KR20040023166A - 유전자 돌연변이 및 ｓｎｐ 탐지용 프라이머를 이용한ｑｔ연장증후군의 진단방법 - Google Patents

유전자 돌연변이 및 ｓｎｐ 탐지용 프라이머를 이용한ｑｔ연장증후군의 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 돌연변이를 이용한 QT연장증후군의 진단방법에 관한 것으로, 본 발명은 QT연장증후군과 관련된 타입 II 유전자의 돌연변이 및 다형성 변이를 탐지할 수 있는 프라이머를 이용하여 한국인에서 QT연장증후군을 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

유전자 돌연변이 및 ＳＮＰ 탐지용 프라이머를 이용한 ＱＴ연장증후군의 진단방법 {Method for diagnosing long QT syndrome using primer for detecting genetic mutation and SNP}
본 발명은 유전자 돌연변이 및 SNP를 이용한 QT연장증후군의 진단방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 QT연장증후군을 유발하는 유전자 돌연변이와 다형성변이(SNP)를 탐지할 수 있는 프라이머를 이용하여 심혈관질환인 QT연장증후군을 진단하는 방법에 관한 것이다.
QT연장증후군은 그동안 선진국형 질병으로만 인식되어 왔었지만 식생활의 서구화와 함께 우리 사회에서도 급격히 증가되는 추세를 보이고 있다. 그러나 QT연장증후군이 우리나라에서 상대적으로 적었던 근본적인 이유는 이런 식생활 문제보다는 진단방법의 개발이 서구보다 늦어졌기 때문이라 생각되고 있다. 이는 QT연장증후군의 경우 강하게 가족력을 보이는 경우가 많아 유전자 차원에서의 분석과 조사가 필수적이지만 우리나라에서는 이에 대한 인식과 연구가 부족하였기 때문이다. QT연장증후군 환자에서는 심전도상 QT간격수치(QT interval)가 정상인보다 상당히 길게 연장되어 있고(0.45초 이상), T파 변형이나 서맥을 동반하는 등 심각한 결과를 초래하는 것이 보통이다. 특히 평소에 아무런 증상이 없다가도 운동이나 스트레스에 의해 돌연사할 수도 있다. 상기에서 언급한 것 처럼 한국인을 대상으로 한 유전자 탐색과 분석이 워낙 미진하여 유전자 차원에서의 진단은 아직 어려운 현실이다.
QT연장증후군를 연구하는 데 있어 가장 큰 장애는 복합유전자에 의해 유발되는 질환(multigene defect)이라는 점이다. 병인에는 최소 4개 이상의 유전자가 관여하고 있을 것으로 보고 있는데 유전자별로 타입 I(KVLQT1), 타입 II(HERG), 타입 III(SCN5A), 타입 V(KCNE1)로 분류하고 있다. 미국에서 보고된 유전적 변이들을 살펴보면, 환자마다 변이의 형태와 위치가 판이하여 특정한 한가지에 초점을 맞추어 진단하기란 사실상 불가능하다. 지금도 전세계에서 새로운 돌연변이와 SNP들이 계속 보고되고 있는데 대부분의 연구가 미국을 중심으로 이루어지고 있고, 한국에서는 아직 환자가 몇 명이나 되는지 기초적인 통계자료조차 제대로 확보되어 있지 못한 형편이다.
최근 미국에서는 상기 유전자들을 정상인에서 분리하여 이들 유전자에 대한 정보를 임상진단에 일부 적용하기도 하였다. 이와 유사하게 한국인에 맞는 유전자 진단법을 개발하기 위해서는 한국인의 특이적 변이와 고유 SNP에 대해 독자적으로 자료를 확보하는 것이 시급한 문제이다. 앞으로 보다 많은 자료가 축적될 때 한국인의 QT연장증후군에 대한 폭넓은 유전자 차원에서의 이해가 도모될 수 있을 것이며 한국인에게 적절한 맞춤 진단법이 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명의 목적은 QT연장증후군을 유발하는 유전자 중 한국인에서 가장 빈도가 높은 타입 II의 HERG의 유전자 돌연변이와 다형성변이에 대한 특이 프라이머를 제작하여 QT연장증후군을 진단하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 한국인의 혈액에서 DNA를 분리한 다음, QT연장증후군의 타입 II HERG 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 제작하고 상기 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하여 HERG 유전자를 증폭한 후 상기에서 얻은 중합효소연쇄반응 산물을 자동화 염기서열 결정방법을 통해 염기서열을 결정하여 상기 염기서열과 HERG의 염기서열을 비교하여 엑손 6의 염기서열 중 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 변이됨과 엑손 7의 염기서열 중 아데닌(adenine)이 구아닌(guanine)으로 변이됨을 확인함으로써 달성하였다.
이하, 발명의 구체적 구성을 상세히 설명한다.
도 1은 QT연장증후군을 유발하는 유전자 HERG의 엑손 6(C→T)과 엑손 7(A→ G)의 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 QT연장증후군을 유발하는 유전자 HERG의 엑손 6번과 SNP 탐지용 각 프라이머의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 QT연장증후군을 유발하는 돌연변이 유전자를 PCR 증폭하여 전기영동한 사진도이다.
도 4는 자동화 염기서열 결정방법(automatic DNA sequencing)을 통한 돌연변이 탐색 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 한국인의 혈액에서 DNA를 분리, QT연장증후군의 타입 II HERG 유전자 증폭을 위한 프라이머 제작, 중합효소연쇄반응, 자동화 염기서열 결정, 상기 염기서열과 정상 HERG의 엑손 6의 염기서열의 비교 단계로 구성된다. 본 발명은 유전자 돌연변이 및 SNP 탐지용 프라이머를 이용한 QT연장증후군의 진단방법에 관한 것으로, 한국인의 혈액에서 DNA를 분리하는 단계; 상기 DNA로부터 HERG 유전자의 돌연변이를 증폭하기 위한 프라이머의 제작 단계; 상기 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응에 의한 HERG 유전자의 증폭 단계; 상기 유전자 증폭 후 얻은 중합효소연쇄반응 산물의 자동화 염기서열 결정 단계; 상기 염기서열과 정상 HERG의 염기서열을 비교하여 엑손 6의 염기서열 중 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 변이됨과 엑손 7의 염기서열 중 아데닌(adenine)이 구아닌(guanine)으로 변이됨을 확인하는 단계로 구성된다.
본 발명은 QT연장증후군의 두 번째 타입인 HERG 유전자의 염기서열 중 한국인에게 특이적으로 일어나는 돌연변이와 SNP에 대한 자료를 통하여 질병변이를 진단한다. 특히 상기 유전자를 탐침하기 위한 특이 프라이머를 제작함으로써 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 을 통하여 상기 유전자를 증폭한다.
또한, 본 발명은 정상인의 HERG 염기서열과 한국인 QT연장증후군 환자들의 염기서열을 비교하여 그 서열순서가 다를 경우 일단 돌연변이로 간주한 다음, 아미노산과 단백질 구조를 시뮬레이션하고 이러한 변이들이 기능상에 심각한 문제를 일으킨다는 것이 확인되면 병인(genetic defect)으로 확정지었다.
본 발명으로부터 정상적인 한국인을 모집단으로 하여 HERG 유전자의 염기서열을 조사한 결과 미국인들의 정상 염기서열과는 다르지만 모든 한국인(정상이든 환자이든 상관없이)에게서 공통적으로 발견되는 변이는 한국인에 특이적인 다형성변이(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)로 결론 내린다. 따라서, 본 발명에서 사용된 프라이머는 한국인 특유의 SNP를 진단할 뿐만 아니라 유전적 결함도 게놈 DNA에서 직접 조사할 수 있는 특징이 있다.
본 발명은 3쌍의 프라이머를 사용하고 있으며 각각의 염기서열은 하기에서 기재한다. 각 프라이머들은 QT연장증후군의 타입 II의 HERG 유전자의 특정영역을 증폭하기 위해 사용되며 하기 서열목록 1에는 HERG의 엑손 6의 염기서열을, 서열목록 2에는 엑손 7의 염기서열을 기재하였다.
첫째로, HERG 유전자의 엑손 6, 7, 8 및 9 부분만을 탐지할 수 있는 프라이머로서,
H5S : 5'-GCTGCCTTCCTGCTGAAGGAGACGGAA-3'
H5AS : 5'-CAGGCAGATGTCAGCCTGCAGCACT-3'
를 사용하며 상기 프라이머는 HERG 유전자의 코딩과 논-코딩 가닥에 각각 특이적으로 결합할 수 있도록 본 발명자에 의해 최초로 제작되었으며, HERG 유전자의 엑손 6, 7, 8 및 9를 포함하는 905bp를 증폭할 수 있다. 상기 H5S 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)는 센스 프라이머(sense primer)로서 엑손 6에, H5AS 올리고뉴클레오티드는 안티센스 프라이머(anti-sense primer)로서 엑손 9에 역방향으로 상보적인 염기서열이다.
본 발명의 상기 프라이머는 한국인의 심장조직에서 추출한 RNA(인간심장조직유래의 RNA)를 역전사시켜 만든 cDNA와 혼합하여 PCR를 실시할 경우, 심장에서 발현되는 HERG 유전자에 상기 프라이머가 특이적으로 결합하여 DNA 폴리머라제(DNA polymerase)의 프라이머로 작용하게 된다. 즉, HERG 유전자의 일부영역(약 905bp)을 증폭시키고, 증폭된 유전자(중합효소연쇄반응물질)는 전기영동 등의 방법을 통하여 확인함으로써 HERG의 존재를 확인할 수 있다.
둘째로, HERG 유전자의 엑손과 인트론 부분을 포함하여 증폭할 수 있는 프라이머로서,
H6bF : 5'-TGCTGAAGGAGACGGAAGAAGGCCC-3'
H6bR : 5'-CCACCTGCCTCCTTGCTGACCCCAC-3'
및,
H7aF : 5'-TTGCCCTGTCCCCCAGCTG-3'
H7aR : 5'-AAGGTGAAGTAGAGCGCCGTCACA-3'
를 사용하여 혈액에서 분리한 게놈 DNA에 직접 적용할 수 있는 특징이 있다.
상기 H6bF 및 H6bR 프라이머쌍은 HERG 유전자의 코딩과 논코딩 가닥에 각각 특이적으로 결합할 수 있으며, H6bF는 센스 프라이머로서 HERG 유전자의 엑손 6에, H6bR는 안티센스 프라이머로서 HERG 유전자의 엑손 6과 엑손 7 사이에 있는 인트론의 전반부에 역방향으로 상보적인 염기서열이다.
본 발명의 상기 프라이머는 정상 한국인의 혈액에서 분리한 게놈 DNA(human genomic DNA)와 혼합하여 PCR 을 실시할 경우, 게놈 DNA에 상기 프라이머가 특이적으로 결합하여 폴리머라제의 프라이머로 작용하게 된다. 즉, HERG 유전자의 일부영역(약 296bp)을 증폭시키고, 증폭된 유전자를 전기영동 등의 방법을 통하여 확인함으로써 HERG의 존재를 확인할 수 있다.
또한, 상기 H7aF 및 H7aR 프라이머쌍은 HERG 유전자의 코딩과 논코딩 가닥에 각각 특이적으로 결합할 수 있으며, H7aF는 센스 프라이머로서 HERG 유전자의 엑손 6과 엑손 7 사이에 있는 인트론의 후반부에, H7aR는 안티센스 프라이머로 HERG 유전자의 엑손 7에 역방향으로 상보적인 염기서열이다.
상기 프라이머는 정상 한국인의 혈액에서 분리한 게놈 DNA와 혼합하여 PCR을 실시할 경우, 게놈 DNA에 상기 프라이머가 특이적으로 결합하여 폴리머라제의 프라이머로 작용하게 된다. 즉, HERG 유전자의 일부영역(약 319bp)을 증폭시키고, 증폭된 유전자를 전기영동 등의 방법을 통하여 확인함으로써 HERG의 존재를 확인할 수 있다.
본 발명의 상기 프라이머들은 일반적인 유전자 합성방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 상기 프라이머를 합성할 때 SDS-PAGE 를 통해 정제될 때 상기 프라이머들은 PCR 결과물을 직접 자동화 염기서열 결정(automated DNA sequencing)을 위한 프라이머로도 사용할 수 있다. 상기 프라이머들을 이용한 중합효소연쇄반응 산물은 일차 정제후 자동화 염기서열 결정방법을 실시하여 세부적인 염기서열을 결정하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예
제조예 1 : HERG 유전자의 엑손 6, 7, 8 및 9를 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머의 제작
한국인의 심장조직에서 분리한 RNA를 역전사시켜 제조한 cDNA를 PCR 할 경우 사용되는 프라이머로서 HERG 유전자의 코딩과 논-코딩 가닥에 각각 특이적으로 결합할 수 있고, HERG 유전자의 엑손 6, 7, 8 및 9를 포함하는 905bp를 증폭할 수 있는 프라이머는, 센스 프라이머 H5S는 HERG 유전자의 엑손 6의 염기서열에, 안티센스 프라이머 H5AS는 HERG 유전자의 엑손 9의 염기서열의 역방향으로 상보적인 올리고뉴클레오티드로 결정하였다. 상기 프라이머의 센스 및 안티센스 프라이머의 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
H5S : 5'-GCTGCCTTCCTGCTGAAGGAGACGGAA-3'
H5AS : 5'-CAGGCAGATGTCAGCCTGCAGCACT-3'
상기 프라이머의 올리고뉴클레오티드는 대한민국 대전에 소재하고 있는 주식회사 바이오니아에게 의뢰하여 제작하였다.
도 3의 C에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머는 한국인의 심장조직에서 분리한 RNA를 역전사시켜 제조한 cDNA를 PCR 할 경우, HERG 유전자의 엑손 6 내지 9를 포함하는 일부영역(약 905bp)을 증폭시켰다.
제조예 2 : 정상 한국인의 혈액에서 얻은 게놈 DNA로부터 HERG 유전자의 엑손과 인트론 영역을 증폭하기 위한 프라이머의 제작
정상 한국인의 혈액에서 얻은 게놈 DNA와 혼합하여 PCR 할 경우 사용되는 프라이머로서 HERG 유전자의 코딩과 논코딩 가닥에 각각 특이적으로 결합할 수 있으며, 센스 프라이머는 HERG 유전자의 엑손 6의 염기서열에, 안티센스 프라이머는 HERG 유전자의 엑손 6과 엑손 7 사이에 있는 인트론의 전반부에 역방향으로 상보적인 올리고뉴클레오티드로 결정하였다. 상기 프라이머의 센스 및 안티센스 프라이머의 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
H6bF : 5'-TGCTGAAGGAGACGGAAGAAGGCCC-3'
H6bR : 5'-CCACCTGCCTCCTTGCTGACCCCAC-3'
상기 프라이머의 올리고뉴클레오티드는 대한민국 대전에 소재하고 있는 주식회사 바이오니아에게 의뢰하여 제작하였다.
도 3의 A에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머는 정상 한국인의 혈액에서 얻은 게놈 DNA와 혼합하여 PCR 을 실시할 경우, 게놈 DNA에 상기 프라이머가 특이적으로 결합하여 폴리머라제의 프라이머로 작용하여 HERG 유전자의 일부영역(약 296bp)을 증폭시켰다.
제조예 3 : 정상 한국인의 혈액에서 얻은 게놈 DNA로부터 HERG 유전자의 엑손과 인트론 영역을 증폭하기 위한 프라이머의 제작
정상 한국인의 혈액에서 얻은 게놈 DNA와 혼합하여 PCR 할 경우 사용되는 프라이머로서 HERG 유전자의 코딩과 논코딩 가닥에 각각 특이적으로 결합할 수 있고 엑손 6과 7을 증폭할 수 있는 프라이머로서, 센스 프라이머는 HERG 유전자의 엑손6과 엑손 7 사이에 있는 인트론의 후반부에, 안티센스 프라이머는 HERG 유전자의 엑손 7에 역방향으로 상보적인 올리고뉴클레오티드로 결정하였다. 상기 프라이머의 센스 및 안티센스 프라이머의 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
H7aF : 5'-TTGCCCTGTCCCCCAGCTG-3'
H7aR : 5'-AAGGTGAAGTAGAGCGCCGTCACA-3'
상기 프라이머의 올리고뉴클레오티드는 대한민국 대전에 소재하고 있는 주식회사 바이오니아에게 의뢰하여 제작하였다.
도 3의 B에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머는 정상 한국인의 혈액에서 얻은 게놈 DNA와 혼합하여 PCR을 실시할 경우, 게놈 DNA에 상기 프라이머가 특이적으로 결합하여 폴리머라제의 프라이머로 작용하여 HERG 유전자의 일부영역(약 319bp)을 증폭시켰다.
본 발명의 상기 프라이머들은 일반적인 유전자 합성방법을 이용하여 화학적으로 합성하였다.
실시예 1 : QT연장증후군 환자로부터 HERG 유전자의 엑손 6과 7의 돌연변이의 탐침
본 발명의 유전자 돌연변이를 이용하여 QT연장증후군을 진단하기 위해, QT연장증후군 환자들로부터 각 200㎕ 이상씩 채혈하여 상기 혈액을 용혈완충액(155mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA)과 잘 섞어 반응시킨 다음 10% SDS 용액과 단백질가수분해효소 K (10㎎/㎖)를 처리하여 37℃에서 밤새 반응시켰다. 페놀과 클로로포름으로 2회 가볍게 추출한 다음 1/10배량의 3M 소듐 아세테이트(pH 5.2)와 2배량의 에탄올을 첨가한 후 실처럼 분리되는 DNA가닥을 U자형으로 구부린 유리막대로 건져내고, 상기 DNA를 멸균수에 녹인 다음 UV 분광광도계에서 농도를 측정한 다음 4℃에 보관하였다. 상기 DNA를 1.0% 아가로우즈 젤을 사용하여 전기영동을 실시한 다음 DNA 밴드를 육안으로 확인하였다. 제조예 2에서 제작한 프라이머 H6bF 및 H6bR, 제조예 3에서 제작한 프라이머 H7aF 및 H7aR를 각각 사용하여 각각의 DNA를 PCR 증폭한 후 반응물을 글래스비드(glass bead)에 통과시켜 정제하였다. 이때 PCR의 반응조건은 변성전(pre-denaturation) 반응은 94℃에서 5분동안, 변성(denaturation) 반응은 94℃에서 30초동안, 복원(annealing) 반응은 60℃에서 20초동안, 연장(extension) 반응은 72℃에서 20초동안, 연장후(post-extension) 반응은 72℃에서 5분간이었다. 변성전 반응과 연장후 반응을 제외한 나머지 반응들은 모두 35 사이클로 하였다. PCR 반응용액의 조성은 다음과 같다. 즉, 총 50㎕ 반응에 주형 DNA 12.5㎕(25-50ng), 10X PCR 반응 용액 5㎕(750mM Tris-Cl (pH 9.0), 150mM 암모늄 설페이트, 보바인 씨럼 알부민(BSA) 1mg/ml, 25mM MgCl2), dNTP 2.5㎕(dATP, dCTP, dGTP, TTP 각각 25 μM), 택 DNA 폴리머라아제(Taq DNA polymerase 0.5㎕(2.5units)), 증류수 24.5㎕, 센스 프라이머 2.5㎕(100pmoles), 및 안티센스 프라이머 2.5㎕(100pmoles)이다. PCR 결과로부터 얻은 반응물은 미세글래스 비드(glass beads, 상업적으로 판매됨)를 이용하여 일차 정제하였고 최종농도를 200ng/㎕ 이상으로 조정한 뒤, 자동화 염기서열 결정 방법으로 염기서열을 최종 결정하였다. 상기 염기서열을 정상인의 HERG 염기서열과 비교하며 이때, 한국인에서는 아직 정상인에 대한 자료가 없으므로 미국인의 HERG 염기서열과 비교하였다.
도 1은 한국인과 미국인의 QT연장증후군의 유전자인 HERG의 엑손 6과 7의 염기서열을 비교하여 나타낸 것으로, 엑손 6의 변이 2개(C→T)와 엑손 7의 변이(A→G) 부분을 보여주고 있다.
도 4에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머들을 이용하여 HERG 유전자 돌연변를 조사한 결과, 미국인의 정상 HERG 염기서열과 비교하여 엑손 6에서는 2개의 염기가 시토신에서 티민으로 변이되어 있음을 볼 수 있었고, 엑손 7에서 아데닌이 구아닌으로 변이되어 있음을 볼 수 있었다(미 도시됨).
비교예 1 : 정상 한국인에서 HERG 유전자 돌연변이 탐침
정상 한국인의 HERG 유전자 돌연변이 여부를 조사하기 위해, 건강한 한국인 성인남녀(18세-50세) 68명을 대상으로 실시예 1과 같은 방법으로 HERG 유전자 돌연변이를 조사하였다. 상기 조사 결과로부터 실시예 1의 결과에서 발견된 엑손 6의 변이는 전혀 관찰되지 않았다(미도시됨). 따라서, 이들 2개의 염기변이는 환자들의 병유발과 직접 연관이 있는 유전적 변이임을 확인하였다. 그러나 엑손 7의 염기변이는 건강한 성인남녀에서도 동일하게 확인되었다. 이는 엑손 7에서 발견된 변이가 모든 한국인에 특이적이고, 미국인과는 확실히 다른 다형성 변이(SNP)임을말하는 것이다.
실시예 2 : 정상 한국인에서 프라이머 H5S 및 H5AS을 이용한 HERG 유전자의다형성 변이의 조사
정상 한국인으로부터 HERG 유전자의 다형성 변이를 조사하기 위해, 정상 한국인의 심장에서 분리한 RNA를 역전사하여 얻은 cDNA를 주형으로 하여 제조예 1을 통하여 제작된 프라이머 H5S 및 H5AS 를 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 의 반응조건은 변성전 반응은 온도 94℃에서 5분간, 변성 반응은 94℃에서 30초간, 복원 반응은 온도 60℃에서 30초간, 연장 반응은 온도 72℃에서 30초간, 연장후 반응은 온도 72℃에서 5분간 실시하였으며, 변성전 반응과 연장후 반응을 제외한 나머지 반응은 모두 35 사이클로 실시하였다. 반응용액의 조성은 총 50㎕ 반응에 주형 DNA 10㎕(25-50ng), 10X PCR 반응용액 5㎕(750mM Tris-Cl (pH 9.0), 150mM 암모늄 설페이트, BSA 1mg/ml, 25mM MgCl2), dNTP(dATP, dCTP, dGTP, TTP 각 25μM), 택 DNA 폴리머라아제 1.25㎕(7.5units), 증류수(26.25㎕), 센스 프라이머 2.5㎕(100pmoles), 및 안티센스 프라이머 각각 2.5㎕(100pmoles)로 하였다.
정상 한국인에서 프라이머 H5S 및 H5AS 을 이용하여 HERG 유전자의 다형성 변이를 조사함에 있어, 심장에서 분리한 RNA로부터 cDNA를 제조하였기 때문에 상기 프라이머를 이용하여 증폭된 HERG 유전자는 인트론에 해당하는 부분이 없이 엑손 6, 7, 8 및 9를 포함하는 905bp의 DNA이다. 상기 DNA를 pGEM-T 이지 벡터라는 플라스미드의LacZ 유전자 사이에 재조합시킨 후, 대장균(JM109)에 형질전환시켰다. 상기에서 형질전환된 대장균을 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤(15시간 이상) 배양하였다. 재조합유전자를 가진 대장균만을 얻기위해 항생제 앰피실린(ampicillin)을 100㎍/㎖ 농도로 첨가한 LB 고체배지에 상기 형질전환된 대장균을 도말하여 다시 밤새 배양하였고 앰피실린에 대한 내성을 가진 형질전환된 대장균만을 선별적으로 골라내었다. 최종적으로 재조합 여부를 보다 확실히 하기 위해 하기에 기재된 "색선별작업(color selection)"을 실시하였다.
상기 색선별작업은 X-gal, IPTG와 앰피실린을 혼합한 LB 고체배지에 상기에서 얻은 내성대장균을 옮긴 다음 다시 한번 37℃에서 밤새 배양하여 자란 콜로니의 색을 관찰하는 방법이다. 흰색으로 자라 나오는 대장균을 백금이로 따서 앰피실린을 포함한 5㎖ LB 액체배지에 배양한 후 집균하여 플라스미드 DNA를 추출한 후 정제하였고, 재조합된 DNA 즉, PCR로 증폭한 HERG 유전자의 905bp 부분의 염기서열을 결정하였다.
상기의 과정으로부터 HERG 유전자의 특정부위(엑손 6, 7, 8 및 9)를 증폭하여 상기에서 언급한 게놈 DNA를 주형으로 한 실시예를 통하여 밝혀진 엑손 6과 7의 염기변이를 비교한 결과, 도 4의 A에 나타난 바와 같이, 엑손 6에서 발견되었던 2개의 변이(QT연장증후군의 환자들에서만 발견됨)는 미국 정상인의 염기서열과 동일하게 나왔으며, 모든 한국인에서 변이된 것으로 보였던 엑손 7의 변이만이 이 심장 RNA를 대상으로 한 실험에서도 동일하게 변이로 관찰되었다. 상기 결과로부터 엑손 6에서 발견되는 변이 2개는 한국인 환자에게서 특별하게 발견된 것으로서 질병의 원인이므로 임상적 가치가 높음을 시사하고 있으며, 엑손 7의 염기변이는 임상적 가치는 아니지만 미국인과 한국인의 유전적 차이를 보여주는 한국인 특이적 다형성 변이임을 확인해 주는 것이다.
이상 상기 실시예와 비교예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 유전자 돌연변이를 이용한 QT연장증후군의 진단방법에 관한 것으로, 본 발명은 한국인 특유의 다형성 변이뿐만 아니라 유전적 결함도 게놈 DNA에서 직접 조사할 수 있는 프라이머를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명 프라이머를 사용하여 한국인에서 가장 임상적 빈도가 높은 타입 II QT연장증후군의 유전자인 HERG의 변이를 특이적으로 탐지하여 단시간내에 정확하게 질병을 진단하는 진단용 키트로 제작될 수 있으므로 질병진단산업상 유용한 발명인 것이다.

Claims (6)

  1. QT연장증후군의 타입 II를 유발하는 유전자 HERG의 엑손 6 내지 9의 영역만을 증폭하기 위한 서열목록 3과 서열목록 4에 기재된 올리고뉴클레오티드로 이루어짐을 특징으로 하는 프라이머.
  2. QT연장증후군의 타입 II를 유발하는 유전자 HERG의 엑손 6과 7의 영역을 증폭하기 위한 서열목록 4과 서열목록 5에 기재된 올리고뉴클레오티드로 이루어짐을 특징으로 하는 프라이머.
  3. QT연장증후군의 타입 II를 유발하는 유전자 HERG의 엑손 6과 7의 영역을 증폭하기 위한 서열목록 6와 서열목록 7에 기재된 올리고뉴클레오티드로 이루어짐을 특징으로 하는 프라이머.
  4. 인체 혈액에서 DNA의 분리 단계;
    상기 DNA로부터 QT연장증후군 관련 HERG 유전자의 돌연변이를 증폭하기 위한 서열목록 5과 6에 기재된 프라이머의 제작 단계;
    상기 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하여 HERG 유전자를 증폭하며, 상기 중합효소연쇄반응의 조건은 변성전(pre-denaturation) 반응은 94℃에서 5분동안, 변성(denaturation) 반응은 94℃에서 30초동안, 복원(annealing) 반응은60℃에서 20초동안, 연장(extension) 반응은 72℃에서 20초동안, 연장후(post-extension) 반응은 72℃에서 5분간으로 35 사이클을 실시함을 특징으로 하며;
    상기 유전자 증폭 후 얻은 유전자산물의 자동화 염기서열 결정 단계; 및,
    상기 염기서열 결정 후 HERG 유전자의 엑손 6의 염기서열 중 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 변이됨을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 QT 연장증후군의 진단방법.
  5. 인체 혈액에서 DNA의 분리 단계;
    상기 DNA로부터 QT연장증후군 관련 HERG 유전자의 돌연변이를 증폭하기 위한 서열목록 7과 8에 기재된 프라이머의 제작 단계;
    상기 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하여 HERG 유전자를 증폭하며, 상기 중합효소연쇄반응의 조건은 변성전(pre-denaturation) 반응은 94℃에서 5분동안, 변성(denaturation) 반응은 94℃에서 30초동안, 복원(annealing) 반응은 60℃에서 20초동안, 연장(extension) 반응은 72℃에서 20초동안, 연장후(post-extension) 반응은 72℃에서 5분간으로 35 사이클을 실시함을 특징으로 하며;
    상기 유전자 증폭 후 얻은 유전자산물의 자동화 염기서열 결정 단계; 및,
    상기 염기서열 결정 후 HERG 유전자의 엑손 6의 염기서열 중 시토신이 티민으로 변이됨을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 QT 연장증후군의 진단방법.
  6. 인체 혈액에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 DNA와 서열목록 3과 4에 기재된 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시하며, 상기 중합효소연쇄반응의 조건은 변성전 반응은 온도 94℃에서 5분간, 변성 반응은 94℃에서 30초간, 복원 반응은 온도 60℃에서 30초간, 연장 반응은 온도 72℃에서 30초간, 연장후 반응은 온도 72℃에서 5분간 35 사이클을 실시함을 특징으로 하고;
    상기 중합효소연쇄반응 후 얻은 DNA 산물을 pGEM-T EASY 벡터의LacZ유전자 사이에 재조합시켜 대장균 JM109에 도입시켜 형질전환하는 단계;
    상기에서 얻은 형질전환 대장균으로부터 재조합 DNA를 분리하여 상기 DNA의 염기서열을 결정하는 단계; 및,
    상기 염기서열 결정 후 HERG 유전자의 엑손 6의 염기서열 중 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 변이됨과 HERG 유전자의 엑손 7의 염기서열 중 아데닌이 구아닌으로 변이됨을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 다형성변이 탐지방법.
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