JP4531317B2 - スピロヘータを検出するための一本鎖オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマーおよび方法 - Google Patents
スピロヘータを検出するための一本鎖オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマーおよび方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、プローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを用いた検出および／または増幅ならびに配列決定のための技術に関し、また、スピロヘータ目（スピロヘータ）の細菌を検出または同定するためにこれらのプローブまたはプライマーを適用することに関する。
【０００２】
ある種の診断試験において、例えば、特に人または動物の神経系の感染検査、あるいは節足動物に噛まれた後の検査の際には、試料中の細菌（詳しくはスピロヘータ）の存在に関する迅速な反応を得なければならないことが多い。しかしながら、グラム染色や培養後の直接試験などの現在開発されている技術は、グラム染色の欠如や培地中での増殖の欠如により失敗に終わることが多い。
【０００３】
髄膜脳炎などの感染症の原因となるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびセルプリーナ（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ）の各種を含む細菌の科を形成するスピロヘータの場合は、培養を行うことができない。したがって、スピロヘータの同定の問題は未だ解決されていない。
【０００４】
ここ二十年に亘る感染性疾病の増加やこれらの感染性疾病の劇的な結果に鑑みると、スピロヘータなどの感染性病原体を検出するための迅速かつ特異的な方法を開発することが必要とされている。
【０００５】
細菌の培養ができないことの緩和策として、生きている有機体、該有機体からの細胞抽出物または試料中に、遺伝子、遺伝子の一部、またはヌクレオチド配列が存在するかどうかを調べるために、核酸および遺伝子材料に関連した技術、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いることが考えられる。どんな遺伝子または遺伝子の一部も、ヌクレオチド塩基の特異的配列によってキャラクタライズされることから、ポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の前記特異的配列の全部または一部の存在を直接的に調べることができる。
【０００６】
核酸を検出するための種々のタイプの方法が文献に記載されている。そのような方法は、ＤＮＡ−ＤＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせんにおける核酸相補鎖間のプリン−ピリミジン対形成特性に基づいている。この対形成プロセスは、二本鎖ＤＮＡのアデニン−チミン（Ａ−Ｔ）塩基間、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）塩基間に水素結合を形成することによって行われる。またＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせんでは、水素結合によってアデニン−ウラシル（Ａ−Ｕ）塩基の対も形成される。特定の核酸分子の有無を調べるための核酸の鎖の対形成は、「核酸のハイブリッド形成」もしくは単に「ハイブリッド形成」と呼ばれている。
【０００７】
ＰＣＲ法の一例としては、ＲＮＡｒ１６Ｓに基づいて配列を決定することが挙げられる。しかしながらこの方法には、診断の妨げとなる潜在的なコンタミネーションの問題に起因する限界がある。
【０００８】
この欠点を埋め合わせるために、細菌培養の前段階を行うことなく、あらゆる試料中でスピロヘータ目に属する細菌を特異的に検出するための新しい遺伝子マーカーが探索されている。そのような新しいマーカーまたはオリゴヌクレオチドが本発明の対象である。
【０００９】
これらの新しいマーカーの決定は、細菌ＲＮＡポリメラーゼ内のβサブユニットをコードするスピロヘータのｒｐｏＢ遺伝子内の特別に定められた配列の使用に依拠している。実際に、細菌の科によって異なるがスピロヘータ目の間では保存されているように思われる領域が、細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするＤＮＡ上で見つかっている。したがって、この細菌の科は、他の細菌の科から区別することができる。スピロヘータ目に特異的なこれらのマーカーの開発にあたっては、上記保存領域において、スピロヘータの特定種の間では小さな配列の変化しか見られないという観察結果を用いた。
【００１０】
ラズカノ（Ｌａｚｃａｎｏ）ら［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．（１９８８） ２７：３６５〜３７６］によれば、ＲＮＡポリメラーゼは、その起源によって、ウィルスＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって構成される群と、真核生物または原核生物（古細菌および真正細菌）を起源とするＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼから構成される群との２つの群に分けられる。ＤＮＡ依存性真正細菌ＲＮＡポリメラーゼは、αββ’で表される「コア酵素」またはαββ’σで表される「ホロ酵素」と呼ばれる単純な保存された多量体構造を特徴としている［ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ），Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．（１９７９） １３：５９〜９７］。
【００１１】
これまで数多くの研究によって、真正細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットの多量体酵素複合体内の機能的法則が明らかにされてきた。古細菌および真正細菌ＲＮＡポリメラーゼは、１０個もしくは３０個ものサブユニットを含むこともあるさらに大きな複合体構造を与える［ピューラ（Ｐｕｈｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８９） ８６：４５６９〜４５７３］。
【００１２】
真正細菌におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの種々のαββ’σサブユニットをコードする遺伝子である、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣおよびｒｐｏＤの各遺伝子は、リボゾームサブユニットを構成するタンパク質をコードする遺伝子、あるいはゲノムの複製および修復に関与する酵素をコードする遺伝子を含む異なる群に分類される［ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ）， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．（１９７９） １３：５９〜９７］。ある著者は、生物界を様々な枝や小枝を分離するための系統樹の作成に、ｒｐｏＢおよびｒｐｏＣ遺伝子の核酸配列を用いることができることを実証している［ローランド（Ｒｏｗｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ．（１９９２） ２１：４０ｓ］。
【００１３】
本発明を詳細に説明する前に、明細書および請求の範囲で使用する種々の用語について、次のように定義しておく。
【００１４】
− 「細菌から抽出された核酸」とは、全核酸、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られたＤＮＡのいずれかのことをいう。
− 「ヌクレオチド断片」または「オリゴヌクレオチド」は、２つの同義語であり、所定の厳しいストリンジェンス条件下において、相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド断片とハイブリッド形成する可能性のある、天然核酸などの、天然の（または修飾された）核酸の情報配列によって特徴付けられるＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドモチーフの配列のことをいう。この配列は、天然核酸のものとは異なる構造のヌクレオチドモチーフを含んでいてもよい。ヌクレオチド断片（またはオリゴヌクレオチド）は、例えば、１００個までのヌクレオチドモチーフを含み得る。該ヌクレオチド断片は、少なくとも１０個、より詳細には少なくとも１２個のヌクレオチドモチーフを含み、天然核酸分子から得られるものであってもよいし、および／または、遺伝子組換え、および／または化学合成によって得られるものであってもよい。
【００１５】
− 「ヌクレオチドモチーフ」は、糖、リン酸基、ならびに、窒素塩基（アデニン、グアニン、ウラシル、シトシンおよびチミンから選択される）を構造的要素とする天然の核酸のヌクレオチドであるモノマーから得られるものであるか、そうでなければ、該モノマーは前記３つの構造的要素のうちの少なくとも１つが修飾されているヌクレオチドである。例を挙げると、修飾は塩基で起こり、その例としては、Ａ，Ｔ，Ｕ，ＣまたはＧの任意の塩基とハイブリッド形成することができるイノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジンなどの修飾塩基、またはハイブリッド形成のできる他の任意の塩基が挙げられる。あるいは、修飾は糖で起こり、例えば、少なくとも１つのデオキシリボースをポリアミドで置換したものである［ＰＥ ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９１） ２５４：１４９７〜１５００］。あるいは、修飾はリン酸基で起こり、例えば、選択されたエステル、特に二リン酸エステル、アルキルおよびアリールホスホン酸エステルおよびモノチオリン酸エステルから選択されるエステルによる置換である。
【００１６】
− 「情報配列」とは、化学的性質および基準方向における順序が、天然の核酸の配列によって提供される情報と類似の情報を構成するような、任意のヌクレオチドモチーフの規則配列のことをいう。
【００１７】
− 「ハイブリッド形成」とは、適当な条件下において、十分に相補的な配列を有する２本のヌクレオチド断片が、安定かつ特異的な水素結合によって会合することができ、２本鎖を形成する過程のことをいう。ハイブリッド形成のための条件は、「ストリンジェンス」、すなわち操作条件の厳しさによって決定される。ストリンジェンスが大きいほど、ハイブリッド形成の特異性は高くなる。ストリンジェンスは、主にプローブ／標的二重らせんの塩基組成の関数であるが、２つの核酸間のミスマッチの程度にもよる。ストリンジェンスは、ハイブリッド形成溶液中に見られるイオン種の濃度および種類、変性剤の種類および濃度、および／または、ハイブリッド形成温度などの、ハイブリッド形成反応のパラメータの関数でもありうる。ハイブリッド形成を行うべき条件のストリンジェンスは、主として使用するプローブに依存している。そのようなデータのすべては周知であり、適当な条件は最終的には、それぞれの場合に応じて常套的実験によって決定することができる。一般に、ハイブリッド形成反応のための温度は、使用するプローブの長さに応じて、約０．８〜１Ｍの濃度の生理食塩水中、約２０〜６５℃であり、より詳細には３５〜６５℃である。
【００１８】
− 「プローブ」は、本件においては、所定の条件下で、メッセンジャーＲＮＡ、または転写産物である前記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られたＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリッド複合体を形成するハイブリッド形成特異性を有する、例えば、１０〜１００個のヌクレオチドモチーフ、より詳細には１２〜３５個のヌクレオチドモチーフを含むヌクレオチド断片である。プローブは診断の目的（特に捕捉または検出プローブ）あるいは治療の目的で使用することもできる。
【００１９】
− 「捕捉プローブ」は、例えば共有結合、吸着、または固体上への直接合成などの適当な手段によって固体支持体上に固定化されているか、固定化することができる。支持体の例としては、ミクロタイタープレートやＤＮＡチップなどが挙げられる。
【００２０】
− 「検出プローブ」は、例えば放射性同位体、酵素、特に色素発生、蛍光発生、発光性の基質と反応することのできる酵素（特に、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、発色化合物、色素発生、蛍光発生または発色性化合物、ヌクレオチド塩基のアナログ、およびビオチンなどのリガンドの中から選択される標識物質によって標識してもよい。
【００２１】
− 「種プローブ」は、細菌の種を同定することのできるプローブである。
− 「属プローブ」は、細菌の属を同定することのできるプローブである。
− 「プライマー」は、例えば１０〜１００個のヌクレオチドモチーフを含み、例えば、ＰＣＲなどの増幅技術、配列決定法、転写法などにおける酵素重合開始のための所定の条件下においてハイブリッド形成特異性を有するプローブである。
【００２２】
本発明の第１の目的は、明細書の最後のリストに記載の配列番号１〜配列番号４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドの中からならびにそれらのオリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドの中から選択される、一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００２３】
配列番号１〜配列番号４のそれぞれの配列において、明細書の最後の配列リストに示されているヌクレオチド「Ｎ」は、該ヌクレオチドが出現する３つの位置のそれぞれにおいて同一でも異なっていてもよいヌクレオチドを表し、イノシンか、あるいは、Ａ，Ｔ，ＣおよびＧから、あるいは場合によってはＡ，Ｕ，ＣおよびＧから選択される４つの異なるヌクレオチドの等モル混合物かを表しうる。
【００２４】
「Ｎ」が、特定の位置におけるヌクレオチドの上記等モル混合物を表す場合、前記位置におけるヌクレオチドは区別なくＡ，Ｔ，ＣまたはＧ（あるいは、場合によっては、それぞれＡ，Ｕ，ＣまたはＧ）を表し、本発明のオリゴヌクレオチドがより正確に４つのオリゴヌクレオチド群の等モル混合物からなり、その各群において、前記特定位置において「Ｎ」は異なる意味を有し、４群のそれぞれにおいてＡ，Ｔ，ＣおよびＧを表すことを意味する。
【００２５】
配列番号１〜４の配列のそれぞれにおいて、ヌクレオチド「Ｎ」が出現する３位置において、Ｎが４つのヌクレオチドＡ，Ｔ，ＣまたはＧ（あるいは、場合によっては、ＮはＡ，Ｕ，ＣおよびＧ）の上記等モル混合物を表す。したがって、前記配列を構成するオリゴヌクレオチドは、４3（６４）個のオリゴヌクレオチドの混合物を表す。
【００２６】
定義において示したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）であってもよいし、あるいは、オリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）であってもよい。後者の場合、「Ｔ」の代わりに「Ｕ」である。
【００２７】
特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、上述のように１２個以上かつ５０個以下のモチーフを有している。詳細には、本発明によれば、オリゴヌクレオチドは１２〜３５個のモチーフを有する。
【００２８】
好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４の配列、またはその相補配列の中から選択される配列を有する。
プライマー１と呼ばれるプライマーからの配列である配列番号１の配列は、２０個の核酸を有する。プライマー２と呼ばれるプライマーからの配列である配列番号２の配列は、２１個の核酸を有する。プライマー３と呼ばれるプライマーからの配列である配列番号３の配列は、２０個の核酸を有する。プライマー４と呼ばれるプライマーからの配列である配列番号４の配列は、１７個の核酸を有する。
【００２９】
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）中のｒｐｏＢ遺伝子を表す命名において、配列番号１〜４の配列中の最初のヌクレオチドは以下の位置に相当する。
配列番号１：１７３０
配列番号２：２９００
配列番号３：３７００
配列番号４：３８５０
本願発明者らは、上で定義されるような配列番号１〜４の配列が、スピロヘータの間で共通であるということだけでなく、それらの配列が、スピロヘータの科にも特異的であり、スピロヘータの種における種および属亜型（genus serovar ）に特異的な配列をした非常に可変領域を含むｒｐｏＢ遺伝子の断片を包含することを発見、解明した。
【００３０】
実際に、相補的標的配列内の可変ヌクレオチドが、対象とする細菌種の関数として、配列番号１〜４の配列中のヌクレオチド「Ｎ」の位置と対応する位置に見つかっている。しかしながら、その他のヌクレオチドは、スピロヘータ科内の全ての細菌種において保存されている。「Ｎ」は任意の塩基とハイブリッド形成しうるイノシン、またはＡ，Ｔ，ＣおよびＧの４塩基の等モル混合物を表すので、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物は、スピロヘータ細菌の相補的標的配列とハイブリッド形成することのできるオリゴヌクレオチドを常に含んでいる。
【００３１】
さらに、配列番号１〜４の配列は、その領域における配列がスピロヘータ科内の細菌種のそれぞれに特異的である可変領域を包含しているので、配列番号１〜４の配列によって、スピロヘータの科に対する特異的プローブの調製が可能になるだけでなく、前記配列をプライマーとして用いることにより、ＰＣＲ増幅による前記細菌の種の検出および同定も可能になる。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチド調製の一形態において、「Ｎ」は全ての位置においてイノシンを表す。
調製の別の形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる配列を有するオリゴヌクレオチド（特に４Pオリゴヌクレオチド）の混合物を表し、該配列において、「Ｎ」が出現する前記各位置（特に、ｐ個の位置。「ｐ」は総数を表す）において、Ａ，Ｔ，ＣおよびＧの全てのヌクレオチドが表される。
【００３３】
配列番号１〜４の配列は、例えばイタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）Ｋ．らによる論文［（１９８４）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３］に記載されているような周知の技術を用いて化学合成によって調製することができる。
【００３４】
本発明によるオリゴヌクレオチドの第１の適用例は、該オリゴヌクレオチドを、生体試料中の、配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモチーフを有するヌクレオチド配列およびそれらの相補的配列を含むスピロヘータ目に属する細菌を検出するためのプローブとして使用することである。以後の説明において、このようなプローブのことを「属プローブ」と呼ぶ。
【００３５】
本発明によれば、あらゆる公知のハイブリッド形成技術、特に、フィルタ上への沈殿を伴ういわゆる「ドットブロット」技術［マニアチス（ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ］、ＤＮＡの転移を伴ういわゆる「サザンブロット」技術［サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）Ｅ．Ｍ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９７５） ９８：５０３］、ＲＮＡの転移を伴ういわゆる「ノーザンブロット」技術、あるいは、いわゆる「サンドイッチ」技術［ダン（Ｄｕｎｎ）Ａ．Ｒ．，ハッセル（Ｈａｓｓｅｌ）Ｊ．Ａ．（１９７７）Ｃｅｌｌ、１２：２３］に従って試料中の標的核酸の有無を調べる検査において、プローブを診断の目的で使用することもできる。特に、「サンドイッチ」技術は、捕捉プローブおよび／または検出プローブと一緒に用いられ、前記プローブは標的核酸の異なる２つの部位とハイブリッド形成することができ、捕捉プローブと検出プローブは少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有していなければならないことを考慮すると、少なくとも１つの前記プローブ（一般には検出プローブ）が、検査対象の種または種の群に特異的な標的内の領域とハイブリッド形成することができる。
【００３６】
検出すべき核酸（標的）は、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよい（いずれか一方がＰＣＲ増幅後に得られる）。二本鎖核酸の標的を検出する場合、検出手順を行う前に、標的二本鎖核酸を変性させておくとよい。標的核酸は、核酸用の周知の方法に従って、試験試料からの抽出によって得られる。二本鎖核酸の変性は、よく知られた化学的、物理的または酵素変性法によって、特に８０℃を超える適当な温度に加熱することによって、行うことができる。
【００３７】
前述のハイブリッド形成技術、特に「サンドイッチ」技術を使用するために、捕捉プローブと呼ばれる本発明によるプローブを固体支持体上に固定化し、検出プローブと呼ばれる本発明による他のプローブを試薬で標識する。
【００３８】
支持体および標識物質の例は上で定義した通りである。
本発明の別の目的は、少なくとも１つのスピロヘータが、少なくとも１つの当該細菌に由来する核酸を含有しているか含有する可能性のある試料中に、存在するかどうかを調べる方法であって、前記試料を少なくとも１つの本発明による属プローブと接触させてから、前記プローブと試料中の核酸との間にハイブリッド複合体が形成されたかどうかを公知の方法で調べる工程から成る方法である。
【００３９】
前記プローブと核酸との間でハイブリッド複合体が形成されているか否かの検出法の例としては、上述の技術、すなわち、「ドットブロット」、「サザンブロット」および「サンドイッチ」技術が挙げられる。
【００４０】
スピロヘータの種または種の群が存在するかどうかを決定するための本手法の１つの特定の用途において、本発明による属プローブと本発明による種プローブとが用いられる。当然ながら、該属および種プローブは、スピロヘータのｒｐｏＢ遺伝子に相当する核酸の非重複領域とハイブリッド形成することができる。
【００４１】
有益な態様において、属プローブは固体支持体上に固定化され、種プローブは標識物質で標識される。
本発明は、特定のスピロヘータ種の存在を調べるために、本発明による手法を適用することも包含する。
【００４２】
実際に、研究の結果、ＣＬＵＳＴＡＬアライメント法［ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）Ｄ．Ｇ．とシャープ（Ｓｈａｒｐ）Ｐ．Ｍ．（１９８９）Ｇｅｎｅ、７３：２３７〜２４４］により、スピロヘータ種内で保存されている配列のアライメントが認められ、前記配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｒｐｏＢ遺伝子ＡＴＣＣ２５２９０の番号付けを参照するとｒｐｏＢ遺伝子の位置１７３０〜２９００の間に位置する１１７０塩基を有し、スピロヘータ目の中の少なくとも１つの細菌を検出することができることが示された。特定の種（対照種に対する、この場合はＥ．ｃｏｌｉ）に対する変異を施した領域を含むプローブを用いることにより、当該種を直接的に検出することが可能になる。２つのプローブの組み合わせ（捕捉プローブと検出プローブ）を用いるサンドイッチハイブリッド形成技術では、例えばスピロヘータの科に特異的なプローブと対象種に特異的なプローブとを組み合わせて用いる。上記の種に特異的な２つのプローブの組み合わせて用いることも可能である。そのような種がある場合には、それら２つのプローブはｒｐｏＢ遺伝子の非重複領域に相補的である。
【００４３】
本発明におけるオリゴヌクレオチドの別の適用例は、該ヌクレオチドを、配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個のヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、一本鎖オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマーとして用いることであり、該ヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼの存在下での周知の手法による核酸合成、すなわち、ポリメラーゼ存在下でのそのような合成を用いた増幅法（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）において用いることができる。特に、本発明によるプライマーは、対応する相補的ＤＮＡ配列を得るために、スピロヘータの少なくとも１つの種または少なくとも１つの種の群のメッセンジャーＲＮＡの配列の特異的逆転写のために用いることもできる。このような逆転写をＲＴ−ＰＣＲ技術における第一段階とし、これに続く段階をＰＣＲによって得られた相補的ＤＮＡの増幅とすることができる。さらに、本発明によるプライマーを、スピロヘータの少なくとも１つの種または少なくとも１つの種の群のｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列の鎖重合反応による特異的増幅のために用いることもできる。
【００４４】
特定の場合において、上記プライマーは本発明によるオリゴヌクレオチドから成るので、該プライマーはＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモータの順方向または逆方向配列をも含んでいる（例えば、プロモータＴ７，Ｔ３，ＳＰ６［スタディ（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ＦＷ，ＢＡ モファット（Ｍｏｆｆａｔｔ）（１９８６）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３］）。このようなプライマーは、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲなどの転写段階に関する核酸増幅方法において使用することができる［ファン・ゲーメン（Ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ）Ｂ．ら、アブストラクトＭＡ１０９１、第７回国際エイズ会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＡＩＤＳ）（１９９１）、フィレンツェ、イタリア］。
【００４５】
本発明の別の目的は、任意のスピロヘータ種におけるｒｐｏＢ遺伝子の全または部分配列決定のために使用することができる、配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドの中から選択される一本鎖オリゴヌクレオチドからなるヌクレオチドプライマーである。特に、このヌクレオチドプライマーは、増幅された核酸の配列決定に用いることができる。
【００４６】
実際に、本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーは、全てのスピロヘータにおけるｒｐｏＢ遺伝子の増幅とその後の配列決定を可能にするとともに、この配列のバイオデータ処理解析による任意のスピロヘータの同定、ならびに新規または未知のスピロヘータ種の認識を可能にする。配列決定は、よく知られた方法、ジデオキシヌクレオチドを用いた吸着重合［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）Ｆ．，クイソン（Ｃｏｕｉｓｏｎ）Ａ．Ｒ．（１９７５）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９４：４４１］、またはＤＮＡチップを用いた多重ハイブリダイゼーションによってｒｐｏＢ遺伝子の全または部分配列を得ることを包含する。
【００４７】
プライマー１〜３は５’プライマーとして、プライマー２〜４は３’プライマーとして使用して、５’と３’の間に囲われたｒｐｏＢ遺伝子の断片を前記プライマーによって増幅することができる。
【００４８】
１つの形態において、５’プライマーに対しては配列番号１〜３、３’プライマーに対しては配列番号２〜４の配列に含まれる、少なくとも１２個のヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される異なる２つのオリゴヌクレオチドからなる、２つのプライマーから成る組が用いられる。
【００４９】
また本発明は、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片をまず本発明によるプライマーで増幅し、次に、前記断片を本発明による前記細菌に由来するプローブと接触させることを特徴とする方法も含んでいる。前記プローブと前記断片との間でハイブリッド複合体が形成されるかどうかが決定される。
【００５０】
また本発明は、スピロヘータ目に属する少なくとも１つの細菌が、そのような細菌に由来する核酸を含んでいるか含む可能性のある試料中に存在するかどうかを調べるための方法であって、前記試料を本発明のプライマーに接触させることを特徴とする方法をも含む。その後、増幅が行われ、増幅産物が出現しているかどうかが決定される。
【００５１】
１つの形態において、スピロヘータ目に属する少なくとも１つの細菌が、そのような細菌に由来する核酸を含んでいるか含む可能性のある生物試料中に存在するかどうかを調べるための方法は、本発明によるプライマーを用いて前記試料中の前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片の増幅および配列決定を行い、得られた遺伝子のｒｐｏＢ遺伝子断片の配列を、試料中の前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片の既知の配列と比較して、得られた断片の配列が前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片の既知の配列と一致するかどうかを調べることを特徴とする。
【００５２】
また本発明は、スピロヘータ目に属する細菌の種に特異的な、生物試料中の検出プローブであって、本発明によるプライマーを用いた増幅によって得られるｒｐｏＢ遺伝子の断片を含み、好ましくは５’プライマーとして配列番号１〜３の配列のいずれか１つを有し、３’プライマーとして配列番号２〜４の配列のいずれか１つを有することを特徴とする検出プローブも包含する。本発明のオリゴヌクレオチドによって囲まれる前記ｒｐｏＢ遺伝子の断片は、実際には、スピロヘータ目に属する前記細菌の種に応じて大きく変化する領域であって、前記各種に対して特異的な領域に相当する。
【００５３】
最後に、本発明は、スピロヘータの少なくとも１種または種の群によって誘起される感染を治療するための、上で定義したオリゴヌクレオチドを含む遺伝子治療プローブも包含する。前記細菌のメッセンジャーＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ上にハイブリッド形成することのできるこの遺伝子治療プローブは、翻訳および／または転写および／または複製の現象を阻止することができる。
【００５４】
遺伝子治療法の原理は公知であり、主として逆方向鎖に相当するプローブを使用することに基づいている。プローブと順方向鎖との間のハイブリッド形成により、遺伝子情報解読における少なくとも１段階を混乱させることができる。これにより、遺伝子治療プローブを、スピロヘータによって引き起こされる感染と闘うための抗細菌薬として使用することができる。
【００５５】
以下の実験報告を用いて本発明を詳細に説明する。
以下の説明は、図１および図２を用いてよりよく理解される。
以下の実施例で使用するスピロヘータ菌株、すなわち、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ ｓｅｒｏｖａｒ ｐａｔｏｃ（以下、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａと呼ぶ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ（以下、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅと呼ぶ）およびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ａｕｓｔｒａｌｉｓ（以下、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓと呼ぶ）は、パリのパスツール研究所（フランス）のＣｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅで入手可能なＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓを除き、すべてＡＴＣＣコレクションから得た。Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉのＡＴＣＣ番号は３５２１０であり、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍのＡＴＣＣ番号は２７０８７であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａのＡＴＣＣ番号は２３５８２であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅのＡＴＣＣ番号は４３６４２であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓのＡＴＣＣ番号は２３６０５である。
【００５６】
ＢｏｒｒｅｌｉａおよびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ株は、それぞれＢＳＫＩＩおよびＥＭＪＨ培地上で３０℃で培養した［バーバ（Ｂａｒｂｏｕｒ）Ａ．Ｇ．（１９８４）Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ５７：５２１］。Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖できないため、この病原性細菌はウサギの精巣に注射することにより増殖させた。
【００５７】
他の使用細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、マルセイユの入院患者より臨床的に単離した。
【００５８】
実施例１：本発明によるプローブを用いたスピロヘータの特異的検出
本実験は以下のスピロヘータ菌株を用いて行った：
Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ。
【００５９】
スピロヘータＤＮＡをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの抽出物と混合することにより、混合細菌懸濁液を調製した。
ＱＩＡａｍｐ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）およびＧｉｂｃｏポリメラーゼＴａｑ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ法を行った。最初の変性ステップ（９４℃、２分間）の後、９４℃３０秒間、５２℃３０秒間、および７２℃１分間の３ステップからなるサイクルを３５回繰り返し、ＰＣＲプログラムを終了した。得られたアンプリコンを精製し上述のように配列決定を行った。
【００６０】
結果を図１に示す。同図において、
バンド１は、分子量マーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に相当し、
バンド２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単独に相当し、
バンド３は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド４は、Ｂ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド５は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド６は、Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド７は、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド８は、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当する。
【００６１】
また、以下のプライマーを使用した。
パネルＡ：ＲＮＡｒプライマー１６Ｓ ＦＤＩおよびＲＤ３［ウェイスブルグ（Ｗｅｉｓｂｕｒｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９１）１７３：６９７−７０３］。
パネルＢ：本発明によるプライマー１７３０Ｄおよび２９００Ｒ。
【００６２】
プライマー１７３０Ｄの配列は配列番号１（５’ＣＴＴＧＧＮＣＣＮＧＧＮＧＧＡＣＴＴＴＣ３’）において「Ｎ」がイノシンであり、プライマー２９００Ｒは、配列番号２の配列（５’ＡＧＡＡＡＴＮＡＡＮＡＴＮＧＣＡＴＣＣＴＣ３’）を有し、該配列中「Ｎ」はイノシンである。
【００６３】
これらの結果は、本発明におけるプライマーは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単独のＤＮＡを増幅できず、したがってこれを検出することができなかったが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいてしかＤＮＡを増幅できなかったプライマー１６Ｓ（パネルＡ）とは対照的に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在下でさえ、スピロヘータのＤＮＡを増幅し、検出することができたことを示している（パネルＢ）。
【００６４】
実施例２：本発明によるプライマーを用いたｒｐｏＢ遺伝子の断片の特異的増幅
本実験は以下のスピロヘータ菌株を用いて行った：
Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、ならびに他の非スピロヘータ菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ。
【００６５】
使用したＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍにおけるｒｐｏＢ遺伝子の配列は、ワインストック（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ）ら［（１９９８）Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ：ｎｅｗ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｓｙｐｈｉｌｉｓ． ＦＥＭ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２：３２３−３３２］に記載の通りである。
【００６６】
使用したＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにおけるｒｐｏＢ遺伝子の配列は、アレクサン（Ａｌｅｋｓｈｕｎ）ら［（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ｒｐｏＢ、Ｇｅｎｅ １８６：２２７−２３５］に記載の通りである。
【００６７】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓおよびＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓのｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＰＣＲにより以下のようにして得た。
【００６８】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａのゲノムＤＮＡを標準的な手法により、フェノール／クロロホルムで抽出した［サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， ＮＹ］。この実験の第１段階において、プライマーＳＥＢ１（５’−ＡＡＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＧＣ ＧＴＴ ＧＧＣ ＣＴＧ Ｇ−３’）およびＳＥＢ２（５’−ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＣＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ Ａ−３’）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢｏｒｒｅｌｉａ ｓｕｂｔｉｌｉｓに対するＳＥＢ）、およびＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によるポリメラーゼＤＢＡ Ｔａｑを用い、最終容積５０μＬに対して５μＬのＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。第１ステップの変性（９５℃、１．５分間）後、９５℃２０秒間、５０℃３０秒間、および７２℃１分間の３ステップから成るサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲプログラムは７２℃で３分間の伸展ステップを１回行って終了した（ＰｅｌｔｉｅｒＰＴＣ２００熱サイクルモデル、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）
【００６９】
電気泳動によって得られたアンプリコンを１％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。
次に、ＰＣＲ ＱＩＡ迅速精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて試料を精製し、該精製試料をｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファ（ＤＮＡシーケンシングキット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）と反応させることにより、遺伝子の配列決定を行った。最後に、アプライドバイオシステムズ自動ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ３１０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて反応性産物の電気泳動を行った。
【００７０】
ｒｐｏＢ遺伝子の５’末端の配列は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ（商標登録）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、以下のようにして得た。ゲノムウォーカー「バンク（Ｂａｎｋｓ）」と呼ばれる５群のゲノムＤＮＡ断片を、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素を用いて構築した。これらのバンクは、遺伝子の既知の５’末端にできる限り近い領域に相当する配列を有した該遺伝子に対する特異的プライマーと、キットにより提供される適応プライマー（adaptation primer ）とを用いて、ゲノムＤＮＡの予備配列決定を行うために用いた。
【００７１】
増幅された断片は精製し、ＤＮＡ供給源は２度目の閉鎖（enclosed）ＰＣＲのために用いた。得られたアンプリコンは、自動シーケンシングに供するために上述のように処理した。
【００７２】
得られたＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号５の配列を有し、３８７６個の核酸を有していた。得られたＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒａｇｉａ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号６の配列を有し、９１４個の核酸を有していた。得られたＬａｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号７の配列を有し、９４９個の核酸を有していた。最後に、得られたＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号８の配列を有し、８００個の核酸を有していた。
【００７３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列は、文献に記載されている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ）。
【００７４】
増幅するｒｐｏＢ遺伝子の断片は９４９ｐｂから成っていた。
ＰＣＲによるｒｐｏＢ遺伝子の断片の増幅は、各種を別々に用いたことを除いては、実施例３と同様にして実施した。
【００７５】
結果は図２に示した。同図において、
バンド１は、分子量マーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に相当し、
バンド２は、Ｂ． ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに相当し、
バンド３は、Ｂ． Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓに相当し、
バンド４は、Ｔ． ｐａｌｌｉｄｕｍに相当し、
バンド５は、Ｌ． ｂｉｆｌｅｘａに相当し、
バンド６は、Ｌ． ａｕｓｔｒａｌｉｓに相当し、
バンド７は、Ｌ． ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅに相当し、
バンド８は、Ｅ． ｃｏｌｉに相当し、
バンド９は、Ｓ． ａｕｒｅｕｓｉに相当し、
バンド１０は、Ｓｔｒ． ｓａｌｉｖａｒｉｕｓに相当し、
バンド１１は、Ｐｓ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに相当し、
バンド１２は、ＤＮＡを含まない陰性対照に相当する。
【００７６】
以下のプライマーを用いた。
パネルＡ：本発明によるプライマー１７３０Ｄおよびプライマー２９００Ｒ。
パネルＢ：本発明によるプライマー１７３０Ｄおよびプライマー３８００Ｒ。
パネルＣ：ＲＮＡｒプライマー１６Ｓ ＲＤ１およびＦＤ３。
プライマー３８００Ｒは、配列番号４の配列（５’ＧＣＴＴＣＮＡＧＮＧＣＣＣＡＮＡＣ３’）を有し、該配列中、「Ｎ」はイノシンである。
【００７７】
以上の結果は、プライマー１６Ｓは全てを増幅したが（パネルＣ）、本発明のプライマーは、スピロヘータのＤＮＡ断片しか増幅することができなかったことを示している（パネルＡおよびＢ）。
【００７８】
プライマー配列番号３（５’ＧＧＧＴＧＮＡＴＴＴＴＮＴＣＡＴＣＮＡＣ３’）もプライマーとして使用できる。本発明によるプライマー１〜３により、増幅に次ぐ増幅産物の配列決定、ザイールで採集されたアフリカカズキダニ（Ａｆｒｉｃａｎ ｔｉｃｋ）のｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ種および回帰熱を示すザイールの患者の全血液中に含まれるＢｏｒｒｅｌｉａ ｄｕｔｔｏｎｉｉ細菌の検出および同定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明におけるプローブを用いて混合細菌懸濁液中のスピロヘータを検出した結果を表す電気泳動ゲルの写真。
【図２】本発明におけるプライマーを用いてスピロヘータのｒｐｏＢ遺伝子の断片をＰＣＲにより特異的に増幅した結果を示す電気泳動ゲルの写真。
【配列表】
本発明は、プローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを用いた検出および／または増幅ならびに配列決定のための技術に関し、また、スピロヘータ目（スピロヘータ）の細菌を検出または同定するためにこれらのプローブまたはプライマーを適用することに関する。
【０００２】
ある種の診断試験において、例えば、特に人または動物の神経系の感染検査、あるいは節足動物に噛まれた後の検査の際には、試料中の細菌（詳しくはスピロヘータ）の存在に関する迅速な反応を得なければならないことが多い。しかしながら、グラム染色や培養後の直接試験などの現在開発されている技術は、グラム染色の欠如や培地中での増殖の欠如により失敗に終わることが多い。
【０００３】
髄膜脳炎などの感染症の原因となるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびセルプリーナ（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ）の各種を含む細菌の科を形成するスピロヘータの場合は、培養を行うことができない。したがって、スピロヘータの同定の問題は未だ解決されていない。
【０００４】
ここ二十年に亘る感染性疾病の増加やこれらの感染性疾病の劇的な結果に鑑みると、スピロヘータなどの感染性病原体を検出するための迅速かつ特異的な方法を開発することが必要とされている。
【０００５】
細菌の培養ができないことの緩和策として、生きている有機体、該有機体からの細胞抽出物または試料中に、遺伝子、遺伝子の一部、またはヌクレオチド配列が存在するかどうかを調べるために、核酸および遺伝子材料に関連した技術、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いることが考えられる。どんな遺伝子または遺伝子の一部も、ヌクレオチド塩基の特異的配列によってキャラクタライズされることから、ポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の前記特異的配列の全部または一部の存在を直接的に調べることができる。
【０００６】
核酸を検出するための種々のタイプの方法が文献に記載されている。そのような方法は、ＤＮＡ−ＤＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせんにおける核酸相補鎖間のプリン−ピリミジン対形成特性に基づいている。この対形成プロセスは、二本鎖ＤＮＡのアデニン−チミン（Ａ−Ｔ）塩基間、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）塩基間に水素結合を形成することによって行われる。またＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせんでは、水素結合によってアデニン−ウラシル（Ａ−Ｕ）塩基の対も形成される。特定の核酸分子の有無を調べるための核酸の鎖の対形成は、「核酸のハイブリッド形成」もしくは単に「ハイブリッド形成」と呼ばれている。
【０００７】
ＰＣＲ法の一例としては、ＲＮＡｒ１６Ｓに基づいて配列を決定することが挙げられる。しかしながらこの方法には、診断の妨げとなる潜在的なコンタミネーションの問題に起因する限界がある。
【０００８】
この欠点を埋め合わせるために、細菌培養の前段階を行うことなく、あらゆる試料中でスピロヘータ目に属する細菌を特異的に検出するための新しい遺伝子マーカーが探索されている。そのような新しいマーカーまたはオリゴヌクレオチドが本発明の対象である。
【０００９】
これらの新しいマーカーの決定は、細菌ＲＮＡポリメラーゼ内のβサブユニットをコードするスピロヘータのｒｐｏＢ遺伝子内の特別に定められた配列の使用に依拠している。実際に、細菌の科によって異なるがスピロヘータ目の間では保存されているように思われる領域が、細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするＤＮＡ上で見つかっている。したがって、この細菌の科は、他の細菌の科から区別することができる。スピロヘータ目に特異的なこれらのマーカーの開発にあたっては、上記保存領域において、スピロヘータの特定種の間では小さな配列の変化しか見られないという観察結果を用いた。
【００１０】
ラズカノ（Ｌａｚｃａｎｏ）ら［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．（１９８８） ２７：３６５〜３７６］によれば、ＲＮＡポリメラーゼは、その起源によって、ウィルスＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって構成される群と、真核生物または原核生物（古細菌および真正細菌）を起源とするＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼから構成される群との２つの群に分けられる。ＤＮＡ依存性真正細菌ＲＮＡポリメラーゼは、αββ’で表される「コア酵素」またはαββ’σで表される「ホロ酵素」と呼ばれる単純な保存された多量体構造を特徴としている［ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ），Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．（１９７９） １３：５９〜９７］。
【００１１】
これまで数多くの研究によって、真正細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットの多量体酵素複合体内の機能的法則が明らかにされてきた。古細菌および真正細菌ＲＮＡポリメラーゼは、１０個もしくは３０個ものサブユニットを含むこともあるさらに大きな複合体構造を与える［ピューラ（Ｐｕｈｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８９） ８６：４５６９〜４５７３］。
【００１２】
真正細菌におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの種々のαββ’σサブユニットをコードする遺伝子である、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣおよびｒｐｏＤの各遺伝子は、リボゾームサブユニットを構成するタンパク質をコードする遺伝子、あるいはゲノムの複製および修復に関与する酵素をコードする遺伝子を含む異なる群に分類される［ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ）， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．（１９７９） １３：５９〜９７］。ある著者は、生物界を様々な枝や小枝を分離するための系統樹の作成に、ｒｐｏＢおよびｒｐｏＣ遺伝子の核酸配列を用いることができることを実証している［ローランド（Ｒｏｗｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ．（１９９２） ２１：４０ｓ］。
【００１３】
本発明を詳細に説明する前に、明細書および請求の範囲で使用する種々の用語について、次のように定義しておく。
【００１４】
− 「細菌から抽出された核酸」とは、全核酸、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られたＤＮＡのいずれかのことをいう。
− 「ヌクレオチド断片」または「オリゴヌクレオチド」は、２つの同義語であり、所定の厳しいストリンジェンス条件下において、相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド断片とハイブリッド形成する可能性のある、天然核酸などの、天然の（または修飾された）核酸の情報配列によって特徴付けられるＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドモチーフの配列のことをいう。この配列は、天然核酸のものとは異なる構造のヌクレオチドモチーフを含んでいてもよい。ヌクレオチド断片（またはオリゴヌクレオチド）は、例えば、１００個までのヌクレオチドモチーフを含み得る。該ヌクレオチド断片は、少なくとも１０個、より詳細には少なくとも１２個のヌクレオチドモチーフを含み、天然核酸分子から得られるものであってもよいし、および／または、遺伝子組換え、および／または化学合成によって得られるものであってもよい。
【００１５】
− 「ヌクレオチドモチーフ」は、糖、リン酸基、ならびに、窒素塩基（アデニン、グアニン、ウラシル、シトシンおよびチミンから選択される）を構造的要素とする天然の核酸のヌクレオチドであるモノマーから得られるものであるか、そうでなければ、該モノマーは前記３つの構造的要素のうちの少なくとも１つが修飾されているヌクレオチドである。例を挙げると、修飾は塩基で起こり、その例としては、Ａ，Ｔ，Ｕ，ＣまたはＧの任意の塩基とハイブリッド形成することができるイノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジンなどの修飾塩基、またはハイブリッド形成のできる他の任意の塩基が挙げられる。あるいは、修飾は糖で起こり、例えば、少なくとも１つのデオキシリボースをポリアミドで置換したものである［ＰＥ ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９１） ２５４：１４９７〜１５００］。あるいは、修飾はリン酸基で起こり、例えば、選択されたエステル、特に二リン酸エステル、アルキルおよびアリールホスホン酸エステルおよびモノチオリン酸エステルから選択されるエステルによる置換である。
【００１６】
− 「情報配列」とは、化学的性質および基準方向における順序が、天然の核酸の配列によって提供される情報と類似の情報を構成するような、任意のヌクレオチドモチーフの規則配列のことをいう。
【００１７】
− 「ハイブリッド形成」とは、適当な条件下において、十分に相補的な配列を有する２本のヌクレオチド断片が、安定かつ特異的な水素結合によって会合することができ、２本鎖を形成する過程のことをいう。ハイブリッド形成のための条件は、「ストリンジェンス」、すなわち操作条件の厳しさによって決定される。ストリンジェンスが大きいほど、ハイブリッド形成の特異性は高くなる。ストリンジェンスは、主にプローブ／標的二重らせんの塩基組成の関数であるが、２つの核酸間のミスマッチの程度にもよる。ストリンジェンスは、ハイブリッド形成溶液中に見られるイオン種の濃度および種類、変性剤の種類および濃度、および／または、ハイブリッド形成温度などの、ハイブリッド形成反応のパラメータの関数でもありうる。ハイブリッド形成を行うべき条件のストリンジェンスは、主として使用するプローブに依存している。そのようなデータのすべては周知であり、適当な条件は最終的には、それぞれの場合に応じて常套的実験によって決定することができる。一般に、ハイブリッド形成反応のための温度は、使用するプローブの長さに応じて、約０．８〜１Ｍの濃度の生理食塩水中、約２０〜６５℃であり、より詳細には３５〜６５℃である。
【００１８】
− 「プローブ」は、本件においては、所定の条件下で、メッセンジャーＲＮＡ、または転写産物である前記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られたＤＮＡに含まれるヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリッド複合体を形成するハイブリッド形成特異性を有する、例えば、１０〜１００個のヌクレオチドモチーフ、より詳細には１２〜３５個のヌクレオチドモチーフを含むヌクレオチド断片である。プローブは診断の目的（特に捕捉または検出プローブ）あるいは治療の目的で使用することもできる。
【００１９】
− 「捕捉プローブ」は、例えば共有結合、吸着、または固体上への直接合成などの適当な手段によって固体支持体上に固定化されているか、固定化することができる。支持体の例としては、ミクロタイタープレートやＤＮＡチップなどが挙げられる。
【００２０】
− 「検出プローブ」は、例えば放射性同位体、酵素、特に色素発生、蛍光発生、発光性の基質と反応することのできる酵素（特に、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、発色化合物、色素発生、蛍光発生または発色性化合物、ヌクレオチド塩基のアナログ、およびビオチンなどのリガンドの中から選択される標識物質によって標識してもよい。
【００２１】
− 「種プローブ」は、細菌の種を同定することのできるプローブである。
− 「属プローブ」は、細菌の属を同定することのできるプローブである。
− 「プライマー」は、例えば１０〜１００個のヌクレオチドモチーフを含み、例えば、ＰＣＲなどの増幅技術、配列決定法、転写法などにおける酵素重合開始のための所定の条件下においてハイブリッド形成特異性を有するプローブである。
【００２２】
本発明の第１の目的は、明細書の最後のリストに記載の配列番号１〜配列番号４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドの中からならびにそれらのオリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドの中から選択される、一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００２３】
配列番号１〜配列番号４のそれぞれの配列において、明細書の最後の配列リストに示されているヌクレオチド「Ｎ」は、該ヌクレオチドが出現する３つの位置のそれぞれにおいて同一でも異なっていてもよいヌクレオチドを表し、イノシンか、あるいは、Ａ，Ｔ，ＣおよびＧから、あるいは場合によってはＡ，Ｕ，ＣおよびＧから選択される４つの異なるヌクレオチドの等モル混合物かを表しうる。
【００２４】
「Ｎ」が、特定の位置におけるヌクレオチドの上記等モル混合物を表す場合、前記位置におけるヌクレオチドは区別なくＡ，Ｔ，ＣまたはＧ（あるいは、場合によっては、それぞれＡ，Ｕ，ＣまたはＧ）を表し、本発明のオリゴヌクレオチドがより正確に４つのオリゴヌクレオチド群の等モル混合物からなり、その各群において、前記特定位置において「Ｎ」は異なる意味を有し、４群のそれぞれにおいてＡ，Ｔ，ＣおよびＧを表すことを意味する。
【００２５】
配列番号１〜４の配列のそれぞれにおいて、ヌクレオチド「Ｎ」が出現する３位置において、Ｎが４つのヌクレオチドＡ，Ｔ，ＣまたはＧ（あるいは、場合によっては、ＮはＡ，Ｕ，ＣおよびＧ）の上記等モル混合物を表す。したがって、前記配列を構成するオリゴヌクレオチドは、４3（６４）個のオリゴヌクレオチドの混合物を表す。
【００２６】
定義において示したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）であってもよいし、あるいは、オリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）であってもよい。後者の場合、「Ｔ」の代わりに「Ｕ」である。
【００２７】
特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、上述のように１２個以上かつ５０個以下のモチーフを有している。詳細には、本発明によれば、オリゴヌクレオチドは１２〜３５個のモチーフを有する。
【００２８】
好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４の配列、またはその相補配列の中から選択される配列を有する。
プライマー１と呼ばれるプライマーからの配列である配列番号１の配列は、２０個の核酸を有する。プライマー２と呼ばれるプライマーからの配列である配列番号２の配列は、２１個の核酸を有する。プライマー３と呼ばれるプライマーからの配列である配列番号３の配列は、２０個の核酸を有する。プライマー４と呼ばれるプライマーからの配列である配列番号４の配列は、１７個の核酸を有する。
【００２９】
大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）中のｒｐｏＢ遺伝子を表す命名において、配列番号１〜４の配列中の最初のヌクレオチドは以下の位置に相当する。
配列番号１：１７３０
配列番号２：２９００
配列番号３：３７００
配列番号４：３８５０
本願発明者らは、上で定義されるような配列番号１〜４の配列が、スピロヘータの間で共通であるということだけでなく、それらの配列が、スピロヘータの科にも特異的であり、スピロヘータの種における種および属亜型（genus serovar ）に特異的な配列をした非常に可変領域を含むｒｐｏＢ遺伝子の断片を包含することを発見、解明した。
【００３０】
実際に、相補的標的配列内の可変ヌクレオチドが、対象とする細菌種の関数として、配列番号１〜４の配列中のヌクレオチド「Ｎ」の位置と対応する位置に見つかっている。しかしながら、その他のヌクレオチドは、スピロヘータ科内の全ての細菌種において保存されている。「Ｎ」は任意の塩基とハイブリッド形成しうるイノシン、またはＡ，Ｔ，ＣおよびＧの４塩基の等モル混合物を表すので、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物は、スピロヘータ細菌の相補的標的配列とハイブリッド形成することのできるオリゴヌクレオチドを常に含んでいる。
【００３１】
さらに、配列番号１〜４の配列は、その領域における配列がスピロヘータ科内の細菌種のそれぞれに特異的である可変領域を包含しているので、配列番号１〜４の配列によって、スピロヘータの科に対する特異的プローブの調製が可能になるだけでなく、前記配列をプライマーとして用いることにより、ＰＣＲ増幅による前記細菌の種の検出および同定も可能になる。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチド調製の一形態において、「Ｎ」は全ての位置においてイノシンを表す。
調製の別の形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる配列を有するオリゴヌクレオチド（特に４Pオリゴヌクレオチド）の混合物を表し、該配列において、「Ｎ」が出現する前記各位置（特に、ｐ個の位置。「ｐ」は総数を表す）において、Ａ，Ｔ，ＣおよびＧの全てのヌクレオチドが表される。
【００３３】
配列番号１〜４の配列は、例えばイタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）Ｋ．らによる論文［（１９８４）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３］に記載されているような周知の技術を用いて化学合成によって調製することができる。
【００３４】
本発明によるオリゴヌクレオチドの第１の適用例は、該オリゴヌクレオチドを、生体試料中の、配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモチーフを有するヌクレオチド配列およびそれらの相補的配列を含むスピロヘータ目に属する細菌を検出するためのプローブとして使用することである。以後の説明において、このようなプローブのことを「属プローブ」と呼ぶ。
【００３５】
本発明によれば、あらゆる公知のハイブリッド形成技術、特に、フィルタ上への沈殿を伴ういわゆる「ドットブロット」技術［マニアチス（ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ］、ＤＮＡの転移を伴ういわゆる「サザンブロット」技術［サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）Ｅ．Ｍ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９７５） ９８：５０３］、ＲＮＡの転移を伴ういわゆる「ノーザンブロット」技術、あるいは、いわゆる「サンドイッチ」技術［ダン（Ｄｕｎｎ）Ａ．Ｒ．，ハッセル（Ｈａｓｓｅｌ）Ｊ．Ａ．（１９７７）Ｃｅｌｌ、１２：２３］に従って試料中の標的核酸の有無を調べる検査において、プローブを診断の目的で使用することもできる。特に、「サンドイッチ」技術は、捕捉プローブおよび／または検出プローブと一緒に用いられ、前記プローブは標的核酸の異なる２つの部位とハイブリッド形成することができ、捕捉プローブと検出プローブは少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有していなければならないことを考慮すると、少なくとも１つの前記プローブ（一般には検出プローブ）が、検査対象の種または種の群に特異的な標的内の領域とハイブリッド形成することができる。
【００３６】
検出すべき核酸（標的）は、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよい（いずれか一方がＰＣＲ増幅後に得られる）。二本鎖核酸の標的を検出する場合、検出手順を行う前に、標的二本鎖核酸を変性させておくとよい。標的核酸は、核酸用の周知の方法に従って、試験試料からの抽出によって得られる。二本鎖核酸の変性は、よく知られた化学的、物理的または酵素変性法によって、特に８０℃を超える適当な温度に加熱することによって、行うことができる。
【００３７】
前述のハイブリッド形成技術、特に「サンドイッチ」技術を使用するために、捕捉プローブと呼ばれる本発明によるプローブを固体支持体上に固定化し、検出プローブと呼ばれる本発明による他のプローブを試薬で標識する。
【００３８】
支持体および標識物質の例は上で定義した通りである。
本発明の別の目的は、少なくとも１つのスピロヘータが、少なくとも１つの当該細菌に由来する核酸を含有しているか含有する可能性のある試料中に、存在するかどうかを調べる方法であって、前記試料を少なくとも１つの本発明による属プローブと接触させてから、前記プローブと試料中の核酸との間にハイブリッド複合体が形成されたかどうかを公知の方法で調べる工程から成る方法である。
【００３９】
前記プローブと核酸との間でハイブリッド複合体が形成されているか否かの検出法の例としては、上述の技術、すなわち、「ドットブロット」、「サザンブロット」および「サンドイッチ」技術が挙げられる。
【００４０】
スピロヘータの種または種の群が存在するかどうかを決定するための本手法の１つの特定の用途において、本発明による属プローブと本発明による種プローブとが用いられる。当然ながら、該属および種プローブは、スピロヘータのｒｐｏＢ遺伝子に相当する核酸の非重複領域とハイブリッド形成することができる。
【００４１】
有益な態様において、属プローブは固体支持体上に固定化され、種プローブは標識物質で標識される。
本発明は、特定のスピロヘータ種の存在を調べるために、本発明による手法を適用することも包含する。
【００４２】
実際に、研究の結果、ＣＬＵＳＴＡＬアライメント法［ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）Ｄ．Ｇ．とシャープ（Ｓｈａｒｐ）Ｐ．Ｍ．（１９８９）Ｇｅｎｅ、７３：２３７〜２４４］により、スピロヘータ種内で保存されている配列のアライメントが認められ、前記配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｒｐｏＢ遺伝子ＡＴＣＣ２５２９０の番号付けを参照するとｒｐｏＢ遺伝子の位置１７３０〜２９００の間に位置する１１７０塩基を有し、スピロヘータ目の中の少なくとも１つの細菌を検出することができることが示された。特定の種（対照種に対する、この場合はＥ．ｃｏｌｉ）に対する変異を施した領域を含むプローブを用いることにより、当該種を直接的に検出することが可能になる。２つのプローブの組み合わせ（捕捉プローブと検出プローブ）を用いるサンドイッチハイブリッド形成技術では、例えばスピロヘータの科に特異的なプローブと対象種に特異的なプローブとを組み合わせて用いる。上記の種に特異的な２つのプローブの組み合わせて用いることも可能である。そのような種がある場合には、それら２つのプローブはｒｐｏＢ遺伝子の非重複領域に相補的である。
【００４３】
本発明におけるオリゴヌクレオチドの別の適用例は、該ヌクレオチドを、配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個のヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、一本鎖オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドプライマーとして用いることであり、該ヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼの存在下での周知の手法による核酸合成、すなわち、ポリメラーゼ存在下でのそのような合成を用いた増幅法（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど）において用いることができる。特に、本発明によるプライマーは、対応する相補的ＤＮＡ配列を得るために、スピロヘータの少なくとも１つの種または少なくとも１つの種の群のメッセンジャーＲＮＡの配列の特異的逆転写のために用いることもできる。このような逆転写をＲＴ−ＰＣＲ技術における第一段階とし、これに続く段階をＰＣＲによって得られた相補的ＤＮＡの増幅とすることができる。さらに、本発明によるプライマーを、スピロヘータの少なくとも１つの種または少なくとも１つの種の群のｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列の鎖重合反応による特異的増幅のために用いることもできる。
【００４４】
特定の場合において、上記プライマーは本発明によるオリゴヌクレオチドから成るので、該プライマーはＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモータの順方向または逆方向配列をも含んでいる（例えば、プロモータＴ７，Ｔ３，ＳＰ６［スタディ（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ＦＷ，ＢＡ モファット（Ｍｏｆｆａｔｔ）（１９８６）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３］）。このようなプライマーは、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲなどの転写段階に関する核酸増幅方法において使用することができる［ファン・ゲーメン（Ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ）Ｂ．ら、アブストラクトＭＡ１０９１、第７回国際エイズ会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＡＩＤＳ）（１９９１）、フィレンツェ、イタリア］。
【００４５】
本発明の別の目的は、任意のスピロヘータ種におけるｒｐｏＢ遺伝子の全または部分配列決定のために使用することができる、配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドの中から選択される一本鎖オリゴヌクレオチドからなるヌクレオチドプライマーである。特に、このヌクレオチドプライマーは、増幅された核酸の配列決定に用いることができる。
【００４６】
実際に、本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーは、全てのスピロヘータにおけるｒｐｏＢ遺伝子の増幅とその後の配列決定を可能にするとともに、この配列のバイオデータ処理解析による任意のスピロヘータの同定、ならびに新規または未知のスピロヘータ種の認識を可能にする。配列決定は、よく知られた方法、ジデオキシヌクレオチドを用いた吸着重合［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）Ｆ．，クイソン（Ｃｏｕｉｓｏｎ）Ａ．Ｒ．（１９７５）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９４：４４１］、またはＤＮＡチップを用いた多重ハイブリダイゼーションによってｒｐｏＢ遺伝子の全または部分配列を得ることを包含する。
【００４７】
プライマー１〜３は５’プライマーとして、プライマー２〜４は３’プライマーとして使用して、５’と３’の間に囲われたｒｐｏＢ遺伝子の断片を前記プライマーによって増幅することができる。
【００４８】
１つの形態において、５’プライマーに対しては配列番号１〜３、３’プライマーに対しては配列番号２〜４の配列に含まれる、少なくとも１２個のヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される異なる２つのオリゴヌクレオチドからなる、２つのプライマーから成る組が用いられる。
【００４９】
また本発明は、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片をまず本発明によるプライマーで増幅し、次に、前記断片を本発明による前記細菌に由来するプローブと接触させることを特徴とする方法も含んでいる。前記プローブと前記断片との間でハイブリッド複合体が形成されるかどうかが決定される。
【００５０】
また本発明は、スピロヘータ目に属する少なくとも１つの細菌が、そのような細菌に由来する核酸を含んでいるか含む可能性のある試料中に存在するかどうかを調べるための方法であって、前記試料を本発明のプライマーに接触させることを特徴とする方法をも含む。その後、増幅が行われ、増幅産物が出現しているかどうかが決定される。
【００５１】
１つの形態において、スピロヘータ目に属する少なくとも１つの細菌が、そのような細菌に由来する核酸を含んでいるか含む可能性のある生物試料中に存在するかどうかを調べるための方法は、本発明によるプライマーを用いて前記試料中の前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片の増幅および配列決定を行い、得られた遺伝子のｒｐｏＢ遺伝子断片の配列を、試料中の前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片の既知の配列と比較して、得られた断片の配列が前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片の既知の配列と一致するかどうかを調べることを特徴とする。
【００５２】
また本発明は、スピロヘータ目に属する細菌の種に特異的な、生物試料中の検出プローブであって、本発明によるプライマーを用いた増幅によって得られるｒｐｏＢ遺伝子の断片を含み、好ましくは５’プライマーとして配列番号１〜３の配列のいずれか１つを有し、３’プライマーとして配列番号２〜４の配列のいずれか１つを有することを特徴とする検出プローブも包含する。本発明のオリゴヌクレオチドによって囲まれる前記ｒｐｏＢ遺伝子の断片は、実際には、スピロヘータ目に属する前記細菌の種に応じて大きく変化する領域であって、前記各種に対して特異的な領域に相当する。
【００５３】
最後に、本発明は、スピロヘータの少なくとも１種または種の群によって誘起される感染を治療するための、上で定義したオリゴヌクレオチドを含む遺伝子治療プローブも包含する。前記細菌のメッセンジャーＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ上にハイブリッド形成することのできるこの遺伝子治療プローブは、翻訳および／または転写および／または複製の現象を阻止することができる。
【００５４】
遺伝子治療法の原理は公知であり、主として逆方向鎖に相当するプローブを使用することに基づいている。プローブと順方向鎖との間のハイブリッド形成により、遺伝子情報解読における少なくとも１段階を混乱させることができる。これにより、遺伝子治療プローブを、スピロヘータによって引き起こされる感染と闘うための抗細菌薬として使用することができる。
【００５５】
以下の実験報告を用いて本発明を詳細に説明する。
以下の説明は、図１および図２を用いてよりよく理解される。
以下の実施例で使用するスピロヘータ菌株、すなわち、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ ｓｅｒｏｖａｒ ｐａｔｏｃ（以下、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａと呼ぶ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ（以下、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅと呼ぶ）およびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ａｕｓｔｒａｌｉｓ（以下、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓと呼ぶ）は、パリのパスツール研究所（フランス）のＣｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅで入手可能なＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓを除き、すべてＡＴＣＣコレクションから得た。Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉのＡＴＣＣ番号は３５２１０であり、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍのＡＴＣＣ番号は２７０８７であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａのＡＴＣＣ番号は２３５８２であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅのＡＴＣＣ番号は４３６４２であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓのＡＴＣＣ番号は２３６０５である。
【００５６】
ＢｏｒｒｅｌｉａおよびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ株は、それぞれＢＳＫＩＩおよびＥＭＪＨ培地上で３０℃で培養した［バーバ（Ｂａｒｂｏｕｒ）Ａ．Ｇ．（１９８４）Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ５７：５２１］。Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖できないため、この病原性細菌はウサギの精巣に注射することにより増殖させた。
【００５７】
他の使用細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、マルセイユの入院患者より臨床的に単離した。
【００５８】
実施例１：本発明によるプローブを用いたスピロヘータの特異的検出
本実験は以下のスピロヘータ菌株を用いて行った：
Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ。
【００５９】
スピロヘータＤＮＡをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの抽出物と混合することにより、混合細菌懸濁液を調製した。
ＱＩＡａｍｐ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）およびＧｉｂｃｏポリメラーゼＴａｑ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ法を行った。最初の変性ステップ（９４℃、２分間）の後、９４℃３０秒間、５２℃３０秒間、および７２℃１分間の３ステップからなるサイクルを３５回繰り返し、ＰＣＲプログラムを終了した。得られたアンプリコンを精製し上述のように配列決定を行った。
【００６０】
結果を図１に示す。同図において、
バンド１は、分子量マーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に相当し、
バンド２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単独に相当し、
バンド３は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド４は、Ｂ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド５は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド６は、Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド７は、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、
バンド８は、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当する。
【００６１】
また、以下のプライマーを使用した。
パネルＡ：ＲＮＡｒプライマー１６Ｓ ＦＤＩおよびＲＤ３［ウェイスブルグ（Ｗｅｉｓｂｕｒｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９１）１７３：６９７−７０３］。
パネルＢ：本発明によるプライマー１７３０Ｄおよび２９００Ｒ。
【００６２】
プライマー１７３０Ｄの配列は配列番号１（５’ＣＴＴＧＧＮＣＣＮＧＧＮＧＧＡＣＴＴＴＣ３’）において「Ｎ」がイノシンであり、プライマー２９００Ｒは、配列番号２の配列（５’ＡＧＡＡＡＴＮＡＡＮＡＴＮＧＣＡＴＣＣＴＣ３’）を有し、該配列中「Ｎ」はイノシンである。
【００６３】
これらの結果は、本発明におけるプライマーは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単独のＤＮＡを増幅できず、したがってこれを検出することができなかったが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいてしかＤＮＡを増幅できなかったプライマー１６Ｓ（パネルＡ）とは対照的に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在下でさえ、スピロヘータのＤＮＡを増幅し、検出することができたことを示している（パネルＢ）。
【００６４】
実施例２：本発明によるプライマーを用いたｒｐｏＢ遺伝子の断片の特異的増幅
本実験は以下のスピロヘータ菌株を用いて行った：
Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、ならびに他の非スピロヘータ菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ。
【００６５】
使用したＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍにおけるｒｐｏＢ遺伝子の配列は、ワインストック（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ）ら［（１９９８）Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ：ｎｅｗ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｓｙｐｈｉｌｉｓ． ＦＥＭ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２：３２３−３３２］に記載の通りである。
【００６６】
使用したＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにおけるｒｐｏＢ遺伝子の配列は、アレクサン（Ａｌｅｋｓｈｕｎ）ら［（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ｒｐｏＢ、Ｇｅｎｅ １８６：２２７−２３５］に記載の通りである。
【００６７】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓおよびＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓのｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＰＣＲにより以下のようにして得た。
【００６８】
Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａのゲノムＤＮＡを標準的な手法により、フェノール／クロロホルムで抽出した［サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， ＮＹ］。この実験の第１段階において、プライマーＳＥＢ１（５’−ＡＡＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＧＣ ＧＴＴ ＧＧＣ ＣＴＧ Ｇ−３’）およびＳＥＢ２（５’−ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＣＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ Ａ−３’）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢｏｒｒｅｌｉａ ｓｕｂｔｉｌｉｓに対するＳＥＢ）、およびＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によるポリメラーゼＤＢＡ Ｔａｑを用い、最終容積５０μＬに対して５μＬのＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。第１ステップの変性（９５℃、１．５分間）後、９５℃２０秒間、５０℃３０秒間、および７２℃１分間の３ステップから成るサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲプログラムは７２℃で３分間の伸展ステップを１回行って終了した（ＰｅｌｔｉｅｒＰＴＣ２００熱サイクルモデル、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）
【００６９】
電気泳動によって得られたアンプリコンを１％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。
次に、ＰＣＲ ＱＩＡ迅速精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて試料を精製し、該精製試料をｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファ（ＤＮＡシーケンシングキット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）と反応させることにより、遺伝子の配列決定を行った。最後に、アプライドバイオシステムズ自動ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ３１０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて反応性産物の電気泳動を行った。
【００７０】
ｒｐｏＢ遺伝子の５’末端の配列は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ（商標登録）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、以下のようにして得た。ゲノムウォーカー「バンク（Ｂａｎｋｓ）」と呼ばれる５群のゲノムＤＮＡ断片を、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素を用いて構築した。これらのバンクは、遺伝子の既知の５’末端にできる限り近い領域に相当する配列を有した該遺伝子に対する特異的プライマーと、キットにより提供される適応プライマー（adaptation primer ）とを用いて、ゲノムＤＮＡの予備配列決定を行うために用いた。
【００７１】
増幅された断片は精製し、ＤＮＡ供給源は２度目の閉鎖（enclosed）ＰＣＲのために用いた。得られたアンプリコンは、自動シーケンシングに供するために上述のように処理した。
【００７２】
得られたＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号５の配列を有し、３８７６個の核酸を有していた。得られたＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒａｇｉａ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号６の配列を有し、９１４個の核酸を有していた。得られたＬａｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号７の配列を有し、９４９個の核酸を有していた。最後に、得られたＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号８の配列を有し、８００個の核酸を有していた。
【００７３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列は、文献に記載されている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ）。
【００７４】
増幅するｒｐｏＢ遺伝子の断片は９４９ｐｂから成っていた。
ＰＣＲによるｒｐｏＢ遺伝子の断片の増幅は、各種を別々に用いたことを除いては、実施例３と同様にして実施した。
【００７５】
結果は図２に示した。同図において、
バンド１は、分子量マーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に相当し、
バンド２は、Ｂ． ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに相当し、
バンド３は、Ｂ． Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓに相当し、
バンド４は、Ｔ． ｐａｌｌｉｄｕｍに相当し、
バンド５は、Ｌ． ｂｉｆｌｅｘａに相当し、
バンド６は、Ｌ． ａｕｓｔｒａｌｉｓに相当し、
バンド７は、Ｌ． ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅに相当し、
バンド８は、Ｅ． ｃｏｌｉに相当し、
バンド９は、Ｓ． ａｕｒｅｕｓｉに相当し、
バンド１０は、Ｓｔｒ． ｓａｌｉｖａｒｉｕｓに相当し、
バンド１１は、Ｐｓ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに相当し、
バンド１２は、ＤＮＡを含まない陰性対照に相当する。
【００７６】
以下のプライマーを用いた。
パネルＡ：本発明によるプライマー１７３０Ｄおよびプライマー２９００Ｒ。
パネルＢ：本発明によるプライマー１７３０Ｄおよびプライマー３８００Ｒ。
パネルＣ：ＲＮＡｒプライマー１６Ｓ ＲＤ１およびＦＤ３。
プライマー３８００Ｒは、配列番号４の配列（５’ＧＣＴＴＣＮＡＧＮＧＣＣＣＡＮＡＣ３’）を有し、該配列中、「Ｎ」はイノシンである。
【００７７】
以上の結果は、プライマー１６Ｓは全てを増幅したが（パネルＣ）、本発明のプライマーは、スピロヘータのＤＮＡ断片しか増幅することができなかったことを示している（パネルＡおよびＢ）。
【００７８】
プライマー配列番号３（５’ＧＧＧＴＧＮＡＴＴＴＴＮＴＣＡＴＣＮＡＣ３’）もプライマーとして使用できる。本発明によるプライマー１〜３により、増幅に次ぐ増幅産物の配列決定、ザイールで採集されたアフリカカズキダニ（Ａｆｒｉｃａｎ ｔｉｃｋ）のｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ種および回帰熱を示すザイールの患者の全血液中に含まれるＢｏｒｒｅｌｉａ ｄｕｔｔｏｎｉｉ細菌の検出および同定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明におけるプローブを用いて混合細菌懸濁液中のスピロヘータを検出した結果を表す電気泳動ゲルの写真。
【図２】本発明におけるプライマーを用いてスピロヘータのｒｐｏＢ遺伝子の断片をＰＣＲにより特異的に増幅した結果を示す電気泳動ゲルの写真。
【配列表】
Claims (7)
- 配列番号１〜配列番号４から選択される配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１７個の連続したヌクレオチドモチーフの配列またはその相補的配列からなる単離オリゴヌクレオチドであって、Ｎはイノシンである単離オリゴヌクレオチド。
- 配列番号１〜配列番号４から選択される配列またはその相補的配列からなる単離オリゴヌクレオチドであって、Ｎはイノシンである単離オリゴヌクレオチド。
- ６４個の単離オリゴヌクレオチドの混合物であって、各単離オリゴヌクレオチドは配列番号１〜配列番号４から選択される配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１７個の連続したヌクレオチドモチーフの配列またはその相補的配列からなる単離オリゴヌクレオチドであり、「Ｎ」が出現する各３つの位置においてヌクレオチドＡ，Ｔ，ＣおよびＧが等しく表されるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である、単離オリゴヌクレオチドの混合物。
- ６４個の単離オリゴヌクレオチドの混合物であって、各単離オリゴヌクレオチドは配列番号１〜配列番号４から選択される配列のいずれか１つまたはその相補的配列からなる単離オリゴヌクレオチドであり、「Ｎ」が出現する各３つの位置においてヌクレオチドＡ，Ｔ，ＣおよびＧが等しく表されるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である、単離オリゴヌクレオチドの混合物。
- スピロヘータ目に属する細菌種のいずれか１つの中のｒｐｏＢ遺伝子の、ポリメラーゼの存在下での合成ならびに全または部分配列決定のために使用可能なヌクレオチドプライマーであって、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするヌクレオチドプライマー。
- スピロヘータ目に属する少なくとも１つの細菌が、少なくとも１つの当該細菌に由来する核酸を含んでいるか含む可能性のある試料中に存在するかどうかを決定するための方法であって、
前記試料を一対のプライマーに接触させ、増幅を行い、増幅産物の有無を決定することからなり、
前記一対のプライマーは、
配列番号１、２、または３から選択された５’プライマーと、
配列番号２、３、または４から選択された５’プライマーとは異なる３’プライマーとからなり、Ｎはイノシンであるか、または「Ｎ」が出現する各３つの位置においてヌクレオチドＡ，Ｔ，ＣおよびＧが等しく表されるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である
ことを特徴とする方法。 - ｒｐｏＢ遺伝子の増幅された断片の配列決定を行い、得られた前記断片の配列を前記細菌の既知のｒｐｏＢ遺伝子配列と比較し、前記得られた断片の配列が既知の配列と一致する場合に前記細菌種が存在すると決定することを特徴とする請求項６に記載の方法。
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