DE60312571T2

DE60312571T2 - Vorrichtung zur Probenahme und -präparation für den Nachweis von Mycobakterien und deren Antigenen

Info

Publication number: DE60312571T2
Application number: DE60312571T
Authority: DE
Inventors: Salman H. Sparks Siddiqi
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2002-01-10
Filing date: 2003-01-10
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2023-01-11
Also published as: ATE357661T1; EP1329718A3; ES2280630T3; EP1329718B1; EP1780547A1; JP2003248002A; US20030129679A1; TW200302349A; DE60312571D1; EP1329718A2; DK1329718T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Herstellungsgegenstände zur Bearbeitung von biologischen Proben zur schnellen und einfachen Detektion von Mykobakterien und sezernierten mykobakteriellen Antigenen, insbesondere des Antigens MPB64 von Mycobacterium bovis oder des Antigens MPT64 von M. tuberculosis.
Hintergrund der Technik
Organismen der Gattung Mycobacterium sind bei Menschen für eine signifikante Mortalität und Morbidität verantwortlich. Die Gattung umfasst mehrere Arten, die Mycobacterium africanum, M. avium, M. bovis, M. bovis-BCG, M. chelonae, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. kansasii, M. microti, M. scrofulaceum, M. paratuberculosis und M. tuberculosis einschließen, ohne darauf beschränkt zu sein. Bestimmte dieser Organismen sind verursachende Mittel von Krankheiten. Von besonderer Wichtigkeit ist in jüngster Zeit ein Anstieg der Häufigkeit von Tuberkulose (TB), deren ätiologisches Mittel M. tuberculosis ist. Infektionen, die durch von Tuberkulose verschiedene Mykobakterien (MOTT, atypische Mykobakterien) verursacht werden, nehmen aber auch immer mehr zu. Viele dieser neuen Fälle stehen in Bezug zur AIDS-Epidemie, die Population mit geschwächtem Immunsystem zur Folge hat, die für eine Infektion durch Mykobakterien besonders empfindlich ist. Bei HIV-infizierten Patienten und anderen Patienten mit geschwächtem Immunsystem sind M. avium, M. kansasii und andere Nicht- Tuberkulose-Mykobakterien als opportunistische Pathogene festgestellt worden. Daher besteht ein steigender Bedarf an einer schnellen differenziellen Diagnose von TB-Infektionen, weil sie sich schnell ausbreiten und innerhalb eines kurzen Zeitraums tödlich sein können.
Traditionelle Verfahren zum Nachweis, zur Isolation und Identifikation von Mykobakterium-Arten umfassen säurebeständige Anfärbeverfahren, Kulturtechniken und biochemische Bestätigungsverfahren. Im ersten Fall wird das mögliche Vorhandensein von Mykobakterien durch eine mikroskopische Untersuchung einer Probe bestimmt, die mit einer zweckmäßigen säurebeständigen Anfärbung behandelt wurde. Das Vorhandensein von säurebeständigen Bakterien (AFB) deutet auf das Vorhandensein von Mykobakterien hin. Beispielsweise wird das Auffinden von säurebeständigen Bakterien in Sputa und anderen geeigneten klinischen Proben als Indizienbeweis für eine aktive Tuberkulose betrachtet, der ausreichend ist, um eine Therapie zu initiieren.
Nach einem anfänglichen visuellen Nachweis von Mykobakterien kann eine Probe weiterverarbeitet und kultiviert werden. Nachdem ein Wachstum erreicht ist, können weitere differenzielle Tests angewandt werden, um die vorhandene Mykobakterienart zu identifizieren. Das Center for Disease Control hat eine Reihe von 18 Tests empfohlen, die eine spezifische Identifizierung von fast 90% der Mykobakterienarten ermöglichen. G. P. Kubica in The Mycobacteria: A Sourcebook, Part A (Kubica & Wayne, Hrsg.), S. 133-175, Marcel Dekkar (New York: 1984).
Eine Diagnose mykobakterieller Infektionen durch eine Kultivierung des Organismus, gefolgt von einer Identifizierung mittels biochemischer Assays, ist zeitaufwändig, und eine typische Diagnose unter Verwendung herkömmlicher Kulturverfahren kann bis zu sechs bis acht Wochen dauern. Automatisierte Kultivierungssysteme wie das BACTEC^®- (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, Md.) System können die Zeit für eine Diagnose auf ein bis zwei Wochen verkürzen. Dennoch besteht nach wie vor ein Bedarf an einer Verkürzung der Zeit, die zur Diagnose von mykobakteriellen Infektionen erforderlich ist, auf weniger als eine Woche, vorzugsweise auf etwa einen Tag oder weniger. Assays auf der Grundlage von Oligonucleotid-Sonden wie Southern-Hybridisierungen oder Dot-Blots sind dazu fähig, ein schnelles Ergebnis (d.h. in einem Tag oder weniger) zu liefern. Gattungs- und art-spezifische Primer können in direkten Assays klinischer Proben mittels Nucleinsäureamplifizierung ebenfalls verwendet werden. Somit stellen moderne Techniken wie BACTEC^®, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die DNA-Hybridisierung mächtige Werkzeuge zur schnellen Diagnose von Tuberkulose dar, wobei die Kosten in denjenigen Ländern, in denen Tuberkulose immer noch ein lebensbedrohliches Problem ist, nicht leicht zu tragen sind.
Genetische Verwandtschaften verschiedener Mykobakterien sind untersucht worden, um mykobakterielle Krankheiten zu verhindern und zu untersuchen. Zum Beispiel ist Bacillus Calmette-Guerin (BCG) die Bezeichnung, die einer Familie von Tuberkulose-Vakzinen verliehen wurde, die 1921 durch die in-vitro-Attenuierung von Mycobacterium bovis erhalten wurden. Anschließend wurden BCG-Impfchargen global verteilt, und sowohl phänotypische als auch genotypische Unterschiede zwischen Stämmen sind beschrieben worden. Siehe M. A. Behr et al., A historical and molecular phylogeny of BCG strains, Vaccine 17:915-922 (1999). Diese Autoren rezensierten die englischen und französischen historischen Aufzeichnungen zu 13 Stämmen, und DNA wurde aus diesen Stämmen für eine Untersuchung des Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus extrahiert. Eine molekulare Typisierung auf der Grundlage der Unterschiedlichkeit der Insertionssequenz IS6110-Typisierung und in Gegenwart eines bestimmten Gens, dem mpt64-Gen, führte zu 3 Claden. Mit zwei Ausnahmen entsprechen diese Claden den Stämmen, die vom Pasteur-Institut 1924-26 (IS6110-2/mpt64+), 1926-31 (IS6110-1/mpt64+) und 1931 oder später (IS6110-1/mpt64-) erhalten wurden.
Immunologische Methoden zur Bestimmung von Mykobakterien, insbesondere M. tuberculosis, sind bekannt. Zum Beispiel offenbarten A. Drowart et al., Detection of mycobacterial antigens present in short-term culture media using particle counting immunoassay, Am Rev Respir Dis 147:1401-1406 (1993) einen Particle counting immunoassay (PACIA, Immunoassay zur Teilchenzählung), der mit dem BACTEC^®-System verglichen wurde, um ein Wachstum von Mykobakterien nach einer kurzzeitigen Kultur nachzuweisen, und dieser wurde zur Identifizierung von M. tuberculosis verwendet. Latexteilchen wurden mit polyklonalem Anti-BCG oder mit einem spezifischen 2A1-2-monoklonalen Antikörper, von dem behauptet wurde, dass er ein Kulturfiltratprotein von 37-38 kDa spezifisch erkennt, beschichtet. Flaschen, die das nichtradioaktive flüssige Medium Middlebrook 7H9 enthielten, und BACTEC^®-Ampullen wurden mit gleichen Mengen an Mykobakterien von vier Bezugsstämmen (M. tuberculosis, M. kansasii, M. avium und M. xenopi) inokuliert. Mittels Anti-BCG wies der PACIA mykobakterielle Antigene 3 bis 6 Tage vor dem BACTEC^®-System nach. M. tuberculosis wurde von den anderen Mykobakterien mittels 2A1-2 unterschieden. 17 klinische Proben wurden ebenfalls untersucht. Bei denselben 10 wiesen die beiden Techniken Mykobakterien nach, PACIA mit Anti-BCG nach 9 Tagen und BACTEC^® 1 bis 5 Tage später. Bei 9 der 10 Proben wies PACIA mit 2A1-2 M. tuberculosis nach 20 Tagen nach, ein Ergebnis, das mit dem AccuProbe^®- (GenProbe, San Diego, CA) System bestätigt wurde. Die Autoren schlossen, dass PACIA das Wachstum von Mykobakterien früher als BACTEC^® nachweist und dass in PACIA, die mit speziellen monoklonalen Antikörpern durchgeführt werden, M. tuberculosis von anderen Mykobakterien unterschieden werden kann.
Ein weiteres mykobakterielles Kulturfiltratprotein, das immunologisch charakterisiert worden ist, wird als MPB64 bzw. MPT64 in M. bovis bzw. M. tuberculosis bezeichnet. Somit offenbaren R. Yamaguchi et al., Cloning and characterization of the gene for immunogenic protein MPB64 of Mycobacterium bovis BCG, Infect. Immun. 57:283-288 (1989) ein Klonen und Sequenzieren eines Gens für das Protein MPB64, das in Kulturfiltraten nur von M.-tuberculosis- und in einigen Stämmen von M. bovis-BCG gefunden wird. Das Gen wurde in Escherichia coli exprimiert, und das Produkt wies bei der Elektrophorese eine Migration auf, die derjenigen des (echten) nativen Proteins MPB64 ähnlich war, und reagierte auch mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die gegen das echte Protein gezüchtet wurden.
Die immunologischen Eigenschaften des Proteins MPB64 sind unter Verwendung zusätzlicher rekombinanter Produktionssysteme weiter untersucht worden. Zum Beispiel offenbaren T. Oettinger et al., Cloning and B-cellepitope mapping of MPT64 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv., Infct. Immun. 62:2058-64 (1994) ein Klonen und Sequenzieren des Gens (mpt64) des immunogenen Proteins MPT64, das in nicht erwärmten Kulturfiltraten von M. tuberculosis H37Rv gefunden wird. Ein Vergleich zeigte, dass mpt64 und das Gen, das das Protein MPB64 mit 23 kD kodierte, das von M. bovis BCG Tokyo sezerniert wurde, mit Ausnahme einer stummen Mutation identisch waren. Southern-Blot-Experimente an genomischer mykobakterieller DNA zeigten das Vorhandensein von MPT64 in den M.-tuberculosis-Unterstämmen H37Rv, H37Ra und Erdmann und MPB64 in den M.-bovis-BCG-Unterstämmen Tokio, Moreau und Russisch, während den M.-bovis-BCG-Unterstämmen Glaxo, Pasteur, Kanadisch, Tice und Dänisch 1331 und Mycobacterium leprae das Gen fehlt. Zum Kartieren von B-Zell-Epitopen an MPT64 mit fünf monoklonalen Antikörpern, C24b1, C24b2, C24b3, L24b4 und L24b5, wurden Mutanten mit N-terminalen und C-terminalen Deletionen konstruiert. Eine Western-Blot- (Immunoblot-)Analyse ergab, dass die Maus-Antikörper an einem linearen und drei Konformationsepitopen binden.
T. Oettinger et al., Mapping of the delayed-type hypersensitivity-inducing epitope of secreted Protein MPT64 from Mycobacterium tuberculosis, Infect. Immun. 63:4613-8 (1995) offenbaren, dass das MPT64 von M. tuberculosis H37Rv codierende Gen in E. coli K-12 exprimiert und als rekombinantes Protein gereinigt wurde. Die gereinigte Rekombinante MPT64 verursachte eine Hypersensibilität vom Spättyp (DTH) in ausgezüchteten Meerschweinchen, die mit M. bovis BCG Tokio sensibilisiert worden waren. Keine Hautreaktionen wurden beobachtet, wenn entweder rekombinantes MPT64 oder natives MPT64 in Meerschweinchen, die mit M. bovis BCG Dänisch 1331 sensibilisiert worden waren, verwendet wurde. Untersuchungen mit überlappenden synthetischen Peptiden ermittelten genau die biologische Aktivität bei einem einzelnen DTH-induzierenden Epitop, das aus 15 Resten zwischen den Aminosäuren Gly-173 und Ala-187 bestand. Ein mittels PCR durchgeführtes Screening von 56 klinischen Isolaten von M. tuberculosis von Patienten aus Dänemark und Tansania demonstrierte das Vorhandensein von mpt64 in allen Stämmen. Die Autoren stellten fest, dass diese Ergebnisse auf MPT64 als möglichen Kandidaten für ein Hauttestreagens hindeuten, dass für die Diagnose von humaner Tuberkulose spezifisch ist.
H. Tasaka et al., Secretion of MPB64 antigen by a recombinant clone of Mycobacterium smegmatis: characterization and application for the diagnosis of tuberculosis, Scand. J. Immuol. 42:487-92 (1995) offenbaren, dass MPB64 von einem Klon von M. smegmatis-MPB64, in den das Strukturgen von MPB64 mittels eines neuen Vektors insertiert wurde, hergestellt und sezerniert wurde. Antikörper gegen die Rekombinante MPB64 (rMPB64) wurden für einen reversen Partikellatexagglutinations- (RPLA-)Test zur schnellen Bestimmung des Antigen MPB64 verwendet. PPLA-Tests wurden auf Lagerkulturen und klinische Isolate von Mykobakterien angewandt, um den TB-Komplex zu identifizieren. Insbesondere wurden Mykobakterien aus Sputa auf Ogawa-Eiermedien isoliert, eine Woche lang auf Middlebrook-7H9-Medium subkultiviert und dann für den RPLA-Test verwendet. Die RPLA mit Anti-MPB64-Antikörper-beschichteten Latexkügelchen unterschied den TB-Komplex vollständig von anderen Mykobakterien. Bei Verwendung von mit polyklonalem Kaninchen-anti-rMPB64-Antikörper beschichteten Latexkügelchen wurden mittels RPLA 1 ng/ml MPB64, nur 10³ M. tuberculosis in 25 μl Kulturmedium, nachgewiesen. Die Autoren schlagen vor, dass RPLA mit einem Anti-MPB64-Antikörper ein neues, leichtes und preiswertes Verfahren für eine schnelle Diagnose von Tuberkulose wäre.
P. W. Roche et al., Expression of Mycobacterium tuberculosis MPT64 in recombinant Myco. smegmatis: purification, immunogenicity and application to skin tests for tuberculosis, Clin. Exp. Immunol. 103:226-32 (1996a), offenbaren die Entwicklung eines rekombinanten mykobakteriellen Vektors, der das kodierte M.-tuberculosis-Protein MPT64 in hohen Konzentrationen im Kulturfiltrat sezerniert, aus dem das Protein mittels eines einstufigen Affinitätschromatographie-Verfahrens isoliert wurde. Das gereinigte Protein wurde sowohl von polyklonalen als auch von monoklonalen Anti-MPT64-Antikörpern erkannt. Die T-Zellen-Reaktivität des Proteins wurde durch seine Fähigkeit zur Stimulation humaner Anti-rMPB64-T-Zellenlinien bestätigt. Das rekombinante M-smegmatis-MPT64-Protein war dem E.-coli-MPB64-Protein, das eine identische Aminosäuresequenz hat, dahingehend überlegen, als es kutane DTH-Reaktionen in Meerschweinchen verursachte, die mit M. tuberculosis sensibilisiert waren. Das Potential dieser Form des M.-tubercu/osis-MPT64-Proteins als Hauttestreagens für Tuberkulose wird diskutiert.
P. W. Roche et al., Human T-cell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis secreted protein MPT64, Scand. J. Immunol. 43:662-70 (1996b), offenbaren eine Kartierung der immunogenen Regionen des MPT64-Proteins von M. tuberculosis unter Verwendung von peripheren einkernigen Blutzellen (PBMC) von TB-Patienten und einen Satz von überlappenden Peptiden, die die komplette Sequenz des Proteins einschließen. Bei einer Minderheit von TB-Patienten (6/32) stieg eine Antikörper-Reaktion auf MPT64 an. In den Seren der Hälfte (3/6) davon wurden zwei lineare Antikörper-Bindungsstellen identifiziert.
Das das Antigen MPB64 codierende Gen ist auch zum Nachweis von Mykobakterien in klinischen Proben mittels Nucleinsäureanalyse verwendet worden. Zum Beispiel offenbaren L. Dar et al., Diagnosis of pulmonary tuberculosis by polymerase chain reaction for MPB64 gene: an evaluation in a blind study, Indian. J. Chest. Dis. Allied Sci. 40:5-16 (1998), eine Auswertung von PCR für das mpb64-Gen, wobei 182 klinische Proben (Sputum, Bronchus-Alveolen-Spülung und Pleuraflüssigkeit) von Patienten mit einer klinischen Diagnose einer Lungentuberkulose und 72 Proben von Patienten mit nicht-tuberkulösen Lungenläsionen und Personen mit normaler Gesundheit eingeschlossen waren. Die PCR war in 59% der einzelnen Sputum-Proben von klinisch diagnostizier ter Lungentuberkulose positiv, während M. tuberculosis in 18% der Proben gezüchtet werden konnte. Mittels PCR konnte M. tuberculosis in 81,8% der positiven Kultur-Sputum-Proben identifiziert werden. PCR war auch in 71,4% der Bronchus-Alveolen-Spül- (BAL-)Flüssigkeit und 60,7% der Pleuraflüssigkeitsproben von vermutlich klinischen Fällen positiv, die hauptsächlich kulturnegativ waren. Die Autoren stellten fest, dass "PCR für das MPB64-Gen eine nützliche Alternative für die Diagnose von Lungentuberkulose aus Sputum- und paucibazillären Proben wie BAL- und Pleuraflüssigkeit ist, bei denen herkömmliche Methoden eine niedrige Empfindlichkeit insbesondere in Bereichen zeigen, bei denen Stämme eine niedrige Kopiezahl von anderen PCR-Zielen wie der IS6110-Insertionssequenz zeigen" (Zusammenfassung).
Das japanische Patent JP-A-11108931, Nanba et al., offenbart ein Verfahren zur Identifizierung von M. tuberculosis in einem Kulturmedium unter Verwendung eines MPB64-Antikörpers. Kürzlich haben C. Abe et al., "Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using anti-MPB64 monoclonal antibodies", J. Clin Microbiol. 37:3693-3697 (1999), offenbart, dass ein immunochromatographischer Assay (MPB64-ICA) zur Identifizierung des M.-tuberculosis-Komplexes mit 20 Bezugsstämmen von mykobakteriellen Spezies und 111 klinischen Isolaten ausgewertet wurde. MPB64-ICA wies eine sehr starke Reaktionsbande mit Organismen auf, die zum M.-tuberculosis-Komplex gehörten, aber nicht mit von M. tuberculosis verschiedenen Mykobakterien (MOTT-Bakterien) mit Ausnahme eines von vier getesteten M.-marinum-Stämmen und einem M. flavescens-Stamm, die beide sehr schwache Signale ergaben. Die Effektivität von MPB64-ICA wurde in Kombination mit zwei flüssigen Kultursystemen (MB-REDOX, Biotest AG, Dreieich, Deutschland, und dem Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT^®) System, BBL Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) getestet. Insgesamt 108 von 362 verarbeiteten Sputumproben waren auf säurebeständige Bakterien positiv. Proben, die von den Kulturen an denselben Tagen genommen wurden, an denen eines der beiden Kultursysteme für Mykobakterien positiv wurde, wurden mittels MPB64-ICA untersucht. Von 108 Kulturen mit Mykobakterien wiesen bei diesem Test 51 ein positives Signal auf, wobei das Vorhandensein des M.-tuberculosis-Komplexes später mittels des AccuProbe^®-Nucleinsäureassays für den M.-tuberculosis-Komplex gezeigt wurde. Darüber hinaus wies der MPB64-ICA den M.-tuberculosis-Komplex in Mischkulturen des M.-tuberculosis-Komplexes und von MOTT-Bakterien richtig nach. Gemäß den Autoren deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der MPB64-ICA leicht zur schnellen Identifizierung des M.-tuberculosis-Komplexes in Kombination mit Kultursystemen auf der Grundlage von flüssigen Medien ohne technische Komplexität in klinischen Laboratorien verwendet werden kann. Die Autoren wiesen jedoch darauf hin, dass, "wenn frisches M.-bovis-BCG, das in einem flüssigen Medium gezüchtet worden war, zur Auswertung verwendet wurde, die analytische Empfindlichkeit des MPB64-ICA als 10⁵ CFU/ml berechnet wurde (Tabelle 3), ein Wert, der demjenigen für den AccuProbe-Test ähnlich ist [Zitate weggelassen]. Daher sollte dieser Test nicht direkt an frischen klinischen Proben verwendet werden" (S. 3996, Spalte 1).
U5-A-6,245,331, Laal et al., offenbart, dass eine Anzahl von Protein- und Glycoprotein-Antigenen, die vom Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sezerniert werden, auf der Grundlage von frühen Antikörpern, die in mit Mt infizierten Patienten vor der Entwicklung einer klinisch nachweisbaren Krankheit vorhanden sind, als "frühe" Mt-Antigene identifiziert worden sind. Diese frühen Mt-Antigene, insbesondere ein sezerniertes Protein mit 88 kDa mit einem pI-Wert von etwa 5,2, das in einem Mt-Lipoarabinomannanfreien Kulturfiltrat vorhanden ist, ein als Mt-Antigen 85C charakterisiertes Protein, ein als Mt-Antigen MPT51 charakterisiertes Protein, ein als Mt-Antigen MPT32 charakterisiertes Glycoprotein und ein Protein mit 49 kDa mit einem pI-Wert von etwa 5,1 sind in Immunoassay-Verfahren für einen frühen, schnellen Nachweis von TB bei einem Patienten brauchbar.
Eine Verarbeitung von biologischen Material (z.B. Sputum) zum Nachweis von Mykobakterien betrifft im Allgemeinen zuerst eine Verflüssigung und Entfernung von zellulären oder anderen Trümmern und eine Verminderung von kontaminierenden Mikroorganismen statt einer Reinigung von Mykobakte rien per se. Somit sind Verfahren zur Verarbeitung von biologischen und anorganischen Proben, von denen vermutet wird, dass sie ein oder mehrere Mykobakterien enthalten, zum Nachweis solcher Mykobakterien durch das Vorhandensein anderer, unerwünschter Mikroorganismen, die natürlicherweise in solchen Proben vorhanden sind, einschränkt. Wenn Versuche zum Kultivieren der langsam wachsenden Mykobakterien aus den verarbeiteten Proben unternommen werden, könnte jedoch oft ein durchbrechendes Wachstum anderer, schneller wachsender Organismen, die in der verarbeiteten Probe vorhanden sind, die Kultur übernehmen, wodurch ein mögliches falsches Positivsignal verursacht wird. Ein solches Durchbruchswachstum ist ein Problem, weil es den Nachweis langsam wachsender Bakterien und insbesondere von Mykobakterien in der Probe behindern oder verhindern kann. Dieses Problem ist insbesondere für die Kultur von langsam wachsenden, pathogenen Mykobakterien-Spezies problematisch, weil an einem Patienten eine Falschdiagnose gestellt werden kann, wenn der vermutete Mikroorganismus aus den Proben des Patienten nicht kultiviert werden kann. Somit besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Förderung der selektiven Isolierung eines gewünschten Mikroorganismus, insbesondere von pathogenen Mykobakterien, aus einer Probe, die viele andere schneller wachsende Mikroorganismen enthalten kann.
Insbesondere werden Sputumproben zur Herstellung einer M.-tuberculosis-Kultur heute immer noch oft mit Verfahren bearbeitet, die seit über 40 Jahren verwendet werden (G. Kubica et al., Am. Rev. Resp. Dis. 87:775-779 (1963)). Diese und andere Probenverarbeitungsverfahren für eine M.-tuberculosis-Kultur sind für folgende Zwecke entwickelt worden: 1) eine Reduzierung der Viskosität der Sputumprobe zur Erleichterung der Handhabung, 2) der Abtötung von kontaminierenden Organismen (wie Pilzen und Nicht-Mykobakterien), um eine gemeinsame Kultivierung mit M. tuberculosis und eine Verwechslung bei der Diagnose zu verhindern, und 3) der Konzentration der Probe zu einem kleinen Volumen zum Impfen von Kulturen. Um diese Ziele zu erreichen, wurden bei herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Proben von Mycobacteria sp. herkömmlicherweise harte Bedingungen und kaustische, toxische oder reaktive Reagenzien verwendet. Herkömmliche Verfahren zur Verarbeitung von Proben für eine Mykobakterien-Kultur sind beispielsweise von G. Kubica in The Mycobacteria: A Source Book. Part A (G. Kubica und L. Wayne, Hrsg.) Marcel Dekker, N.Y. (1984), S. 315-344, rezensiert.
US-A-5,364,763, Kacian, offenbart Verfahren und Zusammensetzungen für eine verbesserte Verflüssigung von mukoiden Sekretionen durch eine Behandlung mit einem Disulfidbindungen reduzierenden Mittel und einem DNA-Aufschlussmittel und zur verbesserten Konzentration ausgewählter Bakterienspezies aus solchen Proben. Darüber hinaus gibt Kacian wie folgt eine historische Übersicht über die Entwicklung verschiedener Verarbeitungsverfahren für zu testende klinische Proben für verschiedene mikrobiologische Organismen, insbesondere Mykobakterien. Nach Kacian erkannten Forscher in den 50-er bis zu den frühen 60-er Jahren des 20. Jahrhunderts, dass Unterschiede zwischen den Zusammensetzungen verschiedener mukoider Sekretionen einschließlich Sputa in Abhängigkeit von der Quelle und der Beschaffenheit eines gegebenen Krankheitsprozesses vorlagen. Insbesondere wurde das Vorhandensein von Sputa, die als mukoid klassifiziert wurden und denen inflammatorische Zellen, die im Zusammenhang mit infektiösen Prozessen üblicherweise gefunden werden, fehlten, sowie Sputa, die solche Zellen enthielten (als purulent klassifiziert), erkannt. Es wurde vorgeschlagen, dass beide Proteinkomponenten und DNA wahrscheinlich zur Viskosität des Sputums beitragen, und Beweise dafür wurden gesammelt. Insbesondere wurde gezeigt, dass DNAsen und Protessen die Fähigkeit haben, Sputa und Eiter in gewissem Ausmaß zu verflüssigen. DNAsen schienen eine höhere Aktivität zu haben, wenn sie bei purulenten Sputa verwendet wurden, während Proteasen bei mukoiden Sputa wirksamer waren.
Weiterhin ist nach Kacian zusätzlich zu Enzymen eine Vielzahl von anderen Mitteln wie Detergenzien, Salzen, Oxidations- und Reduktionsmitteln als verflüssigende Mittel versucht worden, und eine Reihe funktionierte mehr oder weniger erfolgreich. In den frühen 60-er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde berichtet, dass die Verwendung des Sulfhydryl-Reagens N-Acetyl-L-cystein ("NALC") zur Verflüssigung von mukoiden Sekretionen mit sowohl purulenter als auch mukoider Beschaffenheit wirksam ist. J. Webb, Thoracic & Cardiovascular Surg., 44:330-343 (1962). Es wurde behauptet, dass das Reagens zur Verflüssigung sowohl von mukosen (wobei angenommen wurde, dass die Proteinkomponente für die meiste Viskosität in mukosen Proben verantwortlich ist) als auch DNA, von der postuliert wurde, dass sie signifikant zur Viskosität in purulenten Spezies beiträgt, fähig ist. Dieses Reagens und die verwandte Verbindung, Dithiothreit (offenbart in US-A-3,502,779 ("das 779-Patent"), Dye et al., 1974) ergaben eine überlegene Verflüssigung vieler mukoider Spezies für eine Vielzahl von Zwecken, wie durch einen Vergleich mit vorherigen Verfahren abgeschätzt wurde.
Insbesondere führen Dye et al. die Verwendung von Dithiothreit und verwandten Verbindungen zur Verflüssigung von Mucus in klinischen Proben unter Verwendung von Dithiothreit in einer 0,5-%igen Lösung mit 2% Natriumhydroxid und 0,1 M Natriumcitrat beispielhaft auf, wobei als Kontrolle dieselbe Lösung verwendet wird, die 0,5% N-Acetyl-L-cystein enthält (Spalte 2, Zeilen 31-65). Bei einigen der Tests wurde die Konzentration an Dithiothreit auf 0,15% vermindert, und es wurde beobachtet, dass die Verflüssigung von Sputum so gut wie bei derjenigen mit N-Acetyl-L-cystein bei 0,5% war. Es gab mit dem erfindungsgemäßen Dithiothreit-Reagens mehr positive Ausstriche, und im Allgemeinen waren die Anzahl und die Größe der Kolonien größer. Das isolierte Mykobakterium schloss medikamentenempfindliche und vielfach medikamentenresistente Tuberkelbakterien, M. kansasii und Bakterien vom Battey-Typ ein. Dye et al. weisen auch darauf hin, dass Dithiothreit gegenüber einer ziemlich schnellen Oxidation in verdünnter wässriger Lösung empfindlich ist, so dass die Lösung, wenn sie verwendet wird, frisch oder etwa zum Zeitpunkt der Verwendung hergestellt werden oder in entgastem Wasser hergestellt und umgehend in Ampullen und dergleichen unter den üblichen Vorsichtsmaßnahmen, die ergriffen werden, um einen Zutritt von Sauerstoff zu verhindern, versiegelt werden sollte.
US-A-5,554,503, Down et al., offenbart Verfahren zur Verarbeitung von Proben, die Mykobakterien enthalten können, die sowohl mit herkömmlichen Kulturtechniken als auch mit einer Nucleinsäureanalyse verträglich sein können. Gemäß dem Verfahren von Down et al. wird eine Probe, gewöhnlich eine klinische Probe wie Sputum, zuerst mittels herkömmlicher Verfahren zur Verflüssigung und Dekontaminierung (d.h. einer Abtötung von Nicht-Mykobakterien) wie dem oben beschriebenen NALC-Verfahren verarbeitet. Bei herkömmlichen Kulturverfahren wird das NALC-Pellet in 1,5-2 ml eines zweckmäßigen Puffers oder Wasser resuspendiert, um feste oder flüssige Wachstumsmedien zu beimpfen. Zur Herstellung der Probe für eine Nucleinsäureanalyse wird das Pellet gewaschen, um hemmende, kaustische und toxische Reagenzien, die die anschließende Nucleinsäureanalyse stören können, zu entfernen, und dann in der Wärme behandelt, um Nucleinsäuren freizusetzen.
Zusätzlich zu Schwierigkeiten in Bezug auf eine Verflüssigung von Sputum und anderen mukoiden oder viskosen Proben ist eine Isolierung oder Konzentration von bakteriellen Spezies aus solchen Proben in bestimmten Fällen problematisch gewesen. Insbesondere ist eine Abtrennung von Bakterien der Art Mycobacterium in zufriedenstellenden Mengen von Sputumproben schwierig, weil ihre Dichte derjenigen von Wasser nahe ist, wodurch ein Zentrifugieren ineffizient wird. Das oben erwähnte US-A-5,364,763, Kacian, offenbart auch verbesserte Verfahren zum Konzentrieren von ausgewählten bakteriellen Spezies aus mukosen Sekretionsproben oder anderen biologischen Proben für die Zwecke der Untersuchung des Vorhandenseins solcher Spezies. Insbesondere werden weiße, mit Bakterien assoziierte Blutzellen konzentriert, vorzugsweise mittels Zentrifugation, und dann selektiv so lysiert, dass die Bakterien im Wesentlichen zellulär intakt bleiben. Die konzentrierten Bakterien, zum Beispiel Mykobakterien, können dann unter Verwendung offenbarter Verfahren und Zusammensetzungen in der konzentrierten Probe untersucht werden. Kürzlich offenbarte US-A-6,126,839, Kreader et al., Verfahren zum Konzentrieren von Bakterien aus einer viskosen biologischen Probe. Die Verfahren umfassen die Zugabe eines wasserlöslichen, dichtevermindernden Mittels mit einer Dichte von 0,7 bis 0,9 g/ml und einem Siedepunkt von mehr als 50°C zur Probe.
Es ist bekannt, dass zur Kontrolle der Kontamination von klinischen Proben mit nicht-mykobakteriellen Organismen die Kulturbrühe mit einem antibakteriellen und antifungiziden/antibiotischen Cocktail wie demjenigen, der von Becton Dickinson hergestellt und unter der Handelsbezeichnung "PANTA" verkauft wird, versehen werden kann. Dieses Produkt vermindert eine mögliche Kontaminierung durch Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa oder Candida tropicalis. Zum Beispiel offenbaren S. Whittier et al., Improved recovery of mycobacteria from respiratory secretions of patients with cystic fibrosis, J. Clin. Microbiol. 31:861-864 (1993), dass eine Dekontamination von respiratorischen Proben (n = 121) mit 0,25% N-Acetyl-L-cystein und 1% Natriumhydroxid (NALC-NaOH) mit einer hohen Rate an Pseudomonas-Überwucherung sowohl für Lowenstein-Jensen-Schrägagarröhrchen (74%) als auch für BACTEC^®-12B-Ampullen, die mit PANTA (Polymyxin B [50 E./ml], Amphotericin B [5 μg/ml], Nalidixinsäure [20 μg/ml], Trimethoprim [5 μg/ml], Azlocillin [10 μg/ml]) (36%) ergänzt waren, assoziiert war. Diese Überwucherung beschränkte die Isolierung von Mykobakterien auf nur 64% (9 von 14) Proben, die mittels eines Ausstrichs für säurebeständige Bakterien (AFB) positiv waren. Eine Dekontaminierung von Proben (n = 441) mit NALC-NaOH, gefolgt von einer Behandlung mit 5% Oxalsäure, führte zur Verunreinigung von nur 5% Lowenstein-Jensen-Schrägagarröhrchen und 3% der BACTEC^®-Ampullen. Unter Befolgung der Verwendung dieser Dekontaminationstechnik wurden AFB aus allen 90 positiven AFB-Ausstrichproben isoliert.
U5-A-5,985,593, Thornton et al., offenbart Verfahren zur enzymatischen Dekontaminierung von Proben, von denen gesagt wird, dass sie besonders brauchbar sind, um nicht gramnegative Verunreinigungen von Proben zu eliminieren, die für die mikrobiologische Analyse verwendet werden. Das Patent offenbart, dass eine lytische Enzymbehandlung bei Bedarf vor einer anschließenden Handhabung des Probestücks oder der Probe bereitgestellt werden kann, beispielsweise in demjenigen Bereich oder an demjenigen Ort, an dem das Probestück oder die Probe zuerst genommen wird, und das Probestück oder die Probe dann gefroren oder anders gegenüber einer Zersetzung stabilisiert werden können, bis eine Weiterverarbeitung erwünscht ist oder durchgeführt werden kann. Im Patent wird auch aufgeführt, dass der Behälter, in dem die Probe positioniert wird, alternativ mit einer erwünschten lytischen Enzymzusammensetzung beschichtet sein oder diese ansonsten enthalten kann. Es wird gesagt, dass der Transport von Proben, insbesondere festen Proben, in einer Lösung, die die lytischen Enzymzusammensetzungen der Erfindung enthält, zum Schutz gegen eine weitere Verunreinigung der Probe oder gegenüber einem Wachstum von endogenen Verunreinigungen, die bereits in der Probe vorhanden sind, besonders brauchbar ist. Zum Beispiel lehrt dieses Patent, dass die lytischen Enzyme mit der NALC-Lösung, die beim NALC-Verflüssigungsschritt zur Verarbeitung eines klinischen Probestücks verwendet wird, vorgemischt werden können.
EP-A-0273333 offenbart einen Immunoassay zum direkten Nachweis von Mykobakterien in Sputum, umfassend die Schritte (a) einer Vorbehandlung des Sputums beispielsweise mit NALC, (b) einer 2- bis 4-minütigen "Tensid"-Behandlung in der Wärme und (c) einem Nachweis mit Antikörpern gegen Mykobakterien.
WO-A-97/34149 offenbart ein Verfahren zur Diagnose einer mykobakteriellen Krankheit durch den Nachweis des Vorhandenseins eines mykobakteriellen Antigens (LAM oder AM) in einer biologischen Probe durch die Verwendung von gegen die Antigene gerichteten Antikörpern und durch den Nachweis der gebildeten Ag/Ab-Komplexe ohne eine Replikation der Zellen.
WO-A-00/73345 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von mykobakteriellen Antigenen durch die Verwendung von für die Antigene spezifischen Antikörpern ohne eine Replikation der Mykobakterienzellen vor dem Nachweis.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Herstellungsgegenstand, umfassend einen Behälter, ein Verflüssigungsmittel und Verpackungsmaterial, das den Behälter und das Verflüssigungsmittel enthält, wobei der Behälter
einen ersten festen Träger und einen zweiten festen Träger umfasst, wobei
der erste feste Träger Mykobakterienzellen zurückhält und das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 nicht zurückhält,
am zweiten festen Träger ein Capture-Antikörper gebunden ist, der am Antigen MPB64 oder am Antigen MPT64 spezifisch bindet, und
der erste feste Träger und der zweite feste Träger innerhalb des Behälters so angeordnet sind, dass eine biologische Probe, die in den Behälter eingeführt wird, den ersten festen Träger und den zweiten festen Träger berührt.
Bevorzugte Ausführungsformen gehen aus den Unteransprüchen hervor.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung stellt ein einfaches und schnelles Verfahren zum Nachweis von Mykobakterien und sezernierten Mykobakterien-Antigenen, insbesondere ein Antigen MPB64 von M. bovis oder ein Antigen MPT64 von M. tuberculosis, in biologischen Proben bereit.
Die Vorrichtung dieser Erfindung macht ein Verfahren zum Nachweis der Infektikon eines Säugers durch eine mykobakterielle Spezies, die ein sezerniertes mykobakterielles Antigen, insbesondere ein Antigen MPB64 oder ein Antigen MPT64, erzeugt, durch das Testen einer biologischen Probe vom Säuger auf das Vorhandensein eines dieser Antigene ohne eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Probe insbesondere ohne eine zeitaufwändige Replikation durch herkömmliche mykobakterielle Kulturverfahren verfügbar.
Die Herstellungsgegenstände, wie ein Kit, der einen Behälter zur Probenahme und Verarbeitung und dazugehörige Reagenzien umfasst, erleichtert den Nachweis einer Infektion eines Säugers durch eine mykobakterielle Spezies, die das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 erzeugt, indem eine biologische Probe des Säugers auf diese Antigene ohne eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Probe getestet wird.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung macht eine unabhängige Vorrichtung zur Probenahme, zum Transport, zur Verarbeitung und zum Testen, wie einen Behälter, der alle Reagenzien enthält, die zur Verflüssigung und Dekontaminierung einer biologischen Probe wie einer Sputum-Probe sowie zum leichten Nachweis des Antigens MPB64 oder des Antigens MPT64 in einer Probe wie durch einen Farbindikator erforderlich sind, einfach durch die Einführung der biologischen Probe in den Behälter und das Einwirkenlassen einiger einfacher Manipulationen auf den Behälter verfügbar.
Diese und andere Aufgaben werden von der vorliegenden Erfindung gelöst, die teilweise auf dem Befund basiert, dass ein sezerniertes mykobakterielles Antigen, insbesondere ein Antigen MPB64 oder ein Antigen MPT64, in biologischen Proben von Säugetieren, die mit einer mykobakteriellen Spezies infiziert sind, die ein solches Antigen sezerniert, insbesondere klinischen Proben wie Sputum von Menschen, die mit M. tuberculosis infiziert sind, ohne eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Probe vor einem Nachweis von Antigenen nachgewiesen werden kann. Die Herstellungsgegenstände ergeben eine verbesserte Isolierung und Nachweisempfindlichkeit für Mykobakterien und sezernierte mykobakterielle Antigene, insbesondere das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64, in einer biologischen Probe.
Die Herstellungsgegenstände der vorliegenden Erfindung machen ein Verfahren zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens in einer biologischen, aus einem Säuger erhaltenen Probe ohne eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Probe verfügbar. Dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen eines Antikörpers, der am sezernierte mykobakterielle Antigen innerhalb der Probe oder einen Teil davon unter solchen Bedingungen bindet, dass der Antikörper am sezernierte mykobakterielle Antigen in der Probe spezifisch bindet, wodurch ein spezifischer Komplex des Antikörpers mit dem sezernierten mykobakteriellen Antigen gebildet wird. Dieses Verfahren umfasst weiterhin den Nachweis des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge des spezifischen Komplexes des Antikörpers mit dem sezernierten mycobakteriellen Antigen in der Probe. Bei diesem Verfahren deutet das Vorhandensein dieses speziellen Komplexes auf das Vorhandensein des sezernierten mykobakteriellen Antigens in der Probe hin.
Im Gegensatz zu bisherigen Verfahren zum Nachweis davon, ob eine biologische Probe ein sezerniertes mykobakterielles Antigen enthält, das eine Kultivierung von Mykobakterienzellen in der Probe eine Woche lang oder länger vor dem Testen auf das Antigen erfordert, ermöglichen die Herstellungsgegenstände der vorliegenden Erfindung zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens in einer biologischen Probe sogar, wenn Mykobakterienzellen in der Probe nicht wesentlich replizieren, nachdem die biologische Probe aus dem Säuger erhalten ist. Mit anderen Worten ist, obwohl eine gewisse unwesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in einer Probe nach der Probenahme, vor dem Testen auf ein Antigen, während des Transports oder während der Aufbewahrung der Probe gelegentlich auftreten kann, beispielsweise eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Testprobe, wie durch ein absichtliches Kultivieren der Zellen in Mykobakterien-Kulturmedien, nicht erforderlich, um ein sezerniertes mykobakterielles Antigen in einer biologischen Probe gemäß der vorliegenden Erfindung nachzuweisen.
Die Herstellungsgegenstände sind besonders brauchbar zum Nachweis des Antigens MPB64 oder des Antigens MPT64 in biologischen Proben von einem Säuger, von dem vermutet wird, dass er Tuberkulose hat, insbesondere in Sputum-Proben von solchen Säugern. Das Verfahren kann jedoch auch auf andere Probestücke mukoider Sekretionen oder andere Körperflüssigkeiten oder -materialien angewandt werden.
In einer Ausführungsform wird vor dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper, der am Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 spezifisch bindet, ein mukolytisches oder Verflüssigungsmittel, vorzugsweise ein Verflüssigungsmittel, das ein Disulfidbindungen reduzierendes Mittel umfasst, zur Probe gegeben. Ein bevorzugtes Disulfidbindungen reduzierendes Mittel ist N-Acetyl-L-cystein und ausreichend N-Acetyl-L-cystein (NALC), und vorteilhaft wird dieses Mittel zur Probe gegeben, um eine Konzentration in der Probe zu erreichen, die wesentlich größer als 0,25% (w/v) ist, eine Konzentration, die bei herkömmlichen sputumverarbeitenden Verfahren eingesetzt wird (siehe z.B. G. Kubica in The Mycobacteria: A Source Book. Part A. (G. Kubica und L. Wayne, Hrsg.) Marcel Dekker, N.Y. (1984), S. 315-344). Vorzugsweise wird N-Acetyl-L-Cystein zur Probe gegeben, um eine Konzentration in der Probe von etwa 2,5% (w/v) zu erreichen.
Beim Verfahren zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens wird vorteilhaft der Antikörper, der am sezernierten mykobakteriellen Antigen spezifisch bindet, an einer festen Matrix gebunden. Vorzugsweise umfasst der Nachweis des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge des spezifischen Komplexes dieses Antikörpers mit dem sezernierten mykobakteriellen Antigen die Verwendung eines Reagens, das eine Farbe erzeugt, die auf das Vorhandensein eines speziellen Komplexes auf der festen Matrix hindeutet. In einer Ausführungsform, bei der ein Antikörper auf einer festen Matrix vor dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Antikörper verwendet wird, wird die Probe behandelt, um Mykobakterienzellen vom Rest der Probe abzutrennen, wodurch eine Mykobakterienzellenfraktion und eine Fraktion mit dem Rest der Probe erhalten werden. Die Mykobakterienzellenfraktion wird dann entweder visuell oder mittels herkömmlicher Kultivierungsverfahren auf das Vorhandensein von Mykobakterienzellen getestet. Der Antikörper, der am sezernierten mykobakteriellen Antigen spezifisch bindet, wird dann mit den Restfraktionen mit dem Rest der Probe in Kontakt gebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform, bei dem ein an eine feste Matrix gebundener Antikörper und eine Fraktionierung der Probe eingesetzt werden, wird die Mykobakterienzellenfraktion hergestellt, indem die Probe durch einen Filter geleitet wird, der Mykobakterienzellen zurückhält und das sezernierte Antigen, z.B. das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64, nicht zurückhält, wodurch das resultierende Retentat auf dem Filter zur Mykobakterienzellenfraktion und das resultierende Filtrat zur Fraktion mit dem Rest wird. Die feste Matrix, die den Antikörper trägt, kann dann auch einen Filter, beispielsweise einen Membranfilter, in einem Filterstapel umfassen, der den Mykobakterienzellen zurückhaltenden Filter und diesen Membranfilter umfasst, die in Reihe fluid verbunden sind. Der Filterstapel kann sich so in einem Behälter befinden, dass eine Probe, die in den Behälter eingeführt wird, zuerst durch den Mykobakterienzellen zurückhaltenden Filter und dann durch den den Antikörper tragenden Membranfilter fließt.
Ein anderer Aspekt der Herstellungsgegenstände der Erfindung macht ein Verfahren zum Nachweis einer Infektion eines Säugers durch eine mykobakterielle Spezies, die ein sezerniertes mykobakterielles Antigen erzeugt, durch das Testen einer aus diesem Säuger erhaltenen biologischen Probe auf das sezernierte mykobakterielle Antigen ohne eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Probe verfügbar. Dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen eines Antikörpers, der sich am sezernierten mykobakteriellen Antigen der Probe oder einer Fraktion davon unter solchen Bedingungen, unter denen der Antikörper am sezernierten mykobakteriellen Antigen in der Probe oder einer Fraktion davon spezifisch bindet, spezifisch bindet, wodurch ein spezifischer Komplex des Antikörpers mit dem sezernierten mykobakteriellen Antigen gebildet wird. Dieses Verfahren umfasst weiterhin den Nachweis des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge des spezifischen Komplexes des Antikörpers mit dem sezernierten mykobakteriellen Antigen in der Probe oder einer Fraktion davon, wo das Vorhandensein des spezifischen Komplexes auf eine Infektion des Säugers durch die Mykobakterien-Spezies hindeutet. Bei diesem Verfahren replizieren Mykobakterienzellen in der Probe nicht wesentlich, nachdem die Probe aus dem Säuger erhalten ist, bis der Schritt des Nachweises des Antigen-Antikörper-Komplexes abgeschlossen ist.
In bevorzugten Ausführungsformen dieses Verfahrens ist das sezernierte mykobakterielle Antigen ein Antigen MPB64 oder ein Antigen MPT64.
In einem anderen Aspekt machen die Herstellungsgegenstände der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verarbeitung einer aus einem Säuger erhaltenen biologischen Probe verfügbar, um ein sezerniertes mykobakterielles Antigen wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 in der Probe nachzuweisen. Dieses Verfahren umfasst die Zugabe eines Verflüssigungsmittels und gegebenenfalls eines Dekontaminierungsmittels zur Probe vor dem Schritt des Nachweisens des Antigens und, nachdem die Probe aus dem Säuger erhalten ist, bis der Nachweis des Antigens abgeschlossen ist, das Halten der Probe unter solchen Bedingungen, dass die Mykobakterienzellen in der Probe im Wesentlichen nicht replizieren. Vorzugsweise wird die Probe unter solchen Bedingungen gehalten, dass kontaminierende Bakterienzellen sich im Wesentlichen auch nicht reproduzieren, zum Beispiel aufgrund der Zugabe eines Dekontaminierungsmittels. Bei diesem Verfahren umfasst das Verflüssigungsmittel vorzugsweise N-Acetyl-L-cystein in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Konzentration in der Probe zu erreichen, die wesentlich größer als 0,25% (w/v) ist. Mit "im Wesentlichen größer als 0,25% (w/v)" ist wenigstens das Zweifache, vorzugsweise etwa das Vierfache und noch mehr bevorzugt etwa das Achtfache dieser Konzentration gemeint. Immer noch mehr bevorzugt umfasst das Verflüssigungsmittel N-Acetyl-L-cystein in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Konzentration in der Probe von etwa 2,5% (w/v) zu erreichen. Das Verflüssigungsmittel kann auch vorteilhaft eine Nuclease, vorzugsweise eine DNase, enthalten, die dazu fähig ist, DNA in der biologischen Probe zu spalten, wie beispielsweise in US-A-5,364,763, Kacian, offenbart ist.
Bei diesem Verfahren zur Verarbeitung von Proben wird die Probe nach der Probenahme und nach dem Nachweis des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge des Antikörpers, der an ein sezerniertes mykobakterielles Antigen wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 spezifisch gebunden ist, in der Probe vorzugsweise auf einem im Wesentlichen neutralen pH-Wert gehalten. Somit hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die Zugabe von NaOH zu einer Sputum-Probe, z.B. von 1-2% (w/v) wie bei herkömmlichen "NaOH-NALC-"Verflüssigungsverfahren, die Reaktivität des Antigens MPB64 oder des Antigens MPT64 gegenüber Antikörpern, die an diese Antigene spezifisch binden, wesentlich vermindert. Eine Behandlung mit solchen herkömmlichen NaOH-Konzentrationen vermindert auch die Lebensfähigkeit von Mykobakterien in einer biologischen Probe, wodurch die Empfindlichkeit anschließender Tests auf ein mykobakterielles Antigen oder lebensfähige Zellen, die durch eine Kultur nachgewiesen werden, vermindert wird. Mit "einem im Wesentlichen neutralen pH-Wert" ist beispielsweise ein pH-Wert zwischen 4 und 10, vorzugsweise zwischen 5 und 9, noch mehr bevorzugt zwischen 6 und 8 und am meisten bevorzugt im Bereich von 6,5 bis 7,5 gemeint.
Das Verfahren zur Verarbeitung einer biologischen Probe zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens umfasst gegebenenfalls weiterhin die Zugabe eines Dekontaminierungsmittels zur Probe vor dem Nachweis eines sezernierten Antigens. Zum Beispiel kann das Dekontaminierungsmittel eine Mischung von Antibiotika wie die als "PANTA" bekannte Mischung, die Polymyxin B, Amphotericin B, Nalidixinsäure, Trimethoprim bzw. Azlocillin in Mengen umfasst, die ausreichend sind, um in der Probe Konzentrationen von wenigstens 50 E./ml, 5 μg/ml, 20 μg/l, 5 μg/l bzw. 10 μg/ml zu erreichen, umfassen. Noch mehr bevorzugt umfasst das Dekontaminierungsmittel Polymyxin B, Amphotericin B, Nalidixinsäure, Trimethoprim bzw. Azlocillin in Mengen, die ausreichend sind, um in der Probe Konzentrationen von wenigstens 500 E./ml, 50 μg/ml, 200 μg/l, 50 μg/l bzw. 100 μg/ml zu erreichen. Das Dekontaminierungsmittel kann auch andere Antibiotika oder Enzyme umfassen, die Nicht-Mykobakterienzellen selektiv töten oder deren Replikation hemmen.
Der Herstellungsgegenstand der Erfindung umfasst einen Behälter, ein Verflüssigungsmittel und Verpackungsmaterial, das den Behälter und das Verflüssigungsmittel enthält. Das Verpackungsmaterial kann eine Etikette einschließen, die darauf hindeutet, dass der Behälter zum Vereinigen des Verflüssigungsmittels mit einer aus einem Säuger erhaltenen biologischen Probe zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens wie des Antigens MPB64 oder des Antigens MPT64 in der Probe oder einer Fraktion davon ohne wesentliche Probenahme von Mykobakterienzellen in der Probe zu verwenden ist. Vorteilhaft ist das Verflüssigungsmittel in diesem Herstellungsgegenstand N-Acetyl-L-cystein in fester Form. Diese feste Form umfasst gegebenenfalls weiterhin ein Dekontaminierungsmittel (z.B. PANTA). Vorzugsweise sind das Verflüssigungsmittel und gegebenenfalls das Dekontaminierungsmittel in fester Form in diesem Herstellungsgegenstand enthalten, so dass eine in den Behälter eingeführte biologische Probe in Kontakt mit dem Verflüssigungsmittel gelangt. Zum Beispiel kann das feste Verflüssigungsmittel in Form einer Beschichtung auf einer Fläche im Inneren des Behälters vorliegen.
Vorzugsweise umfasst der Behälter der Erfindung weiterhin einen ersten festen Träger und einen zweiten festen Träger, wobei der erste feste Träger Mykobakterienzellen zurückhält und ein sezerniertes mykobakterielles Antigen wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 nicht zurückhält und am zweiten Träger ein Capture-Antikörper gebunden ist, der am sezernierten Antigen spezifisch bindet. In dieser Ausführungsform sind der erste feste Träger und der zweite feste Träger so im Inneren des Behälters angeordnet, dass eine in den Behälter eingeführte Probe den ersten festen Träger und den zweiten festen Träger berührt. Der erste feste Träger umfasst vorteilhaft eine erste poröse Matrix, und der zweite feste Träger umfasst eine zweite poröse Matrix, wobei die erste und die zweite poröse Matrix so angeordnet sind, dass, wenn eine biologische Probe in den Behälter eingeführt wird, die biologische Probe durch die erste poröse Matrix gelangt, wodurch Mykobakterienzellen in der Probe von der ersten porösen Matrix zurückgehalten werden, und danach die biologische Probe durch die zweite poröse Matrix gelangt, wodurch das sezernierte mykobakterielle Antigen wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 in der Probe am Capture-Antikörper auf der zweiten porösen Matrix spezifisch gebunden wird.
Vorteilhaft ist in dieser Ausführungsform des Herstellungsgegenstandes der Erfindung die erste poröse Matrix vom Behälter entfernbar, nachdem die biologische Probe durch diese hindurchgelangt ist, so dass Mykobakterienzellen, die von der ersten porösen Matrix zurückgehalten werden, auf dieser Matrix aus dem Behälter entfernt werden. Diese entfernbare erste poröse Matrix stellt daher ein zweckmäßiges Verfahren zum Konzentrieren von Mykobakterienzellen in einer Probe für ein weiteres Testen wie ein Anfärben und eine Sichtprüfung oder herkömmliche Kultivierungstests dar.
Vorteilhaft umfasst dieser Herstellungsgegenstand der Erfindung weiterhin ein Nachweisreagens, das ein sezerniertes mykobakterielles Antigen wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64, das am Capture-Antikörper spezifisch gebunden ist, spezifisch nachweist und dadurch ein nachweisbares Signal auf der zweiten porösen Matrix erzeugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Herstellungsgegenstandes dieser Erfindung enthält der Behälter alle Reagenzien, die erforderlich sind, um ein sezerniertes mykobakterielles Antigen wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 in einer biologischen Probe nachzuweisen. Diese Reagenzien umfassen eines, das eine Farbe erzeugt, die auf das Vorhandensein auf das Antigen, das am Capture-Antikörper auf der zweiten porösen Matrix spezifisch gebunden ist, hinweist. Bei dieser Ausführungsform deutet die Etikette darauf hin, dass der Behälter alle Reagenzien enthält, die zum Nachweis des sezernierten mykobakteriellen Antigens in einer in den Behälter eingeführten biologischen Probe erforderlich sind.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Ablaufdiagramm einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens in einer aus einem Säuger erhaltenen biologischen Probe ohne eine wesentliche Probenahme von Mykobakterienzellen in der Probe. Bei diesem Verfahren wird eine Tablette, die ein lyophilisiertes Verflüssigungsmittel (NALC) und ein Dekontaminierungsmittel (PANTA) enthält, vor der Isolierung des Probestücks (z.B. Sputum) im Probenahmerohr positioniert, und die Probe wird bei Umgebungstemperatur zur Stelle des Mykobakterien-Antigen-Assays transportiert. Dort wird die Probe mittels Zentrifugation fraktioniert, der Überstand wird direkt auf Antigen getestet, und das Pellet wird gegebenenfalls mit NaOH behandelt und mittels herkömmlicher Kultivierungsverfahren auf säurebeständige Bakterien (AFB) und lebensfähige Mykobakterien getestet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf dem Befund, dass ein sezerniertes mykobakterielles Antigen, insbesondere ein Antigen MPB64 oder ein Antigen MPT64, in biologischen Proben von Säugern, insbesondere in klinischen Probestücken wie Sputum von mit M. tuberculosis infizierten Menschen, die mit einer Mykobakterien-Spezies infiziert sind, die ein solches Antigen sezerniert, ohne eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Probe vor dem Antigennachweis nachgewiesen werden kann.
Die folgenden Definitionen und Erläuterungen von Begriffen gelten für die gesamte gegenwärtige Offenbarung, sofern nichts anderes aufgeführt ist.
Eine Konvention der Nomenklatur von mykobakteriellen Proteinen ist die Verwendung von MPB- und MPT-Nummern. MPB bezeichnet ein Protein, das aus M.-bovis-BCG gereinigt ist, gefolgt von einer Zahl, die seine relative Mobilität in Gelen mit 7,7% Polyacrylamid bei einem pH-Wert von 9,5 bezeichnet. MPT bezeichnet ein Protein, das aus M. tuberculosis isoliert ist. Siehe z.B. US-A-6,245,331, Laal et al.
Der hier verwendete Begriff "sezerniertes mykobakterielles Antigen" schließt jedes Element der Familie von wenigstens vier sezernierten Proteinen mit üblichen Strukturmerkmalen ein, das von Mykobakterien erzeugt und sezerniert wird und in der die Zellen umgebende Flüssigkeit gefunden werden kann, wie unten beschrieben ist, einschließlich Antigenen, die ein Epitop eines sezernierten Proteins 85A, 85B, 85C, MPT51 oder MPT64 oder MPB64 aufweisen.
Wiker und Kollegen haben eine Familie von sezernierten Mt-Proteinen untersucht, die einen Komplex von 3 Proteinen einschließen, die als die Antigene 85A, 85B und 85C bezeichnet sind (auch als "85er-Komplex oder "85cx" bekannt). Siehe beispielsweise H. G. Wiker et al., Scand. J. Immunol. 36:307-319 (1992), H. G. Wiker et al., Microbiol. Rev. 56:648-661 (1992). Dieser Komplex wurde ursprünglich in BCG-Präparaten von M. bovis gefunden, die ein sezerniertes Antigen erzeugten, das einen Komplex von drei eng verwandten Komponenten, die Antigene 85A, 85B und 85C umfasste (H. G. Wiker et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 81:289-306 (1986)). Die entsprechenden Mt-Komponenten werden auch aktiv sezerniert. Der 85er-Komplex wird als der sezernierte Haupt-Proteinbestandteil von mykobakteriellen Kulturflüssigkeiten betrachtet, obwohl er im Zusammenhang mit der Bakterienoberfläche gefunden wird. In den meisten SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese- (SDS-PAGE-)Gelen werden 85A und C nicht aufgelöst, während ein isoelektrisches Fokussieren drei getrennte Banden offenbart.
Gene, die sechs der sezernierten Proteine 85A, 85B, 85C, "Antigen 78" (üblicherweise als das Protein mit 38 kDa bezeichnet), MPB64 und MPB70 codieren, sind geklont worden. Drei getrennte Gene, die sich an getrennten Stellen im Mykobakterien-Genom befinden, codieren 85A, B und C (J. Content et al., Infect. Immun. 59:3205-3212 (1991)). Ein Gen, das das als MPT-32 bekannte Antigen (als sezernierter Antigen-Komplex mit 45/47 kDa berichtet) codiert, ist geklont, sequenziert und exprimiert worden (A. Laqueyrerie et al., Infec. Immun. 63:4003-4010 (1995)) und als das apa-Gen bezeichnet worden. Der Antigen-85-Komplex wird oft als "30/31-kDa-Dublett" bezeichnet, obwohl leicht unterschiedliche Molmassenbezeichnungen berichtet worden sind.
In der folgenden Liste sind die Molmassen der einzelnen Komponenten des Antigen-85-Komplexes plus zweier zusätzlicher Antigene (in SDS-PAGE) gemäß der Beschreibung von Wiker und Kollegen zusammen mit alternativen Nomenklaturen aufgeführt:
Wikers Gruppe untersuchte Kreuzreaktionen zwischen fünf aktiv sezernierten Mt-Proteinen durch gekreuzte Immunoelektrophorese, SDS-PAGE, mit Immun-Blotting und Enzym-Immunoassay (EIA) unter Verwendung von (1) polyklonalen Kaninchen-Antiseren für die gereinigten Proteine und (2) einem monoklonalen Maus-Antikörper ("mAb"). Das mAb HBT4 reagierte mit dem Protein MPT51. Die Bestandteile 85A, 85B und 85C unterlagen einer beträchtlichen Kreuzreaktion, obwohl jedes zusätzlich zu kreuzreagierenden Epitopen spezifische Komponenten aufwies. Diese Komponenten gingen auch eine Kreuzreaktion mit MPT51 und MPT64 ein. Eine Aminosäure-Sequenzhomologie wurden zwischen 85A, 85B, 85C und MPT51 gezeigt. MPT64 wies eine geringere Homologie auf. Eine auffallende Homologie wurde auch zwischen zwei verschiedenen Strukturen innerhalb der 85B-Sequenz gefunden. Somit ist eine Familie von wenigstens vier sezernierten Proteinen mit gemeinsamen strukturellen Merkmalen in Mykobakterien demonstriert worden.
Der Begriff "ohne eine wesentliche Replikation", der beispielsweise bei der Beschreibung eines Verfahrens zum Nachweis eines sezernieren mykobakteriellen Antigens in einer aus einem Säuger erhaltenen biologischen Probe ohne eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Probe verwendet wird, wird verwendet, um anzugeben, dass die Säugerzellen nicht Bedingungen, die einer extensiven Replikation dienen, wie herkömmlichen Bedingungen zur Kultivierung von Mykobakterien, unterzogen wurden. Im Gegensatz zu bisherigen Verfahren zur Bestimmung, ob eine biologische Probe ein sezerniertes mykobakterielles Antigen enthält, insbesondere Verfahren zum Nachweis des Antigens MPT64, die von Abe et al., s.o., offenbart sind, die ein Kultivieren von mykobakteriellen Zellen in der Probe für eine Woche oder länger vor einem Testen auf das Antigen erfordern, ermöglicht das Verfahren den Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens in einer biologischen Probe sogar, obwohl nach dem Erhalt der biologischen Probe vom Säuger bis zum Nachweis des Antigens Mykobakterienzellen in der Probe nicht wesentlich replizieren.
Mit anderen Worten ist, obwohl eine gewisse unwesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in einer Probe beispielsweise nach der Probenahme, vor dem Testen auf Antigen, während des Transports oder während der Aufbewahrung der Probe gelegentlich auftreten kann, eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Testprobe wie durch ein absichtliches Kultivieren der Zellen in mykobakteriellen Kulturmedien zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens in einer biologischen Probe gemäß der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich. Demgemäß bedeutet "ohne eine wesentliche Replikation" im vorliegenden Zusammenhang, dass Mykobakterienzellen in einer Probe ohne eine wenigstens 1000-fache Erhöhung der ursprünglichen Anzahl von Mykobakterienzellen in der Probe, vorzugsweise ohne eine 10-fache Erhöhung und noch mehr bevorzugt sogar ohne eine dreifache Erhöhung gehalten werden.
Mit "Antikörper" ist ein beliebiges Peptid oder Peptidmimetikum, das auf eine immunologisch spezifische Weise an einem Antigen bindet, gemeint.
Typischerweise umfasst es, ohne darauf beschränkt zu sein, intakte polyklonale und monoklonale Antikörper und Derivate einschließlich antigenbindende Fragmente einschließlich solcher Immunoglobulin-Fragmente wie Fab, F(ab')₂, Fab', scFv (sowohl Monomere als auch polymere Formen) und isolierte H- und L-Ketten. Ein antigenbindendes Fragment behält die Fähigkeit bei, spezifisch an einem Antigen zu binden, obwohl die Avidität und/oder Affinität im Vergleich beispielsweise zu einem verwandten Antikörper verändert sein können.
Mit "Antibiotikum" ist eine Verbindung gemeint, die eine nachteilige Auswirkung auf die Lebensfähigkeit, Unversehrtheit oder Kompetenz einer Kontaminante hat, wie im Fachgebiet verstanden ist. Beispiele für verschiedene Klassen von Antikörpern umfassen die β-Lactam-Antibiotika, die β-Lactamase-Inhibitoren, die Aminoglycoside und Aminocyclitole, die Chinolone, Tetracycline, Macrolide und Lincosamide sowie die Glycopeptide, Lipopeptide und Polypeptide, die Sulfonamide und Trimethoprim, Chloramphenicol, Isoniazid, Nitroimidazole, Rifampine, Nitrofurane, Methenamin und Mupirocin. Andere antifungizide Verbindungen umfassen die Polyene, Azole und Inhibitoren der Pyrimidinsynthese. Ein beliebiges dieser Antibiotika oder alle sind im Zusammenhang mit den Verfahren der Erfindung brauchbar. Der Begriff "Antibiotikum" ist mit dem hier verwendeten Begriff "antimikrobielles Mittel" synonym.
Mit einer "biologischen Probe" ist eine Probe gemeint, die von einem Probestück biologischen Ursprungs stammt oder davon genommen ist, wie ein Probestück, das von einem Tier (einschließlich eines Menschen) oder von einer Pflanze genommen ist. Biologische Proben können von einem beliebigen Teil des biologischen Organismus einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, expectorierten Stoffen (zum Beispiel Sputum, Speichel und Schleim), Bronchialspülungen und analogen respiratorischen Waschungen, Fäkalien, Gewebeproben einschließlich Hautproben, gastrischen Aspiraten, Urin, Tränen, Schweiß, Blut und Zerebrospinalflüssigkeit (CFS) stammen oder davon genommen werden. Beliebige tierische Spezies können als Quelle für solche Proben verwendet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, wiederkäuenden Tieren (wie Mitgliedern der Rinderfamilie (Rinder, Kühe etc.) oder Mitgliedern der Schaffamilie (Schafen etc.), Schweinen, Fischen und Mitgliedern der Vogelfamilie.
Mit "anorganische Probe" ist eine Probe gemeint, die von einem nichtbiologischen Probestück wie beispielsweise einer Umweltquelle wie Erdreich, Schlamm, Wasser, Sägespänen und Luft stammt.
Die Herstellungsvorrichtung macht ein Verfahren zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens in einer aus einem Säuger erhaltenen biologischen Probe ohne eine wesentliche Replikation von mykobakteriellen Zellen in der Probe verfügbar. Dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen eines Antikörpers, der am sezernierten mykobakteriellen Antigen der Probe oder eine Fraktion davon unter solchen Bedingungen spezifisch bindet, dass der Antikörper am sezernierten mykobakteriellen Antigen in der Probe spezifisch bindet, wodurch ein spezifischer Komplex des Antikörpers mit dem sezernierten mykobakteriellen Antigen gebildet wird. Das Verfahren umfasst weiterhin den Nachweis des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge des spezifischen Komplexes des Antikörpers mit dem sezernierten mykobakteriellen Antigen in der Probe. Beim diesem Verfahren deutet das Vorhandensein dieses spezifischen Komplexes auf das Vorhandensein des sezernierten mykobakteriellen Antigens in der Probe hin.
Der Nachweis eines spezifischen Komplexes eines Antikörpers mit einem sezernierten mykobakteriellen Antigen kann unter Verwendung eines beliebigen Immunoassay-Formats durchgeführt werden, von dem im Fachgebiet viele bekannt sind. Somit können polyklonale oder monoklonale Antikörper in Immunoassay-Protokollen mehrerer Typen verwendet werden. Die Antikörper können intakt verwendet werden, oder es können Fragmente erzeugt werden, die in der Lage sind, am Ziel-Antigen zu binden. Obwohl Immunoassays unter Verwendung ausschließlich von polyklonalen Antikörper-Reagenzien durchgeführt werden können, ist in den meisten Fällen ein monoklonaler Antikörper oder eine Kombination von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern bevorzugt.
Im Allgemeinen sind Antikörper oder Antigene in Immunoassays durch Konjugation an eine detektierbare Markierung markiert, um den Nachweis der Antigen/Antikörper-Bindung durch den Einschluss der Markierung in die gebildeten bindenden Komplexe zu erleichtern. Der hier verwendete Begriff "detektierbare Markierung" und verwandte Begriffe sollen sowohl die detektierbare Markierung allein als auch, wie unten beschrieben ist, detektierbare Markierungen einschließen, die mit Teilchen assoziiert sind. Geeignete detektierbare Markierungen und Verfahren zur Konjugation davon an Proteine wie Antikörper sind wohlbekannt. Direkt detektierbare Markierungen, für die der Nachweis zusätzlicher zu detektierender Reagenzien oder eine zusätzliche Reaktion nicht erforderlich ist, umfassen Radioisotope, Fluoreszenzfarbstoffe und im Sichtbaren absorbierende Farbstoffe. Enzyme, die zur Reaktion unter Bildung gefärbter Produkte fähig sind, sind zweckmäßigerweise indirekt detektierbare Markierungen, die üblicherweise zur Konjugation an Antikörper in speziellen bindenden Assays verwendet werden. Alle obigen detektierbaren Markierungen sind zur Konjugation an polyklonale und monoklonale Antikörper zur Verwendung in Antigennachweisschritten geeignet.
Beim Verfahren des Nachweisens eines sezernierten mykobakteriellen Antigens wird vorteilhaft der Antikörper, der am sezernierten mykobakteriellen Antigen spezifisch bindet, an einer festen Matrix gebunden. Vorzugsweise umfasst der Nachweis des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge des spezifischen Komplexes dieses Antikörpers mit dem sezernierten mykobakteriellen Antigen die Verwendung eines Reagens, das eine detektierbare Markierung umfasst, die auf das Vorhandensein des spezifischen Komplexes auf der festen Matrix hindeutet. Zum Beispiel kann der spezifische Komplex des Antikörpers und des sezernierten mykobakteriellen Antigens mit einem detektierbaren, markierten zweiten Antikörper detektiert werden, der am selben Antigen wie der erste, an einem festen Körper gebundene Antikörper, aber an einer verschiedenen Stelle spezifisch bindet (Epitop). Vorzugsweise umfasst die detektierbare Markierung auf diesem zweiten Antikörper ein Reagens, das eine Farbe aufweist, die mit dem bloßen Auge leicht detektierbar ist.
Protokolle für Immunoassays sind im Fachgebiet wohlbekannt. Zum Beispiel können polyklonale oder monoklonale Antikörper oder antigenbindende Fragmente davon in Sandwich-Assays zum Nachweis des sezernierten mykobakteriellen Antigens oder in bekannten Modifikationen und Variationen von Sandwich-Assay-Protokollen verwendet werden. Alternativ können Antikörper und antigenbindende Fragmente davon in verschiedenen kompetitiven Assayformaten verwendet werden, wie im Fachgebiet bekannt ist. Zum Nachweis des Antigens MPB64 oder MPT64 ist ein besonders bevorzugter Immunoassay ein immunochromatographischer Assay, bei dem monoklonale Anti-MPB64-Antikörper verwendet werden, wie von C. Abe et al., s.o., beschrieben ist. Eine kommerziell verfügbare Form dieses Immunoassays ist erhältlich, der "Capilia TB Slide Test", ein Lateralfluss-Immunochromatographie-Assay von Tauns (Namazo City, Japan). Eine Western-Blot- (Immunoblot-)Analyse kann auch zum Nachweis des Antigens MPB64 oder MPT64 verwendet werden, weil von diesen Antigenen bekannt ist, dass sie wenigstens ein lineares Epitop aufweisen. Siehe z.B. T. Oettinger et al., 1994, oben.
Das Verfahren ist zum Nachweis des Antigens MPB64 oder des Antigens MPT64 in biologischen Proben von einem Patienten, von dem vermutet wird, dass er Tuberkulose hat, insbesondere für Sputum-Proben von solchen Patienten, besonders brauchbar. Das Verfahren kann aber auch auf andere mukoide Sekretions-Probestücke, zum Beispiel Zervikalmukus, Bronchialmukus, Vaginalmukus oder einen anderen Mukus, der von einem Menschen oder einem anderen Tier genommen ist, angewandt werden. Das Verfahren kann auch auf andere biologische Proben oder Probestücke wie Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Vollblut oder andere Körperflüssigkeiten und Sekretionen angewandt werden.
In einer Ausführungsform des Verfahrens wird vor dem In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der an das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 spezifisch bindet, ein mukolytisches oder Verflüssigungsmittel, vorzugsweise ein Verflüssigungsmittel, das ein Disulfidbindungen reduzierendes Mittel umfasst, zur Probe gegeben. Ein bevorzugtes Disulfidbindungen reduzierendes Mittel ist N-Acetyl-L-Cystein (NALC), und ausreichend N-Acetyl-L-Cystein (NALC) und vorteilhaft wird dieses Mittel zur Probe gegeben, um eine Konzentration in der Probe zu erhalten, die wesentlich größer als 0,25% (w/v) ist, eine Konzentration, die bei herkömmlichen Verfahren zur Bearbeitung von Sputum verwendet wird (siehe z.B. G. Kubica in The Mycobacteria: A Source Book. Part A. (G. Kubica and L. Wayne, Hrsg.) Marcel Dekker, N.Y. (1984), S. 315-344). Vorzugsweise wird N-Acetyl-L-Cystein so zur Probe gegeben, dass eine Konzentration in der Probe von etwa 2,5% (w/v) erreicht wird. NALC ist bevorzugt, weil es mit Kulturtests einschließlich automatisierter Kultivierungsinstrumente wie den BACTEC^®-Instrumenten, die von Becton, Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, Md, kommerziell erhältlich sind, verträglich ist.
Andere Disulfid reduzierende Mittel sind im Zusammenhang mit den Verfahren brauchbar, wenn sie auf eine ähnliche Weise wie NALC funktionieren. Beispiele für solche Reduktionsmittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Dithiothreit (DTT) und verwandte Verbindungen, die in US-A-3,502,779, Dye et al., offenbart sind, und β-Mercaptoethanol (β-ME).
In einer Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis des mykobakteriellen Antigens wird die Probe so behandelt, dass Mykobakterienzellen vom Rest der Probe getrennt werden, wodurch eine Mykobakterien-Zellfraktion und eine restliche, das Antigen enthaltende Fraktion erhalten werden. Die Mykobakterien-Zellfraktion wird dann beispielsweise visuell (z.B. durch säurefestes Anfärben) oder durch herkömmliche Kultivierungsverfahren auf das Vorhandensein von Mykobakterienzellen getestet. Der Antikörper, der am sezernierten mykobakteriellen Antigen spezifisch bindet, wird dann mit der Restfraktion der Probe in Kontakt gebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform, bei der eine solche Fraktionierung der Probe eingesetzt wird und weiterhin ein an einer festen Matrix gebundener Antikörper verwendet wird, wird die Mykobakterien-Zellfraktion hergestellt, indem die Probe durch einen Filter geleitet wird, der Mykobakterienzellen zurückhält und das sezernierte Antigen, zum Beispiel das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64, nicht zurückhält, wodurch das resultierende Retentat auf dem Filter die Mykobakterien-Zellfraktion wird und das resultierende Filtrat die das Antigen enthaltende Restfraktion wird. Die feste Matrix, die den spezifischen Antikörper trägt, kann dann auch einen Filter, beispielsweise einen Membranfilter, in einem Filterstapel umfassen, der den Mykobakterienzellen zurückhaltenden Filter und diesen Membranfilter umfasst, die fluid in Reihe verbunden sind. Der Filterstapel kann sich so in einem Behälter befinden, dass eine in den Behälter eingeführte Probe zuerst durch den Mykobakterienzellen zurückhaltenden Filter und dann durch den den Antikörper tragenden Filter fließt.
Ein anderer Aspekt der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung macht ein Verfahren zum Nachweis einer Infektion eines Säugers durch eine mykobakterielle Spezies verfügbar, die ein sezerniertes mykobakterielles Antigen erzeugt, indem eine von diesem Säuger erhaltene biologische Probe ohne eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Probe auf das sezernierte mykobakterielle Antigen getestet wird. Dieses Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen eines Antikörpers, der an das sezernierte mykobakterielle Antigen spezifisch bindet, mit der Probe oder einer Fraktion davon unter solchen Bedingungen, unter denen der Antikörper an das sezernierte mykobakterielle Antigen in der Probe oder einer Fraktion davon spezifisch bindet, und den Nachweis des Vorhandenseins, des Fehlens oder der Menge des an das Antigen gebundenen Antikörpers, wie oben beschrieben ist.
In einem anderen Aspekt macht die Vorrichtung der Erfindung ein Verfahren zur Verarbeitung einer aus einem Säuger erhaltenen biologischen Probe zum Nachweis eines Antigens, insbesondere eines sezernierten mykobakteriellen Antigens wie des Antigens MPB64 oder des Antigens MPT64, sowie von Bakerienzellen, insbesondere Mykobakterienzellen, in der Probe verfügbar. Dieses Verfahren umfasst die Zugabe eines Verflüssigungsmittels zur Probe zum Zeitpunkt der Probenahme oder zu einem anderen Zeitpunkt vor dem Schritt des Antigen-Nachweises und nach dem Erhalt der Probe aus dem Säuger, bis der Nachweis des Antigens abgeschlossen ist, wobei die Probe unter solchen Bedingungen gehalten wird, dass Bakterienzellen in der Probe im Wesentlichen nicht replizieren. Bei diesem Verfahren umfasst das Verflüssigungsmittel vorzugsweise N-Acetyl-L-cystein in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Konzentration in der Probe zu erreichen, die wesentlich höher als die übliche Konzentration von 0,25% (w/v) ist. Vorzugsweise umfasst das Verflüssigungsmittel N-Acetyl-L-cystein in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Konzentration in der Probe von 2,5% (w/v) zu erreichen. Das Verflüssigungsmittel kann vorteilhaft auch eine Nuclease, insbesondere eine DNase, umfassen, die dazu fähig ist, DNA in der biologischen Probe zu spalten, wie beispielsweise in US-A-5,364,763, Kacian, offenbart ist. Bei diesem Verfahren zur Verarbeitung von Proben wird die Probe vorzugsweise nach der Entnahme bis nach dem Nachweis des Ziel-Antigens und noch mehr bevorzugt bis nach dem Nachweis von Bakterienzellen im Wesentlichen auf einem neutralen pH-Wert gehalten. Mit anderen Worten werden herkömmliche Dekontaminierungsbehandlungen mit einer starken Base, z.B. 1-2%iger NaOH, vorzugsweise über die gesamte Probenverarbeitung vermieden, um eine begleitende Verminderung der Lebensfähigkeit von Mykobakterien in einer biologischen Probe zu vermeiden, wodurch die Empfindlichkeit anschließender Tests auf ein mykobakterielles Antigen oder lebensfähige Zellen vermieden wird.
Beispiele für Pathogene, die aus Proben extrahiert werden können, die gemäß der Erfindung hergestellt sind und dazu fähig sind, Krankheiten und Bedingungen erhöhter Wichtigkeit beim Testen zu verursachen, umfassen insbesondere die verursachenden Mittel für Tuberkulose (M.-tuberculosis-Komplex) und Lepra (M. leprae (humane Lepra) und M. lepraemurium (Nager-Lepra)); Bakterien vom Mycobacterium-avium-Komplex (wichtige Vogel-Pathogene), M. avium (manchmal bei AIDS-Patienten isoliert, die an einer mykobakteriellen Superinfektion leiden), M. bovis (in der Veterinärmedizin wichtig), M. fortuitum (ein Bodenbakterium, das aus Läsionen bei Tieren und Menschen isoliert worden ist), M. intracellulare (opportunistisch und insbesondere bei Patienten auftretend, die mit dem AIDS-Virus infiziert sind), M. paratuberculosis (bei der Diagnose der Crohnschen Krankheit (regionale Enteritis) bei Menschen von Interesse), Mycobacterium kansasii (ein seltenes, aber verheerendes Mittel, gewöhnlich mit einer Lungenkrankheit assoziiert), Mycobacterium marinum (infiziert kaltblütige Tiere und Fische und ist auch aus superfiziellen Granulomea auf den Extremitäten von Menschen isoliert worden), Mycobacterium paratuberculosis (das verursachende Mittel der Johneschen Krankheit bei Vieh; es ist sehr langsamwachsend, und Kulturen müssen 16 Wochen lang gehalten werden, bevor gewährleistet werden kann, dass sie negativ sind) und M. ulcerans (auch in der Humanmedizin von Interesse).
Der Nachweis von Organismen, die in ihren äußeren Membranen Mycolsäurestrukturen enthalten, in Proben, die mittels des Verfahrens hergestellt sind, kann unter Verwendung von Techniken wie der Kultur, der Nucleinsäureamplifizierung und der Immunodiagnose erfolgen.
Wenn es erwünscht ist, die Mykobakterien aus der Probe zu kultivieren, können im Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden. Beispiele für flüssige Medien, die zur Kultivierung von Mykobakterien brauchbar sind, umfassen BACTEC^® 12B (auch als "12B" bezeichnet) (Becton-Dickinson, Cockeysville, MD), ESP^® MYCO System II (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) oder MB/BacT^® (Organon Teknika, Durham, NC). Beispiele für nichtselektive feste Medien, die zur Kultivierung von Mykobakterien brauchbar sind, umfassen Lowenstein-Jensen (L-J), 7H10 oder 7H11. Beispiele für selektive feste Medien, die zur Kultur von Mykobakterien brauchbar sind, umfassen L-J Gruft, Mycobactosel oder 7H11 I-selective. Während im Allgemeinen die selektiven festen Medien im Vergleich zu den nichtselektiven Medien bevorzugt sind, ist das flüssige Kulturmedium, das gewöhnlich empfindlicher ist, bei den Verfahren der Erfindung bevorzugt. Kommerzielle Präparate von Antibiotika-Zusätzen zur Verwendung im Zusammenhang mit den oben erwähnten flüssigen Kultivierungssystemen umfassen PANTA (Becton-Dickinson, Cockeysville, MD), PVNA (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) bzw. MAS (Organon Teknika, Durham, NC). Jedes dieser Kultivierungssysteme kann dahingehend modifiziert werden, dass es andere oder zusätzliche Antibiotika einschließt, um die diagnostische Leistung im Zusammenhang mit den Methoden der Erfindung zu optimieren. Zum Beispiel ist eine Modifikation der PANTA-Formulierung dahingehend, dass sie Vancomycin und/oder Ceftazidim einschließt, im Fachgebiet bekannt.
Das Verfahren zur Verarbeitung einer biologischen Probe zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens umfasst gegebenenfalls weiterhin die Zugabe eines Dekontaminierungsmittels zur Probe vor dem Nachweis eines sezernierten Antigens. Das Dekontaminierungsmittel dient zum selektiven Abtöten oder Hemmen von nicht-mykobakteriellen Zellen, die andernfalls anschließende Tests, insbesondere Kulturtests, auf Mykobakterien stören könnten. Eine Zugabe des Dekontaminierungsmittels unmittelbar bei der Probenahme ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Probe für längere Zeit insbesondere ohne Kühlung in warmen Klimata aufzubewahren oder zu transportieren ist. Das Dekontaminierungsmittel kann eine Mischung von Antibiotika umfassen, wie die Mischung, die als "PANTA" bekannt ist, das Polymyxin B, Amphotericin B, Nalidixinsäure, Trimethoprim bzw. Azlocillin in Mengen umfasst, die ausreichend sind, um in der Probe Konzentrationen von wenigstens 50 E./ml, 5 μg/ml, 20 μg/ml, 5 μg/ml bzw. 10 μg/ml zu erhalten. Noch mehr bevorzugt umfasst das Dekontaminierungsmittel die Antibiotika in PANTA mit dem fünf- bis zehnfachen der obigen Konzentration, zum Beispiel Polymyxin B, Amphotericin B, Nalidixinsäure, Trimethoprim bzw. Azlocillin in Mengen umfasst, die ausreichend sind, um in der Probe Konzentrationen von 500 E./ml, 50 μg/ml, 200 μg/ml, 50 μg/ml bzw. 100 μg/ml zu erhalten. Somit hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass eine Zugabe von PANTA zu biologischen Proben, um diese letzteren Konzentrationen zu erreichen (die um etwa das Zehnfache höher als die übliche Verwendung von PANTA ist), eine stärkere Verminderung von nicht-mykobakteriellen Verunreinigungen ergibt, ohne dass die Isolierung von lebensfähigen mykobakteriellen Zellen, insbesondere M.-tuberculosis-Zellen, inakzeptabel vermindert wird. Es kann gezeigt werden, dass höhere Konzentrationen an antimikrobiellen Mitteln wie denjenigen, die in PANTA, falls es zum Wachstumsmedium gegeben wird, vorhanden sind, auf das Wachstum vieler Mykobakterien hemmend einwirken können.
Das Dekontaminierungsmittel kann auch andere Antibiotika oder Enzyme umfassen, die nicht-mykobakterielle Zellen selektiv abtöten oder deren Replikation hemmen. Zum Beispiel offenbaren S. Whittier et al., oben, eine Dekontamination von respiratorischen Probestücken mit NALC-NaOH, gefolgt von einer Behandlung mit 5%iger Oxalsäure. Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat jedoch gefunden, dass statt einer herkömmlichen Behandlung mit NALC-NaOH eine höhere Konzentration an NALC bei einem kompletten Fehlen von NaOH eine überlegene Isolierung lebensfähiger Mykobakterien ergibt. Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat gefunden, dass es alternativ statt einer Zugabe der üblichen NaOH-Konzentration zu einer biologischen Probe (bis zu einer Konzentration von 1-2% (w/v)) bei einer gleichzeitigen Zugabe von NALC vorteilhaft ist, NaOH für einen kürzeren Zeitraum und/oder bei einer niedrigeren Konzentration (z.B. 10 Mal weniger oder 0,1% (w/v)) als bei den herkömmlichen NALC-NaOH-Verflüssigungs-Dekontaminations-Verfahren zuzugeben. Vorzugsweise wird NaOH erst zugegeben, nachdem der Nachweis des Antigens abgeschlossen ist, wenn ein solcher Nachweis erwünscht ist, und dann nur für einen relativ kurzen Zeitraum, zum Beispiel 10-20 min vor der Neutralisation und gegebenenfalls dem Waschen von Zellen zur Entfernung von neutralisierter NaOH.
Alternativ oder darüber hinaus kann die Dekontaminierung von biologischen Proben, die gemäß der vorliegenden Erfindung verarbeitet werden, auch die Verwendung eines lytischen Enzyms als Dekontaminierungsmittel umfassen, wie beispielsweise in US-A-5,985,593, Thornton et al., offenbart ist, das Verfahren zur enzymatischen Dekontaminierung von Probestücken offenbart, wodurch nicht gramnegative Verunreinigungen eliminiert werden.
Der Herstellungsgegenstand macht eine Verarbeitung einer biologischen Probe zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens verfügbar. Dieser Herstellungsgegenstand, zum Beispiel ein Kit, umfasst einen Behälter, ein Verflüssigungsmittel und Verpackungsmaterial, das den Behälter und das Verflüssigungsmittel enthält. Das Verpackungsmaterial umfasst ein Etikett, das darauf hindeutet, dass der Behälter zum Vereinigen des Verflüssigungsmittels mit einer von einem Säuger erhaltenen biologischen Probe zu verwenden ist, um ein sezerniertes mykobakterielles Antigen wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 in der Probe oder in einer Fraktion davon ohne eine wesentliche Replikation von Mykobakterienzellen in der Probe nachzuweisen.
Vorteilhaft umfasst das Verflüssigungsmittel in diesem Herstellungsgegenstand ein Disulfidbindungen reduzierendes Mittel, vorzugsweise N-Acetyl-L-cystein, in fester Form, vorzugsweise in Form eines Pulvers oder von Mikroteilchen, gegebenenfalls in granulierter Form, wie einer Tablette, oder in einer Kapsel. Diese feste Form umfasst gegebenenfalls weiterhin ein Dekontaminierungsmittel wie ein Antibiotikum oder eine Antibiotikummischung oder ein lytisches Enzym oder Mischungen davon. Vorzugsweise ist das Verflüssigungsmittel im Behälter dieses Herstellungsgegenstandes enthalten, so dass eine in den Behälter eingeführte biologische Probe in Kontakt mit dem Verflüssigungsmittel gelangt. Zum Beispiel kann das feste Verflüssigungsmittel in Form einer Beschichtung auf einer Fläche innerhalb des Behälters vorliegen, oder es könnte sich um eine Tablette handeln, die zum Zeitpunkt der Probenahme in das Probenahmeröhrchen eingeführt wird.
Vorzugsweise umfasst der Behälter der Erfindung weiterhin einen ersten festen Träger und einen zweiten festen Träger, wobei der erste feste Träger Mykobakterienzellen zurückhält und ein sezerniertes mykobakterielles Antigen wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 nicht zurückhält und am zweiten festen Träger ein Capture-Antikörper gebunden ist, der spezifisch an diesem sezernierten Antigen bindet. Bei dieser Ausführungsform sind der erste feste Träger und der zweite feste Träger innerhalb des Behälters so angeordnet, dass eine in den Behälter eingeführte biologische Probe den ersten festen Träger und den zweiten festen Träger berührt. Der erste und der zweite feste Träger umfassen vorteilhaft eine erste und eine zweite poröse Matrix, wie geeignete Filter oder Membranen in einem Filterpaket, wobei der erste und der zweite Filter oder die erste und die zweite Membran so angeordnet sind, dass, wenn eine biologische Probe in den Behälter eingeführt wird, diese durch den ersten Filter gelangt, wodurch Mykobakterienzellen in der Probe von diesem Filter zurückgehalten werden, und danach die biologische Probe durch den zweiten Filter gelangt, wodurch das sezernierte mykobakterielle Antigen, wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64, in der Probe am Capture-Antikörper auf dem zweiten Filter spezifisch gebunden wird.
Vor der Filtration kann die Probe gegebenenfalls mit einem Mittel behandelt werden, dass mit weißen Blutzellen unter Bedingungen, unter denen Mykobakterien innerhalb oder assoziiert mit solchen Zellen im Wesentlichen zellulär intakt bleiben, selektiv lysiert, wie beispielsweise in US-A-5,364,763, Kacian, offenbart ist.
Filter, die Bakterienzellen einschließlich Mykobakterienzellen selektiv zurückhalten, während sie ein Passieren von Proteinen wie sezernierten mykobakteriellen Antigenen einschließlich der Antigene MPB64 und MPT64 ermöglichen, sind im Fachgebiet wohlbekannt. Bei Bedarf können zusätzliche Vorfilter oder Nachfilter in das Filterpaket eingeschlossen sein, um beispielsweise ein Reagens (z.B. ein Verflüssigungsmittel) in den Strom einzuführen oder Material, das größer als Bakterienzellen ist, vor der Isolierung dieser Zellen zu entfernen. Alternativ oder zusätzlich kann vor der Filtration unlösliches Material, das größer als mykobakterielle Zellen ist, das die Kapazität des Filterpakets zur Entfernung übersteigen könnte, durch andere Mittel, beispielsweise eine Zentrifugation oder durch das Leiten der Mischung über eine Spin-X-II-Säule, die mit einer Fritte mit 20-60 μm (Corning Costar, Boston, Mass.) ausgestattet ist, entfernt werden. Eine solche Säule könnte auch eine Matrix wie Sephadex^® (G-50: Pharmacia, Piscataway, NJ) oder ein äquivalentes Harz zur Verstärkung der Reinigung enthalten. Bei Bedarf kann der Behälter mit einer Öffnung ausgestattet sein, die zum Anlegen von Vakuum oder Druck geeignet ist, um eine Filtration der verflüssigten Probe zu erleichtern, oder der Behälter kann als Zentrifugenröhrchen oder in einer Form konfiguriert sein, in der er an einem solchen Röhrchen befestigt oder darin eingeführt werden kann, so dass eine Zentrifugation (mittels einer elektrisch oder von Hand angetriebenen Zentrifuge) angewandt werden kann, um die Filtration der verflüssigten Probe zu erleichtern.
Beim probenverarbeitenden Behälter der Erfindung ist die erste poröse Matrix (Filter) vorteilhaft vom Behälter entfernbar, nachdem die biologische Probe durch sie hindurch gelangt ist, so dass Mykobakterienzellen, die von der ersten porösen Matrix zurückgehalten wurden, auf dieser Matrix vom Behälter entfernt werden. Diese entfernbare erste poröse Matrix ergibt daher ein bequemes Verfahren zum Konzentrieren von Mykobakterienzellen in einer Probe für ein weiteres Testen, wie ein Anfärben und eine Sichtprüfung oder herkömmliche Kultivierungstests.
Der Herstellungsgegenstand wie ein Kit umfasst weiterhin vorteilhaft ein Nachweismittel, das ein sezerniertes mykobakterielles Antigen wie das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 spezifisch nachweist, wenn dieses Antigen am Capture-Antikörper auf der zweiten porösen Matrix (Filter) spezifisch gebunden ist, und erzeugt dadurch ein nachweisbares Signal auf der zweiten porösen Matrix.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Behälter alle Reagenzien, die zum Nachweis eines sezernierten mykobakteriellen Antigens wie des Antigens MPB64 oder des Antigens MPT64 in einer biologischen Probe erforderlich sind. Diese Reagenzien umfassen ein Nachweisreagens, das eine Farbe erzeugt, die auf das Vorhandensein eines Ziel-Antigens hindeutet, das an den Capture-Antikörper auf der zweiten porösen Matrix spezifisch gebunden ist. Die Geometrie des zweiten Filters kann hinsichtlich eines visuellen Nachweises einer minimalen Abscheidung des verfärbten Nachweisreagenzes optimiert sein. Zum Beispiel kann der Oberflächenbereich des den Capture-Antikörper tragenden Filters minimiert werden, um die dazugehörige Farbe zu konzentrieren, und der Filter kann so im Behälter angeordnet sein, dass ein Rand des Filters angesehen werden kann, ohne den Filter aus dem Behälter zu entfernen, wodurch ein längerer Weg für die Lichttransmission durch die assoziierte Farbe erhalten und somit die Empfindlichkeit für den Nachweis des immunologischen Komplexes im Vergleich zur Ansicht einer größeren Oberfläche des Filters erhöht wird.
Bei dieser Ausführungsform des Herstellungsgegenstandes deutet das Etikett des Verpackungsmaterials darauf hin, dass der Behälter alle Reagenzien enthält, die zum Nachweis des sezernierten mykobakteriellen Antigens in einer in den Behälter eingeführten biologischen Probe erforderlich sind. Eine Probenverarbeitung besteht bei diesem Behälter einfach in der Zugabe der biologischen Probe zum Behälter, der bereits das (die) erforderliche(n) Verflüssigungsmittel und bei Bedarf das (die) Dekontaminierungsmittel enthält, und das Bewegen des Behälters, um die Probe mit diesen Mitteln zu vermischen. Zum Beispiel kann eine Sputumprobe direkt in diesem Behälter gesammelt werden. Die Probe kann dann im Behälter aufbewahrt und/oder versandt werden, bis ein Testen auf ein Antigen oder Zellen erwünscht ist. Der Behälter und die Filter können so konstruiert und manipuliert sein, dass eine Filtration der verflüssigten Probe unmittelbar bei der Zugabe der Probe oder erst später, beispielsweise unmittelbar vor dem Testen auf Antigene oder Zellen, durch eine weitere Manipulation des Behälters (z.B. ein Anlegen eines Vakuums oder von Druck oder einer Zentrifugalkraft) erfolgt. Wenn der Antigentest positiv ist, kann der gesamte Behälter entsorgt werden, ohne ihn für ein weiteres Testen zu öffnen, wodurch die Einwirkung lebensfähiger Pathogene auf das Personal minimiert ist.
Alternativ erleichtert die oben erwähnte Entfernbarkeit des ersten Filters, auf dem Mykobakterienzellen gesammelt sind, aus dem Behälter das weitere Testen auf solche Zellen, indem er ein bequemes Mittel zum Konzentrieren der meisten oder aller dieser Zellen aus der Probe auf einer festen, leicht handhabbaren Form darstellt. Durch die Verwendung einer Filtration zum Konzentrieren von Mykobakterienzellen wird auch das bekannte Problem einer schwierigen Abtrennung von Bakterien der Gattung Mycobacterium in zufriedenstellenden Mengen von Sputum-Proben überwunden, weil ihre Dichte derjenigen von Wasser ähnlich ist, wodurch eine Zentrifugation ineffizient gemacht wird.
Experimentelles
Direktes Testen von Sputum-Proben mit positivem Ausstrich zum Nachweis von MPT64. Für den Test wurde der kommerziell erhältliche "Capilia TB Slide Test", ein Lateralfluss-Immunochromatographie-Assay von Tauns (Namazo City, Japan) verwendet.

a. Auswirkung von NaOH und NALC auf den Test: Vorexperimente deuteten darauf hin, dass NaOH bei der Konzentration, die typischerweise bei der herkömmlichen NALC-NaOH-Probenherstellung eingesetzt wird, die Antigen-Antikörper-Reaktion zerstört. Nach einer Neutralisation ist die Kontrollreaktion der Assayvorrichtung, mit der die Gültigkeit des Tests angezeigt wird, zwar wiederhergestellt, wobei die Testreaktion aber dennoch beeinflusst ist. Im Gegensatz dazu beeinflusste NALC den Test sogar beim Zehnfachen der herkömmlicherweise verwendeten Konzentration den Test nicht. Daher wurde geschlossen, dass wenigstens etwa 2,5% NALC (w/v) ohne NaOH verwendet werden könnten, um ein klinisches Probestück für einen Immunoassay zum Nachweis des Antigens MPT64 aufzuschließen.
b. Direktes Testen von Sputum-Probestücken: Es wurden acht Probestücke (gefroren) mit positivem Ausstrich, die positiv auf säurebeständige Bakterien (AFB) waren, getestet. Die Positivität des Ausstrichs einer jeden Probe wurde mit 1+ (d.h. 1-10 AFB/Mikroskopiefeld) bis 3+ (100 oder mehr AFB/Mikroskopiefeld) bewertet. Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Für den MPT64-Antigen-Test wurde die Tauns-Vorrichtung verwendet. Wie durch Ergebnisse unten gezeigt wird, floss, wenn ein aufgeschlossenes Probestück auf die Vorrichtung aufgetragen wurde, ohne zu zentrifugieren, der größte Teil des Probestücks nicht durch die Membran. Wenn das Probestück aber nach einem Aufschluss mit NALC zentrifugiert wurde, floss die Probe gut. Direkte Antigen-Testergebnisse auf das Antigen MPT64 unter Verwendung des Tauns-Tests waren wie folgt.
+/– = rosafarben, aber viel schwächer als die Kontrolle
c. Ergebnisse einer Kultivierung: Zwei Probestücke wurden mit und ohne Zugabe von PANTA zum Medium kultiviert.

* ein Röhrchen kontaminiert
1. Radiometrisches BACTEC^®-12B-Medium (Becton Dickinson). Während der Metabolisierung eines radioaktiv markierten Substrats im Medium wird CO₂ freigesetzt, und C¹⁴ im freigesetzten CO₂ wird mittels eines BACTEC^®-460-Instruments nachgewiesen.
2. Nicht radiometrisches BACTEC^®-MGIT^®-960-Medium (Becton Dickinson). Ein Wachstum wird durch die Fluoreszenz eines Sensors im Unterteil des Röhrchens nachgewiesen, die sich aufgrund des Verbrauchs von Sauerstoff durch Bakterien während des Wachstums verändert.
3. Alle kommerziellen Produkte wurden gemäß der Anleitung des Herstellers (Becton Dickinson) verwendet.

Auf der Grundlage der obigen Ergebnisse wurde der folgende, in 1 veranschaulichte Zugang zur Probenverarbeitung für eine routinemäßige Verwendung statt der herkömmlichen NALC-NaOH-Verfahren entwickelt. Eine auf das Antigen MPT64 zu testende Probe wird in einem Röhrchen gesammelt, das lyophilisiertes NALC (ausreichend, um nach Zugabe der Probe 2,5% (w/v) zu erreichen) und PANTA enthält, oder das lyophilisierte NALC und PANTA, beide vorzugsweise mit einer Konzentration, die um das 5- bis 10-fache höher als gewöhnlich empfohlen ist, werden in Tablettenform zum Röhrchen gegeben. Die Probe wird dann bei Umgebungstemperatur transpor tiert und/oder aufbewahrt, bis sie auf ein Antigen getestet wird. Dann wird ein kleiner Teil (z.B. 0,1-0,5 ml) der verflüssigten Probe zentrifugiert, beispielsweise in einer Mikrozentrifuge (Mikrofuge), und der Überstand wird mittels eines Immunoassays auf das Antigen MPT64 getestet. Zur verbliebenen verflüssigten Probe wird ein gleiches Volumen von 0,5-1% (w/v) NaOH gegeben, und die Probe wird 5-10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird eine Neutralisationslösung (0,068 M Natrium- und Kaliumphosphat) zugegeben, die Probe wird zentrifugiert, und das Sediment wird erneut suspendiert, um einen Ausstrich herzustellen und ein standardmäßiges Kulturmedium (gegebenenfalls ohne PANTA) zu inokulieren.

Claims

Herstellungsgegenstand, umfassend einen Behälter, ein Verflüssigungsmittel und Verpackungsmaterial, das den Behälter und das Verflüssigungsmittel enthält, wobei der Behälter einen ersten festen Träger und einen zweiten festen Träger umfasst, wobei der erste feste Träger mykobakterielle Zellen zurückhält und das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 nicht zurückhält, am zweiten festen Träger ein Capture-Antikörper gebunden ist, der am Antigen MPB64 oder am Antigen MPT64 spezifisch bindet, und der erste feste Träger und der zweite feste Träger innerhalb des Behälters so angeordnet sind, dass eine biologische Probe, die in den Behälter eingeführt wird, den ersten festen Träger und den zweiten festen Träger berührt.
Herstellungsgegenstand nach Anspruch 1, wobei der erste feste Träger eine erste poröse Matrix umfasst und der zweite feste Träger eine zweite poröse Matrix umfasst, wobei die erste poröse Matrix und die zweite poröse Matrix so angeordnet sind, dass, wenn eine biologische Probe in den Behälter eingeführt wird, die biologische Probe durch die erste poröse Matrix gelangt, wodurch mykobakterielle Zellen in der Probe von der ersten porösen Matrix zurückgehalten werden, und danach die biologische Probe durch die zweite poröse Matrix gelangt, wodurch das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 in der Probe am Capture-Antikörper auf der zweiten porösen Matrix spezifisch gebunden wird, und wobei weiterhin die erste feste Matrix aus dem Behälter entfernbar ist, nachdem die biologische Probe durch die erste poröse Matrix gelangt ist, so dass mykobakterielle Zellen, die von der ersten porösen Matrix zurückgehalten werden, auf der ersten porösen Matrix aus dem Behälter entfernt werden, und der weiterhin ein Nachweisreagens umfasst, das am Antigen MPB64 oder am Antigen MPT64, das am Capture-Antikörper spezifisch gebunden ist, spezifisch bindet und dadurch ein nachweisbares Signal auf der zweiten porösen Matrix erzeugt, und wobei weiterhin der Behälter weiterhin alle Reagenzien enthält, die erforderlich sind, um das Antigen MPB64 oder das Antigen MPT64 in einer biologischen Probe nachzuweisen, die ein Reagens einschließt, das eine Farbe erzeugt, die das Vorhandensein des Antigens MPB64 oder des Antigens MPT64, das am Capture-Antikörper auf der zweiten porösen Matrix spezifisch gebunden ist, anzeigt.
Herstellungsgegenstand nach Anspruch 1, wobei das Verflüssigungsmittel N-Acetyl-L-cystein in einer Menge umfasst, die ausreichend ist, um eine Konzentration in der Probe zu erreichen, die etwa gleich oder größer als 0,25% (w/v) ist oder wobei das Verflüssigungsmittel eine DNase umfasst, die dazu fähig ist, DNA in der biologischen Probe zu spalten.