＳｒＲＮＡの９８０−１０５０塩
    基、Escheric hia coliの１６ＳｒＲＮＡの９９５−１０
    ３０塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１０２
    ５−１０６０塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡ
    の１０８０−１１１０塩基、Escher ichia coliの１６Ｓ
    ｒＲＮＡの１１２５−１１５５塩基、Escherichia coli
    の１６ＳｒＲＮＡの１２５０−１２９０塩基、Escheric
    hia co liの１６ＳｒＲＮＡの１２５５−１２９０塩基、
    Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの２７０−３０５塩
    基、Escheric hia coliの２３ＳｒＲＮＡの２７０−３９
    ０塩基、Escherichia c oliの２３ＳｒＲＮＡの２７５−
    ３２０塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの３０
    ５−３４０塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの
    ３３０−３６５塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮ
    Ａの３３５−３７５塩基、Esc herichia coliの２３Ｓｒ
    ＲＮＡの３５０−３９５塩基、Escherichia coliの２３
    ＳｒＲＮＡの３６５−４０５塩基、Escherichia coliの
    ２３ＳｒＲＮＡの４６０−４９０塩基、Escherichia co
    liの２３ＳｒＲＮＡの５３５−５６０塩基、Escheri chi
    a coliの２３ＳｒＲＮＡの５４０−５７５塩基、Escher
    ichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１０５０−１０８０塩
    基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１１５０−１
    ２００塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１１
    ５５−１１９０塩基、Escherich ia coliの２３ＳｒＲＮ
    Ａの１１６０−１１９０塩基、Escherichia coliの２３
    ＳｒＲＮＡの１４４０−１４７５塩基、Esc herichia co
    liの２３ＳｒＲＮＡの１４４０−１６００塩基、Escher
    ichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１４５０−１４９０塩
    基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１５１０−１
    ５４５塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１５
    １５−１５５５塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮ
    Ａの１５７０−１６１０塩基、Escheric hia coliの２３
    ＳｒＲＮＡの１５８５−１６２０塩基、Escherichia co
    liの２３ＳｒＲＮＡの１７１０−１７５０塩基、Es cher
    ichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１９００−１９６０塩
    基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの２１９０−２
    ３３０塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの２１
    ９５−２２３５塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮ
    Ａの２２８０−２３３０塩基、Saccharomyces cerevisi
    aeの１８ＳｒＲＮＡの８４５−８８０塩基、Saccharomy
    ces cerevisiaeの２８ＳｒＲＮＡの１２２５−１２７０
    塩基、及びSaccharomyces cerevisiaeの２３ＳｒＲＮＡ
    の１９６０−２０００塩基、から選ばれるｒＲＮＡの領
    域に対応するものである請求の範囲第２項に記載の調製
    法。
  4. 【請求項４】 前記標的ヌクレオチド配列が５ＳｒＲＮ
    Ａ、１６ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ
    及び２８ＳｒＲＮＡからなる群より選ばれるものである
    請求の範囲第２又は３項に記載の調製法。
  5. 【請求項５】 前記標的非ウイルス生物が、Acinetobac
    ter属、Bacillus属、Bactriodes属、Blastomyces属、Br
    anhamella属、Campylobacter属、Candida属、Chla mydia
    属、Citroba cter属、Chromoba cterium属、Clost ridium
    属,Coryne bacterium属、Cry ptococcus属、Dei nococcus
    属、Derx ia属、Enterococc i、Enterobacter属、Escheri
    chia属、Gargnerella属、Hahnia属、Klebsi ella属、Lac
    tobac illus属、Legione lla属、Moraxella属、Morgenell
    a属、Mycoplasma属、Mycobacterium属、Neisseria属、P
    roteus属、Providencia属、Pseudomonas属、Rahnella
    属、Rhodospirillum属、Saccharomyces属、Salmonella
    属、Serratia属、Shigella属、Staphylococcus属、Stre
    ptococcus属、Torulopsis属、Trichosporon属、Ureapla
    sma属、Vibrio属又はYersinia属の種である請求の範囲
    第２ないし４項のいずれか１項に記載の調製法。
  6. 【請求項６】 前記標的ヌクレオチド配列が以下の群： （ｉ）Mycoplasma属の種の５ＳｒＲＮＡ、 （ｉｉ）Mycoplasma属、Mycobacterium属、Chlamydia
    属、Escherichia属、Legionella属、Enterococci, Neis
    ser ia属、Campylobac ter属、Streptoco ccus属、Salmone
    l la属、Shigella属、Citrobacter属、Enterobacter属、
    Klebsiella属、Morgenella属、Provi dencia属、Pseudo m
    onas属、Serrati a属、Staphylococ cus属、Ureaplasm a
    属、Acinetobact er属、Bacillus属、Bactriodes属、Bra
    nhamella属、Chromobacterium属、Clostridium属、Cory
    nebacterium属、Deinococcus属、Derxia属、Gargnerell
    a属、Hahnia属、Lactobacillus属、Moraxella属、Rahne
    lla属、Rhodospirillum属、Vibrio属又はYersinia属の
    種の１６ＳｒＲＮＡ、 （ｉｉｉ）Mycobacterium属、Chlamydia属、Enterobact
    er属、Legionella属、Sa lmonella属、Prot eus属、Pseud
    omon as属、Citrobacte r属、Escherichia属、Klebsiella
    属、Morgenella属、Providencia属、Serratia属、Staph
    ylococcus属、Streptococcus属、Ureaplasma属、Bacill
    us属、Branhamella属、Campylobacter属、Chromobacter
    ium属、Clostridium属、Deinococcus属、Derxia属、Gar
    dnerella属、Hafnia属、Lactobacillus属、Moraxella
    属、Neisseria属、M ycoplasma属、Rah nella属、Rhodosp
    irillum属、Vibri o属、Yersinia属又はEscherichia属の
    種の２３ＳｒＲＮＡ （ｉｖ）Blastomyces属、Candida属、Cryptococcus属、
    Torulopsis属、Trichosporon属又はSaccha romyces属の
    種の１８ＳｒＲＮＡ、及び （ｖ）Candida属、Torulopsis属又はSaccharomyces属の
    種の２８ＳｒＲＮＡ、から選ばれるものである請求の範
    囲第２ないし５項のいずれか１項に記載の調製法。
  7. 【請求項７】 プローブが、（ｉ）下記ＲＮＡ配列（C.
    jejuni の１６ＳｒＲＮＡ）の１５又はそれ以上の塩基
    対配列に対し実質的に相補的であるCa mpylobacter プロ
    ーブでなく、 配列： AAGCUUGCUA GCUUGCUAGA AGUGGAUUAG UGGCGCACGG GUGAGUAAGG UAUAGUUAAU CUGCCCUACA CAAGAGGACA ACAGUUGGAA ACGACUGCUA AUACUCUAUA CUCCUGCUUA ACACAAGUUG ACUAGGGAAA GUUUUUCGGU GUAGGAUGAG ACUAUAUAGU AUCAGCUAGU UGGUAAGGUA AUGGCUUACC AAGGCUAUGA CGCUUAACUG GUCUGAGAGG AUGAUCAGUC ACACUGGAAC UGAGACACGG UCCAGACUCU ACGGGAGGCA GCAGUAGGGA AUAUUGCGCA AUGGGGGAAA CCCUGACGCA GCAACGCCGC GUGGAGGAUG ACACUUUUCG GAGCGUAAAC UCCUUUUCUU AGGGAAGAAU UCUGACGGUA CCUAAGGAAU AAGCACCGGC UAACUCCGUG CCAGCAGCCG CGGUAAUACG GAGGGUGCAA GCGUUACUCG GAAUCACUGG GCGUAAAGGG CGCGUAGGCG GAUUAUCAAG UCUCAAGUGA AAUCUAAUGG CUUAGCCAUU AAACUGCUUG GGAAACUGAU AGUCUAGAGU GCAGGGAGAG GCAGAUGGAU UGGUGGUGUA GGGUAAAUCC UAGAUAUCAC AGAUACAUUG CGAGGCGAUC UCUGGAUCCA UCGAGCCUA 又は配列： ACCAAGAAUA CCCAUUGCGA AGGCGAUCUG CUGGAACUCA ACUGACGCUA AGGCGCGAAA GCGUCCCCAG CAAACAGGAU UAAGAUACCC UUGUAGUCCA CGCCCUAAAA CGACGUACAC UAGUUAUUCC CCUGCUAGUC AUCUCUGUAU UGUCGCUAAC GCAUUAAGUG UACCGCCUAG GGUGUACGGU CGCAAGAUUA AUUUCCGCAA CGAGCGCACC CACGUAUUUG UUGCUAACGG UUCGGACCGA GACACUCUAA AUAGGCUGCC UUCGUAAGGA GGAGGAAGGU GUGGACGACG UCAAGUCAUC AUGGCCCUUA UGCCCAAGGC GACACACGUG CUACAAUGGC AUAUACAAUG AGACGCAAUA CCGCGAGGUU GGGCAAUCUA UAAAUAUGUC CGGUUCGGAU UGUUCUCUGC AACUCGAGAG CAUGAAGCCG GAAUCGCUAG UAAUCGUGGA UCAGCCAUGC UACGGUGAAU ACGUUCCCGG GUCUUGGAAC UCACCGCCCG UCACACCAUG GGAGUUGAUU UCACUCGAAG CCGGAAUACU AAACUAGUUA CCGUCCACAG UGGAAUCACC GGCGCUGGGG UGAAGUCGUA ACAAGGUAAC CGUAGGAGAA CCUGCGGUCG GAUCACCUCC U; （ｉｉ）次の配列でなく、 5' AAG GAG GTG ATC CAG 3' 5' AAAGGAGGTGATCCA 3' 5' AAGGAGGTGA 3' 5' AAGGAGGTGAT 3' 5' AAGGAGGTGATC 3' 5' AAGGAGGTGATCC 3' 5' AAGGAGGTGATCCA 3'又は ５’ ＡＡＧＣＴＧＣＴＣＲ’ＡＣＣＣＣＧＣＧ ３’ 但しＲ′はＴまたはＣであり、 （ｉｉｉ）次の配列ではなく、 ５’ ＡＡＣＡＣＧＴＡＴＣ ３’ 5' CGAATCAGCTATGTCG 3' 5' ATCCGGATTTATT 3' 5' TCTCAGTTCGGATTGA 3' 5' AGGTGGTGCATGGTTG 3' 5' TCCTGGCTCAGAT 3' 5' ATACATAGGT 3' 5' AACTATGTGC 3' 5' AATTTTTCACAATG 3'又は 5' TCTCGGGTCT 3' （ｉｖ）次の配列における少なくとも１２の連続配列で
    なく、 GTTTCACTTCTCACTTCGG,CUUUCACUUCUGAGUUCG, AGCTTAACTT
    CTGTGTTCGGCATGG又はAGCUUAACUUCUGUGUUCGGCAUGG; （ｖ）次の配列に相補的なMollicute sプローブでなく、 AACAGGTATC,CGAATCAGCTATGTCG,GAGGTT-AAC,ATCCGGATTTA
    TT,TCTCAGTTCGGATTGA,AGGTGGTGCATGGTTG,TCCTGGCTCAGGA
    T,AATACATAGGT,AACTATGTGC,AATTTTTCACAATG,TCTCGGGTC
    T, 及びTAGATATATG,但し−は配列内においてヌクレオチ
    ド欠失を表し、 （ｖｉ） GCTTAGTCGATACAGC でない、請求の範囲第２ないし６項のいずれか１項に記
    載の調製法。
  8. 【請求項８】 非標的ヌクレオチド配列が前記標的非ウ
    ィルス生物又は非ウィルス生物群に最も近縁の公知生物
    由来である請求の範囲第２なしし７項のいずれか１項に
    記載の調製法。
  9. 【請求項９】 前記標的rＲＮＡ可変領域又はそれをコ
    ードするＤＮＡが、前記標的非ウィルス生物又は非ウィ
    ルス生物群に対して最近縁である公知の生物の対応rＲ
    ＮＡ配列又はそれをコードするＤＮＡとの間に少なくと
    も約一つの塩基配列の差異を有するように選択される請
    求の範囲第第２ないし７項のいずれか１項に記載の調製
    法。
  10. 【請求項１０】 前記標的rＲＮＡ可変領域又はそれを
    コードするＤＮＡが、前記標的非ウィルス生物又は非ウ
    ィルス生物群に対して最近縁である公知の生物の対応r
    ＲＮＡ配列又はそれをコードするＤＮＡとの間に少なく
    とも約10％又はそれ以上の塩基配列の差異を有するよう
    に選択される請求の範囲第第２なしし７項のいずれか１
    項に記載の調製法。
  11. 【請求項１１】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも
    約15ヌクレオチド長である請求の範囲第第２なしし７項
    のいずれか１項に記載の調製法。
  12. 【請求項１２】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも
    約20ヌクレオチド長である請求の範囲第第２なしし７項
    のいずれか１項に記載の調製法。
  13. 【請求項１３】 前記オリゴヌクレオチドが約30ヌクレ
    オチド長である請求の範囲第第２なしし７項のいずれか
    １項に記載の調製法。
  14. 【請求項１４】 前記オリゴヌクレオチドが約20〜約50
    ヌクレオチド長である請求の範囲第第２なしし７項のい
    ずれか１項に記載の調製法。
  15. 【請求項１５】 前記オリゴヌクレオチドが約30〜約50
    ヌクレオチド長である請求の範囲第２なしし７項のいず
    れか１項に記載の調製法。
  16. 【請求項１６】 前記プローブが前記標的rＲＮＡ可変
    領域又はそれをコードするＤＮＡに対して少なくとも約
    75％の相補性を有する請求の範囲第２なしし７項のいず
    れか１項に記載の調製法。
  17. 【請求項１７】 前記プローブが前記標的rＲＮＡ可変
    領域又はそれをコードするＤＮＡに完全に相補的である
    請求の範囲第２なしし７項のいずれか１項に記載の調製
    法。
  18. 【請求項１８】 前記非標的生物又は非標的生物群が前
    記標的生物又は標的生物群と系統分類学的に近縁関係に
    ある請求の範囲第２なしし７項のいずれか１項に記載の
    調製法。
  19. 【請求項１９】 前記オリゴヌクレオチドが前記標的r
    ＲＮＡ可変領域の少くとも一部分又はそれをコードする
    ＤＮＡに対して少なくとも約90％の相補性を有している
    請求の範囲第２なしし７項のいずれか１項に記載の調製
    法。
  20. 【請求項２０】 前記オリゴヌクレオチドがそれから区
    別すべき前記系統分類学的に最近縁関係にあるものの非
    標的ヌクレオチド配列に対して約90％未満の相補性を有
    している請求の範囲第２なしし７項のいずれか１項に記
    載の調製法。
  21. 【請求項２１】 前記プローブを前記非標的ヌクレオチ
    ド配列とハイブリダイズさせることにより該プローブの
    非交差反応性を確証するステップを更に含む請求の範囲
    第２なしし２０項のいずれか１項に記載の調製法。
  22. 【請求項２２】 前記オリゴヌクレオチドの標的相補配
    列が、前記標的rＲＮＡ可変領域又はそれをコードする
    ＤＮＡ配列と少なくとも１つの知られている系統分類学
    的最近縁関係のもののrＲＮＡ可変領域又はそれをコー
    ドするＤＮＡとを整列させて、種間超可変rＲＮＡ又は
    それをコードするＤＮＡ領域を解明し、前記標的ｒＲＮ
    Ａ可変領域又はそれをコードするＤＮＡ内にある前記超
    可変領域の少なくとも１つへの前記オリゴヌクレオチド
    の相補性を実質的に最大になるように前記オリゴヌクレ
    オチドをデザインする一方、それから区別すべき前記系
    統分類学的最近縁関係のものの対応するｒＲＮＡ可変領
    域又はそれをコードするＤＮＡへの前記オリゴヌクレオ
    チドの相補性を実質的に最小になるように前記オリゴヌ
    クレオチドをデザインする、ことによって得られるもの
    である請求の範囲第第２なしし２１項のいずれか１項に
    記載の調製法。
  23. 【請求項２３】 前記オリゴヌクレオチドを非標的ヌク
    レオチド配列とハイブリダイズさせることにより該オリ
    ゴヌクレオチドの非交差反応性を確証するステップを更
    に含む請求の範囲第２２項に記載の調製法。
  24. 【請求項２４】 標的非ウイルス生物又は非ウイルス生
    物群の標的ヌクレオチド配列を非標的非ウイルス生物又
    は非ウイルス生物群の非標的ヌクレオチド配列から区別
    するために、非ウィルス生物又は非ウィルス生物群につ
    いて分析すべき試料の任意のrＲＮＡ又はＤＮＡとプロ
    ーブとを、一緒に反応させることを包含するハイブリダ
    イゼーションアッセイであって、前記プローブはオリゴ
    ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドの少なく
    とも約１０連続ヌクレオチドはハイブリダイゼーション
    条件下で前記標的ヌクレオチド配列の標的可変領域又は
    その相補配列と検出可能なハイブリドを形成することが
    でき、前記オリゴヌクレオチドは前記非標的ヌクレオチ
    ド配列とは検出可能なハイブリドを形成することができ
    なく、前記標的可変領域は前記標的非ウイルス生物又は
    非ウイルス生物群のｒＲＮＡ又は前記ｒＲＮＡをコード
    するＤＮＡ中に存在し、かつ前記標的可変領域はEscher
    ichia co liの５ＳｒＲＮＡ、Escheric hia coliの１６Ｓ
    ｒＲＮＡ、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡ、Saccha
    romy ces cerevisiaeの１８ＳｒＲＮＡ及びSaccharomyce
    s cerevisiaeの２８ＳｒＲＮＡからなる群より選ばれる
    ｒＲＮＡの領域に対応するものである、アッセイ。
  25. 【請求項２５】 前記標的可変領域が以下の群：Escher
    ichia coliの５ＳｒＲＮＡの６５−１０８塩基、Escher
    ichia coliの５ＳｒＲＮＡの６５−１２０塩基、Escher
    ichia coliの１６ＳｒＲＮＡの６０−１００塩基、Esch
    eri chia coliの１６ＳｒＲＮＡの６０−１０５塩基、Es
    cherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１２０−１５０塩
    基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１２５−１５
    ０塩基、Escheri chia coliの１６ＳｒＲＮＡの１７０−
    ２３０塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１７
    ５−２１０塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの
    １８５−２２５塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮ
    Ａの１９０−２３０塩基、Escherichia coliの１６Ｓｒ
    ＲＮＡの３３０−３６５塩基、Es cherichia coliの１６
    ＳｒＲＮＡの４０５−４２８塩基、Escherichia coliの
    １６ＳｒＲＮＡの４０５−４８０塩基、Escherichia co
    liの１６ＳｒＲＮＡの４４０−４７５塩基、Escherichi
    a coliの１６ＳｒＲＮＡの４５０−４９０塩基、Escher
    ichia coliの１６ＳｒＲＮＡの４５５−４８５塩基、Es
    cherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの６００−６３５塩
    基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの６００−６７
    ０塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの６３０−
    ６７５塩基、Escherichi a coliの１６ＳｒＲＮＡの６７
    ５−７１５塩基、E scherichia col iの１６ＳｒＲＮＡの
    ７０５−７３５塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮ
    Ａの８２０−８６０塩基、Escherichia coliの１６Ｓｒ
    ＲＮＡの８２５−８６０塩基、Escherichia coliの１６
    ＳｒＲＮＡの８３０−８７０塩基、Esche richia coliの
    １６ＳｒＲＮＡの９７５−１０２０塩基、Escherich ia
    coliの１６ＳｒＲＮＡの９８０−１０１０塩基、Escher
    ichia coliの１６ＳｒＲＮＡの９８０−１０１５塩基、
    Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの９８０−１０５０
    塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの９９５−１
    ０３０塩基、Escherichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１０
    ２５−１０６０塩基、Es cherichia coliの１６ＳｒＲＮ
    Ａの１０８０−１１１０塩基、Escherichia coliの１６
    ＳｒＲＮＡの１１２５−１１５５塩基、Escherichia co
    liの１６ＳｒＲＮＡの１２５０−１２９０塩基、Escher
    ichia coliの１６ＳｒＲＮＡの１２５５−１２９０塩
    基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの２７０−３０
    ５塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの２７０−
    ３９０塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの２７
    ５−３２０塩基、Esc herichia coliの２３ＳｒＲＮＡの
    ３０５−３４０塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮ
    Ａの３３０−３６５塩基、Escherichia coliの２３Ｓｒ
    ＲＮＡの３３５−３７５塩基、Escherichia coliの２３
    ＳｒＲＮＡの３５０−３９５塩基、Escheri chia coliの
    ２３ＳｒＲＮＡの３６５−４０５塩基、Escherichia co
    liの２３ＳｒＲＮＡの４６０−４９０塩基、Escherichi
    a coliの２３ＳｒＲＮＡの５３５−５６０塩基、Escher
    ichia coliの２３ＳｒＲＮＡの５４０−５７５塩基、Es
    cherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１０５０−１０８０
    塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１１５０−
    １２００塩基、Esche richia coliの２３ＳｒＲＮＡの１
    １５５−１１９０塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲ
    ＮＡの１１６０−１１９０塩基、Escherichia c oliの２
    ３ＳｒＲＮＡの１４４０−１４７５塩基、Escherichia
    coliの２３ＳｒＲＮＡの１４４０−１６００塩基、Esch
    erichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１４５０−１４９０塩
    基、Escherichi a coliの２３ＳｒＲＮＡの１５１０−１
    ５４５塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１５
    １５−１５５５塩基、Esch erichia coliの２３ＳｒＲＮ
    Ａの１５７０−１６１０塩基、Escherichia coliの２３
    ＳｒＲＮＡの１５８５−１６２０塩基、Escherichia co
    liの２３ＳｒＲＮＡの１７１０−１７５０塩基、Escher
    ichia coliの２３ＳｒＲＮＡの１９００−１９６０塩
    基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮＡの２１９０−２
    ３３０塩基、Escherich ia coliの２３ＳｒＲＮＡの２１
    ９５−２２３５塩基、Escherichia coliの２３ＳｒＲＮ
    Ａの２２８０−２３３０塩基、Sac charomyces cerevisi
    aeの１８ＳｒＲＮＡの８４５−８８０塩基、Saccharomy
    ce s cerevisiaeの２８ＳｒＲＮＡの１２２５−１２７０
    塩基、及びSacchar omyces cerevis iaeの２３ＳｒＲＮＡ
    の１９６０−２０００塩基、から選ばれるｒＲＮＡの領
    域に対応するものである請求の範囲第２４項に記載のア
    ッセイ。
  26. 【請求項２６】 前記標的ヌクレオチド配列が５ＳｒＲ
    ＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮ
    Ａ及び２８ＳｒＲＮＡからなる群より選ばれるものであ
    る請求の範囲第２４又は２５項に記載のアッセイ。
  27. 【請求項２７】 前記標的非ウイルス生物が、Acinet ob
    acter属、Bacil lus属、Bactriode s属、Blastomyces属、
    Branhamella属、Campylobacter属、Ｃａｎｄｉｄａ属、
    Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Citrobacter属、Chromobacteri
    um属、Clostridium属,Corynebacterium属、Cryptococcu
    s属、Deinococcus属、Derxia属、Enterococci、Enterob
    acter属、Escherichia属、Gargnerella属、Hahnia属、K
    lebsiella属、Lactobacillus属、Legionella属、Moraxe
    lla属、Morgenella属、M ycoplasma属、Myc obacterium
    属、Ne isseria属、Prote us属、Providenci a属、Pseudom
    onas属、Rahnella属、Rhodospirillum属、Saccharomyce
    s属、Salmonella属、Serratia属、Shigella属、Staphyl
    ococcus属、Streptococcus属、Torulopsis属、Trichosp
    oron属、Ureaplasma属、Vibrio属又はYer sinia属の種で
    ある請求の範囲第２４ないし２６項のいずれか１項に記
    載のアッセイ。
  28. 【請求項２８】 前記標的ヌクレオチド配列が以下の
    群： （ｉ）Mycoplasma属の種の５ＳｒＲＮＡ、 （ｉｉ）Mycoplasma属、Mycobacterium属、Chlamydia
    属、Escherichia属、Legionella属、Enterococci, Neis
    ser ia属、Campylobac ter属、Streptoco ccus属、Salmone
    l la属、Shigella属、Citrobacter属、Enterobacter属、
    Klebsiella属、Morgenella属、Providencia属、Pseudom
    onas属、Serratia属、Staphylococcus属、Ureaplasma
    属、Acinetobacter属、Bacillus属、Bactriodes属、Bra
    nhamella属、Chromobacterium属、Clostridium属、Cory
    nebacterium属、Deinococcus属、Derxia属、Gargnerell
    a属、Hahnia属、Lactobacillus属、Moraxella属、Ra hne
    lla属、Rhodos pirillum属、Vibr io属又はYersinia属の
    種の１６ＳｒＲＮＡ、 （ｉｉｉ）Mycobacterium属、Chlamydia属、Enterobact
    er属、Legionella属、Sa lmonella属、Prot eus属、Pseud
    omon as属、Citrobacte r属、Escherichia属、Klebsiella
    属、Morgenella属、Providencia属、Serratia属、Staph
    ylococcus属、Streptococcus属、Ureaplasma属、Bacill
    us属、Branhamella属、Campylobacter属、Chromobacter
    ium属、Clostridium属、Deinococcus属、Derxia属、Gar
    dnerella属、Hafnia属、Lactobacillus属、Moraxella
    属、Neisseria属、M ycoplasma属、Rah nella属、Rhodosp
    irillum属、Vibri o属、Yersinia属又はEscherichia属の
    種の２３ＳｒＲＮＡ （ｉｖ）Blastomyces属、Candida属、Cryptococcus属、
    Torulopsis属、Trichosporon属又はSaccha romyces属の
    種の１８ＳｒＲＮＡ、及び（ｖ）Candida属、Torulopsi
    s属又はSaccha romyces属の種の２８ＳｒＲＮＡ、から選
    ばれるものである請求の範囲第２４ないし２７項のいず
    れか１項に記載のアッセイ。
  29. 【請求項２９】 プローブが、（ｉ）下記ＲＮＡ配列
    （C. jejuni の１６ＳｒＲＮＡ）の１５又はそれ以上の
    塩基対配列に対し実質的に相補的であるCampyloba cter
    プローブでなく、 配列： AAGCUUGCUA GCUUGCUAGA AGUGGAUUAG UGGCGCACGG GUGAGUAAGG UAUAGUUAAU CUGCCCUACA CAAGAGGACA ACAGUUGGAA ACGACUGCUA AUACUCUAUA CUCCUGCUUA ACACAAGUUG ACUAGGGAAA GUUUUUCGGU GUAGGAUGAG ACUAUAUAGU AUCAGCUAGU UGGUAAGGUA AUGGCUUACC AAGGCUAUGA CGCUUAACUG GUCUGAGAGG AUGAUCAGUC ACACUGGAAC UGAGACACGG UCCAGACUCU ACGGGAGGCA GCAGUAGGGA AUAUUGCGCA AUGGGGGAAA CCCUGACGCA GCAACGCCGC GUGGAGGAUG ACACUUUUCG GAGCGUAAAC UCCUUUUCUU AGGGAAGAAU UCUGACGGUA CCUAAGGAAU AAGCACCGGC UAACUCCGUG CCAGCAGCCG CGGUAAUACG GAGGGUGCAA GCGUUACUCG GAAUCACUGG GCGUAAAGGG CGCGUAGGCG GAUUAUCAAG UCUCAAGUGA AAUCUAAUGG CUUAGCCAUU AAACUGCUUG GGAAACUGAU AGUCUAGAGU GCAGGGAGAG GCAGAUGGAU UGGUGGUGUA GGGUAAAUCC UAGAUAUCAC AGAUACAUUG CGAGGCGAUC UCUGGAUCCA UCGAGCCUA 又は配列： ACCAAGAAUA CCCAUUGCGA AGGCGAUCUG CUGGAACUCA ACUGACGCUA AGGCGCGAAA GCGUCCCCAG CAAACAGGAU UAAGAUACCC UUGUAGUCCA CGCCCUAAAA CGACGUACAC UAGUUAUUCC CCUGCUAGUC AUCUCUGUAU UGUCGCUAAC GCAUUAAGUG UACCGCCUAG GGUGUACGGU CGCAAGAUUA AUUUCCGCAA CGAGCGCACC CACGUAUUUG UUGCUAACGG UUCGGACCGA GACACUCUAA AUAGGCUGCC UUCGUAAGGA GGAGGAAGGU GUGGACGACG UCAAGUCAUC AUGGCCCUUA UGCCCAAGGC GACACACGUG CUACAAUGGC AUAUACAAUG AGACGCAAUA CCGCGAGGUU GGGCAAUCUA UAAAUAUGUC CGGUUCGGAU UGUUCUCUGC AACUCGAGAG CAUGAAGCCG GAAUCGCUAG UAAUCGUGGA UCAGCCAUGC UACGGUGAAU ACGUUCCCGG GUCUUGGAAC UCACCGCCCG UCACACCAUG GGAGUUGAUU UCACUCGAAG CCGGAAUACU AAACUAGUUA CCGUCCACAG UGGAAUCACC GGCGCUGGGG UGAAGUCGUA ACAAGGUAAC CGUAGGAGAA CCUGCGGUCG GAUCACCUCC U; （ｉｉ）次の配列でなく、 5' AAG GAG GTG ATC CAG 3' 5' AAAGGAGGTGATCCA 3' 5' AAGGAGGTGA 3' 5' AAGGAGGTGAT 3' 5' AAGGAGGTGATC 3' 5' AAGGAGGTGATCC 3' 5' AAGGAGGTGATCCA 3'又は 5' AAGCTGCTCR'ACCCCGCG 3' 但しＲ′はＴまたはＣであり、 （ｉｉｉ）次の配列ではなく、 5' AACACGTATC 3' 5' CGAATCAGCTATGTCG 3' 5' ATCCGGATTTATT 3' 5' TCTCAGTTCGGATTGA 3' 5' AGGTGGTGCATGGTTG 3' 5' TCCTGGCTCAGAT 3' 5' ATACATAGGT 3' 5' AACTATGTGC 3' 5' AATTTTTCACAATG 3'又は 5' TCTCGGGTCT 3' （ｉｖ）次の配列における少なくとも１２の連続配列で
    なく、 GTTTCACTTCTCACTTCGG, CUUUCACUUCUGAGUUCG, AGCTTAACT
    TCTGTGTTCGGCATGG又はＡＧＣＵＵＡＡＣＵＵＣＵＧＵＧ
    ＵＵＣＧＧＣＡＵＧＧ； （ｖ）次の配列に相補的なＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓプロー
    ブでなく、 AACAGGTATC,CGAATCAGCTATGTCG,GAGGTT-AAC,ATCCGGATTTA
    TT,TCTCAGTTCGGATTGA,AGGTGGTGCATGGTTG,TCCTGGCTCAGGA
    T,AATACATAGGT,AACTATGTGC,AATTTTTCACAATG,TCTCGGGTC
    T, 及びTAGATATATG,但し−は配列内においてヌクレオチ
    ド欠失を表し、 （ｖｉ） GCTTAGTCGATACAGC でない、請求の範囲第２４ないし２８項のいずれか１項
    に記載のアッセイ。
  30. 【請求項３０】 前記プローブと試料ｒＲＮＡ又はそれ
    をコードするＤＮＡとの前記ハイブリダイゼーション
    が、少なくとも約１０％から約１００％である請求の範
    囲第２４ないし２９項のいずれか１項に記載のアッセ
    イ。
  31. 【請求項３１】 前記プローブが cＤＮＡである請求の
    範囲第２４ないし２９項のいずれか１項に記載のアッセ
    イ。
  32. 【請求項３２】 前記条件がＴm 値の約25℃下からＴm
    値の約１℃下までの温度を含む請求の範囲第２４ないし
    ２９項のいずれか１項に記載のアッセイ。
  33. 【請求項３３】 陽性ホモロガスコントロール、陽性ヘ
    テロガスコントロール、又はその両者の比較アッセイを
    更に含む請求の範囲第２４ないし２９項のいずれか１項
    に記載のアッセイ。
  34. 【請求項３４】 陰性コントロールの比較アッセイを更
    に含む請求の範囲第２４ないし２９項のいずれか１項に
    項記載のアッセイ。
  35. 【請求項３５】 ハイブリダイゼーション速度を増加さ
    せるための試薬を含む条件下で行なう請求の範囲第２４
    ないし２９項のいずれか１項に記載のアッセイ。
  36. 【請求項３６】 前記条件が、プローブ及び任意の相補
    試料rＲＮＡ又はＤＮＡ間の最大ハイブリダイゼーショ
    ン並びにプローブ及び任意の非相補試料rＲＮＡ又はＤ
    ＮＡ間の最小交差反応性を促進するようなものである請
    求の範囲第２４ないし２９項のいずれか１項に記載のア
    ッセイ。
  37. 【請求項３７】 前記プローブが標識されている請求の
    範囲第２４ないし２９項のいずれか１項に記載のアッセ
    イ。
  38. 【請求項３８】 前記プローブが同位元素、非同位元素
    又は化学発光性の標識で標識されている請求の範囲第３
    ７項に記載のアッセイ。
  39. 【請求項３９】 反応ステップに先立ち、前記非ウィル
    ス生物又は非ウィルス生物群の細胞から rＲＮＡを遊離
    させることを更に含む請求の範囲第２４ないし２９項の
    いずれか１項に記載のアッセイ。
  40. 【請求項４０】 前記標的非ウィルス生物又は非ウィル
    ス生物群がMyc obacterium avi um、Mycobacterium intra
    cellulare、Mycobacterium tuberculosis‐複合細菌、M
    ycobacterium属、Mycoplasma pneumoniae、Legionell
    a、Salmonella、Chl amydia trachom atis、Campylobacte
    r、Proteus mirabilis、Enterococcus、Ente robacter c
    loac ae、E．coli又はPse udomonas 群Ｉである請求の範
    囲第２４ないし２９項のいずれか１項に記載のアッセ
    イ。
  41. 【請求項４１】 前記標識オリゴヌクレオチドプローブ
    が約20〜約50ヌクレオチド長である請求の範囲第２４な
    いし２９項のいずれか１項に記載のアッセイ。
  42. 【請求項４２】 前記標識プローブが少なくとも約95％
    が前記rＲＮＡ可変領域又はそれをコードするＤＮＡに
    相補的である請求の範囲第２４ないし２９項のいずれか
    １項に記載のアッセイ。
  43. 【請求項４３】 少なくとも約10ヌクレオチド長であ
    り、かつ少なくとも約75％が前記標的ヌクレオチド配列
    に相補的である追加プローブの一つ以上を使用すること
    を更に含む請求の範囲第２４ないし２９項のいずれか１
    項に記載のアッセイ。
  44. 【請求項４４】 一つ以上の追加非ウィルス生物又は非
    ウィルス生物群を同定し、それによってアッセイすべき
    非ウィルス生物群を拡張できる追加プローブの一つ以上
    を使用することを更に含む請求の範囲第２４ないし２９
    項のいずれか１項に記載のアッセイ。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010515451A (ja) * 2007-01-08 2010-05-13 メディジーンズ カンパニー リミテッド 大腸菌検出用ｄｎａチップ
JP5219057B2 (ja) * 1998-07-31 2013-06-26 旭化成株式会社 微生物検出用抗体

Families Citing this family (209)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4038804A1 (de) * 1990-10-09 1992-04-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit
US5447848A (en) * 1986-01-22 1995-09-05 Amoco Corporation Detection of campylobacter with nucleic acid probes
US7090972B1 (en) 1986-11-24 2006-08-15 Gen-Probe Incorporated Methods for determining the presence of non-viral organisms in a sample
US5994059A (en) * 1986-11-24 1999-11-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and methods for detecting Streptomyces enterococci
US6150517A (en) 1986-11-24 2000-11-21 Gen-Probe Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
US5541308A (en) * 1986-11-24 1996-07-30 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms
US7087742B1 (en) 1986-11-24 2006-08-08 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
GB8709803D0 (en) * 1987-04-24 1987-05-28 Mcfadden J J Treatment of crohn's disease &c
EP0305145A3 (en) * 1987-08-24 1990-05-02 Ortho Diagnostic Systems Inc. Methods and probes for detecting nucleic acids
US5089386A (en) * 1987-09-11 1992-02-18 Gene-Trak Systems Test for listeria
US5030557A (en) * 1987-11-24 1991-07-09 Ml Technology Venture Means and method for enhancing nucleic acid hybridization
US5147778A (en) * 1987-12-01 1992-09-15 Amoco Corporation Probes and methods for the detection of salmonella
DE3854943T2 (de) * 1987-12-01 1996-09-05 Amoco Corp Nachweis von salmonella
WO1989006704A1 (en) * 1988-01-11 1989-07-27 Microprobe Corporation Oligonucleotide probes for detection of periodontal pathogens
EP0335633B1 (en) * 1988-03-28 1995-05-03 Amoco Corporation Detecting Eukaryotic Microorganisms
JPH02203800A (ja) * 1988-04-15 1990-08-13 Innogenetics Sa:Nv ナイセリア菌株を検出するための交雑プローブ
FR2633941A1 (fr) * 1988-07-05 1990-01-12 Ire Medgenix Sa Sondes d'acides nucleiques utiles pour detecter de maniere specifique differentes especes bacteriennes du genre campylobacter
JPH0638759B2 (ja) * 1988-07-29 1994-05-25 株式会社島津製作所 サルモネラ菌検査に用いるｄｎａプローブ及びそれを用いたサルモネラ菌の検出法
US5084565A (en) * 1988-08-18 1992-01-28 Gene-Trak Systems Probes for the specific detection of escherichia coli and shigella
US7172863B1 (en) 1988-12-09 2007-02-06 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae
EP0418346A1 (en) * 1989-02-06 1991-03-27 Gene-Trak Systems Probes and methods for the detection of listeria
IE81145B1 (en) * 1989-04-20 2000-05-03 Thomas Gerard Barry Generation of specific probes for target nucleotide sequences
CA2016553A1 (en) * 1989-05-16 1990-11-16 Dyann F. Wirth Dna hybridization probes for identification of mycobacteria
EP0426837B1 (en) * 1989-05-23 1995-09-06 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection of staphylococcus aureus
US5217862A (en) * 1989-05-24 1993-06-08 Amoco Corporation Method for the detection of Neisseria gonorrhoeae
JP3170714B2 (ja) * 1989-05-31 2001-05-28 ジーン―トラック・システムス クラミジア・トラコマチスを検出するための核酸プローブ
AU5950690A (en) * 1989-05-31 1991-01-07 Gene-Trak Systems Universal eubacteria nucleic acid probes and methods
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
US7009041B1 (en) 1989-07-11 2006-03-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis
US5334501A (en) * 1989-07-11 1994-08-02 Microprobe Corporation Quantification of bacteria using a nucleic acid hybridization assay
EP0484385A4 (en) * 1989-07-11 1993-05-26 Microprobe Corporation Quantification of bacteria using a nucleic acid hybridization assay
DE3923341A1 (de) * 1989-07-14 1991-01-24 Boehringer Mannheim Gmbh Neisseria gonorrhoeae-nachweis
FR2651505B1 (fr) * 1989-09-06 1994-07-22 Pasteur Institut Fragments d'acides nucleiques derives d'un genome de mycobacterie appropriee, leurs applications dans le diagnostic des infections a mycobacteries et plasmides contenant lesdits fragments.
JP3218350B2 (ja) * 1989-09-06 2001-10-15 アンスティテュ パストゥール 適当なマイコバクテリアゲノム由来の核酸断片、マイコバクテリア感染の診断におけるその適用及び該断片を含有するプラスミド
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
CA2025178A1 (en) * 1989-10-02 1991-04-03 William G. Weisburg Nucleic acid probes for the detection of lyme disease spirochetes
CA2025181A1 (en) * 1989-10-12 1991-04-13 William G. Weisburg Nucleic acid probes and methods for detecting fungi
CA2025180A1 (en) * 1989-10-12 1991-04-13 William G. Weisburg Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts
CA2025179A1 (en) * 1989-10-12 1991-04-13 William G. Weisburg Nucleic acid probes and methods for detecting cryptococcus neoformans
CA2028012A1 (en) * 1989-10-23 1991-04-24 Randall Dimond Hybridization assay for campylobacter rrna
CA2033718A1 (en) * 1990-01-19 1991-07-20 Ronald M. Atlas Process for detection of water-borne microbial pathogens and indicators of human fecal contamination in water samples and kits therefor
EP0439968A1 (en) * 1990-02-02 1991-08-07 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes for the detection of haemophilus ducreyi strains
EP0452596A1 (en) * 1990-04-18 1991-10-23 N.V. Innogenetics S.A. Hybridization probes derived from the spacer region between the 16S and 23S rRNA genes for the detection of non-viral microorganisms
AU7429591A (en) * 1990-04-18 1991-10-24 Gene-Trak Systems Nucleic acid probes for the detection of giardia lamblia
WO1992004458A1 (en) * 1990-09-11 1992-03-19 The Brookdale Hospital Medical Center Drug resistance screening method
US5484699A (en) * 1990-09-28 1996-01-16 Abbott Laboratories Nucleotide sequences useful as type specific probes, PCR primers and LCR probes for the amplification and detection of human papilloma virus, and related kits and methods
US5635348A (en) * 1990-10-05 1997-06-03 Hoffmann-La Roche Inc. Method and probes for identifying bacteria found in blood
US5620847A (en) * 1990-10-05 1997-04-15 Hoffman-La Roche Inc. Methods and reagents for detection of bacteria in cerebrospinal fluid
DE69132830T2 (de) * 1990-10-05 2002-07-18 Hoffmann La Roche Verfahren und Reagentien für die Identifikation von Bakterien
ATE161893T1 (de) * 1990-10-19 1998-01-15 Microprobe Corp Verfahren und pharmazeutische sätze zum aufspüren von mikroorganismen assoziiert mit vaginalinfektionen
US5700636A (en) * 1990-10-19 1997-12-23 Becton Dickinson And Company Methods for selectively detecting microorganisms associated with vaginal infections in complex biological samples
JPH07121240B2 (ja) * 1990-11-09 1995-12-25 日本製粉株式会社 細菌の薬剤感受性試験法
US5256536A (en) * 1990-11-09 1993-10-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Nucleotide probe for Neisseria gonrrhoeae
US5491225A (en) * 1991-12-19 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. PCR primers for detection of legionella species and methods for controlling visual intensity in hybridization assays
CA2075493A1 (en) * 1990-12-20 1992-06-21 Teresa K. H. Picone Pcr primers for detection of legionella species and methods for controlling visual intensity in hybridization assays
US5762876A (en) * 1991-03-05 1998-06-09 Molecular Tool, Inc. Automatic genotype determination
US5552279A (en) * 1991-03-22 1996-09-03 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection of mycoplasma pneumoniae and mycoplasma genitalium
US5843667A (en) * 1991-03-22 1998-12-01 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection for genital mycoplasmas
US5472843A (en) * 1991-04-25 1995-12-05 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to Haemophilus influenzae
JPH05137600A (ja) * 1991-05-15 1993-06-01 Amoco Corp ビブリオ属細菌を検出するための組成物及び方法
NZ243802A (en) * 1991-07-31 1994-12-22 Hoffmann La Roche Polynucleotide probes and methods for their use for identifying and detecting bacteria capable of causing meningitis
US6028187A (en) * 1991-08-01 2000-02-22 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to Listeria monocytogenes
US5521300A (en) * 1991-08-13 1996-05-28 Norval B. Galloway Oligonucleotides complementary to mycobacterial nucleic acids
EP0529985A1 (en) * 1991-08-23 1993-03-03 Hernan Robert Chang Pinares Molecular detection and identification of a new mycobacterium causing infection in aids patients
US5738987A (en) * 1991-09-04 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated 16S ribosomal nucleic acid probes to streptococcus pneumoniae
US5292874A (en) * 1991-09-04 1994-03-08 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to Staphylococcus aureus
AU2844792A (en) * 1991-12-11 1993-06-17 Becton Dickinson & Company Probes to chlamydia trachomatis
US5558990A (en) * 1991-12-18 1996-09-24 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to blastomyces dermatitidis and paracoccidioides brasiliensis
US5763163A (en) * 1991-12-18 1998-06-09 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to Cryptococcus neoformans
US5284747A (en) * 1991-12-18 1994-02-08 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to Coccidioides immitis
WO1993013221A1 (en) * 1991-12-23 1993-07-08 Chiron Corporation Chlamydiae probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
EP0639230A1 (en) * 1992-04-27 1995-02-22 Research Corporation Technologies, Inc. Oligonucleotides and nucleic acids for detection of ureaplasma urealyticum
WO1993022330A1 (en) * 1992-04-28 1993-11-11 Gen-Probe Incorporated NUCLEIC ACID PROCESS PROBES TO $i(MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS)
WO1993022461A1 (en) * 1992-05-06 1993-11-11 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
US5426025A (en) * 1992-05-28 1995-06-20 Florida State University Species-specific DNA probes for vibrio vulnificus methods and kits
DE69227678T2 (de) * 1992-06-04 1999-05-27 Vysis Inc Nukleinsäuresonden zum Nachweis von Mycoplasma fermentans
DE69226948T2 (de) * 1992-06-04 1999-02-04 Vysis Inc Nucleinsäureproben zum Nachweis genitaler Mycoplasmen
EP0576743B1 (en) * 1992-06-04 1996-12-11 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection of mycoplasma pneumoniae
US5443951A (en) * 1992-07-20 1995-08-22 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Species-specific oligonucleotides for bifidobacteria and a method of detection using the same
JPH07509361A (ja) * 1992-07-28 1995-10-19 日立化成工業株式会社 遺伝子検出システム
US5580971A (en) * 1992-07-28 1996-12-03 Hitachi Chemical Company, Ltd. Fungal detection system based on rRNA probes
FR2694768B1 (fr) 1992-07-30 1994-12-23 Pasteur Institut Séquences d'oligonucléotides pour la détection spécifique de mollicutes par amplication de gènes conservés.
US5776680A (en) * 1992-07-30 1998-07-07 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Diagnostic probes for pneumocystis carini
KR100316498B1 (ko) * 1992-08-04 2002-06-20 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프, 피터 알. 쉬어리 핵산서열증폭방법
US5374718A (en) * 1992-08-26 1994-12-20 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to chlamydia pneumoniae
US5389515A (en) * 1992-09-15 1995-02-14 Boehringer Mannheim Corporation Isolated nucleotide sequences for identifying Neisseria gonorrhoeae
US5582983A (en) * 1992-10-28 1996-12-10 Woods Hole Oceanographic Institution Genetic markers and methods of identifying alexandrium (dinophyceae) species
US5314801A (en) * 1992-11-06 1994-05-24 Becton, Dickinson And Company Probes to Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, and Mycobacterium paratuberculosis
US5591838A (en) * 1993-02-12 1997-01-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Detection of conversion to mucoidy in pseudomonas aeruginosa infecting cystic fibrosis patients
JPH06261758A (ja) * 1993-03-12 1994-09-20 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd マラリアの検出
CA2161405A1 (en) * 1993-04-26 1994-11-10 James L. Doran Methods and compositions for detection of salmonella
JPH08501455A (ja) * 1993-05-24 1996-02-20 アモコ・コーポレーション Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属の細菌の検出のための核酸プローブおよび在郷軍人病の病因物質の検出方法
US5550040A (en) * 1993-06-23 1996-08-27 Hoffman-La Roche Inc. Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae
JPH09508003A (ja) * 1993-07-23 1997-08-19 ハイセック，インコーポレイション 未知の生物をスクリーニングするための方法
US5601978A (en) * 1993-09-03 1997-02-11 Abbott Laboratories Oligonucleotides and methods for the detection of chlamydia trachomatis
US6136529A (en) * 1993-09-03 2000-10-24 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to Mycobacterium avium complex
US5484909A (en) * 1993-09-10 1996-01-16 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection of bacteria of the genera Pediococcus and Lactobacillus and methods for the detection of the bacterial agents causing spoilage of beer
EP1352973A3 (en) 1993-12-23 2004-01-02 Beckman Coulter, Inc. Automatic genotype determination
US5582978A (en) * 1994-01-21 1996-12-10 Amoco Corporation Nucleic acid probes for the detection of Haemophilus influenzae
US5922575A (en) * 1994-04-18 1999-07-13 Mayo Foundation For Medical Education & Research Mutations in the katG gene useful for detection of M. tuberculosis
US5658733A (en) * 1994-04-18 1997-08-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of isoniazid resistant strains of M. tuberculosis
US6169169B1 (en) 1994-05-19 2001-01-02 Dako A/S PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis
US5643723A (en) * 1994-05-26 1997-07-01 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens
PT771360E (pt) 1994-06-09 2004-07-30 Innogenetics Nv Metodo para a deteccao do espectro de resistencia a antibioticos de especies mycobacterium
US5656427A (en) * 1994-08-29 1997-08-12 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid hybridization assay probes, helper probes and amplification oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae nucleic acid
US20020055101A1 (en) 1995-09-11 2002-05-09 Michel G. Bergeron Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
US6001564A (en) * 1994-09-12 1999-12-14 Infectio Diagnostic, Inc. Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
US5514551A (en) * 1994-10-14 1996-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis
EP0709466B1 (en) * 1994-10-28 2006-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for the simultaneous detection and quantification of multiple specific nucleic acid sequences
US5654141A (en) * 1994-11-18 1997-08-05 Thomas Jefferson University Amplification based detection of bacterial infection
US5763169A (en) * 1995-01-13 1998-06-09 Chiron Diagnostics Corporation Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi
US5707802A (en) * 1995-01-13 1998-01-13 Ciba Corning Diagnostics Corp. Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi
US6180339B1 (en) 1995-01-13 2001-01-30 Bayer Corporation Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi
WO1996022392A2 (en) * 1995-01-19 1996-07-25 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid amplification oligonucleotides and probes to lyme disease associated borrelia
US5622827A (en) * 1995-02-07 1997-04-22 Gen-Probe Incorporated Amplification primers and nucleic acid probes targeted to coccidioides immitis nucleic acid
FR2730234B1 (fr) * 1995-02-08 1997-03-28 Bio Merieux Detection de bacteries du genre listeria selon des techniques d'hybridation de sondes nucleiques
US6110665A (en) * 1995-02-14 2000-08-29 University Of Kentucky Research Foundation Sarcocystis neuronadiagnostic primer and its use in methods of equine protozoal myeloencephalitis diagnosis
FR2733755B1 (fr) * 1995-05-03 1997-07-11 Bio Merieux Fragment nucleotidique de l'arn ribosomique 16s de corynebacteries, sondes et amorces derivees, reactif et procede de detection
US5747252A (en) 1995-06-07 1998-05-05 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for Neisseria species
US5710002A (en) * 1995-06-07 1998-01-20 Oregon State University Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
US5994066A (en) * 1995-09-11 1999-11-30 Infectio Diagnostic, Inc. Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
JP2000500342A (ja) 1995-11-15 2000-01-18 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド ヒトパピローマウイルス核酸に相補的な核酸プローブおよび関連する方法およびキット
US5888733A (en) * 1995-11-16 1999-03-30 Dako A/S In situ hybridization to detect specific nucleic acid sequences in eucaryotic samples
US6048688A (en) * 1996-11-12 2000-04-11 Kimberly-Clark Corporation Method for detection of Pseudomonas aeruginosa using polymerase chain reaction
DE69732926T2 (de) * 1996-02-28 2006-04-13 bioMérieux B.V. Primer und sonden zur amplifizierung, erkennung und typisierung von mycoplasma pneumoniae
JP4241929B2 (ja) 1996-05-22 2009-03-18 ジェン―プローブ・インコーポレーテッド Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための組成物および方法
FR2751000B1 (fr) * 1996-07-12 1998-10-30 Inst Nat Sante Rech Med Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques
US5962227A (en) * 1996-07-26 1999-10-05 The Regents Of The University Of California DNA-based diagnostic test for detecting myxobolus, the cause of salmonid whirling disease
US20030049636A1 (en) 1999-05-03 2003-03-13 Bergeron Michel G. Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories
US20100267012A1 (en) 1997-11-04 2010-10-21 Bergeron Michel G Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms
US6025133A (en) * 1996-12-30 2000-02-15 Gen-Probe Incorporated Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use
FR2764293B1 (fr) * 1997-06-05 2001-09-14 Bio Merieux Fragment nucleotidique de l'arn 23s de bacteries du genre chlamydia, utilisations comme sonde, amorce, et dans un reactif et un procede de detection
US6054269A (en) * 1997-06-25 2000-04-25 Institut Pasteur Polynucleotides and their use for detecting enterococci and streptococci bacterial strains
US6465638B2 (en) 1997-06-25 2002-10-15 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Multiplexed PCR assay for detecting disseminated Mycobacterium avium complex infection
FR2769323B1 (fr) * 1997-10-08 2001-07-13 Suez Lyonnaise Des Eaux Moyens pour l'analyse qualitative et quantitative des populations microbiennes eventuellement presentes dans un echantillon
EP1044284A2 (en) * 1998-01-08 2000-10-18 Merck Sharp & Dohme de Espana S.A.E. Hybridization probes which differentiate between the actinomadura madurae group of bacteria and maduromycetes
US6468743B1 (en) * 1998-05-18 2002-10-22 Conagra Grocery Products Company PCR techniques for detecting microbial contaminants in foodstuffs
US6280946B2 (en) 1998-08-07 2001-08-28 Boston Probes, Inc. PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the universal detection of bacteria and eucarya
US7108980B1 (en) 1998-08-07 2006-09-19 Boston Probes, Inc. Methods for the analysis of microcolonies of bacteria and yeast
GB9827585D0 (en) * 1998-12-15 1999-02-10 Celsis Int Plc Assay method
GB9904804D0 (en) * 1999-03-02 1999-04-28 King S College London Identification of bacteria
US6197514B1 (en) * 1999-04-12 2001-03-06 Becton, Dickinson And Company Amplification and detection of Yersinia enterocolitica
EP1925678B1 (en) * 1999-05-03 2009-07-22 Gen-Probe Incorporated Polynucleotide matrix-based method of identifying microorganisms
JP2002542808A (ja) * 1999-05-03 2002-12-17 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド ポリヌクレオチドマトリックスに基づく微生物同定方法
EP2322667A3 (en) 1999-09-28 2011-10-26 Geneohm Sciences Canada, Inc. Highly conserved gene and its use to generate species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes for microorganisms.
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
DE10053821A1 (de) * 2000-10-30 2002-05-08 Univ Eberhard Karls Detektion von seltenen Candida-Spezies
US20040121309A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US7052837B2 (en) 2001-03-13 2006-05-30 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Histoplasma capsulatum catalase sequences and their use in the detection of Histoplamsa capsulatum and histoplasmosis
DE10121505A1 (de) * 2001-05-03 2003-01-30 Hain Lifescience Gmbh Verfahren zum Nachweis von Gram-positiven Bakterien
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
JP4395372B2 (ja) * 2001-11-02 2010-01-06 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 試験サンプル中のＭｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を決定するための組成物、方法およびキット
ES2193873B1 (es) * 2002-03-22 2004-08-16 Carlos Muñoz Ruiz Metodo para la deteccion de presencia bacteriana en un sujeto.
US7217519B1 (en) 2002-11-21 2007-05-15 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Histoplasma capsulatum chitin synthase sequences and their use for detection of Histoplasma capsulatum and histoplasmosis
JP2006516193A (ja) 2002-12-06 2006-06-29 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法
JP4304976B2 (ja) 2002-12-19 2009-07-29 東ソー株式会社 リボゾームｒｎａを標的とした抗酸菌の検出法
WO2004067702A2 (en) * 2003-01-30 2004-08-12 The University Of Warwick Methods, oligonucleotides and kits for the identification of mycobacterium in a sample
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
DE10338123B3 (de) * 2003-08-15 2005-07-28 Scanbec Gmbh Verfahren zum Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8394945B2 (en) 2003-09-11 2013-03-12 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
CA2567839C (en) 2004-05-24 2011-06-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
DE102004025710A1 (de) * 2004-05-26 2005-12-22 Eppendorf Ag Verfahren zur taxonspezifischen Zellidentifizierung und Zellsortierung auf grampositive Bakterien und Vorrichtungen hierfür
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
JP4769041B2 (ja) * 2004-07-28 2011-09-07 株式会社ビー・エム・エル 抗酸菌属細菌同定キット
KR100850193B1 (ko) * 2004-08-28 2008-08-04 주식회사 진인 모든 세균의 감별을 위한 세균 특이적, 속 특이적 및 종특이적 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 진단 키트, 및이를 이용한 검출 방법
CA2600184A1 (en) 2005-03-03 2006-09-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for use in identification of adventitious viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
CA2616281C (en) 2005-07-21 2014-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of mitochondrial dna variants
WO2007140279A2 (en) * 2006-05-24 2007-12-06 Gen-Probe Incorporated Probes and kits for determining the presence of mycobacterium tuberculosis complex organisms in a test sample and method of amplifying gram-positive bacteria and fungi employing capture probe
AU2007257340A1 (en) * 2006-06-09 2007-12-13 Celera Corporation Identification of a nucleic acid molecule
EP2064332B1 (en) 2006-09-14 2012-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
WO2008104002A2 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic dna analysis
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
CA2723917A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of salmonella
WO2010033625A1 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
US8550694B2 (en) 2008-09-16 2013-10-08 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
US8148163B2 (en) 2008-09-16 2012-04-03 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
TWI419974B (zh) 2008-10-27 2013-12-21 Qiagen Gaithersburg Inc 於自動平台上之快速結果雜交捕捉法
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
EP2425019B1 (en) 2009-05-01 2014-03-19 QIAGEN Gaithersburg, Inc. A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample
US8950604B2 (en) 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
EP2454000A4 (en) 2009-07-17 2016-08-10 Ibis Biosciences Inc SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES
JP5826752B2 (ja) 2009-09-14 2015-12-02 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 細胞学用培地に固定された組織サンプルから核酸またはタンパク質を回収するための組成物および方法
EP2488656B1 (en) 2009-10-15 2015-06-03 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
CN102822189B (zh) 2010-01-29 2016-06-29 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 用于核酸的序列特异性纯化和多重复合体分析(multiplex analysis)的方法和组合物
US9605303B2 (en) 2010-01-29 2017-03-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Method of determining and confirming the presence of an HPV in a sample
US20110262989A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Nanomr, Inc. Isolating a target analyte from a body fluid
US9476812B2 (en) 2010-04-21 2016-10-25 Dna Electronics, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
JP2013528049A (ja) 2010-05-19 2013-07-08 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物
US9376727B2 (en) 2010-05-25 2016-06-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes
CN103597095B (zh) 2011-02-24 2016-08-17 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 用于检测hpv核酸的材料和方法
JP5680989B2 (ja) * 2011-02-25 2015-03-04 ハウス食品グループ本社株式会社 非ヒト動物を検出するためのプライマー・プローブセット
US10000557B2 (en) 2012-12-19 2018-06-19 Dnae Group Holdings Limited Methods for raising antibodies
US9599610B2 (en) 2012-12-19 2017-03-21 Dnae Group Holdings Limited Target capture system
US9551704B2 (en) 2012-12-19 2017-01-24 Dna Electronics, Inc. Target detection
US9434940B2 (en) 2012-12-19 2016-09-06 Dna Electronics, Inc. Methods for universal target capture
US9995742B2 (en) 2012-12-19 2018-06-12 Dnae Group Holdings Limited Sample entry

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4717653A (en) * 1981-09-25 1988-01-05 Webster John A Jr Method for identifying and characterizing organisms
ATE202801T1 (de) * 1983-01-10 2001-07-15 Gen Probe Inc Verfahren zum nachweis, identifizieren und quantifizieren von organismen und viren
DE3785590T2 (de) * 1986-01-22 1993-09-16 Amoco Corp Campylobacter-sonde.
FR2596774B1 (fr) * 1986-04-04 1988-07-22 Pasteur Institut Sondes oligonucleotidiques et procedes pour la detection par hybridation des acides nucleiques de bacteries et autres etres vivants
DE3650043T2 (de) * 1986-06-25 1995-01-19 Univ California Nachweis von Mykoplasma durch Hybridisierung von DNS.
WO1988000618A1 (en) * 1986-07-10 1988-01-28 Toray Industries, Inc. Method of inspecting specimen for bacteria and probe therefor

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5219057B2 (ja) * 1998-07-31 2013-06-26 旭化成株式会社 微生物検出用抗体
JP2010515451A (ja) * 2007-01-08 2010-05-13 メディジーンズ カンパニー リミテッド 大腸菌検出用ｄｎａチップ

Also Published As

Publication number Publication date
JP3116353B2 (ja) 2000-12-11
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ATE163680T1 (de) 1998-03-15
AU1041988A (en) 1988-06-16
EP0272009B2 (en) 2007-10-03
PT86204A (en) 1987-12-01
AU616646B2 (en) 1991-11-07
JP3290920B2 (ja) 2002-06-10
FI883482A0 (fi) 1988-07-22
EP0272009A2 (en) 1988-06-22

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