JP2001502536A

JP2001502536A - 生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリ核酸の検出および型決定のためのプローブ、方法およびキット

Info

Publication number: JP2001502536A
Application number: JP10518004A
Authority: JP
Inventors: キント，ウィルヘルムス; ファン・ドールン，レーンデルト―ヤン
Original assignee: Fujirebio Europe NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1996-10-16
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2001-02-27
Also published as: US20030175746A1; EP0946747A2; WO1998016658A2; US20030165860A1; WO1998016658A3; AU4866997A; CA2267991A1; AU732099B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、（ｉ）必要ならば試料中のポリ核酸を遊離させ、単離し、あるいは濃縮し；（ｉｉ）適当なプライマーペアーを用いてｖａｃＡ遺伝子あるいは他の毒性決定遺伝子（ＶＤＧ）の関連標的領域のポリ核酸を増幅し（一般的には該プライマーは異なるエイチ・ピロリ株に対して適用可能であり、適合する増幅条件においてＶＤＧの該関連標的領域を優先的に増幅可能にするものである）；（ｉｉｉ）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において、（ｉ）または（ｉｉ）で得られたポリ核酸を、少なくとも２種のＶＤＧ由来のプローブからなるセットとハイブリダイゼーションさせ(該プローブのうち少なくとも１種はエイチ・ピロリのＶＤＧの保存された領域にハイブリダイゼーションし、該プローブのうち少なくとも１種はｖａｃＡの可変領域にハイブリダイゼーションする)；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において形成されたハイブリッドを検出し；（ｖ）工程（ｉｖ）において得られたディファレンシャルハイブリダイゼーションシグナルから、試料中に存在するエイチ・ピロリを検出および／または型決定することを含む、試料中に存在するヘリコバクター・ピロリ（Helicobacterpylori）（エイチ・ピロリ（H．pylori））の検出および／または型決定のための方法であって、該型決定が特にエイチ・ピロリ株に存在するＶＤＧ対立遺伝子による株の対立遺伝子特異的検出であり、該毒性決定遺伝子が該エイチ・ピロリ株の感染性および／または病原性を可能にし、決定し、有効にすることに関与する遺伝学的エレメントである方法に関する。また本発明は、それを行うためのプローブおよびプライマーならびにヘリコバクター・ピロリ検出／型決定キットにも関する。さらに本発明は、上記プライマーおよびプローブの設計に使用できるＶＤＧの新規配列も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリ核酸の検出および型決定のためのプローブ、方法およびキット本発明は、以下エイチ・ピロリ（H．pylori）と略称されるヒト病原体ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）の検出および型決定の分野に関する。本発明は、生物学的試料中の核酸の検出および型決定のためのプローブ、プライマー、およびそれらを含むキットに関する。エイチ・ピロリはヒトの慢性表在性胃炎の病原体であり、この生物による感染は胃潰瘍性疾患および胃癌の発生の大きな危険因子である（Blaser et al.，199 2;Hentschel et al.，1993;Parsonnet et al.，1991）。エイチ・ピロリによる感染経過はむしろ多様であり、おそらく、遺伝学的レベルにおける種の広い多様性を反映しているのであろう(Foxall et al.，1992;Ako pyanz et al.，1992)。しかしながら、大部分の表現型的特徴はよく保存されている。個体は種々の株に感染する可能性があるので、これらの株のなかでも正確に危険性のある個々のエイチ・ピロリ株の特性を同定することが重要であろう。エイチ・ピロリの個々の毒性決定因子のなかでも、２つの重要な遺伝学的エレメント、すなわち空胞形成毒素遺伝子（ｖａｃＡ遺伝子）および細胞毒素関連遺伝子（ｃａｇＡ遺伝子）が最近同定された(Leunk et al.，1988;Cover and Blas er，1992，1995;Cover et al.，1992，1994;Tummuru et al.，1993;Covacci et al.，1993)。エイチ・ピロリ空胞形成毒素は、多数の哺乳動物細胞系においてインビトロで細胞質の空胞形成を誘導し（Leunk et al，1988）、マウスに鼻腔内投与した場合、上皮細胞のダメージおよび粘膜潰瘍を引き起こす（Telford et al，1993）。vaｃＡ遺伝子は１２８７〜１２９６個のアミノ酸前駆体をコードしており、それはプロセッシング（ＮおよびＣ末端において）を受けて８７ｋｄａの分泌蛋白を生じる(Cover and Blaser，1992;Cover et al.，1994;Telford et al.，1994; Schmitt and Haas，1994;Phadmis et al，1994)。エイチ・ピロリ株の５０％のみが空胞形成を誘導するが、ほとんどすべての株がｖａｃＡプローブにハイブリダイゼーションする（Cover et al.，1994;Telford et al，1994;Scumitt and Haas，199 4;Phadmis et al.，1994)。ごく最近になって、Athertonら（１９９５年）は、ｖａｃＡ遺伝子のモザイク的組織化の証拠を見出し、エイチ・ピロリ株の特定のｖａｃＡ遺伝子型がインビトロにおける細胞毒素活性のレベルならびに臨床的結果に関連していることを示している。３つの異なるクラスのｖａｃＡシグナル配列（ｓｌａ、ｓｌｂおよびｓ２）および２つの異なるクラスの中央領域（middle-region）対立遺伝子（ｍ１およびｍ２）が存在することが示された。ｓ２／ｍ１を除いて、これらのｖａｃＡ領域のすべての可能性のある組み合わせ物が単離されている。細胞毒素活性の発生は、ｓ１タイプのシグナルペプチドを含むｖａｃＡ対立遺伝子の存在に密接に関連していた。ｓ２タイプのｖａｃＡ対立遺伝子を含む株は検出可能な細胞毒素活性を生じなかった。さらに、消化性潰瘍およびｓ１タイプのｖａｃＡ対立遺伝子の間の有意な関連性は示されなかった。第２の推定上の毒性決定因子は、細胞毒素関連遺伝子ｃａｇＡによりコードされる高分子蛋白である（Tummuru et al.，1993;Covacci et al.，1993）。エイチ・ピロリ株の約６０％がｃａｇＡ遺伝子を有し、それらのほとんどすべてがｃａｇＡ遺伝子産物を発現する。両方の遺伝子は遺伝学的に強く関連していないが、インビトロにおける空胞形成細胞毒素の生成およびｃａｇＡ遺伝子の存在は密接に関連した特徴である（Tummuru et al.，1993;Covacci et al，1993）。イムノブロットによる研究により、ｃａｇＡ（＋）株に感染した人は、ｃａｇＡ（−）株に感染した人よりもより重い胃炎および上皮細胞ダメージを有することが示されている。さらに、ｃａｇＡ（−）株による感染と比較すると、ｃａｇＡ(＋)株により感染においては多くのサイトカインの発現促進がみられる(Huang et al，1995)。感染の程度および上皮ダメージの程度は両方とも胃癌発症の決定因子でありうるので、エイチ・ピロリ感染によるｃａｇＡ遺伝子の存在につき調べることが重要である。本発明において、Athertonら（１９９５年）により記載された方法は、オランダおよびポルトガルの患者から得た多くの臨床試料に存在するエイチ・ピロリ株の型決定には不適であることが初めて示された（実施例１参照）。そのうえ、これらの著者により記載された型決定法は遺伝子増幅生成物のアガロースゲル電気泳動による分離を必要とし、多数の試料に適用する場合、面倒で信頼性にも欠ける方法である。よって、エイチ・ピリ株および病原性の表現型の間の関連性についての統計学的に重要なデータを得るために大きな集団を評価する必要性に関して、そして臨床段階において適用可能な撲滅方法を決定するための迅速、簡単かっ信頼性の高い型決定法に対する必要性に関しては、Athertonら（１９９５年）により記載された上記方法はあまり適切でない。生物学的試料中のエイチ・ピロリ株を検出し型決定するための迅速、鋭敏かつ信頼性のある方法を提供することが本発明の目的である。より詳細には、慢性の活発な胃炎ならびに／あるいは胃および十二指腸潰瘍、ならびに／あるいは胃のアデノカルシノーマならびに／あるいは粘膜関連リンパ組織のリンパ腫の発生に関連して、そして／あるいは適応可能な撲滅治療を決定するために生物学的試料中のエイチ・ピロリ株を検出し型決定するための迅速、鋭敏かつ信頼性のある方法を提供することが本発明の目的である。少なくともｖａｃＡ遺伝子を包含する、存在している毒性決定遺伝子の対立遺伝子の検出および／または型決定に直接連結した、迅速、鋭敏かつ信頼性のある方法を提供することが本発明の目的である。より詳細には、存在しているｖａｃＡおよびｃａｇＡ対立遺伝子の検出および型決定に直接連結した、迅速、鋭敏かつ信頼性のある方法を提供することが本発明の目的である。ｖａｃＡ由来の少なくとも１つのプローブを包含する、存在している毒性決定遺伝子の対立遺伝子に基づいてエイチ・ピロリの検出および／または対立遺伝子特異的な型決定を可能にする適当なプローブを決定することが本発明の目的である。より詳細には、存在しているｖａｃＡおよびｃａｇＡ毒性決定遺伝子の対立遺伝子に基づいてエイチ・ピロリの検出および／または対立遺伝子特異的な型決定を可能にする適当なプローブを決定することが本発明の目的である。そのうえ、少なくともｖａｃＡ遺伝子を包含する、存在している毒性決定遺伝子の対立遺伝子に基づいてエイチ・ピロリの検出および／または対立遺伝子特異的な型決定を可能にする適当なプローブを組み合わせることが本発明の目的であり、好ましくは該プローブはすべて多パラメーターアッセイにおいて、詳細には同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において同時使用できるものである。より詳細には、存在しているｖａｃＡおよびｃａｇＡ遺伝子の対立遺伝子に基づいてエイチ・ピロリの検出および／または対立遺伝子特異的な型決定を可能にする適当なプローブを組み合わせることが本発明の目的であり、好ましくは該プローブはすべて同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において同時使用できるものである。より詳細には、少なくともｖａｃＡ遺伝子を包含する、ＶＤＧの関連標的領域の適当なプローブを開発することが本発明の目的であり、該標的領域はＶＤＧの可変領域または保存された領域のいずれかを含むものであり、適当な場合に該プローブは同時ハイブリダイゼーションアッセイに適用可能なものである。さらにより詳細には、ｖａｃＡおよびｃａｇＡ遺伝子の関連標的領域のプローブを開発することが本発明の目的であり、該標的領域は、ｖａｃＡ遺伝子の場合には可変領域を含み、ｃａｇＡ遺伝子の場合には保存された領域を含むものであり、適当な場合に該プローブは同時ハイブリダイゼーションアッセイに適用可能なものである。最も詳細には、ｖａｃＡ遺伝子中の非常に可変的なＳおよびＭ領域を含む適当なプローブを設計することが本発明の目的であり、該Ｓ領域はヌクレオチド位置１から３００までの間に含まれ、該Ｍ領域はヌクレオチド位置１４５０から１６５０までの間に含まれ、好ましくは共通プローブはｃａｇＡ遺伝子の場合にはエイチ・ピロリのｃａｇＡ遺伝子のヌクレオチド位置１７からヌクレオチド位置１１３までの間の非常に保存された領域を含み、適当な場合には同時ハイブリダイゼーションアッセイに適用可能なものである。また、少なくともｖａｃＡ遺伝子を包含する、目的エイチ・ピロリの毒性決定遺伝子の対立遺伝子の関連標的領域の増幅を可能にするプライマーを選択することが本発明の目的であり、該増幅は個々の標的領域に対して普遍的なものであり、該標的領域はＶＤＧの可変領域または保存された領域のいずれかを含むものである。より詳細には、本発明は、エイチ・ピロリのｖａｃＡおよびｃａｇＡ毒性決定遺伝子の対立遺伝子関連標的領域の増幅を可能にするプライマーを選択することが本発明の目的であり、一般的には該プライマーはエイチ・ピロリ株について適用可能であり、適合する増幅条件において該関連標的領域の増幅を可能にするものであり、該増幅は存在するｖａｃＡおよびｃａｇＡ対立遺伝子に対して普遍的なものである。最も詳細には、ｖａｃＡ遺伝子中の非常に可変的なＳおよびＭ領域の増幅を可能にするプライマーを選択することが本発明の目的であり、該Ｓ領域はヌクレオチド位置１から３００までの間に含まれ、該Ｍ領域はヌクレオチド位置１４５０から１６５０までの間に含まれ、非常に保存された領域はエイチ・ピロリのｃａｇＡ遺伝子の読み枠のヌクレオチド位置１から２５０までの間であり、好ましくはそれらは単一の増幅反応に適用可能なものである。また、エイチ・ピロリ株の検出および／または型決定のためのキットを提供することも本発明の目的である。より詳細には、少なくともｖａｃＡ遺伝子を包含する、存在している毒性決定遺伝子の対立遺伝子の検出および／または型決定に直接連結した、エイチ・ピロリ株の検出および／または型決定のためのキットを提供することが本発明の目的である。さらに詳細には、存在しているｖａｃＡおよびｃａｇＡ遺伝子の対立遺伝子の検出および／または型決定に基づいた、エイチ・ピロリ株の検出および／または型決定のためのキットを提供することが本発明の目的である。最も詳細には、エイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子中の非常に可変的なＳおよびＭ領域ならびにｃａｇＡ遺伝子のヌクレオチド位置１からヌクレオチド位置２５０までの間の非常に保存された領域を検出および／または型決定することに基づいた、エイチ・ピロリ株の検出および／または型決定のためのキットを提供することが本発明の目的である。本発明のすべての目的は後に説明する特定の具体例と合致したものである。本発明によるプローブ（配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３５から３９までのプローブを除く）の選択はラインプローブアッセイ（Line Probe Assay(LiPA)）の原理に基づくものであり、実施例セクションにおいて説明する。ＬｉＰＡは、固体支持体片上に平行線状に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる逆ハイブリダイゼーションアッセイである（Stuyver et al．1993；国際出願ＷＯ９４／１２６７０）。この方法は迅速かつ簡単であるので、特に有利である。逆ハイブリダイゼーション形式、より詳細にはＬｉＰＡ法は、特に、関連した必要な情報を得るためにプローブの組み合わせを用いることが好ましいかまたは不可避な場合に、他のＤＮＡ法またはハイブリダイゼーション形式と比較して多くの実際面での利点を有する。そのようなものとして、ＬｉＰＡは一般的な（微）生物およびエイチ・ピロリを検出または／型決定するための特に適切な方法である。実施例８に示すように、配列番号：３５から３９までのプローブはＤＮＡエンザイムイムノアッセイに使用するように設計されている。このアッセイは迅速検出法には特に便利である。しかしながら、本明細書においてさらに説明される選択プローブを用いる他のタイプのハイブリダイゼーションアッセイまたはハイブリダイゼーション形式もまた、本発明に含まれることが理解されよう。逆ハイブリダイゼーション法においては、プローブが固体支持体上に固定化され、生成したハイブリッドの検出を可能にするために標的ＤＮＡが標識される。以下の定義は本明細書において使用される用語および表現の説明に役立つ。本発明の試料中の標的物質はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡまたはそれらの増幅物であってもよい。これらの分子はポリ核酸とも称される。関連標的領域は、原理的には、毒性決定遺伝子を含むすべてのポリ核酸配列であり、該毒性決定遺伝子はエイチ・ピロリの感染性および／または病原性を可能にし、決定し、有効ならしめることに関連した遺伝学的エレメントであり、より詳細には、毒性決定遺伝子ｖａｃＡおよびｃａｇＡ、さらに詳細には、ｃａｇＡ遺伝子中の保存された領域を含むすべてのポリ核酸配列であり、該保存された領域は異なるエイチ・ピロリ株の対立遺伝子間において、最も詳細には、ｖａｃＡ遺伝子の可変的なＳおよびＭ領域において９５％以上同一な領域と定義される。可変配列のほかに、ｖａｃＡ遺伝子のＳ領域は保存された配列を含み、それらは本発明によるエイチ・ピロリの型決定を行わずにエイチ・ピロリの検出を行うための標的領域として使用できる。「プローブ」は、検出すべき標的配列に相捕的な配列を有するオリゴヌクレオチドに特異的な１本鎖配列をいう。本明細書の用語「相捕的」は、１本鎖プローブの配列が１本鎖標的の配列に正確にハイブリダイゼーションすることを意味し、標的は検出すべき変異が存在する配列として定義される。本発明は単一の塩基対ミスマッチの検出を必要とするので、原理的には、正確に相捕的な配列のハイブリダイゼーションのみを可能にする非常に厳密なハイブリダイゼーション条件が要求される。しかしながら、プローブ長さの変化が可能であり（下記参照）、プローブの中央部分がそのハイブリダイゼーション特性に必要であるので、長いプローブ配列を用いる場合にはプローブの頭部側および尾部側において標的配列に対するプローブ配列の可能な変化が可能である。しかしながら、当該分野における通常の知識から考えられるこれらの変化は、正確に相捕的なプローブと比較して等価なハイブリダイゼーションが起こるかどうかについて常に実験的に評価されるべきである。好ましくは、プローブは約５ないし５０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約１０ないし２５ヌクレオチドの長さである。本発明に使用されるヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびイノシンのごとき修飾ヌクレオチドまたは本質的にはハイブリダイゼーション特性を変化させない修飾基を含むヌクレオチドであってもよい。本明細書においてはプローブ配列を１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして５ ’末端から３’末端へと示す。下記プローブをそれ自体、またはその相捕的形態、またはＲＮＡ形態（ＴがＵに置き換わる）として使用できることは当業者に明らかである。対応ヌクレオチド配列を含有するインサートを含む組み換えプラスミドのクローニングにより本発明プローブを調製することができ、必要ならば、適当な制限酵素を用いてクローン化プラスミドから対応ヌクレオチド配列を開裂させ、例えば分子量による分画によりそれらを回収することもできる。例えば、慣用的なホスホトリエステル法により本発明プローブを化学合成することもできる。用語「固体支持体」は、オリゴヌクレオチドプローブを結合しうる物質をいうが、オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーション特性を維持し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低いままであることを条件とする。通常には、固体支持体はマイクロタイタープレート、膜（例えばナイロンまたはニトロセルロース）または微小球（ビーズ）またはチップである。膜の使用または固定化の前に、核酸プローブを修飾して固定化を容易にし、あるいはハイブリダイゼーション効率を向上させるのが便利である。かかる修飾としては、ホモポリマーテイリング、脂肪族基、ＮＨ₂基、ＳＨ基、カルボキシル基のごとき異なる反応性基とのカップリング、またはビオチン、ハプテンもしくは蛋白とのカップリングが挙げられる。用語「標識された」は、標識核酸の使用をいう。Saiki et al（1988）またはB ej et al(1990)により説明されているように増幅のポリメラーゼ工程を行っている間に標識ヌクレオチドを取り込ませることにより、あるいは標識プライマーにより、あるいは当業者に知られた他の方法により標識を行うことができる。標識の性質は同位元素（³²Ｐ、³⁵Ｓ等）であっても同位元素でないもの（ビオチン、ジゴキシゲニン等）であってもよい。用語「プライマー」は、コピーされる核酸鎖に相捕的なプライマー伸長生成物の合成開始点として作用しうる１本鎖オリゴヌクレオチド配列をいう。プライマーの長さおよび配列は伸長生成物の合成を開始させるようなものでなくてはならない。好ましくは、プライマーは約５〜５０ヌクレオチドの長さである。個々の長さおよび配列は必要なＤＮＡまたはＲＮＡ標的の複雑さならびに温度およびイオン強度のごときプライマー使用条件に依存するであろう。正しい増幅を保証するには増幅プライマーが対応鋳型配列に正確に対合する必要はないという事実は、文献に十分に示されている（Kwok et al,．1990）。用いる増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Saiki et al.，1988）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Landgren et al.，1988;Wu&Wallace，1989;Barany ，1991）、核酸配列に基づく増幅（NASBA;Guatelli et al.，1990;Compton，199 1）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ；Kwoh et al.，1989）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Duck，1990;Walker et al.，1992）またはＱβレプリカーゼによる増幅(Lizza rdi et al，1988;Lomeli et al.，1989)または当該分野で知られた他の核酸増幅方法のいずれであってもよい。プライマーまたはプローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（Matsukura et al.，1987）、アルキルホスホロチオエート（Miller e t al.，1979）またはペプチド核酸（Nielsen et al.，1991;Nielsen et al.，19 93）であってもよく、あるいは挿入剤（intercalating agents）を含むもの（As seline et al.，1984）であってもよい。本発明のもとのＤＮＡ配列中に導入される大部分の他の変化または修飾に関しては、これらの変化は、オリゴヌクレオチドを用いて必要な特異性および感度を得るべき条件に関して適用可能なものであろう。しかしながら、ハイブリダイゼーションの最終結果は未修飾オリゴヌクレオチドを用いて得られるものと本質的に同じであろう。オリゴヌクレオチド分子のハイブリダイゼーション反応動力学、ハイブリッド生成の可逆性、生物学的安定性等のごとき特性に積極的に影響させるには、これらの修飾の導入は有利でありうる。「試料」は、感染したヒト（または動物）から直接取ったもの、あるいは培養後のもの、あるいは他の環境から集めたもののいずれであってもよい。生物学的材料は、例えばいずれかの種類の吐出物、気管支洗浄物、血液、皮膚、組織、生検試料、リンパ球、血液培養物、コロニー、液体培養物、土壌、糞便試料、尿、表面水等であってもよい。本発明プローブは、同じハイブリダイゼーション条件下で最適に作動するように設計され、その結果、同時ハイブリダイゼーション用にそれらをセットにして使用することができる。このことはこれらのプローブの有用性を非常に向上させ、時間および労力の有意な節約をもたらす。明らかに、他のハイブリダイゼーション条件を用いる場合、末端部においてヌクレオチド数を増減させることによりすべてのプローブを適合させなければならない。これらの付随する適合は本質的に同じ結果を生じるはずであり、すなわち個々のプローブが一定の標的に特異的にハイブリダイゼーションするはずである。ＮＡＳＢＡ系のように増幅された物質がＲＮＡであってＤＮＡでない場合に、かかる適合は不可避であろう。所望特性を有するプローブの設計には、当業者に知られた下記の有用な指針を適用することができる。本明細書に記載するような配列番号：反応の程度および特異性は因子の数により影響されるので、１またはそれ以上のそれらの因子の取り扱いにより個々のプローブ（完全に相捕的であるか否かにかかわらず）の正確な感度および特異性が決定される。本発明においてさらに説明する種々のアッセイ条件の重要性および影響は当業者に知られている。第１に、アッセイ条件に適合するように［プローブ：標的］核酸ハイブリッドの安定性を選択すべきである。長いＡＴ豊富配列を避けることにより、Ｇ：Ｃ塩基対でハイブリッドを終結させることにより、そしてプローブのＴｍを適当な値に設計することによりこれを行うことができる。長さおよびＧＣ％を調節してＴｍが最終アッセイを行う温度よりも約２〜１０℃高くなるようにプローブの始点および終点を選択すべきである。さらなる水素結合によりＧ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ塩基対よりも熱安定性が高いのでプローブの塩基組成は重要である。よって、高いＧ−Ｃ含量の相捕的核酸を用いるハイブリダイゼーション物は高温でも安定であろう。プローブが使用されるイオン強度およびインキュベーション温度のごとき条件も、プローブ設計に際して考慮すべきである。反応混合物のイオン強度が増加するにつれハイブリダイゼーションが増加し、イオン強度の増加とともにハイブリッドの熱安定性が増大することが知られている。一方、ホルムアミド、尿素、ＤＭＳＯおよびアルコール類のごとき化学試薬は水素結合を破壊し、ハイブリダイゼーションの厳密さを上昇させるであろう。かかる試薬による水素結合の脱安定化によりＴｍが大幅に低下しうる。一般的には、長さ約１０〜５０塩基の合成オリゴヌクレオチドプローブの最適ハイブリダイゼーションは生じる２本鎖の融解温度よりも約５℃低い温度で起こる。最適温度以下でのインキュベーションはミスマッチ塩基をハイブリダイゼーションさせる可能性があり、それゆえ特異性が低くなる可能性がある。厳密さの高い条件でのみハイブリダイゼーションするプローブを持つことが望ましい。高い厳密さの条件下では非常の相捕的な核酸ハイブリッドが生じ、十分な程度の相補性のないハイブリッドは生じないであろう。したがって、アッセイ条件の厳密さは、ハイブリッドを生じる２つの核酸鎖間に必要な相補性を決定する。生成したハイブリッドと標的核酸および生成したハイブリッドと非標的核酸の間の安定性の相異が最大となるように厳密さの程度を選択する。第２に、［プローブ：非標的］核酸ハイブリッドの安定性を最小にするようにプローブを置くべきである。非標的生物に対する完全に相捕的な部分の長さを最短にすることにより、非標的配列に対して相同性のあるＧＣ豊富領域を避けることにより、そしてできるかぎり多くの脱安定化ミスマッチをまたぐようにプローブを配置することによりこれを行うことができる。プローブ配列が特定タイプの生物のみの検出に有用であるかどうかは、［プローブ：標的］ハイブリッドおよび［プローブ：非標的］ハイブリッドの間の熱安定性の相違に大きく依存する。プローブの設計に際して、これらのＴｍ値の相違をできるかぎり大きくすべきである（例えば少なくとも２℃、好ましくは５℃）。標的核酸配列の長さ、したがってプローブ配列の長さも重要でありうる。いくつかの場合、種々の位置および長さの個々の領域由来のいくつかの配列が存在する可能性があり、それより所望ハイブリダイゼーション特性を有するプローブが得られるであろう。他の場合において、たった１個の塩基の相違により、ある配列が他の配列よりも有意に良好なものとなる可能性がある。完全には相捕的でない核酸がハイブリダイゼーションすることは可能であるが、通常には、主として最長の完全に相捕的な塩基配列がハイブリッドの安定性を決定するであろう。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよいが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプローブは約５なし５０塩基（より詳細には１０〜２５塩基）の長さであり、標的核酸配列に対して完全に相捕的な十分な長さの鎖を配列中に有するものである。第３に、ハイブリダイゼーションを阻害する強固な内部構造を形成することが知られている標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の領域はあまり好ましくない。同様に、過度の自己相補性を有するプローブも避けるべきである。上で説明したように、ハイブリダイゼーションは相捕的核酸の２つの１本鎖の会合であり、水素結合した２本鎖を形成するものである。２つの鎖の一方が全体的または部分的にハイブリッドに含まれている場合、それは新たなハイブリッドの形成にはあまり関与しないであろう。十分な自己相補性がある場合には、特定のタイプのプローブ分子において分子内および分子間ハイブリッドが形成されうる。かかる構造は注意深いプローブ設計によって避けることができる。目的配列の重要部分が１本鎖になるようにプローブを設計することにより、ハイブリダイゼーション速度および程度を大いに増加させることができる。コンピュータープログラムを利用してこのタイプの相互作用を検索することができる。しかしながら、ある場合には、このタイプの相互作用は不可避であるかもしれない。本発明は、その最も一般的な形態において、試料中に存在するヘリコバクター・ピロリ（エイチ・ピロリ）株の検出および／または型決定のための方法であって、下記工程：（ｉ）必要ならば試料中のポリ核酸を遊離させ、単離し、あるいは濃縮し；（ｉｉ）適当なプライマーペアーを用いてｖａｃＡ遺伝子あるいは他の毒性決定遺伝子（ＶＤＧ）の関連標的領域のポリ核酸を増幅し（一般的には該プライマーは異なるエイチ・ピロリ株に対して適用可能であり、適合する増幅条件においてＶＤＧの該関連標的領域を優先的に増幅可能にするものである）；（ｉｉｉ）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において、（ｉ）または（ｉｉ）で得られたポリ核酸を、少なくとも２種のＶＤＧ由来のプローブからなるセットとハイブリダイゼーションさせ（該プローブのうち少なくとも１種はエイチ・ピロリのＶＤＧの保存された領域にハイブリダイゼーションし、該プローブのうち少なくとも１種はｖａｃＡの可変領域にハイブリダイゼーションする）；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において形成されたハイブリッドを検出し；（ｖ）工程（ｉｖ）において得られたディファレンシャルハイブリダイゼーションシグナルから、試料中に存在するエイチ・ピロリを検出および／または型決定するを含む方法を提供する。該型決定は、個々のエイチ・ピロリ株中に存在するＶＤＧ対立遺伝子に応じた株の対立遺伝子特異的検出である。該毒性決定遺伝子は、エイチ・ピロリ株の感染性および／または病原性を可能にし、決定し、有効ならしめることに関与する遺伝学的エレメントである。該方法を「検出／型決定法」という。関連標的領域はエイチ・ピロリに特徴的な毒性決定遺伝子を含むポリ核酸配列由来のものであり、該関連標的領域はＶＤＧ中の保存された領域であるかまたはＶＤＧの可変領域のいずれかである。毒性決定遺伝子の関連標的領域は、試料中のエイチ・ピロリ株中のＶＤＧの存在を検出することを可能にする既知ＶＤＧ中の保存された領域、あるいは試料中に存在するエイチ・ピロリの型決定を可能にする既知ＶＤＧ中の可変領域のいずいれかである。本発明の好ましい具体例によれば、適当な増幅またはハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で使用した場合に所望の増幅またはハイブリダイゼーション結果を示すように慎重に設計されたプライマーおよびプローブを用いて工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を行う。より詳細には、本発明は、慢性活性胃炎および／または胃および十二指腸の潰瘍および／または胃のアデノカルシノーマおよび／または粘膜関連リンパ組織のリンパ腫の発症、および／または撲滅療法の決定に関して試料中に存在するエイチ・ピロリ株を検出および／または型決定する方法を提供する。ｃａｇＡ遺伝子およびｖａｃＡ遺伝子はエイチ・ピロリの毒性決定遺伝子の典型例である。ｃａｇＡ遺伝子の対立遺伝子の関連する保存された標的領域を用いて試料中のエイチ・ピロリ株中の好ましくは遺伝子の存在を検出することができる。さらに、ｖａｃＡ遺伝子の対立遺伝子中の同定された可変領域を用いて、対立遺伝子特異的なやり方で個々のエイチ・ピロリ株を型決定することもできる。好ましくは、ｃａｇＡ遺伝子の対立遺伝子の該保存された標的領域は読み枠の位置１から位置２５０までのヌクレオチドにまたがる領域を含む（番号付けはGenb ank受託番号Ｌ１１７４１（ＨＥＣＭＡＪＡＮＴ）またはＸ７００３９（ＨＰＣＡＩ）による）。また、好ましくは、ｖａｃＡ遺伝子の対立遺伝子の同定された可変領域はｖａｃＡ遺伝子の同定されたＳおよびＭ領域を含み、該Ｓ領域はヌクレオチド位置１から３００までの間に含まれ、該Ｍ領域はヌクレオチド位置１４５０から１６５０までの間に含まれる（番号付けはGenbank受託番号Ｕ０５６７６またはＵ２９４０１による）。標準的ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、例えば、５０℃における２ＸＳＳＣ（ソジウムセイラインシトレート）、０．１％ＳＤＳである。他の溶液（ＳＳＰＥ（ソジウムセイラインホスフェートＥＤＴＡ））、ＴＭＡＣｌ（塩化アンモニウムテトラメチル）等）および他の温度を用いてプローブの特異性および感度を維持してもよい。必要ならば、プローブの長さまたは配列をわずかに変更して、一定条件における特異性および感度を維持してもよい。適当なプライマーを、例えば、下記のプライマーのリストから選択することができる。より好ましい具体例において、上記の工程（ｉｉ）からのポリ核酸を少なくとも２、３、４、５種またはそれ以上のｃａｇＡまたはｖａｃＡ由来のプローブとハイブリダイゼーションさせ、プローブはそれぞれｃａｇＡ遺伝子の保存された領域およびｖａｃＡ遺伝子の可変領域をカバーする。また、より好ましい具体例において、上記の工程（ｉ）および（ｉｉ）からのポリ核酸を、ｖａｃＡ遺伝子の対立遺伝子の少なくとも１つの同定された可変領域に指向された少なくとも１種のｖａｃＡ由来のプローブ、好ましくは配列番号：２ないし１１および２８ないし３４のｖａｃＡ由来のプローブとハイブリダイゼーションさせる。対立遺伝子特異的プローブを包含する上記のすべてのプローブはエイチ・ピロリの特定の毒性決定遺伝子、より好ましくはｃａｇＡ遺伝子またはｖａｃＡ遺伝子の配列中に含まれ、該プローブはｃａｇＡ遺伝子の保存された領域を含むか、あるいはｖａｃＡ遺伝子の可変領域を含むということを強調すべきである。好ましくは、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件において使用できるようにプローブを設計する。好ましくは、両方の判断基準は、単一の増幅およびハイブリダイゼーション工程が試料中に存在するエイチ・ピロリ株の検出および型決定を同時に行うに十分であるということを包含する。より詳細には、本発明は、工程（ｉｉ）が適当なプライマーのセットを用いてｖａｃＡおよびｃａｇＡ遺伝子中の関連標的領域のポリ核酸を増幅することからなる上記方法に関し、一般的には、該プライマーは異なるエイチ・ピロリ株に適用可能であり、適合する増幅条件下において該関連標的領域の増幅を可能にするものであり、該標的領域はｃａｇＡ対立遺伝子の場合には保存された領域であり、ｖａｃＡ対立遺伝子の場合には可変領域であり、好ましくは、該プライマーのセットは下表１に示すプライマーのリスト： cagF (SEQ ID NO12) cagR (SEQ ID NO13) VA1XR (SEQ ID NO14) VA1F (Atherton et al，1995) M1F (SEQ ID NO15) M1R (SEQ ID NO16) HPMGF (SEQ ID NO 17) HPMGR (SEQ ID NO 18) cagSF (SEQ ID NO 19) cagSR (SEQ ID NO 20) cagFN1 (SEQ ID NO 21) cagRN1 (SEQ ID NO 22) VAMSFb (SEQ ID NO 23) VAMSFc (SEQ ID NO 24) VAMSFd (SEQ ID NO 25) VAMSFe (SEQ ID NO 26) またはそれらの配列変種から選択され、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであってもよく、あるいはまた該変種は上記オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの相補物からなるものであってもよく、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであってもよいが、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーション／増幅しうることが条件となる。プライマーｃａｇＦおよびｃａｇＲはｃａｇＡ対立遺伝子の２つの公表された配列（Cocacci et al.，1993;Tummuru et al.，1993）に由来する。本発明は、図１０に示される（実施例５も参照）ｃａｇＡ蛋白のＮ−末端のアミノ酸１４９〜１５４をコードする新規核酸配列を提供する。これらの新規配列に基づいて、ｃａｇＡ遺伝子の関連標的領域を増幅するための改良されたプライマーを設計した。これらのプライマーは： cagSF(順方向) (SEQ ID NO 19) cagSR(逆方向) (SEQ ID NO 20) である。これらのプライマーの配列を表１に示す。図１０に示す配列を並置比較して調べると、プライマーｃａｇＳＦおよびｃａｇＳＲは東アジアから単離されたポリ核酸にはハイブリダイゼーションしないことが示されるであろう。それゆえ、さらに改良されたプライマーを設計したならば、これらの配列の増幅が可能になるであろう。これらのプライマーは： cagFN1(順方向)(SEQ ID NO 21) cagRN1(逆方向)(SEQ ID NO 22) である。これらのプライマーの配列を表１に示す。もちろん、東アジアから単離されたポリ核酸の増幅が必要ない場合にも、プライマーｃａｇＳＦおよびｃａｇＳＲを使用できる。プライマーＭ１Ｆ、Ｍ１Ｒ、ＨＰＭＧＦおよびＨＰＭＧＲはｖａｃＡ遺伝子のＭ領域の配列に基づくものであり、図２および３に示され、該配列は本発明により提供されるものである。次の例において、本発明は図１４に示す、Ｍ領域に関するさらなる配列を開示する（実施例７参照）。これらの配列に基づいて、改良された順方向プライマーを設計した。好ましくは、逆方向プライマーＭ１Ｒと組み合わせて、該プライマーをプライマーＭ１Ｆのかわりに使用する。これらのプライマーは： VAMSFb(順方向） (SEQ ID NO 23) VAMSFc(順方向） (SEQ ID NO 24) VAMSFd(順方向） (SEQ ID NO 25) VAMSFe(順方向） (SEQ ID NO 26) である。これらのプライマーの配列を表１に示す。最大数の単離体からポリ核酸の増幅物を得るためには、プライマーＶＡＭＳＦｂ、ＶＡＭＳＦｃ、ＶＡＭＳＦｄおよびＶＡＭＳＦｅを組み合わせてＰＣＲ反応に使用すべきである。好ましい具体例によれば、本発明は、工程（ｉｉｉ）が適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において工程（ｉｉ）で得たポリ核酸をプローブのセットとハイブリダイゼーションさせることからなる上記方法にも関し、好ましくは該プローブのセットは同時ハイブリダイゼーションアッセイに適用可能であり、エイチ・ピロリのｃａｇＡ遺伝子の保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブおよびエイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子の可変領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブを含み、より好ましくは、該プローブのセットは表２および図２ないし３に示す、下記ｃａｇＡおよびｖａｃＡ由来のプローブ：ｃａｇＡ由来のプローブ： cagApro (SEQ ID NO1) cagprobe3 (SEQ ID NO 27)ｖａｃＡ由来のプローブ： P1S1 (SEQ ID NO2) P22S1a (SEQ ID NO3) P1S1b (SEQ ID NO4) P2S1b (SEQ ID NO5) P1S2(VAS2) (SEQ ID NO6) P2S2 (SEQ ID NO7) P1M1 (SEQ ID NO8) P2M1 (SEQ ID NO9) P1M2 (SEQ ID NO10) P2M2 (SEQ ID NO11) P3S1 (SEQ ID NO 28) P4S1 (SEQ ID NO 29) P1M1new (SEQ ID NO 30) P2M1new (SEQ ID NO 31) P1M2new (SEQ ID NO 32) P2M2new (SEQ ID NO 33) P1M3 (SEQ ID NO 34) またはそれらの配列変種の少なくとも１種を含み、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであってもよく、あるいはまた該変種は上記オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの相補物からなるものであってもよく、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであってもよいが、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうることが条件となる。プローブｃａｇＡｐｒｏはｃａｇＡ対立遺伝子の公表された配列(Covacci et al.，1993；Tummuru et al.，1993)に由来した。本発明により提供されるｃａｇＡ遺伝子の上記新規配列（図１０）に基づいて、下記改良プローブを設計した： cagprobe3 (SEQ ID NO 27)．このプローブの配列を表２に示す。プローブＰ１Ｓ１、Ｐ２２Ｓ１ａ、Ｐ１Ｓ１ｂ、Ｐ２Ｓ１ｂ、Ｐ１Ｓ２およびＰ２Ｓ２は、本発明により提供されるｖａｃＡ遺伝子のＳ領域（図２）の配列に基づく。これらのプローブはそれぞれｓ１ａ、ｓ１ｂおよびｓ２変種を認識するように設計されている。次の例において、図１２に示すように、ｖａｃＡ遺伝子のＳ領域の配列の大きなコレクションが本発明により開示される（実施例６も参照）。これらの新規配列を並置比較して調べ、さらに系統発生額的分析（図１３）を行うと、既知変種ｓ１ａおよびｓ１ｂ以前知られていなかったｓ１変種の存在が明らかである。この以前知られていなかった変種は本発明により開示され、ｓ１ｃと命名される。また本発明は、ｓ１ｃ変種への特異的ハイブリダイゼーションを可能にする新規プローブを提供する。これらのプローブは： P3s1 (SEQ ID NO 28) P4s1 (SEQ ID NO 29)．である。これらのプローブの配列を表２に示す。プローブＰ１Ｍ１、Ｐ２Ｍ１、Ｐ１Ｍ２およびＰ２Ｍ２は、本発明により提供されるｖａｃＡ遺伝子のＭ領域の配列に基づくものであり、図３に示される。これらのプローブは、ｍ１およびｍ２変種に特異的にハイブリダイゼーションするように設計されている。実施例７に示すように、本発明により提供されるＭ領域の多数の配列を並置比較すると、ｍ１およびｍ２変種とは異なる３つの配列の存在が明らかである（図１４）。本発明によれば、この変種はｍ３と命名される。図１４に示すＭ領域の配列に基づいて新規プローブを設計した。これらのプローブは： P1M1new (SEQ ID NO 30) P2M1new (SEQ ID NO 31) P1M2new (SEQ ID NO 32) P2M2new (SEQ ID NO 33) である。プローブＰ１Ｍ１ｎｅｗおよびＰ２Ｍ１ｎｅｗは、一緒に使用した場合、図１４に示すすべてのｍ１配列に特異的にハイブリダイゼーションできるという点で、プローブＰ１Ｍ１およびＰ２Ｍ１の改良物である。同様に、プローブＰ１Ｍ２ｎｅｗおよびＰ２Ｍ２ｎｅｗは、図１４に示すすべてのｍ２配列に特異的にハイブリダイゼーションする改良プローブである。さらに、上記ｍ３配列に特異的にハイブリダイゼーションする新規プローブも提供される。このプローブは： P1M3 (SEQ ID NO 34)．である。プローブＰ１Ｍ１ｎｅｗ、Ｐ２Ｍ１ｎｅｗ、Ｐ１Ｍ２ｎｅｗ、Ｐ２Ｍ２ｎｅｗおよびＰ１Ｍ３の配列を表２に示す。もう１つの具体例によれば、本発明は、試料中に存在するエイチ・ピロリ株の検出方法であって、下記工程：（ｉ）必要ならば、試料中のポリ核酸を遊離させ、単離し、または濃縮し；（ｉｉ）適当なプライマーペアーを用いてｖａｃＡ遺伝子の関連標的領域のポリ核酸を増幅し（一般的には、該プライマーペアーは異なるエイチ・ピロリ株に適用可能であり、適合する増幅条件下において優先的にｖａｃＡ遺伝子の該関連標的領域の増幅を可能にするものである）；（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）で得られたポリ核酸を、ｖａｃＡ遺伝子の保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブにハイブリダイゼーションさせ；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で生成したハイブリッドを検出し；（ｖ）工程（ｉｖ）で得られたハイブリダイゼーションシグナルから、試料中のエイチ・ピロリの存在または不存在を決定するを含む方法に関する。該方法は「検出方法」と呼ばれる。好ましい具体例によれば、本発明は、上記具体例による方法に関し、該方法において、工程（ｉｉ）は、適当なプライマーを用いてｖａｃＡ遺伝子中の関連標的領域のポリ核酸を増幅することからなり、一般的には該プライマーは異なるエイチ・ピロリ株に適用可能であり、適合する増幅条件下において該関連標的領域の増幅を可能にするものであり、該標的領域は保存された領域であり、好ましくは該プライマーはＶＡ１ＦおよびＶＡ１ＸＲ（配列番号：１４）またはそれらの配列変種であり、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであってもよく、あるいはまた該変種は上記オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの相補物からなるものであってもよく、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであってもよいが、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーション／増幅しうることが条件となる。さらに好ましい具体例によれば、本発明は、２つの上記具体例によるいずれの方法にも関連しており、該方法において、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）で得られたポリ核酸を、適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下においてプローブのセットとハイブリダイゼーションさせることからなり、好ましくは該プローブのセットは同時ハイブリダイゼーションアッセイに適用可能であり、エイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子の保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブを含み、より好ましくは、該プローブのセットは下記のｖａｃＡ由来のプローブ： HpdiaS1 (SEQ ID NO 35) HpdiaS2 (SEQ ID NO 36) HpdiaS3 (SEQ ID NO 37) HpdiaS4 (SEQ ID NO 38) HpdiaS5 (SEQ ID NO 39) またはそれらの配列変種の少なくとも１種を含み、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであってもよく、あるいはまた該変種は上記オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの相補物からなるものであってもよく、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであってもよいが、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうることが条件となる。もう１つの具体例によれば、本発明は、上記のいずれかの検出／型決定方法において使用するプローブ組成物に関し、該組成物は、エイチ・ピロリのＶＤＧの保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブ、およびｖａｃＡの可変領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブを含み、より好ましくは、該エイチピロリのｖａｃＡおよび／またはｃａｇＡ遺伝子のポリ核酸配列由来のものであり、最も好ましくは、該プローブは配列番号：１ないし１１および２７ないし３４、またはそれらの配列変種から選択され、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであってもよく、あるいはまた該変種は上記オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの相補物からなるものであってもよく、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであってもよいが、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうることが条件となる。もう１つの具体例によれば、本発明は、上記のいずれかの検出方法において使用するプローブ組成物に関し、該組成物は、エイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子の保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブを含み、最も好ましくは、該プローブは配列番号：３５または３９またはそれらの配列変種から選択され、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであってもよく、あるいはまた該変種は上記オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの相補物からなるものであってもよく、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであってもよいが、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうることが条件となる。もう１つの具体例において、本発明は、個々のＶＤＧの関連標的領域のポリ核酸の増幅を可能にする少なくとも１種の適当なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを含む組成物に関し、一般的には、該適当なプライマーは異なるエイチ・ピロリ株について適用可能であり、適合する増幅条件において使用された場合該関連標的領域の増幅を可能にするものであり、より好ましくは該プライマーはｃａｇＡ遺伝子の保存された領域ならびに保存された標的領域および／または可変標的領域を含むｖａｃＡ遺伝子の領域の増幅を可能にするものであり、最も好ましくは、該プライマーは配列番号：１２ないし２６またはそれらの配列変種から選択されるものであり、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであってもよく、あるいはまた該変種は上記オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの相補物からなるものであってもよく、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであってもよいが、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうることが条件となる。さらに特別な具体例によれば、本発明は、エイチ・ピロリのｖａｃＡおよび／またはｃａｇＡ遺伝子のポリ核酸配列由来のプローブに関し、該プローブは配列番号：１ないし１１および２７ないし３９またはそれらの配列変種から選択され、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであってもよく、あるいはまた該変種は上記オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの相補物からなるものであってもよく、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであってもよいが、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうることが条件となる。さらにもう１つの好ましい具体例によれば、本発明は、エイチ・ピロリのｃａｇＡ遺伝子の領域またはｖａｃＡ遺伝子の領域の増幅を可能にするオリゴヌクレオチド増幅プライマーに関し、該プライマーは配列番号：１２ないし２６またはそれらの配列変種から選択され、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’ ）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであってもよく、あるいはまた該変種は上記オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの相補物からなるものであってもよく、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであってもよいが、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーション／増幅しうることが条件となる。もう１つの具体例によれば、本発明は、試料中に存在するエイチ・ピロリのＶＤＧの対立遺伝子、より好ましくはエイチ・ピロリのｃａｇＡおよびｖａｃＡ遺伝子の対立遺伝子の検出および／または型決定のための上記方法であって、該対立遺伝子を検出し、そして／または増幅し、そして／または型決定するために特別に設計されたプローブおよび／またはプライマーのセットを用いる方法に関し、該プローブおよびプライマーは上記のものである。もう１つの具体例によれば、本発明は、試料中に存在するエイチ・ピロリのＶＤＧの対立遺伝子、より好ましくはエイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子の対立遺伝子を検出するための上記方法であって、該対立遺伝子を検出および／または増幅するように特別に設計されたプローブおよび／またはプライマーのセットを用いる方法に関し、該プローブおよびプライマーは上記のものである。試料中に存在するエイチ・ピロリ株の検出および／または型決定を行うために、上記のオリゴヌクレオチドプローブのセットを用い、当該分野で知られたすべてのハイブリダイゼーション法（慣用的なドットブロット、サザンブロット、サンドイッチ、チップによる方法等）を用いることができる。多数のプローブを用いる場合に迅速かつ簡単な結果を得るためには、逆ハイブリダイゼーション形式が最も便利であるかもしれない。好ましい具体例によれば、プローブの選択されたセットが固体支持体上に固定化される。もう１つの好ましい具体例によれば、プローブの選択されたセットが膜片に固定化される。該プローブを個々にまたは混合物として固体支持体上に固定化してもよい。上記好ましい方法の特別かつ非常にユーザーフレンドリーな具体例はＬｉＰＡ法であり、該方法においては、さらに実施例において説明するように上記プローブのセットが平行線状に膜上に固定化される。別法として、慣用的にＤＮＡ酵素イムノアッセイ（ＤＥＩＡ）を用いてエイチ・ピロリ株の型決定を行わない検出を行ってもよい。ｖａｃＡ遺伝子のＳ領域の保存された部分の検出に基づくこのアッセイの原理ならびに適用を実施例８において説明する。上記プローブのいくつかは先行技術においてすでに記載された核酸配列に指向されるものである。しかしながら、実施例において説明するように、エイチ・ピロリの多数の新たな単離体のＶＤＧの核酸配列は本発明において初めて開示されたものであり、エイチ・ピロリ株の検出およびより重要には型決定に適したプローブをうまく設計するのに必要な、貴重な新たな情報を提供するものである。これらの新たなエイチ・ピロリの配列もまた本発明の一部を形成する。そのうえ、他の著者ら（Atherton et al.，1995）により以前に設計されたプライマーおよびプローブは、試料中のエイチ・ピロリの型決定においてあまり適当でないことが実施例において示された。また本発明は、新たな単離体の個々のＶＤＧ対立遺伝子を特異的に検出し増幅するように設計されたプローブおよびプライマーのセットを提供し、さらに試料中に存在するエイチ・ピロリ株の検出および／または型決定において該プライマーまたはプローブを適用するための方法およびキットも提供する。また本発明は、エイチ・ピロリのｃａｇ遺伝子の位置１から２５０までの間のヌクレオチド領域にまたがる保存された領域の増幅を可能にするプライマーのセットを提供する。プライマーのセットは、例えば： cagFおよびcagR（SEQ ID N°11 and 12）を含む。また、本発明は、エイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子の可変的なＳおよび／またはＭ領域をカバーするプライマーのセットを提供し、該Ｓ領域はヌクレオチド位置１から３００までの間に含まれ、可変配列のほかに保存された領域も含み、該Ｍ領域はヌクレオチド位置１４５０から１６５０までの間に含まれ、該プライマーは、例えば： VA1-FおよびVA1-XR（Atherton et al.，1995およびSEQ ID N°15） M1FおよびM1R（SEQ ID N°16および17）である。また本発明は、ＶＤＧ遺伝子、例えばｃａｇＡおよびｖａｃＡ遺伝子の特定領域に指向された上記プライマーを、同じ増幅、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に同時に適用するための方法およびキットを提供する。本発明プライマーを選択した標識（例えばビオチン）で標識してもよい。異なる標的増幅系を用いてもよく、好ましくは実施例において説明するＰＣＲ増幅を用いてもよい。単一ラウンドのＰＣＲまたはネステッドＰＣＲを用いてもよい。さらにもう１つの具体例によれば、本発明は、表面に少なくとも１種の上記プローブを担持した固体支持体、好ましくは膜片に関する。もう１つの具体例によれば、本発明は、エイチ・ピロリを含む可能性のある試料中のエイチ・ピロリを検出および／または型決定するためのキットであって、下記成分： −適宜、少なくとも１種の上記オリゴヌクレオチドプライマー； −少なくとも１種の上記プローブ（好ましくは、適用される該プローブおよび／または他のプローブは固体支持体上に固定化される）； −増幅またはこれらのプローブと増幅生成物との間のハイブリダイゼーション反応を可能にするバッファーまたはバッファーを得るのに必要な成分； −適宜、上記ハイブリダイゼーションにより生じたハイブリッドを検出するための手段を含むキットに関する。用語「ハイブリダイゼーションバッファー」は、適当な厳密さの条件下においてプローブと試料中に存在するポリ核酸または増幅生成物との間にハイブリダイゼーションを起こさせることのできるバッファーを意味する。用語「洗浄溶液」は、適当な厳密さの条件下において生成したハイブリッドの洗浄を可能にする溶液を意味する。また本発明は、エイチ・ピロリの１種またはそれ以上のｖａｃＡ対立遺伝子の検出および／または型決定方法においてプライマーまたはプローブとして使用できる、配列番号：４０ないし９１および配列番号：１１５ないし２７６により定義される単離ｖａｃＡポリ核酸配列またはそれらのフラグメントに関する。また本発明は、エイチ・ピロリの１種またはそれ以上のｃａｇＡ対立遺伝子の検出および／または型決定方法においてプライマーまたはプローブとして使用できる、配列番号：９２ないし１１４により定義される単離ｃａｇＡポリ核酸配列またはそれらのフラグメントにに関する。また本発明は、配列番号：４０ないし９１および配列番号：１１５ないし２７６を有する核酸のいずれかによりコードされるｖａｃＡ蛋白フラグメントまたは該ｖａｃＡ蛋白フラグメントのサブフラグメントに関し、該サブフラグメントはｖａｃＡ蛋白の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の連続したアミノ酸からなる。また本発明は、配列番号:９２ないし１１４を有する核酸のいずれかによりコードされるｃａｇＡ蛋白フラグメントまたは該ｃａｇＡ蛋白フラグメントのサブフラグメントに関し、該サブフラグメントはｃａｇＡ蛋白の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の連続したアミノ酸からなる。下記実施例は本発明の説明に役立ち、本発明を限定するものと解してはならない。本明細書において引用されたすべての文献の内容は参照により本明細書に記載されているものとみなされることにも注意すべきである。図面の説明図１：エイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子のＳおよびＭ領域を図式的に示し、さらに関連プライマーの位置を示したものである。図２ａ：種々のエイチ・ピロリ株のＳ領域Ｓ１ａ／ｂのＤＮＡ配列を並置比較したものである。図２ｂ：種々のエイチ・ピロリ株のＳ領域Ｓ２のＤＮＡ配列を並置比較したものである。図３ａ：種々のエイチ・ピロリ株のＭ領域Ｍ１のＤＮＡ配列を並置比較したものである。図３ｂ：種々のエイチ・ピロリ株のＭ領域Ｍ２のＤＮＡ配列を並置比較したものである。図４：実施例１に示す胃の生検試料１８番由来のＤＮＡおよびプライマーを出発材料として用いた増幅生成物のアガロースゲル電気泳動。図５：実施例１に示す胃の生検試料４１番由来のＤＮＡおよびプライマーを出発材料として用いた増幅生成物のアガロースゲル電気泳動。図６：実施例１に示す胃の生検試料Ｆ６７番由来のＤＮＡおよびプライマーを出発材料として用いた増幅生成物のアガロースゲル電気泳動。図７：実施例１に示す胃の生検試料２５番由来のＤＮＡおよびプライマーを出発材料として用いた増幅生成物のアガロースゲル電気泳動。図８：図中に示すプローブが表１１のものであり、プライマーが実施例３のものである場合のＬｉＰＡのアウトライン。図９：ｖａｃＡならびにｃａｇＡプライマーを用いた多重ＰＣＲ。ｖａｃＡにはプライマーセットＧを用い（図１）、ｃａｇＡにはプライマーｃａｇＦおよびｃａｇＲを用いた。最初の２つのレーンに示す単離体はｓ１およびｍ１対立遺伝子を含み、ｃａｇＡ＋である。レーン４および５（左から数える）に示す単離体は多重感染を含む。図１０：かが蛋白のＮ末端をコードするｃａｇＡ核酸配列を並置比較したものである。いくつかのｃａｇＡプライマーの位置を示す。ハイフンは、最適な並置比較比較を行うために導入されたギャップを示す。下部のアステリスクは同一ヌクレオチドを示す。下部の点は部分的保存を示す。図１１：ｃａｇＡアミノ酸配列の系統発生樹である。上から数えて１６個の配列はヨーロッパおよびオーストラリアで発生した最初の変種である。ＵＳＡ１２３およびＵＳＡ３９はアメリカ合衆国から得た株であり、中ほどの位置を占める。下から数えて７個の配列（ＨＫ７からＨＫＴｈ８８２８まで）は主として極東アジアにおいて見出された変種である。図１２：ｖａｃＡ遺伝子おＳ領域の部分の核酸配列を並置比較したものである。それらが属する変種により配列をグループ分けしてある。図２ａおよび２ｂよりも多くの配列を示す。変種は上から下へ、Ｓ２、ｓ１ｃ、ｓ１ｂおよびｓ１ａである。ハイフンは、その位置でヌクレオチドが２９４０１株の配列中のヌクレオチドと同じであることを示す。点は並置比較比較を行うために導入された配列中のギャップを示す。図１３：ｖａｃＡ蛋白のＳ領域の一部の核酸配列の系統発生学的分析である。変種を示す。図１４：ｖａｃＡ遺伝子のＭ領域の一部の核酸配列を並置比較したものである。図３ａおよび３ｂよりも多くの配列を示す。ハイフンおよび点は図１２と同じ。図１５：ｖａｃＡ蛋白のＭ領域の一部の核酸配列の系統発生学的分析である。変種を示す。実施例実施例１:大規模臨床試験の枠内でのエイチ・ピロリ株の型決定における、Ather ton et al.，1995により記載されたプライマーの使用に関する評価１．１ｖａｃＡ遺伝子型決定法の比較： Atherton et al．(1995)により記載されたｖａｃＡ遺伝子型決定法の有効性を、本発明の有効性と比較した。Athertonにより記載された方法は６つの異なるｐｃＲ反応を含む：Ａ．プライマーＶＡ１ＦおよびＶＡ１Ｒを用いてｓ１およびｓ２対立遺伝子を識別する。Ｂ．プライマーＳＳ１ＦおよびＶＡ１Ｒを用いてｓ１ａ配列を増幅する。Ｃ．プライマーＳＳ３ＦおよびＶＡ１Ｒを用いてｓ１ｂ配列を増幅する。Ｄ．プライマーＳＳ２ＦおよびＶＡ１Ｒを用いてｓ２配列を増幅する。Ｅ．プライマーＶＡ３ＦおよびＶＡ３Ｒを用いてｍ１配列を増幅する。Ｆ．プライマーＶＡ４ＦおよびＶＡ４Ｒを用いてｍ２配列を増幅する。図１は、ｖａｃＡ型決定に使用したすべてのプライマーを図式的に示す。ＰＣＲ生成物の同定はアガロースゲル上のＤＮＡバンドを視覚的に検査することによる。１．２ Atherton系の問題点：Ｓ領域：図２ａおよび２ｂに示すように、ヨーロッパの単離体の配列並置比較によれば、プライマーＳＳ１Ｆ、ＳＳ２Ｆ、およびＳＳ３Ｆがそれぞれの標的配列に対していくつかのミスマッチを含むことが明らかである。このことは正しいアニーリングを妨げ、痕跡程度バンドの増幅生成物しか生じない可能性がある。プライマーＳＳ３Ｆに対する標的配列（ｓ１ｂ対立遺伝子の検出を目的とする）は、いくつかの単離体（例えば、単離体Ｆ６７、Ｆ６８、Ｆ７３、Ｆ７６、Ｆ４２、Ｆ１２）においてプライマーの３’末端における２つの重大なミスマッチを含む。Ｆ６７（下記参照）はプライマーＳＳ１ＦおよびＶＡ１Ｒを用いた場合に増幅を示したが、ＳＳ３ＦおよびＶＡ１Ｒを用いた場合には増幅は陰性であり、ｓ１ａ遺伝子型の存在が示された。しかしながら、ＰＣＲ／ＬｉＰＡ分析により遺伝子型ｓ１ａが示され、配列分析により確認された。ｓ２配列を目的としたプライマーＳＳ２Ｆは特異的なバンドの増幅生成物を示した（例えば、プライマーセットＤの場合には図面写真１および２参照）。Ｍ領域： Atherton et al.，(1995)により記載されたように、Ｍ領域の型決定は、まず、２種の特異的ＤＮＡプローブ、すなわち、それぞれＭ１およびＭ２変種に関するｐＣＴＢ４およびＶＡ６を用いるハイブリダイゼーションによる。６０１９０株（Ｍ１型）およびＴｘ３０ａ株（Ｕ２９４０１；Ｍ２型）由来のｖａｃＡ配列についての公表されたヌクレオチド配列の並置比較から、これら２つのプローブが実質的な変種の領域をカバーすることが明らかである。そのうえ、Ｍ２変種と比較すると、Ｍ１変種は欠失（６０１９０株の配列の位置２３４０付近）を示す。この領域の欠失／挿入（Ｓ領域と同様）がＭ２およびＭ２の識別に非常に重要であることが予想できる。しかしながら、Ｍ１およびＭ２を特異的に検出するためのＰＣＲプライマーはｖａｃＡ遺伝子の異なる領域を目的としており、該領域は下流（６０１９０株の配列の位置２７５０から３０３０の間）にあり、元のＤＮＡプローブではカバーされない。我々は、Ｍ１およびＭ２配列に対する配列の並置比較により個々のＰＣＲプライマーを分析した。我々は、Atherton et al.,により記載されたくつかのプライマーの３’末端がｖａｃＡ遺伝子において完全にはユニークなものではないことに気づいた。プライマーＶＡ３Ｒは下記配列：６０１９０株中（Genbank配列Ｕ０５６７６；ｍ１型）：位置２２９付近（３’末端における６ヌクレオチド）位置８３９付近（３’末端における６ヌクレオチド）位置３０１１付近（標的配列，１００％）位置４６５３付近（３’末端における６ヌクレオチド）Ｔｘ３０ａ株中：位置４２７１付近（３’末端における６ヌクレオチド）に対して相同性を示す。プライマーＶＡ４Ｆは下記配列：Ｔｘ３０ａ株中（Genbank配列Ｕ２９４０１；ｍ２型）：位置２３１付近（３’末端における７ヌクレオチド）位置１９０７付近（３’末端における８ヌクレオチド）位置２２９７付近（標的配列，１００％）位置２５９４付近（３’末端における９ヌクレオチド）に対して相同性を示す。特に、３’末端における相同性はこれらのプライマーの特異性を妨害する。これらのプライマーを用いた場合、いくつかの痕跡バンドが得られた。そのうえ、いくつかの単離体または生検試料においてはこれらのプライマーは増幅生成物を生じなかった（例えば、生検試料４１番、下記参照）。このことは以前に観察されていた（Maeda，S．K．Ogura，M．Ishitom，F．Kanai，H．Yoshida，S．Ota， Y．Shiratori，and M．Omata．abstract # 492:Diversity of Helicobacterpy l orivacA gene in Japaneses trains-high cytotoxin activity sl is dominant in Japan，Digestive Disease Week，San Francisco，May 1996）。我々は、プライマーＨＰＭＧＦおよびＨＰＭＧｒを用いるＰＣＲの後でＤＮＡ配列決定を行うことにより、複数のエイチ・ピロリ株由来のｖａｃＡ対立遺伝子のＭ１およびＭ２領域を分析した（図３ａおよび３ｂ参照）。これらの配列に基づけば、実施例４に記載したように、多重ＰＣＲにおけるｖａｃＡ遺伝子型決定用の新たなプライマーを開発しなければならなかった。１．３比較の結果を図示し、以下に議論する： Atherton et al．(1995)により使用された個々のプライマーをＡ〜Ｆに用いたが、プライマーセットＧは本発明により初めて開示されたＶＡ１Ｆ、ＶＡ１ＸＲ、Ｍ１ＦおよびＭ１Ｒを含む新たに設計されたプライマーを含んでいた。Athert on et al．(1995)により開示されたＶＡ１Ｆを除き、これらのプライマーはすべて新しいものである。生検試料１８番（図４参照） A s1/s2 S1 B s1a + C s1b - D s2 -（注：バックグラウンド） E m1 - F m2 + G 多重 s1/m2 この生検試料から、ｓ１ａ／ｍ２遺伝子型と矛盾しない予想されるフラグメントが増幅された。本明細書記載のＬｉＰＡ後の多重ＰＣＲにより同一結果を得た。生検試料４１番（図５参照） A s1/s2 s1 B s1a + C s1b - D s2 -（注：バックグラウンド） E m1 + F m2 - G 多重 s1/m1 この生検試料からは、Athertonらの方法によりｓ領域のみが型決定された。ｍ１およびｍ２特異的プライマーを用いる増幅によっては目に見えるＤＮＡ生成物は得られなかった。しかしながら、本明細書記載のＬｉＰＡ後の多重ＰＣＲにより、ｓ１ａ、ｍ１遺伝子型が検出された。単離体Ｆ６７（図６参照） A s1/s2 s1 B s1a + C s1b - D s2 +（注：バックグラウンド） E m1 + F m2 - G 多重 s1/m1 ＬｉＰＡにより、ｓ１ａではなくｓ１ｂの存在が示された。このことは配列の分析により確認された。１．４．多重感染の検出生検試料２５番（図７参照） A s1/s2 両方 B s1a - C s1b + D s2 +（注：バックグラウンド） E m1 + F m2 + G 多重 s1/s2/m1/m2 ＬｉＰＡ分析により、ｓ１ｂ／ｓ２／ｍ１／ｍ２混合遺伝子型の存在が明らかとなった。実施例２：エイチ・ピロリのｃｇＡ遺伝子フラグメントの保存された領域の同定および増幅；逆ハイブリダイゼーションによる試料中のエイチ・ピロリ検出のためのプライマーおよびｃａｇＡ由来のプローブの設計ｃａｇＡ遺伝子の場合の逆ハイブリダイゼーションアッセイのセットアップを行うための実験条件の確立は、ｉ）標準的なＤＮＡ分析コンピュータープログラムを用いる核酸配列の比較に基づく適当なプローブおよびプライマーの理論的評価、およびｉｉ）プライマーおよびプローブの実験的評価および逆ハイブリダイゼーション法に適合させるための調整を含む。異なるエイチ・ピロリ株のｃａｇＡ対立遺伝子の２つの公表された核酸配列の比較により、核酸１７から１１３までの領域が非常に保存されており（Covacci et al.，1993；Tummuruetal.，1993）該領域は、ある種のエイチ・ピロリ株中のｃａｇＡ遺伝子の存在の積極的同定に使用可能であることが示された。下記のようにプライマーのセットを設計した： cagF（bp 17 to 40） cagR（bp 178-199）両方のプライマーは本明細書に記載された新しいプライマー配列である（表Ｉ参照）。これらのプライマーを選択した標識（例えばビオチン）で標識することができる。異なるプライマーに基づく標的増幅系を用いてもよい。ＰＣＲを用いる増幅には、上記プライマーｃａｇＦおよびｃａｇＲを用いる単一ラウンド増幅の場合に用いる条件は、１分／９５℃、１分／５５℃、１分／７２℃を４０サイクル、次いで、７２℃で５分間の最終伸長を含む。ＰＣＲ反応混合物は下記のごとし：エイチ・ピロリＤＮＡまたは対照ＤＮＡを含む１μｌのＤＮＡ試料１０μｌの１０ｘポリメラーゼミックス(最終濃度１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ９．０，５０ｍＭＫＣｌ、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ) ２０μｌのデオキシリボヌクレオチドミックス（最終濃度各２００μＭ）１μｌのSuper Taqポリメラーゼ（０．２５Ｕ／μｌ）１μｌの順方向プライマー（５０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）１μｌの逆方向プライマー（５０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）６６μｌの水合計１００μｌ増幅生成物をアガロースゲルで分析し、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ下で可視化した。出発物質として１μｌのエイチ・ピロリＤＮＡおよび上記プライマーを用いて得られた増幅生成物は、分子量約０．１８ｋｂの単一バンドからなり、予想サイズ１８３ｂｐと一致した。ｃａｇ（−）エイチ・ピロリ株または他の細菌種由来のＤＮＡを含む対照試料は増幅生成物を生じなかった(データ示さず)。標準的配列決定法を用いたＤＮＡ配列決定により増幅生成物の均一性を証明した。記載した領域との１００％の対合が示された（データ示さず）。また、逆ハイブリダイゼーションアッセイに用いる標準的ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において上記増幅生成物および該プローブの最適ハイブリダイゼーションを調べるために多くのプローブを試験した。表ＩＩに示すリストから下記の試験プローブを選択した。実施例３に記載のごとく該プローブを固体支持体上に固定化した。上記プライマーを用いて得た増幅生成物を、実施例３記載の条件と同じ条件で個々のプローブとハイブリダイゼーションさせた。プローブｃａｇＡｐｒｏ（配列番号：１２）を用いた場合最適結果が得られ、該プローブは、下記の逆ハイブリダイゼーションアッセイの条件下において上記プライマーと組み合わせて、エイチ・ピロリ株のｃａｇＡ遺伝子の存在を積極的に同定するプローブとして用いることができる。実施例３：エイチ・ピロリ中のｖａｃＡ遺伝子の可変標的領域の同定および増幅；逆ハイブリダイゼーションによる試料中のエイチ・ピロリの検出および／または型決定のためのプライマーおよびｖａｃＡ由来のプローブの設計ｃａｇＡ遺伝子の場合の逆ハイブリダイゼーションアッセイのセットアップを行うための実験条件の確立は、ｉ）標準的なＤＮＡ分析コンピュータープログラムを用いる核酸配列の比較に基づく適当なプローブおよびプライマーの理論的評価、およびｉｉ）種々の領域の実験的増幅、個々の増幅フラグメントのＤＮＡ配列の分析、対立遺伝子特異的プローブおよび適当なプライマーの設計、ならびにプライマーおよびプローブを評価し、逆ハイブリダイゼーション法に適用可能な条件に適合するように調整することを含む。最近、Atherton et al．(1995)は、ｖａｃＡ遺伝子中の２つの可変領域、すなわちＳおよびＭ領域の存在を示した。可変ＳおよびＭ領域を有するｖａｃＡの対立遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを設計した。本発明において、ＳまたはＭ領域のＰＣＲ増幅物を分析することにより、ＳまたはＭ領域あるいは両方の領域を含むさらなる多数の核酸配列を得た。これらのデータは新しいものであり、本発明により初めて開示されるものである（図２および図３参照）。ｖａｃＡ遺伝子のＳまたはＭ領域のいずれかを含む増幅生成物を得るために、下記のプライマーのセットを用いた： S領域： VA1-F（Atherton et al.，1995参照） VA1-R（Atherton et al.，1995参照） M領域： HPMGF（CACAGCCACTTTCAATAACGA） HPMGR（CGTCAAAATAATTCCAAGGG）これらのプライマーを選択した標識で標識することができる（この場合にはビオチンを使用）。異なるプライマーに基づく標的増幅系を用いてもよい。ＰＣＲを用いる増幅には、上記プライマーを用いる単一ラウンド増幅の場合に用いる条件は、１分／９５℃、１分／５５℃、１分／７２℃を４０サイクル、次いで、７２℃で５分間の最終伸長を含む。ＰＣＲ反応混合物は下記のごとし：エイチ・ピロリＤＮＡまたは対照ＤＮＡを含む１μｌのＤＮＡ試料１０μｌの１０ｘポリメラーゼミックス(最終濃度１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ９．０，５０ｍＭＫＣｌ、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ) ２０μｌのデオキシリボヌクレオチドミックス（最終濃度各２００μＭ）１μｌのSuper Taqポリメラーゼ（０．２５Ｕ／μｌ）１μｌの順方向プライマー（５０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）１μｌの逆方向プライマー（５０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）６６μｌの水合計１００μｌ標準的配列決定法を用いるＤＮＡ配列決定により増幅生成物を分析した。これらの分析結果を図２および図３に示す。これらの分析により、ｖａｃＡ遺伝子の可変ＳおよびＭ領域に基づくエイチ・ピロリの対立遺伝子特異的型決定の目的で他人により使用されたプライマーは、全範囲の病原性エイチ・ピロリ株をカバーすることはできなかった（実施例１参照）。よって、試料中の病原性エイチ・ピロリ株を検出し型決定するために、当業者に明らかでない新たなプライマーのセットを設計した。プライマーおよびそれらの配列を表Ｉに示す。逆ハイブリダイゼーションアッセイに用いる標準的ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において新たなプライマーセットにより得られた増幅生成物および該プローブの間の最適ハイブリダイゼーションを調べるために多くのプローブを試験した。試験したプローブを表１１に示す。Styver et al.，1993により記載されたようにして該プローブを固体支持体上に固定化した。この実施例中ですでに述べた条件およびプロトコールにより該プライマーを用いて増幅を行った。上記プライマーを用いて得られた増幅生成物を個々のプローブにハイブリダイゼーションさせた（図８参照）。下記プライマー： VA1-F (Atherton et al.，1995) VA1XR (SEQ ID NO14) M1F (SEQ ID NO15) M1R (SEQ ID NO16) を下記プローブ： P1S1 (SEQ ID NO2) P22S1a (SEQ ID NO3) P1S1b (SEQ ID NO4) P2S1b (SEQ ID NO5) P1S2(VAS2) (SEQ ID NO6) P2S2 (SEQ ID NO7) P1M1 (SEQ ID NO 8) P2M1 (SEQ ID NO 9) P1M2 (SEQ ID NO10) P2M2 (SEQ ID NO11) と組み合わせて最適結果を得た。実施例４：ラインプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）片の開発ラインプローブアッセイの原理およびプロトコールは本質的にはすでに記載されている（Stuyver et al.，1993）。下記プライマー： cagF (SEQ ID NO12) cagR (SEQ ID NO13) VA1-F (Atheron et al.，1995) VA1XR (SEQ ID NO14) M1F (SEQ ID NO15) M1R (SEQ ID N016) を下記プローブ： cagApro (SEQ ID NO1) P1S1 (SEQ ID NO2) P22S1a (SEQ ID NO3) P1S1b (SEQ ID NO4) P2S1b (SEQ ID NO5) P1S2(VAS2) (SEQ ID NO6) P2S2 (SEQ ID NO7) P1M1 (SEQ ID NO8) P2M1 (SEQ ID NO9) P1M2 (SEQ ID NO10) P2M2 (SEQ ID NO11) と組み合わせて良好な結果を得た。上記プライマーをビオチンで標識した。異なるプライマーに基づく標的増幅系を用いてもよい。ＰＣＲを用いる増幅には、上記プライマーを用いる単一ラウンド増幅の場合に用いる条件は、１分／９５℃、１分／５５℃、１分／７２℃を４０サイクル、次いで、７２℃で５分間の最終伸長を含む。ＰＣＲ反応混合物は下記のごとし：エイチ・ピロリＤＮＡまたは対照ＤＮＡを含む１μｌのＤＮＡ試料１０μｌの１０ｘポリメラーゼミックス(最終濃度１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ９．０，５０ｍＭＫＣｌ、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ) ２０μｌのデオキシリボヌクレオチドミックス（最終濃度各２００μＭ）１μｌのSuper Taqポリメラーゼ（０．２５Ｕ／μｌ）１μｌの順方向プライマー（５０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）１μｌの逆方向プライマー（５０ｐｍｏｌｅｓ／μｌ）６６μｌの水合計１００μｌこれらのプライマーの配列を表２に示す。ｖａｃＡｓ／ｍ領域のプライマーまたはｃａｇＡのプライマーを用いて得られた増幅生成物を図９に示す。この実験のために、プライマーセットＧ（図１）をｖａｃＡに使用し、ｃａｇＦおよびｃａｇＲをｃａｇＡに使用した。最初の２つのレーンに示す単離体はｓ１およびｍ１対立遺伝子を含み、ｃａｇＡ＋である。レーン４および５（左から数える）に示す単離体は多重感染を含む。ＬｉＰＡの結果を図８に示す。実施例５：エイチ・ピロリのｃａｇＡ遺伝子フラグメントの新規ＤＮＡ配列およびそれらに基づくプライマーおよびプローブの設計ｃａｇＡ遺伝子の５’部分を、異なるプライマーの組み合わせを用いて種々のエイチ・ピロリ単離体からＰＣＲにより増幅した。得られたフラグメントを配列決定し、並置比較を図１０に示す。配列は４４９〜４６４塩基対を含み、ＯＲＦのスタートコドンから開始していた。ｃａｇＡ蛋白のＮ末端を表す全部で１４９〜１５４個のアミノ酸は、図１０の位置１のＡＴＧコドンから開始するこれらの配列の翻訳により得ることができる。図１１の系統発生学的分析により示されるように、異なる形態のｃａｇＡが認められた。第１の変種はもとの配列（Genbank受託番号Ｌ１１７４１（ＨＥＣＭＡＪＡＮＴ）またはＸ７００３９（ＨＰＣＡＩ））に対して非常に相同的であり、主としてヨーロッパおよびオーストラリアからの株中に存在する。アメリカ合衆国からの２つの配列（Ｊ１２３およびＪ３９）は系統発生樹の中ほどを占めると思われる。主として極東アジアからの株中の第２の変種は、リファレンス配列と比較すると、ヌクレオチド位置２０から３１の間に１５個のさらなるヌクレオチドを含み、位置８〜９の間における５個のさらなるアミノ酸をコードしている。ヌクレオチド配列の並置比較により、下記の新規プライマーおよびプローブが演鐸され、ｃａｇＡ遺伝子の非常に保存された領域を目的とされる。表３．ｃａｇＡプライマーおよびプローブ ¹位置はＯＲＦの位置１のＡＴＧを基準とする。実施例６：エイチ・ピロリのｓ領域の新規ＤＮＡ配列およびそれらに基づくプローブの設計プライマーＶＡ１ＦおよびＶＡ１Ｒ（Atherton et al.，1995）を用いて、多数のエイチ・ピロリ単離体からｖａｃＡのｓ領域を増幅した。これによりｓ１型の配列については１７６塩基対のフラグメント、ｓ２型の配列については２０３塩基対のフラグメントが得られた。これらのフラグメントの部分を配列決定し、得られた８０個の配列を並置比較して図１２に示す（２個のリファレンス配列Ｕ２９４０１およびＵ０７１４５を含む）。すでに知られているｓ１ａおよびｓ１ｂ型の配列とは別に、極東アジア（日本、中国、ホンコン）からの単離体において第３の変種が観察された。この変種はｓ１ｃと命名される。ｓ１ｃ型は、型ｓ１ａおよびｓ１ｂと比較すると、いくつかの非常に一貫した変異を有する。これらの変異は各ｓ１亜型の特異的認識を可能にする。図１３に示す系統発生学的分析により、ｓ１ａ、ｓ１ｂ、ｓ１ｃおよびｓ２配列の別個のクラスターが明らかである。図１２の位置２のコドンＣＣＴから開始する翻訳により、ｓ１ａ、ｓ１ｂ、ｓ１ｃおよびｓ２変種の核酸配列からｖａｃＡ蛋白のＮ末端部分を推定することができる。これにより、ｓ１ａおよび／またはｓ１ｂ配列と比較すると、亜型ｓ１ｃの位置２２における単一の保存されたアミノ酸変異（Ｌｙｓ）の存在が明らかである。他のすべてのヌクレオチド変異はサイレントであると思われる。ｓ１ｃ変種を特異的に検出するように設計された新たなプローブは下記のものである： P3s1:5’GGGYTATTGGTYAGCATCAC 3’（位置26−45） P4s1:5’GCTTTAGTRGGGYTATTGGT 3’（位置17−36）よって、ｖａｃＡのｓ領域の変種を最適に検出するために下記プローブを使用した： s1a用: P1S1およびP22S1a s1b用: P1s1bおよびP2s1b s2用: P1S2（VAS2）およびP2S2 s1c用: P3s1およびP4s1実施例７：エイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子のｍ領域の新規ＤＮＡ配列およびそれらに基づくプローブの設計プライマーＨＰＭＧＦおよびＨＰＭＧＲを用いることによりエイチ・ピロリ単離体のｖａｃＡのｍ領域を分析した。これらのプライマーはｍ領域配列の大部分を増幅してｍ１およびｍ２変種についてそれぞれ４０１および４７６塩基対のフラグメントを生じる。フラグメントを配列決定し、８６種のｍ領域配列（リファレンス配列Ｕ０５６７７、Ｕ０７１４５、Ｕ０５６７６およびＵ２９４０１を含む）を並置比較して図１４に示す。系統発生樹を図１５に示す。並置比較により、公表されたｍ１およびｍ２変種とは異なる３つの配列の存在が明らかとなった。これらの配列はｍ領域における別の変種であるかもしれない。上記の新たな変種をｍ３と命名する。これらの並置比較により、順方向プライマーＭ１Ｆ（配列番号：１５）のための標的配列はすべての株において完全には保存されていないことがわかった。Ｍ１Ｒのための標的配列はすべての株において非常に保存されていた。順方向プライマーＭ１Ｆのかわりに、下記プライマーを設計し、これらを表４に示す。表４．ｖａｃＡのｍ領域のための新規順方向プライマーかくして、ＶＡＭＳＦｂ、ｃ、ｄおよびｅを順方向プライマーとして用い、Ｍ１Ｒを逆方向プライマーとして用いることによりｖａｃＡ遺伝子のｍ領域におけるＰＣＲ増幅を行うことができる。ｍ１およびｍ２変種に特異的にハイブリダイゼーションするように新規プローブを設計した。それらの配列は上記プローブＰ１ｍ１、Ｐ２ｍ１、Ｐ１ｍ２およびＰ２ｍ２に基づくものである。すべての配列に対する反応性を得るために、少しの縮重を含ませた。新規配列を表５に示す。ｍ３変種の特異的同定のために、１つのプローブを加えた（Ｐ１ｍ３）。表５．ｖａｃＡのｍ領域のための新規プローブ ¹プローブＰ１ｍ３はＰ１ｍ２およびＰ２ｍ２の位置と同じであるが、このｍ型のための配列はGenbankにおいては利用できない。実施例８：エイチ・ピロリＤＮＡの検出およびＤＮＡエンザイムイムノアッセイ（ＤＥＩＡ）ＰＣＲ生成物の迅速かつ特異的な検出のためにこの方法を使用する。順方向または逆方向いずれかのプライマーが５’末端にビオチンを含んでいるプライマーセットによりＰＣＲ生成物を得る。このことにより、ストレプトアビジン被覆マイクロタイターウェルへのビオチン化アンプリマー（amplimer）の結合が可能となる。ＰＣＲ生成物を水酸化ナトリウムにより変性させ、そのことによりビオチン化されていない鎖を除去する。特異的ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識オリゴヌクレオチドプローブを１本鎖固定化ＰＣＲ生成物にハイブリダイゼーションさせ、酵素標識抱合体および比色法によりハイブリッドを検出する。エイチ・ピロリＤＮＡの検出のために、ｖａｃＡのｓ領域を標的として使用した。ＰＣＲプライマーＶＡ１Ｆおよびビオチン化ＶＡ１ＸＲをｖａｃＡのｓ領域にＰＣＲに使用する。ｖａｃＡのｓおよびｍ領域に対して多重ＰＣＲを行うことができる。ついで、ｓ領域を目的としたプローブを用いてＰＣＲの結果をＤＩＥＡにより試験する。陽性の結果の場合には、ｖａｃＡのｓおよびｍ領域双方からのアンプリマーを含む同じＰＣＲ混合物をｖａｃＡのＬｉＰＡに使用することができる。ＰＣＲ混合物は下記成分からなっていてもよい：１μｌ標的ＤＮＡ５μｌ１０ｘＰＣＲバッファー（最終濃度１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．３，５０ｍＭＫＣｌ，１〜３ｍＭＭｇＣｌ₂）１０ μｌ５ｘｄＮＴＰ’ｓ（１ｍＭ）０．３μｌＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ(５ユニット／ μｌ) １μｌＶＡ１Ｆ（２５ｐｍｏｐｌｅｓ／μｌ）１μｌＶＡ１Ｘｒ（２５ｐｍｏｐｌｅｓ／μｌ）１μｌＶＡＭＳＦｂ（２５ｐｍｏｐｌｅｓ／μｌ）１μｌＶＡＭＳＦｃ（２５ｐｍｏｐｌｅｓ／μｌ）１μｌＶＡＭＳＦｄ（２５ｐｍｏｐｌｅｓ／μｌ）１μｌＶＡＭＳＦｅ（２５ｐｍｏｐｌｅｓ／μｌ）１μｌＭ１Ｒ（２５ｐｍｏｐｌｅｓ／μｌ）２６．３μｌ水合計５０μｌ下記ＰＣＲプログラムを用いることができる：・９分９４℃でプレインキュベーション・９４℃１分、５０℃１分、ついで７２℃１分を４０サイクル・最終伸長：７２℃５分ｖａｃＡのｓ領域の検出に使用するプローブ混合物を表６に示す。表６．ＤＩＥＡによるｖａｃＡのｓ領域アンプリマー検出用プローブ実際には、マイクロタイタープレートのウェルをストレプトアビジンで前以て被覆した。１０μｌのＰＣＲ生成物をアンプリマー希釈バッファー(１ｘＳＳＣ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．００４％フェノールレッド)で希釈した。４２℃で３０分インキュベーション後、ウェルを４００μｌの洗浄溶液（１ｘＳＳＣ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。捕捉されたＰＣＲ生成物を、１００μｌの０．１ＭＮａＯＨをウェルに添加することにより変性させ、ついで、室温で５分間インキュベーションした。ビオチン化されていない溶離鎖を含む液体を除去した。１ｘＳＳＣ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０，Ｏ．００４％フェノールレッドおよび１ｐｍｏｌｅのジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する１００μｌのハイブリダイゼーション溶液をウェルに添加し、４２℃の水浴で４５分インキュベーションした。ウェルを洗浄溶液で３回洗浄した後、１００μｌの７５ｍＵ／ｍｌ抗ジゴキシゲニン−パーオキシダーゼ抱合体（Boehringer Mannheim）を添加し、４２℃の水浴で１５分インキュベーションした。ウェルを洗浄溶液で５回洗浄することにより未結合抱合体を除去した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含有する１００μｌの基質溶液をウェルに添加した。室温で１５分インキュベーション後、１００μｌの０．５Ｍ硫酸を添加することにより発色反応を停止させた。マイクロタイタープレートリーダーでウェルの光学密度を４５０ｎｍにおいて読んだ。結果の解釈のために、試料の光学密度を陰性対照およびボーダーラインの陽性対照と比較した。表７は６つの試料のＤＥＩＡ分析の結果を示す。試料１および５はボーダーラインの陽性対照の光学密度よりも高いものである。それゆえ、これらの試料を陽性とみなす。他の試料の光学密度はボーダーラインの陽性対照よりも低い。それらを陰性とみなす。表７．ＤＥＩＡ試験結果表１：プライマーのヌクレオチド配列文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ファン・ドールン，レーンデルト―ヤンオランダ、エヌエル―2986ベーイェー・リデルケルク、ズワリューウ167番

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程：（ｉ）必要ならば試料中のポリ核酸を遊離させ、単離し、あるいは濃縮し；（ｉｉ）適当なプライマーペアーを用いてｖａｃＡ遺伝子あるいは他の毒性決定遺伝子（ＶＤＧ）の関連標的領域のポリ核酸を増幅し（一般的には該プライマーは異なるエイチ・ピロリ株に対して適用可能であり、適合する増幅条件においてＶＤＧの該関連標的領域を優先的に増幅可能にするものである）；（ｉｉｉ）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において、（ｉ）または（ｉｉ）で得られたポリ核酸を、少なくとも２種のＶＤＧ由来のプローブからなるセットとハイブリダイゼーションさせ（該プローブのうち少なくとも１種はエイチ・ピロリのＶＤＧの保存された領域にハイブリダイゼーションし、該プローブのうち少なくとも１種はｖａｃＡの可変領域にハイブリダイゼーションする）；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において形成されたハイブリッドを検出し；（ｖ）工程（ｉｖ）において得られたディファレンシセルハイブリダイゼーションシグナルから、試料中に存在するエイチ・ピロリを検出および／または型決定するを含む、試料中に存在するヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）（エイチ・ピロリ（H．pylori））の検出および／または型決定のための方法であって、該型決定が特にエイチ・ピロリ株に存在するＶＤＧ対立遺伝子による株の対立遺伝子特異的検出であり、該毒性決定遺伝子が該エイチ・ピロリ株の感染性および／または病原性を可能にし、決定し、有効にすることに関与する遺伝学的エレメントである方法。２．工程（ｉｉ）が適当なプライマーを用いてｖａｃＡおよびｃａｇＡ遺伝子中の関連標的領域のポリ核酸を増幅することからなり、一般的には該プライマーは異なるエイチ・ピロリ株に適用可能であり、適合する増幅条件下において該関連標的領域の増幅を可能にするものであり、該標的領域はｃａｇＡ対立遺伝子の場合には保存された領域であり、ｖａｃＡ対立遺伝子の場合には可変領域であり、好ましくは該プライマーは下記のもの： cagF (SEQ ID NO 12) cagR (SEQ ID NO 13) VA1XR (SEQ ID NO 14) VA1F (Atherton et al，1995) M1F (SEQ ID NO 15) M1R (SEQ ID NO 16) HPMGF (SEQ ID NO 17) HPMGR (SEQ ID NO 18) cagSF (SEQ ID NO 19) cagSR (SEQ ID NO 20) cagFN1 (SEQ ID NO 21) cagRN1 (SEQ ID NO 22) VAMSFb (SEQ ID NO 23) VAMSFc (SEQ ID NO 24) VAMSFd (SEQ ID NO 25) VAMSFe (SEQ ID NO 26) またはそれらの配列変種から選択され、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、あるいは該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであり、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであり、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーション／増幅しうるものである、請求項１記載の方法。３．工程（ｉｉｉ）が工程（ｉｉ）で得られたポリ核酸を適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下においてプローブのセットとハイブリダイゼーションさせることからなり、好ましくは該プローブのセットは同時ハイブリダイゼーションアッセイに適用可能であり、エイチ・ピロリのｃａｇＡ遺伝子の保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブおよびエイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子の可変領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブを含み、より好ましくはプローブのセットは下記のｃａｇＡおよびｖａｃＡ由来のプローブ：cag A 由来のプローブ： cagApro (SEQ ID NO1) cagprobe3(SEQ ID NO27)vacA 由来のプローブ： P1S1 (SEQ ID NO2) P22S1a (SEQ ID NO3) P1S1b (SEQ ID NO4) P2S1b (SEQ ID NO5) P1S2(VAS2) (SEQ ID NO6) P2S2 (SEQ ID NO7) P1M1 (SEQ ID NO8) P2M1 (SEQ ID NO9) P1M2 (SEQ ID NO10) P2M2 (SEQ ID NO11) P3S1 (SEQ ID NO 28) P4S1 (SEQ ID NO 29) P1M1new (SEQ ID NO 30) P2M1new (SEQ ID NO 31) P1M2new (SEQ ID NO 32) P2M2new (SEQ ID NO 33) P1M3 (SEQ ID NO 34) またはそれらの配列変種の少なくとも１種を含み、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、あるいは該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであり、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであり、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうるものである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。４．下記工程：（ｉ）必要ならば、試料中のポリ核酸を遊離させ、単離し、または濃縮し；（ｉｉ）適当なプライマーペアーを用いてｖａｃＡ遺伝子の関連標的領域のポリ核酸を増幅し（一般的には、該プライマーペアーは異なるエイチ・ピロリ株に適用可能であり、適合する増幅条件下において優先的にｖａｃＡ遺伝子の該関連標的領域の増幅を可能にするものである）；（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）で得られたポリ核酸を、ｖａｃＡ遺伝子の保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブにハイブリダイゼーションさせ；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で生成したハイブリッドを検出し；（ｖ）工程（ｉｖ）で得られたハイブリダイゼーションシグナルから、試料中のエイチ・ピロリの存在または不存在を決定するを含む、試料中に存在するエイチ・ピロリ株の検出方法。５．工程（ｉｉ）が適当なプライマーを用いてｖａｃＡ遺伝子中の関連標的領域のポリ核酸を増幅することからなり、一般的には該プライマーが異なるエイチ・ピロリ株に適用可能であり、適合する増幅条件下において該関連標的領域の増幅を可能にするものであり、該標的領域は保存された領域であり、好ましくは該プライマーはＶＡ１ＦおよびＶＡ１ＸＲ（配列番号：１４）またはそれらの配列変種であり、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、あるいは該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであり、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであり、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーション／増幅しうるものである、請求項４記載の方法。６．工程（ｉｉｉ）が工程（ｉｉ）で得られたポリ核酸を適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下においてプローブのットとハイブリダイゼーションさせることからなり、好ましくは該プローブのセットは同時ハイブリダイゼーションアッセイに適用可能であり、エイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子の保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブを含み、より好ましくはプローブのセットは下記のｖａｃＡ由来のプローブ： HpdiaS1 (SEQ ID NO 35) HpdiaS2 (SEQ ID NO 36) HpdiaS3 (SEQ ID NO 37) HpdiaS4 (SEQ ID NO 38) HpdiaS5 (SEQ ID NO 39) またはそれらの配列変種の少なくとも１種を含み、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、あるいは該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであり、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであり、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうるものである、請求項４または５のいずれかに記載の方法。７．さらに工程（ｉｉｉ）が逆ハイブリダイゼーション工程であり、プローブが固体支持体上に、好ましくは膜片上に、好ましくは平行線状に固定化される、請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。８．さらに工程（ｉｉ）のポリ核酸が固体支持体上に、好ましくはマイクロタイタープレート上に固定化され、その後の工程（ｉｉｉ）のハイブリダイゼーションが該固体支持体上で行われる、請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。９．エイチ・ピロリのＶＤＧの保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブ、およびｖａｃＡの可変領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブを含み、より好ましくは該プローブはエイチ・ピロリのｖａｃＡおよび／またはｃａｇＡ遺伝子のポリ核酸配列由来のものであり、最も好ましくは該プローブは下記のもの：cagA 由来のプローブ： cagApro (SEQ ID NO1) cagprobe3 (SEQ ID NO 27)vacA 由来のプローブ： P1S1 (SEQ ID NO2) P22S1a (SEQ ID NO3) P1S1b (SEQ ID NO4) P2S1b (SEQ ID NO5) P1S2(VAS2) (SEQ ID NO6) P2S2 (SEQ ID NO7) P1M1 (SEQ ID NO8) P2M1 (SEQ ID NO9) P1M2 (SEQ ID NO10) P2M2 (SEQ ID NO11) P3S1 (SEQ ID NO 28) P4S1 (SEQ ID NO 29) P1M1new (SEQ ID NO 30) P2M1new (SEQ ID NO 31) P1M2new (SEQ ID NO 32) P2M2new (SEQ ID NO 33) P1M3 (SEQ ID NO 34) またはそれらの配列変種から選択されるものであり、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、あるいは該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであり、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであり、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうるものである、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法において使用されるプローブ組成物。１０．エイチ・ピロリのｖａｃＡ遺伝子の保存された領域にハイブリダイゼーションする少なくとも１種のプローブ、最も好ましくは下記のもの： HpdiaS1 (SEQ ID NO 35) HpdiaS2 (SEQ ID NO 36) HpdiaS3 (SEQ ID NO 37) HpdiaS4 (SEQ ID NO 38) HpdiaS5 (SEQ ID NO 39) またはそれらの配列変種から選択されるものであり、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、あるいは該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであり、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであり、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうるものである、請求項４ないし６のいずれかに記載の方法において使用されるプローブ組成物。１１．少なくとも１種の適当なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを含み、個々のＶＤＧの関連標的領域のポリ核酸の増幅を可能にする組成物であって、一般的には該適当なプライマーは異なるエイチ・ピロリ株に適用可能であり、適合する増幅貢献かで使用した場合に該関連標的領域の増幅を可能にするものであり、より好ましくは該プライマーはｃａｇＡ遺伝子の保存された標的領域ならびに保存された標的領域および／または可変標的領域を含むｖａｃＡ遺伝子の領域の増幅を可能にするものであり、最も好ましくは該プライマーは該プライマーは下記のもの： cagF (SEQ ID NO12) cagR (SEQ ID NO13) VA1XR (SEQ ID NO14) M1F (SEQ ID NO15) M1R (SEQ ID NO16) HPMGF (SEQ ID NO 17) HPMGR (SEQ ID NO 18) cagSF (SEQ ID NO 19) cagSR (SEQ ID NO 20) cagFN1 (SEQ ID NO 21) cagRN1 (SEQ ID NO 22) VAMSFb (SEQ ID NO 23) VAMSFc (SEQ ID NO 24) VAMSFd (SEQ ID NO 25) VAMSFe (SEQ ID NO 26) またはそれらの配列変種から選択され、該配列変種は、主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、あるいは該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであり、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであり、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうるものである組成物。１２．エイチ・ピロリのｖａｃＡおよび／またはｃａｇＡ遺伝子のポリ核酸配列由来であり、下記のもの： cagApro (SEQ ID NO1) cagprobe3 (SEQ ID NO 27) P1S1 (SEQ ID NO2) P22S1a (SEQ ID NO3) P1S1b (SEQ ID NO4) P2S1b (SEQ ID NO5) P1S2(VAS2) (SEQ ID NO6) P2S2 (SEQ ID NO7) P1M1 (SEQ ID NO8) P2M1 (SEQ ID NO9) P1M2 (SEQ ID NO10) P2M2 (SEQ ID NO11) P3S1 (SEQ ID NO 28) P4S1 (SEQ ID NO 29) P1M1new (SEQ ID NO 30) P2M1new (SEQ ID NO 31) P1M2new (SEQ ID NO 32) P2M2new (SEQ ID NO 33) P1M3 (SEQ ID NO 34) HpdiaS1 (SEQ ID NO 35) HpdiaS2 (SEQ ID NO 36) HpdiaS3 (SEQ ID NO 37) HpdiaS4 (SEQ ID NO 38) HpdiaS5 (SEQ ID NO 39) またはそれらの配列変種から選択されるプローブであって、該配列変種が主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、あるいは該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであり、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであり、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーションしうるものであるプローブ。１３．エイチ・ピロリのｃａｇＡ遺伝子の領域またはｖａｃＡ遺伝子の領域の増幅を可能にするものであり、下記のもの： cagF (SEQ ID NO12) cagR (SEQ ID NO13) VA1XR (SEQ ID NO14) M1F (SEQ ID NO15) M1R (SEQ ID NO16) HPMGF (SEQ ID NO 17) HPMGR (SEQ ID NO 18) cagSF (SEQ ID NO 19) cagSR (SEQ ID NO 20) cagFN1 (SEQ ID NO 21) cagRN1 (SEQ ID NO 22) VAMSFb (SEQ ID NO 23) VAMSFc (SEQ ID NO 24) VAMSFd (SEQ ID NO 25) VAMSFe (SEQ ID NO 26) またはその配列変種から選択されるオリゴヌクレオチド増幅プライマーであって、該配列変種が主に末端部分（３’または５’）における１個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入および／または置換を含むか、あるいは必須でないヌクレオチドの置換を含み、該必須でないヌクレオチドは対立遺伝子間の識別に必要ないものであり、あるいは該置換は他のヌクレオチド（イノシンのごとき修飾ヌクレオチドを包含）によるものであり、あるいは該変種はデオキシリボヌクレオチドのかわりにリボヌクレオチドからなるものであり、変種がもとのオリゴヌクレオチドプライマーと同じ特異性で特異的にハイブリダイゼーション／増幅しうるものであるオリゴヌクレオチド増幅プライマー。１４．試料中に存在するエイチ・ピロリのＶＤＧの対立遺伝子、より好ましくはエイチ・ピロリのｃａｇＡおよびｖａｃＡ遺伝子の対立遺伝子の検出および／または型決定のための方法であって、該対立遺伝子を検出および／または増幅および／または型決定するための特別に設計された、請求項７ないし１１のいずれかにおいて定義されたプローブおよび／またはプライマーのセットを用いる方法。１５．表面に結合した請求項７、８および１０のいずれかに記載の少なくとも１種のプローブを担持した固体支持体、好ましくは膜片。１６．エイチ・ピロリを含む可能性のある試料中のエイチ・ピロリを検出および／または型決定するためのキットであって、下記成分： −適宜、少なくとも１種の上記オリゴヌクレオチドプライマー； −少なくとも１種の上記プローブ（好ましくは、適用される該プローブおよび／または他のプローブは固体支持体上に固定化される）； −増幅またはこれらのプローブと増幅生成物との間のハイブリダイゼーション反応を可能にするバッファーまたはバッファーを得るのに必要な成分； −適宜、上記ハイブリダイゼーションにより生じたハイブリッドを検出するための手段を含むキット。１７．エイチ・ピロリのｖａｃＡ対立遺伝子を検出および／または型決定する方法においてプライマーまたはプローブとして使用できる、配列番号：４０から９１までおよび配列番号：１１５から２７６までにより定義される単離ｖａｃＡポリ核酸配列またはそれらのフラグメント。１８．エイチ・ピロリのｃａｇＡ対立遺伝子を検出および／または型決定する方法においてプライマーまたはプローブとして使用できる、配列番号：９２から１１４までにより定義される単離ｃａｇＡポリ核酸配列またはそれらのフラグメント。１９．配列番号：４０ないし９１および配列番号：１１５ないし２７６を有する核酸のいずれかによりコードされるｖａｃＡ蛋白フラグメントまたは該ｖａｃＡ蛋白フラグメントのサブフラグメント（該サブフラグメントはｖａｃＡ蛋白の少なくとも５個の連続したアミノ酸からなる）。２０．配列番号：９２ないし１１４を有する核酸のいずれかによりコードされるｖａｃＡ蛋白フラグメントまたは該ｃａｇＡ蛋白フラグメントのサブフラグメント（該サブフラグメントはｃａｇＡ蛋白の少なくとも５個の連続したアミノ酸からなる）。